（森林保护学专业论文）豆科树种染色体及凝集素与结瘤关系的初步研究.pdf

摘要 豆科植物能与根瘤菌形成共生固氮体系，但不是所有的豆科树种都能够结瘤，深入研 究非结瘤豆科树种不能结瘤的原因不仅可为非结瘤豆科植物结瘤固氮提供理论依据，对进 一步扩大根瘤菌共生寄主范圈等研究也有一定的价值，本文即从部分豆科树种的染色体和 凝集素两个方面探讨非结瘤豆科树种不结瘤原因，主要研究结果如下： 1 1 6 种树种的箍播观察表明含羞草亚科( 施肌舢d f 如d p ) 的3 种树种和蝶形花亚科 ( p 印f ，f o n d 埘如) 中除了槐属的国槐( s 印厅d m ，印伽f c 目) 外的其余4 种树种都能结瘤。苏 木亚科( c n g 阳勿f n f d i 出础) 的8 种树种都不能结瘤。并且结瘤树种的根系颜色一般都较浅， 不结瘤的豆科树种根系的颜色均较深。 2 通过常规根尖压片法对1 8 种豆科树种的染色体数目观察计数，表明豆科树种的染 色体数目与其结瘤之间存在一定的关系。不结瘤的1 0 种树种除望江南( c 白础砌d c c 托把h 胁肺) 染色体数是2 6 条外，其余9 种树种的染色体数目都是2 8 条，是7 的倍数：其中包括苏木 亚科的8 种树种和蝶形花皿科中的国槐( s 印 o r o 廊p d n i c ) ；而结瘤的8 种树种包括含羞 草亚科的四种树种一一合欢( 彳舾扬曲，“，f 6 r 栅咖) 2 n = 2 x = 2 6 、银荆( 爿c 胁出口舾日m ) 2 n = 2 x - 2 6 、肯氏相思似c 蛔f l m n f a 川f ) 2 n ：2 x = 2 6 、马占相思c 口c 蛔卅c 7 馏f “m ) 2 n _ 2 x = 2 6 ： 蝶形花科的四种树种马蹄针( 脚o m 出v 瑚f ) 2 n ：2 x = 1 8 、紫穗槐口脚d p 砌步“咖d 5 口) 2 n = 2 x = 4 0 、刺槐0 6 f n 胁筇p “出印c f ) 2 n = 2 x = 2 2 、木豆( c 匆d n 以sc 咖h ) 2 n = 2 x = 2 2 ，它们的 染色体数目都不是7 的倍数，且这8 种树种都能结瘤。 3 选取的1 8 种树种都是二倍体，由于药物的作用，在根尖压片中也出现极少数的混 倍现象。 4 对马蹄针和伞房决明的染色体进行核型分析，马蹄针核型为k ( 2 n ) = 2 x = 1 8 = 1 4 m ( 8 s a t ) + 4 s m ，核型类型属2 a 型；伞房决明核型k ( 2 n ) = 2 x = 2 8 m ( 4 s a t ) ，核型类型 属1 a 型。它们都属于较原始的类群，相比之下，伞房决明更原始一些。 5 通过6 种豆科树种凝集素与1 3 种根瘤菌胞外多糖的结合反应，表明凝集素与根瘤 菌胞外多糖的结合，这是豆科与根瘤菌建立共生体系的一个前提条件，能与根瘤菌胞外多 糖发生结合反应豆科树种，并不一定能结瘤。 关键词：非结瘤豆科树种；结瘤；染色体数目；核型：凝集素；胞外多糖 s t u d y o nt h e r e l a t i o n s h i po f c h r o m o s o m el e c t i no fs o m e s p e c i e s o f l e g u m i n o u s t r e e sw i t hn o d u l a t i o n a b s t r a c t a sw ea 1 1k n o w ，n o to fa l ll e g u m i n o u st r e e sc a nf i xn i o g e n i t si m p o r t a n ti nt h e o r i e sa n d u s e st os t u d yo nw h ys o m es p e c i e so f 1 e g u m i n o u st r e e sc a l ln o tb en o d u l 砒e d 1 1 l i ss t u d yc a n b r i n gt h em e o r i e sb a s eo fm a k i n gu n _ n o d u l a t e dl e g u m et r e e sb ea b l et on o d u l a t e ，a sw e l la sb e f a v o r t ot h es t u d yo nt h er c l “o n s h i po fr h i z o b i aw i t ht h e i rh o s t s t h es t u d yi so nt t l er e a s o n s w h y s o m es p e c i e so fl e g u m i n o u st r e e sc a nn o tb er l o d u l a t e do nt h et r e e s c h r o m o s o m ea n d l e c t i n t h em a j nr e s u l ta r ea sf 0 1 1 0 w ： 1 3 s p e c i e so f l e g u m i n o u st r e e si nm m o s d 胁船a r en o d u l a t e d ，4s p e c i e so f l e g u m i n o u s t r e e s i np q p f ，曲竹d f d h pa r en o d u l a t e d ，孓9 p o r 御o f c ai n p q p f 打d h o 胁pi su n n o d u l a t e d ，9s p e c i e so f l e g u m i n o u st r e e si nc a e s p 咖加f o f 出口pa r e n tn o d u l a t e d t h ec o l o ro f t l i en o d u l a t e d1 e g u m i n o u s t r c e s r o o t si sl i g h 时行o ml i g h ty e l l o wt oy e l l o wt h a nt h a to fu n - n o d u l a t e dl e g u m i n o u st r e e s 行o ml i 曲tb r o w nt ob l a c k 2 a c c o r d i n gt ot h ec o u n t i n gt h ec h r o m o s o m en 啪b e r so fl8s p e c i e so fl e g u m i n o u st r e e s ，t h e n u m b e ro fc h r o m o s o m eo f l e g u m i n o u s t r e e sh a sr e l a t i o nw i t hw h e t h e rt h el e g u m i n o u st r e e sa r e n o d u l a t c do rn o ti ns o m ed e 伊e e t h ec h r o m o s o m en 啪b e r so f1 0 s p e c i e so fu n - n o d u l a t e d l e g u m i n o u st r e e sw h i c he x p e c tf o r 白舳面d c c f 出玎胁协a r ea l l2 8w h i c h 酬i v i d e di n t e r g r a l l yb y 7 t h ec h r o m o s o m en u m b e r so fg 淞s 面o c c 砘n m ，西i s2 6 a 1 1 du n n o d u l a t e d e a c ho ft h e c h r o m o s o m en u m b e ro f9s p e c i e so f l e g u m i n o u st r c e s 、h i c hc a nb en o d u l a t e di sn o t2 8a n di s n o td i v i d e d i n t e r g r a l l yb y7 t h e s ec h r o m o s o m en 啪b e r sa 1 1a r en o td i v i d e di n t e r g m i l yb y7 3 a l lo ft h ec l l r o m o s o m eo f1 8 s p e c i e so f l e g u m i n o u st r e e sa r ed i p l o i d ，b u tb e c a u s eo f t h e 胁c t i o no ft h ep r e t r e a t m e n t ，t l l e r ca r ef e wc e l l st h a ti m v et e 把l p l o i dc l l r o m o s o m ei nr o o t s s q u 强h o f l e g u m i n o u s n e s 4 k a r y o t y p ea n a l y s i s i n d i c a t et h a t c a r y o t y p e f o m m l ao f 脚 d r d 出v f 讲fi sk ( 2 n ) = 2 x = l 8 = 1 4 m ( 8 s a r ) + 4 s m k a r y o t y p ef o r n l u l ao fc 协捌臼c o 毋研6 0 j 口i sk ( 2 n ) = 2 x = 2 8 m ( 4 s a t ) 琊如叩门胂6 甜口i sm o r co r i g i n a lt 1 1 a f l 泖向d m 出v 砌f 5 t h er c a c t i o no fl e c t i n sw i t hr h i z o b i u r ni st h ep r e c o n d i t i o no f f o u n d i n gt h er e l a t i o n s h i po f s ”n b i o n i cn i t r o g e nf i x a t i o n s o m el e g u m i n o u st r e e sc a nr e c o g n i z er h i z o b i u mb u ts t i l lc a nn o t b en o d u l a t e d k e yw o r d s ：u n - n o d u l a l e dl e g i l m i n o u st r e e s ； n o d u l a t e d ；c h r o m o s o m en u m b c r ； k a r y o t y p e l e c t i n ：e p s ： 。 致谢 本文是在导师韩素芬教授的悉心指导下完成的! 从论文的选题、资料的 收集、实验材料的准备、实验技术的摸索以及论文写作最后定稿无不凝聚着 导师大量的心血! 三年来，导师严谨的治学态度，扎实的工作作风，献身科 学事业的崇高品质一直影响着学生的研究工作，也是我学习的楷模。师恩如 海，永志难忘! 感谢病理教研组的韩正敏教授、朱克恭教授、叶建仁教授、吴小芹教授、 樊奔老师。、谈家全博士后对本文的顺利完成自始至终给予了帮助和指导! 感谢植物组赵治芬老师，育种组徐进老师、显微镜室张雪英老师及本组 李玉琴老师都对本文的完成提供了无私帮助! 感谢吴均章博士、何月秋博士、王惠利硕士、张红娟硕士、金辉硕士等 难以一一列举的同窗好友都对本文的完成伸出过友谊之手。在论文的撰写过 程中特别得到了朱云峰硕士和陆燕硕士的鼎力相助。 值此论文完成之际，作者一并对给予我热情帮助和指导过的各位老师、 同学致以诚挚的谢意! 作者：殷爱华 2 0 0 4 年5 月于南京林业夫学 h 舌 作为构成生命物质蛋白质的基本元素之一的氮素，是植物生长必需的大量元素， 它广泛分布在自然界中。氮气占整个空气各种气体组成的8 0 左右。人类和一般植物对 丰富的氮气绝大部分却不能直接利用，自然界中，固氮微生物等能将空气中的氮气( n 2 ) 还原成氨( n h 3 ) ，为植物或微生物的生长发育提供氮源，这种现象被称为生物固氮 ( b i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o n ) 。农林业需要的氮绝大部分来自生物圃氮，而共生圃氮量约 占生物固氮量的五分之四，相当于当今全世界合成氨生产总量的三倍，在生物固氮中占有 重要的地位 2 】。而且主要的固氮共生体又是农业生产中的一类重要作物一豆科植物。生物 固氮不仅是生命科学研究中的重大课题，而且在农业中也具有重要的应用价值1 7 ”。 早在几千年前人类就知道豆科植物与非豆科植物轮作可以增产，豆科树种能促进与之 混交的其他树种的生长，都说明豆科植物可提高土壤肥力。这些作用都跟豆科植物与根瘤 菌共生结瘤固氮的特性密切相关。豆科植物通过与根瘤菌的共生固氮作用，才可以把空气 中的分子态氮变成植物可以利用的氨态氮。共生固氮在自然界氮素循环中有十分重要的作 用。共生固氮技术在退耕还林还草中的作用是其他技术无法替代的，有十分重要的地位【j j 。 生物固氮还可为农作物的生长发育提供充足的氮素肥料，提高农作物的产量，是大力发展 农业生产的必要条件之一。 在根瘤菌与豆科植物的共生固氮体系中，寄主可为固氮微生物提供能源和固氮酶作用 的适合环境，是生物固氮最有效的方式，其共生固氮量占整个生物固氯量的一半，因而一 直是生物固氮的研究的重点。共生固氮体系是生物界中最有效的固氮组合，固氮作用所需 要的能量来自宿主植物的光合作用，固氮产物直接为宿主的氮素营养，共生的两方面相互 有利、相互支持【4 1 。 多年来，国内外在对植物结瘤固氮的研究多集中于对能够结瘤的豆科植物和根瘤菌的 共生固氮的研究，从上个世纪二十年代开始的三十多年，在继续进行各种固氮生物的类型、 形态、分类的描述以及结瘤与固氮等方面的同时，生物固氮的研究逐渐深入到生理生化机 理方面 5 】。而到目前，对根瘤菌的研究更深入到根瘤菌与豆科植物共生体系的遗传和分予 生物学领域的研究，而对不能结瘤的豆科植物研究很少。 在自然界中对农、林和牧业生产有价值的共生固氮体系，仅限于少数微生物与有限的 豆科植物共生。研究扩大根瘤菌的共生寄主范围，使能在一些不结瘤的豆科种类或其它有 用植物上结瘤固氮：也有人试图将固氮基因导入高等植物细胞，创建能固氮的高等植物、 自给氮索营养的植物类型是非常有意义的【6 j 。 深入研究非结瘤豆科树种不能结瘤的原因具有重要的理论和实用价值，不仅可为不结 瘤豆科植物结瘤固氮提供理论依据，对扩大根瘤菌共生寄主范围等研究有一定的价值，对 豆科植物和根瘤菌共生固氮体系的协同进化研究也有重要意义。 本文研究豆科树种染色体数目之问的差异以及它们的凝集素分别对根瘤菌胞外多糖 凝集反应的差异，从这两个方面探讨非结瘤豆科树种不结瘤的原因。 第一章文献综述 1 豆科植物与根瘤菌的共生体系的研究 1 1 豆科树种结瘤调查概况 豆科( l e g u m i n o s a e ) 是被子植物中仅次于菊科和兰科的三个最大的科之一，分布极 为广泛，生长环境各式各样，无论平原、荒漠、高山、森林、草原直至水域，几乎都可见 到豆科植物的踪迹。本科具有重要的经济意义，它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜 的重要来源之一【7j 。一般来说根瘤菌只能与豆科植物建立起共生固氮体系，全世界的豆科 植物有近2 0 0 0 0 种，调查过结瘤情况的豆科植物中大部分能形成根瘤，故其固氮作用具有 重要的生态和农业经济意义。豆科包括苏木亚科( c 矗8 5 e 加加f o f 出卯) 、含羞草亚科 ( a 卉m o “招e ) 和蝶形花亚科( 尸印f f f o n o f 出p ) 三个亚科【8 】o 它们之间的结瘤率差异很大。 p 印f f f 0 f 出口p 和m 珊d s o f 虎口口中仅有少数种不结瘤，而c h 8 s 口慨h f o 胁p 中的多数种不结瘤。 据a l l e n ( 1 9 8 1 ) 的统计表明，全球豆科树种有9 2 0 0 1 0 3 2 1 种，含羞草亚科 ( 脚卅o s d 珧日p ) 2 2 0 6 2 6 0 0 种，蝶形花亚科( p 印f f 幻”o 砒d p ) 4 4 7 8 5 1 0 5 种，苏木亚科 ( c 口p s d 功f ”f d f c 跆口g ) 2 5 1 6 2 6 1 6 种，对结瘤状况已做过调查有2 3 7 5 种( 含羞草亚科3 8 8 种、 蝶形花亚科1 7 2 9 种、苏木亚科2 5 8 种) ，结瘤树种2 1 1 6 种( 含羞草亚科3 5 1 种，占调查 树种的9 0 5 ；蝶形花亚科种1 6 8 7 种，占调查树种的9 7 6 ；苏木亚科种7 2 种，占调查 树种的2 7 9 ) 一j 。韩素芬等( 1 9 9 0 ，1 9 9 5 ) 对我国豆科树种结瘤情况进行过统计，我国 豆科树种超过7 6 0 种，观察过结瘤的2 4 8 种，其中蝶形花亚科为1 4 6 种，结瘤的1 3 7 种( 占 9 3 8 ) ，不结瘤7 种( 占4 8 ) ，有争议的2 种( 占1 4 ) ，含羞草亚科4 7 种，结瘤的 4 2 种( 占8 9 3 ) ，不结瘤的3 种( 占6 4 ) ，有争议的2 种( 占4 2 ) ，苏木亚科5 5 种， 结瘤的5 种( 占9 1 ) ，不结瘤的4 3 种( 占7 8 2 ) ，有争议的7 种( 占1 2 7 ) 【1 0 l 【1 1 】。 黄维南( 2 0 0 1 ) 报道过结瘤状况的豆科树种中各亚科的结瘤树种占该亚科调查树种的百分 率依次为含羞草亚科8 8 4 9 1 2 ，蝶形花亚科9 8 。9 9 ，苏木亚科2 5 7 1 2 1 3 1 。 根据各种调查结果都表明不是所有豆科植物都能结瘤固氮，苏木亚科在三个亚科中是 最不易结瘤的，且从各种豆科树种结瘤状况的调查统计资料都说明苏木亚科树种绝大部分 不结瘤。尤其像皂荚属( g 比讲船蛔) 、肥皂荚属( 回删n o c 肠撕) 、紫荆属( g p 阳括) 等主要属几乎 没有发现有结瘤的种：此外，含羞草亚科的猴耳环( p f m 口c 8 ，f d 6 m mc ，炉p 甜f n ) 、孔雀豆 0 出胛口n f h e ，口p 口v o h 加、蝶形花亚科的国槐( 勋肋d m ，印彻f c 口) 、翅荚香槐( c 肠毋船咖 p 肠纱c n p 盘) 、马鞍树( ：l 妇口c 妇 印p p n s 括) 等也都不能结瘤固氮。 特立尼克( 1 9 7 3 ) 发现在榆科( 胁”d c p 口p ) 的p 甜聊n 胁属的一些种同豆科植物一 样能与根瘤菌形成共生根瘤，而榆科与其它双子叶植物一样同豆科植物的亲缘关系并不密 切，这也是唯一的例外【2 副【2 。 y 0 u n g 和j 0 1 1 i l s t o n ( 1 9 8 9 ) 【“j 认为c 臼p 期扫m f o 托抽e 与根瘤菌的共生作用是在豆科植物 进化过程中相对较晚的时期形成的较原始类群。含羞草亚科其次，蝶形花亚科进化程度较 高，草本又较木本进化，从结瘤情况也说明了这一点。靖元孝等【1 4 l 曾对广东地区c a s s i a 的6 种植物结瘤状况进行调查的结果也证实了这一观点，调查中仅山扁豆( c 朋f m o 胁曲 和圆叶决明( c 加f “n d 的f 枷有瘤，其余4 种植物一一槐叶决明( c p 矗。阳) 、望江南 ( c d c c j 如”幻f 捃) 、黄槐决明( c 删r 口地m 括) 、双荚决明( c 6 f c 印s “栅柳均无结瘤，其中圆叶决 明是一种半直立、多年生亚灌木状草本，山扁豆是一种一年生或多年生亚灌木状草本。而 4 种不结瘤植物均不是草本。这一结果与a l l e n 和a l l e n i ”l 、柏学亮等及w h i t t y m 】等对 c a s s i a 植物结瘤状况进行调查所得结果一致。草本是植物中较为进化的一种类型，乔木、 灌木则比较原始。豆科草本到目前为止，还没有不结瘤的报道，而木本中结瘤情况与进化 程度有一定相关性。尽管豆科植物的形态、习性和生态因其分布的广泛性而差异很大，但 根瘤菌却能使大多数豆科植物结瘤，说明豆科植物和根瘤菌的共生不是对特殊生态环境的 适应，而是依赖于豆科植物的某些极其复杂的遗传特性。 豆科植物这种结瘤固氮性能的差异，反映了豆科植物的异质性，也反映了它们各自的 进化程度。在根瘤菌方面，结瘤基因及其产物蛋白的活动是决定这种宿主特异性的主要因 剥1 8 】。从苏木亚科树种的结瘤固氮情况看，有一个明显的从不结瘤到结瘤的进化过程， 有些种需要在特定的条件下才能结瘤。在苏木亚科8 个族中，以真苏木族最难结瘤，而决 明属中结瘤的种最多。决明属中草本植物比较多，而草本是较为进化的一种类型植物，草 本植物比木本植物容易结瘤。 1 2 根瘤菌豆科植物共生体系 1 8 8 6 年德国学者赫尔利格尔( h h e l l r i e g e l ) 和惠尔法斯( h w i l 髓h ) 用砂培试 验证明豌豆只有在形成根瘤时才能固定空气中的氮素营养其后，荷兰细菌学家拜依林克 ( m w b e u e r i n c k ) 从根瘤中分离得根瘤菌纯培养；接着波兰学者柏拉兹莫夫斯基 ( a p r a z m o w s k i ) 用根瘤菌接种豆科植物，形成了根瘤，完成了对根瘤菌共生结瘤固氮 的论证。根瘤菌一豆科植物共生体系是自然界固氮效率最高，固氮量最多的一个生物固氮 体系。 1 2 1 根瘤菌的分类 近年来，根瘤菌分类无论从分类方法还是从分类系统上都得到了很大发展，经历了从 按互接种族分类到表观群和遗传群分类的转变和从单属向多属发展的过程。应用数量分 类、核酸杂交、1 6 s r n a 、r a p d 、p c r 、血清学反应等现代细菌分类方法进行系统研究， 表明根瘤菌科有明显的遗传分化。目前f 式建立的有五个属，即：根瘤菌属( r 扫d 6 f “埘) 、 慢生根瘤菌属( 胁撕拓d 6 m m ) 、中生根瘤菌属( 如j d 拍扫d 6 f “川) 、固氮根瘤菌属 ( 爿z o 砌洳6 f 删) 、中华根瘤菌属( 研h o 砌拓0 6 f “埘) 。 1 2 2 根瘤菌的结瘤基因 根瘤菌能与豆科植物形成特殊的共生体系，固定较大量的氮供植物生长。共生结瘤过 程中根瘤菌的结瘤基因的表达调控及寄主植物的黄酮类物质等起着关键性的作用【9 ”。 根瘤菌的结瘤基因( n o d ) 约有2 0 个，其表达产物共同合成了一个小分子化合物，称 结瘤因子( 是一类脂几丁寡糖，l i p o c h i t i 0 0 1 i g o s a c c h a r i d e ，l c o s ) ，使根毛卷曲直至豆科植 物形成根瘤。在众多的n o d 基因中，受黄酮类物质诱导的是结瘤基因中称为共同结瘤基因 ( c o m m o n 加d g e n e s ) 行d d a b c ，所有根瘤菌都具有这些基因；不同根瘤菌合成的结瘤因 子在结构上有差别，决定它们同植物识别的特异性。结瘤基因不是由植物黄酮物质直接诱 导而表达，只有在另一结瘤基因”o d d 的产物( n o d d ) 存在下才起作用。加d d 是结瘤的 调节基因。研究认为，所有的根瘤菌中n o d 基因的调控是相似的，它们的调控包含三个因 素：一是t m sa c t i n g 调节子n o dd 蛋白起的转录激活作用：二是n o d d 蛋白结合到存在 广泛的同源序列的启动子( 即n o db o x ) 上；三是豆科植物根分泌的植物信号分子如黄酮类 物质或具苯环的化合物激活n o d d 基因，n o d d 基因表达，产生n o d d 蛋白，n o d d 蛋 白激活”o d a ，b ，c 基因的转剥“j 。 1 2 3 根瘤菌和豆科植物共生关系的专一性 根瘤菌( r h i z o b i 啪) 是一类土壤微生物，能够侵入豆科植物，在其中繁殖，使豆科植 物形成根瘤并具有固氮能力。根瘤菌与豆科植物的共生关系是指豆科植物为根瘤菌提供 适宜的生活和固氮环境以及所需要的能源，而根瘤菌则在根瘤内进行有效的固氮反应， 并向植物提供氮素营养1 2 0 j ，这样就形成了互为有利的共生关系。根瘤就是根瘤菌与豆科 植物之间相互作用的结果。根瘤菌可根据其生长速度不同，分为快生型，如快生型大豆 根瘤菌、豌豆根瘤菌、三叶草根瘤菌、苜蓿根瘤菌、菜豆根瘤菌；慢生型如慢生型大豆 根瘤菌、羽扇豆根瘤菌等，但是生长快慢只是相对的，例如羽扁豆根瘤菌的生长比其他 慢生种类快，而苜蓿根瘤菌在快生型中又是生长缓慢的。根瘤菌的各个种又都只能感染 一定的豆科植物种类，它们的结瘤能力表现不同程度的专一性，即一种根瘤菌只能侵染 一定范围的豆科植物，产生根瘤。一般快生型的专一性较强，能够结瘤的宿主植物种类 有限，慢生型可结瘤植物范围则大得多。人们将这些能够相互利用同一种根瘤菌菌株形 成共同体系的豆科植物称为“互接种族( c r o s si n o c u l a t i o ng r o u p ) ”【2 l 】。常见的主要豆科 植物互接种族有大豆族、豌豆族、菜豆族、苜蓿族、三叶草族等，但有的根瘤菌的寄主 范围超出了原有的互接种族。快生型和慢生型根瘤菌的结瘤基因在基因组中的位置不同， 快生型根瘤菌的结瘤基因存在方式较复杂，随菌株不同而异，有些快生型根瘤菌的结瘤 基因簇位于巨型质粒上，有些则位于染色体上；而慢生型根瘤菌的结瘤基因簇则位于染 色体上【2 2 】。 1 2 4 根瘤的形成发育 豆科植物根瘤的形成发育过程可分为两类：一类是植物受到根瘤菌侵染时在根皮内形 成原基( p r i m o r d i a ) ，接着形成分生组织，最后突起形成根瘤，这样的根瘤叫做无限型根瘤 ( i n d e t e n n i n a t en o d u l e ) ；另一类相反，原基形成于根皮外部，产生的根瘤不含分生组织， 叫做有限型根瘤( d e t e n n i n a t en o d u l e ) 【1 9 。 4 一个典型的豆科植物根瘤发育过程是：根瘤菌与植物根系接触，宿主植物分泌的类黄 酮( n a v o n o i d s ) 和异类黄酮( i s o n a v o n o i d s ) 物质诱导根瘤菌产生分子结构特异的结瘤因 子，这是共生能否发生的前体条件。根瘤菌也正是以其细胞表面分子结构独特的多糖同 宿主植物根部的凝集素特异性结合的。根瘤菌识别和吸附到宿主根毛细胞上，根瘤菌一 般通过根毛侵染，根毛发生变形甚至卷曲，将根瘤菌包在其中并侵入根毛，同时，宿主 植物分泌新的细胞壁物质，包围侵入的根瘤菌，逐渐形成一条管状的侵入线，侵入线不 断伸长，到达根皮层细胞，根系的皮层细胞分裂，形成根瘤原基，并产生分枝，侵入线 向细胞内陷，并从先端的无壁小泡释放到细胞内，因而释放的菌体外仍被外膜，在含菌 细胞中菌体可继续分裂繁殖几次后，直至转化成类菌体，仍有周膜包围。类菌体具有将 n 2 还原成n h 3 的功能，为植物生长发育提供氮源【2 5 】。随着含菌细胞的不断扩大，最终发 育为成熟的根瘤，并固氮能力也随之增加。在正常情况下豌豆根瘤菌不能使三叶草形成 根瘤，但当三叶草导入豌豆凝聚素基因后，三叶草能与豌豆根瘤菌共生产生根瘤，此结 果从侧面支持了凝聚素特异性识别的假设。 最新研究表明：豆科植物和根瘤菌共生初期的识别过程是一种相互间的分子对话， 豆科宿主植物的根分泌物诱导根瘤菌基因( n o d ) 活化而产生称为结瘤因子( n o df a c t o r s 简称n f s ) 的信号分子。由n f s 结瘤因子处理的宿主植物，其根毛形变以及表皮、皮层 和中柱均表现出相应的表型变化，纯化的n f s 是一类脂几丁质寡糖( l i p o c h i t i n o l i g o s s a c h a r i d s 简称l c o s ) ( l e r o u g ep e ta l ，1 9 9 0 ) 州，高浓度的纯化的n f s 可以诱导豆 科宿主植物形成根瘤，但为空瘤，没有固氮活性。 总之，生物固氮研究目前所面临的提高固氮效率；构建新的固氮物种，以及根瘤菌 向非豆科植物扩建共生固氮体系等问题，最终目的是使农、林和牧等植物能自动向大气 摄取氮素养料，但这里面尚有很复杂的机理需要深入的探索1 2 ”。 2 染色体核型与豆科植物根瘤菌共生体系关系的研究 2 1 染色体的发现 地球上的生物按其细胞内有无细胞核结构，可分真核生物和原核生物两大类，前者 为具有细胞核结构的生物，如牡丹、芍药等：后者为不具有细胞核结构的生物，如细菌、 发菜、念珠藻和蓝藻等睇】。真核生物的细胞在细胞有丝分裂的中期和后期，有一种可被 碱性染料可染色的棒状或杆状的小体，称之为染色体【2 ”。染色体是生物细胞核中最重要 的组成部分，几乎在所有真核生物细胞中都有染色体的存在。它的结构直至1 9 5 4 年才由 w 缸s o n 与c r i c k 揭示与世，他们描述组成染色体的重要遗传物质d n a 是一种双螺旋结构 的模型。 1 9 世纪中叶，细胞生物学家首先在光学显微镜下看到了细胞这个生命的基本单位， 它们不但记录了真核细胞分裂的全过程，发现了细胞质与细胞核之间的界限，还在细胞 分裂时观察到存在于细胞核中的棒状可染色结构并将其命名为染色体。一般说来，只有 在细胞有丝分裂过程中，人们才能在光学显微镜下观察这些结构【2 。 早在1 8 4 8 年植物学家h o 劬e i s e r 在研究紫鸭砣草的花粉母细胞的时候，就描绘了细 胞核中染色体的图形。四十年之后( 1 8 8 8 ) w a l d e v e r 才把这种结构定为染色体 ( c h r o m o s o m e ) 。由于发现真核细胞的绝大部分d n a 都集中在染色体中，所以认为染色 体是细胞中最重要的遗传结构，因而自上世纪以来对染色体的结构与功能的研究一直是 细胞学、遗传学的重大课题。特别是1 9 7 3 年后，由于引用了生物化学物理学的新方法， 对染色体的超微结构的研究有新的突破，确立了染色质基本结构单位( 或称染色质的亚 单位) 的核粒模型，在此基础上对从染色体的动态变化也提出了一些模型口。 2 2 染色体的性质 染色体的主要成分是核蛋白、微量脂类以及k 、c a 离子所组成，而核蛋白主要是由 d n a ( 脱氧核糖核酸) 、r n a ( 核糖核酸) 、组蛋白和非组蛋白构成，因此它是重要的遗 传物质，更具体讲，染色体是决定生物个体性状的基因的载体，遗传单位基因是d n a 分子上一卜有效应的区段，基因又控制着生物性状和发育。染色体是基因的载体，基因 决定生物的性状，一定的性状则适应特定的环境。染色体对生物繁衍后代，延续种族起 着重要的作用【9 2 l 。 染色体位于真核细胞的核仁内，是极细微的线性构造，因为它控制了生命遗传，所 以人们又称之为“生命之线”。当细胞分裂时，每一条染色体都复制生成一条与母链完全 一样的子链，形成同源染色体对。而在细胞生活周期中占较长时间的分裂间期，染色体 以较细且松散的染色质形式存在于细胞核中，非分裂期的细胞核经低渗处理、溶胀破裂 后释放出染色质，在电子显微镜下呈纤维状的长丝，包括有d n a 双螺旋及部分蛋白质【j ”。 由于亲代能够将自己的遗传物质d n a 以染色体的形式传给予代，保持了物种的稳定 性和连续性，因此，人们普遍认为染色体在遗传上起着主要作用。同一物种内每条染色 体所带d n a 的量是一定的，每条染色体中的d n a 都是一条相当长的大分子，其中包含 大量基因的遗传密码，构成众多基因的一个连锁群1 3 。但不同染色体或不同物种之间变 化很大，从上百万到几亿个核甘酸不等。人的x 染色体就带有1 2 8 亿个核甘酸对，而y 染色体只带有0 1 9 亿个核甘酸对。此外，组成染色体的蛋白质( 组蛋白核非组蛋白) 种 类和含量也是十分稳定的。由于细胞内的d n a 主要在染色体上，可以说遗传物质的主要 载体是染色体【3 ”。因而对每一物种来说具有遗传的稳定性，但不同物种之间有明显差异。 2 3 植物染色体的变异 生命从诞生开始，在经历了复杂的进化历程之后，才形成了现在丰富多彩的生物世 界。在这一进化过程中，作为遗传物质的载体染色体也发生了相应的进化。并且， 核型的进化反映了生物的进化过程及各物种的亲缘关系。植物是出细胞组成的，而染色 体集中位于细胞核上，因此，对植物的核型进行分析将有助于对植物系统进化的认识。 在生物的进化过程中，物种形成是非常关键的一步。现代达尔文主义认为：生物进化的方 式有两种，是渐进式物种形成，即原来的种经过突变与选择，逐渐积累变异，首先形 成地理族和生态族，然后分化成独立的新种。而还有少数学者认为种间进化不同于种内 进化，新种形成是通过跃进式的染色体畸变和重组，而不是由于染色体和基因的细微变 异的积累。据估计，种子植物中有3 0 是多倍体。一些植物的二倍体在冰川时期以前就 已经存在，而多倍体则是在冰川时期以后才发现的，所以可以说植物界的多倍体生物是 由相应的二倍体生物进化而来的1 3 3 】。 染色体数的变异可以导致遗传性状的变异，而植物染色体数目的变异有二种情况：一 是染色体数目成倍地增加或减少，形成同( 异) 源多倍体或单倍体；二是染色体数比正常 合子染色体数多或少一条以至若干条染色体，形成非整倍体【3 4 】。 植物的生长发育和环境条件密切相关。青藏高原上高山冰缘地带在第四纪末次冰期曾 多次受到冰川作用，如今仍处在冰雪影响和作用之下，在地表下有永久冻土，地面寒冷， 高海拔，低气压，长日照，强紫外线辐射，温度瞬息或昼夜骤变以及土壤频繁的融、冻作 用。这些严酷而不稳定的生态因子对该地区植物染色体变异和进化、多倍体产生以及新的 物种形成必然产生巨大影响。黄荣福( 1 9 9 6 ) 对青藏高原东北部高山冰缘地区和相邻低海拔 地区5 9 种多年生草本被子植物进行了染色体计数，结果表明：多年生草本被子植物多倍 体频率随海拔高度上升而增加。海拔2 0 0 0 3 0 0 0 米，多倍体频率为2 9 4 4 7 1 ：3 0 0 0 3 8 0 0 米，多倍体频率为3 3 3 5 3 3 ；4 0 0 0 一5 2 0 0 米以上的高山冰缘地区，多倍体 频率达5 5 6 7 0 4 1 35 1 。 自然形成多倍体和非整倍体往往具有很大的偶然性，而人工创造则是主要方法和手 段，经过人们的不懈努力，在各种农作物上已得到了很多多倍体和非整倍体，不仅可用来 进行遗传分析，合成新的物种，而且也是很好的种质资源，为作物遗传育种、新品种培育， 打下物质基础，发挥着重要作用口钔。在各种人工创造多倍体的方法中，以秋水仙素处理 的效果最好。秋水仙素作用机理是：它能抑制或破坏细胞有丝分裂过程中纺锤丝的形成， 因而使染色子体不能向两极散开，同时初生壁的发育也被抑制，结果染色体分裂了，而细 胞并没有分裂，形成多倍体细胞，由多倍体细胞长成的组织变成了多倍体植株【3 4 1 。 在一定的生态环境中，植物的染色体数目往往是恒定的，喜光植物染色体数目的变异 程度小于喜阴植物。在干旱环境中生长的植物由于长期受到干旱的胁迫，导致染色体数目 的变异程度较大，使之更能适应恶劣的环境，说明植物能在染色体水平上适应生态环境。 从染色体数目变异程度看，草本最高，藤本次之。分布的广泛性、生境的异质性为草本植 物染色体变异创造了外部条件，而有效的克隆繁殖则有利于保存种群中发生的染色体变异 【3 6 】。 植物的染色体资料对于系统分类及进化的研究是十分重要的。我国近2 0 年来在这方 面的研究进展甚快，每年有大量的植物种的染色体数和核型得到报道，这些资料大多集中 在一些广为栽培的植物或分类地位较重要的科属，而较少对地区植物作系统的细胞学研 究。我国的植物区系十分古老，区系成分非常复杂，对于某些古老植物区系的成分作细胞 学的研究将有助于了解有关类群的起源、甚或可能为整个区系的历史和发展过程提供证据 ( 3 ” 虽然在一定的生境中，植物的染色体是恒定的，但是大尺度的生境异质性往往导致染 色体水平的变异，从而增加了物种的遗传多样性。由于一个物种的稳定性和进化潜力依赖 其遗传多样性，因此保护遗传多样性成为生物多样性保护的最终目的1 3 8 1 。 2 4 豆科植物染色体数目研究 豆科植物的染色体数目是多种多样的，豆科植物按思格勒( 1 9 6 4 ) 【3 9 】的系统分为3 个亚 科，在我国已研究过的9 8 种豆科植物中，其配子内染色体基数是多样的，有n - 5 一1 2 ， 1 4 ，2 0 ，2 1 等。在已报道的3 3 属豆科植物中，配子中染色体数为7 的9 属，为8 的5 属， 为6 的3 属，为1 2 的3 属，为1 0 的6 属，为1 1 的7 属，为9 ，1 4 ，1 5 ，2 1 和2 0 的各1 属，根据原始性状的普遍性原则【8 6 】，豆科的原始染色体基数通常被认为x = 7 。其演化是沿 着数目升高和降低，沿着多倍体化和非整倍化的途径进化的。特别是蝶形花亚科不仅有几 个族是多倍体起源的，而且次生多倍化较多如染料木属g e n i s t a 中7 5 的是多倍体种， 羽扁豆属l u p i n u s 中9 5 ；金雀儿属c y t i s u s 中8 5 以上。据目前资料，在豆科的蝶形花 亚科中有5 5 属中已知有种内多倍化。而在其它两亚科中次生多倍体不常见：这从染色体 数目变化角度支持了形态分类上将蝶形花亚科作为三亚科中最进化类群的观点。这与洪德 元【8 7 】分析的蔷薇亚纲r o s i d a e 的原始基数一致，也符合r o v e n ( 1 9 7 5 ) 【4 0 l 对植物界植物全面 分析比较得出的被子植物的原始基数是x 一7 。 在各分类系统中，几乎都认为豆科与蔷薇科俾础日c p p ) 特别是梅亚科俨r 姗d f 如口g ) 近 缘，而该亚科的类群中很多基数是为x = 7 【4 2 l 的。而x = 1 4 ，2 l 为其多倍体起源，x = 5 ，6 和8 ，9 的为其非整倍体化进化：至于x = 1 0 ，1 1 ，1 2 和2 0 则为多倍体化后再经非整倍化 的结果。这样，豆科植物的进化途径是以x = 7 为基数，向两个方向发展进化，一个是向 着染色体基数降低，另一个是向染色体基数升高发展。这样n - x = 5 、6 是通过原始祖先的 非整倍体化的演化而成的。n = x = 1 0 、1 l 的种类，如g o l d b l a u ( 1 9 5 0 ) 和l e w i s ( 1 9 5 0 ) 对双子 叶植物的多倍比例作了全面的讨论，认为染色体数目超过n = 1 0 的种在起源上是多倍性的， n - 1 1 则更肯定是多倍体起源的。豆科下的3 个亚科中，从外部形态上，以苏木亚科 ( c 日p 册加f 加f 0 ，胁口p ) 最原始，含羞草亚科( 埘m d s o 缸如胛) 次之，而蝶形花亚科 ( p 印f f f d 胁口p ) 最进化。这3 个亚科的染色体基数的起源大致是：含羞草亚科中以x = 1 2 和1 4 常见，显然它是由早期x = 7 的祖先加倍后演化而来的，朱缨花属( o f f 抽n 卉口) 中的 x = 8 是由x = 7 的祖先非整倍化起源，或者是下降的非整倍化的结果。苏木亚科一条演化途 径为x 一7 ，是原始基数，而另一条是x = 1 4 和1 2 ，都是多倍体后的演化一。 从进化角度来看，物种形成和进化的机制可以是基因的( 基因突变) ，也可以是染色 体的( 染色体畸变) ，更有两种因素交织在一起的。染色体结构上相差的细胞型之间或非整 倍性变异的细胞型之间交配产生的杂种中，可以观察到配对不正常，从而造成可育性的降 低。因此可以说，细胞型变异作为隔离机制，为进一步分化提供了条件，是物种形成和进 化的开端。经自然选择之后，新的物种就开始产生，同时，属内或种内的细胞型发生分化 的类群是较进化的类群，因为它已在染色体水平发生了分化：相反，细胞型单一、恒定的 类群则是比较保守或原始的类群【9 。 宿主植物决定了入侵的方式和机制的类型，不同种的根瘤菌能以相同的机制入侵豆 科植物。同样，根瘤的结构和发育特征的特异性也取决于植物而不是根瘤菌。表明宿主 植物具有共生侵染和结瘤的遗传信息，细菌的作用是开启植物的发育程序。 2 5 染色体核型分析进展 染色体核型分析对细胞遗传学、育种学、分类学、起源和进化等学科的研究有着重 要的意义。 生命从诞生开始，在经历了复杂的进化历程之后，才形成了现在丰富多彩的生物世界。 在这一进化过程中，作为遗传物质的载体一染色体也发生了相应的进化。并且，核型的 进化反映了生物的进化过程及各物种的亲缘关系。因此，对植物的核型进行分析将有助 于对植物系统进化的认识【j “。 我国豆科植物细胞型分化存在以下3 种类型：种内多倍性的细胞型：染色体结构 差异的细胞型，这种细胞型表现为染色体形态一卜的差异和带型上的差异包括核型类型的 差异，这种细胞型在豆科的种问广为存在，在种内也有。非整倍性变异的细胞型，这种 细胞型在其它植物中并不普遍，但在豆科植物中却不少， 目前国内核型分析仍按李懋学等的标准【43 1 ，核型不对称性按s t e b b i n s 的分类标准【“j ( 见表1 - 1 ) ，s t e b b i n s 按核型中最长染色体与最短染色体之比及臂比大于2 的染色体在 染色体组中所占的比例，把核型的不对称性程度分为”4 a 一4 c “1 2 个等级。 表1 1s t e b b i n s 核型分类标准 每条染色体的相对长度= 染色体长度全组染色体总长度1 0 0 臂比值= 长臂( l ) 短臂( s ) 根据染色体的相对长度、臂比值、随体或次缢痕的有无和位置，进行同