（环境科学专业论文）水消毒副产物三氯甲烷及金属离子与蛋白质的作用研究.pdf

水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 质作用的影响，结果表明，随三氯甲烷浓度的增大，金属离子和牛血清 白蛋白的结合常数降低，特别是三氯甲烷对低浓度金属离子与牛血清白 蛋白的结合影响显著。相反，三氯甲烷对金属离子与人血丙种球蛋白的 结合影响较小，这也证明了三氯甲烷与人血丙种球蛋白作用较弱。 关键词：三氯甲烷；牛血清白蛋白；人血丙种球蛋白；金属离子；荧光 光谱 英文摘要 a b s t r a c t t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c h l o r o f o r i l l ( c h c l 3 ) a n d b i o m a c r o m o l e c u l e s - - p r o t e i n s ，b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( b s a ) ，g a m m a s e r o g l o b u l i n u mh u m a n u m ( g s h ) ，a n d t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h c l 3a n d t r y p t o p h a n ( t r p ) a n dt y r o s i n e ( t y r ) w e r es t u d i e du s i n gf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y i n t h i s p a p e r t h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fb s ai n d u c e db yc h c l 3f o l l o w ss t a t i cq u e n c h i n g p r o c e d u r e ，a n dt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fg s ha n dt r pi n d u c e db y c h c l 3m a y b ef o l l o ws t a t i cq u e n c h i n gp r o c e d u r eb u ts t i l ln e e d sf u r t h e rs t u d y t h eb i n d i n gc o n s t a n tb e t w e e nc h c l 3a n db s ai sf a rg r e a t e rt h a nt h a t b e t w e e nc h c l 3a n dg s h ，p o s s i b l yc a u s e db yd i f f e r e n c e si nt h es t r u c t u r eo f t h et w op r o t e i n s t ob e t t e ru n d e r s t a n dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h c l 3a n dp r o t e i n su n d e r t h ei n f l u e n c e so fm e t a li o n se x i s t e di nb l o o do ri nd r i n k i n gw a t e r , t h i sa r t i c l e a l s os t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nm e t a li o n s ( c u 2 + 、f e 3 + ? a n db s a ，g s h ， a n dt r p r e s u l t ss h o w e dt h a ta tl e a s tt w ot y p e so fb i n d i n gp o s i t i o ne x i s t b e t w e e nc u ”a n db s a t h ef i r s tb i n d i n gp o s i t i o ni sn o tb i d e dd i r e c t l yt o t r pi nt h ep r o t e i na n di t sb i n d i n gc o n s t a n ti ss m a l l e rt h a nt h a to ft h es e c o n d t h es e c o n db i n d i n gp o s i t i o n ，s i m i l a rt of e ”，i sb i d e dd i r e c t l yt ot r pi nt h e p r o t e i n b a s e do nc a l c u l a t i o n ，t h er e s u l th a sb e e no b t a i n e dt h a tt h eb i n d i n g c o n s t a n t so f c u 2 + t ot h e s et w op r o t e i n sa r es m a l l e rt h a nt h a to fm ef e 3 + ，w h i l e t ot h eo p p o s i t e ，t h eb i n d i n gc o n s t a n to fc u 2 + t ot r pi sl a r g e rt h a nt h a to ft h e f e 3 + t h e t e m a r y i n t e r a c t i o no fm e t a l i o n s - p r o t e i n s c h c l 3 w a sa l s o d e t e r m i n e di nt h i sa r t i c l e r e s u l t ss h o w e dt h a tm e t a li o n ss l i g h t l yr e d u c et h e b i n d i n gc o n s t a n tb e t w e e nc h c l 3a n db s a w h i l es t r o n g l yc o m p e t ea g a i n s to r d i s p l a c ec h c l 3t oc o m b i n ew i t hg s h t h eb i n d i n gc o n s t a n t sb e t w e e n m e t a li o n sa n db s aa r ed e c r e a s e dw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fc h c l 3i s i n c r e a s e de s p e c i a l l yw h e nm e t a li o n sc o n c e n t r a t i o n sa r el o w o nt h eo t h e r h a n d ，t h ei n f l u e n c eo fc h c l 3o nt h eb i n d i n gc o n s t a n tb e t w e e nm e t a li o n sa n d 3 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 g s hi ss m a l l ，w h i c hf u r t h e rp r o v e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nc h c l 3a n d g s hi sw e a k e rt h a nt h a tb e t w e e nc h c l 3a n db s a k e y w o r d s ： c h l o r o f o r m ；b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( b s a ) ；g a m m a s e r o g l o b u l i n u mh u m a n u m ( a s h ) ；m e t a li o n s ( c u 2 + 、f e 3 + ) ；f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y 4 第一章综述 第一章综述 1 1 水消毒副产物概述 1 1 1 水消毒副产物的产生 饮用水的净化技术是保障人们饮水卫生和安全的重要手段，它是人类在水源污 染及由此引起的疾病所做的长期斗争中产生的，并随着水源水污染及由此引起的疾 病的变化而不断发展和完善的。十九世纪，欧美一些城市由于排出的污水、粪便和 垃圾等使地下水和地表水受到污染，造成藿乱、痢疾、伤寒等传染疾病的多次大规 模爆发和蔓延，夺去成千上万人的生命。这些惨痛的教训，促进了饮用水去除和消 灭细菌技术的发展，其代表性的工艺流程是混凝沉淀一沙滤一投氯消毒。该工艺起 到了去除浊度和水传染病菌的良好效果。自二十世纪初开始推广氯化消毒后介水传 播的肠道传染病逐渐下降，卫生效益非常显著。 由于氯化消毒具有成本低、货源充足，投加设备简单、运行方便、杀菌效果显 著且能在管网中保持持续性杀菌能力等优点，一直被国内外各自来水厂广泛使用。 但是氯化消毒在消除微生物污染的同时，也产生了大量的消毒副产物( d i s i n f e c t i o n b y - p r o d u c t s ，d b p 。) 。早在1 9 7 4 年，r o o k 等人发现莱因河水氯化消毒过程中氯与原 水中有机物生成三卤甲烷( t 删。，其形态主要包括c h c i 。、c h b r c i 。、c h b r 。c 1 、c h b r 。) 等系列氯化消毒副产物( c h l o r i n a t i o nb y p r o d u c t s ，c b p ；) 。1 ，同年美国环保局对 新奥尔良市洛尔顿水厂进行测试和分析，结果在出水水中检测出6 6 中微量有机物， 其中有机卤化物含量最高。随后美国环保局又对美国8 0 多个主要城市的各种不同水 源的原水及经过不同流程处理的自来水的出水中的有机物进行调查研究，证明自来 水中广泛存在三卤甲烷( t h m s ) ，检出的t i n 。浓度高达7 8 4 l ，而且是在氯化过程 中形成的。k r a s n e r 等人1 9 8 9 年对美国3 5 个主要水厂中氯化消毒副产物进行全面 详细的调查，发现氯化消毒副产物中三卤甲烷所占比例最大，卤代乙酸次之，此外 还检测出卤代乙腈、卤代酮及卤酚等多种难挥发性的有机卤代物。1 。在其他的调查 研究中，从各种自来水中检测的有机化合物多达7 0 0 多中，其中有些是致癌的或被 怀疑致癌的。根据英国、美国、荷兰的一些流行病学的调查研究，皆证明了长期饮 用含多种微量污染物( 尤其是致癌、致畸、致突变污染物) 水的居民其消化道癌症 死亡率明显高于饮用洁净水对照组的居民。由于水与人类的生存息息相关，因此对 水中d b p 的研究逐渐成为热门研究领域。 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 1 1 2 水消毒副产物的形成机理”1 水源水中存在着大量的天然有机化合物( n a t u r a lo r g a n i cm a t t e r ，n o m ) 。这 些天然有机化合物是动植物在自然循环过程中经腐烂分解产生的，主要包括腐殖质、 蛋白质、脂肪、多糖等。腐殖质作为天然胶体具有大量的官能团和吸附位，如羟基、 羧基、酚羟基、烯醇羟基、醌、羟基醌、内酯、醚醇羟基等。它们对各种阳离子或 基团存在着较强的吸附能力或结合反应能力，尤其对一些极性化合物或极性基团在 水环境中的行为产生重要影响。因此水中大分子天然有机物( n o m ) 不仅是造成色度、 异臭味、配水管腐蚀和沉淀物的原因物质，也是目前常规氯化消毒副产物的前体物。 另外，其它的小分子有机化合物如酚类化合物、苯胺、苯醌、1 ，3 一环己二酮、藻类 及其代谢物、蛋白质、酶、氨基酸等也是氯化消毒副产物的前体。 常规的混凝沉淀一沙滤一投氯消毒以除去水中浊度、悬浮物、胶体、色度、病 原菌为目的，而它对水中有机物特别是溶解性有机物不能有效去除。国内外的试验 研究和实际生产结果表明受污染水源水经混凝、沉淀及过滤工艺只能去除水中有机 物的2 0 一3 0 ，用增加混凝剂的量来改善处理效果不仅使处理成本上升而且可能使 水中金离子含量增加，也不利于居民的身体健康。地面水普遍存在的氨氮问题用常 规方法也不能有效去除，因此产生大量的消毒副产物。 以下是一个一般公式用来描述t h m s 和其它卤仿d b p s 的形成“1 ： c 12 + h 2 0 = h o c i + h c i h o c i + b r 一+ n o m t 删。+ 其他卤仿d b p 。 对形成挥发性卤代烃有贡献的官能团是有机物中的羰基、羟基、酯基和羧酸官 能团。当氯气通入水中时生成的c 1 + 既是中等强度的氧化剂也是一类亲电加成剂。当 醛酮等发生烯醇式互变异构后，与c l + 发生亲电加成反应最终被水解产生卤仿。 1 1 3 水消毒副产物的种类“： 在出水中确定的主要的卤代毒副产物如下： ( 1 ) 三卤甲烷( t h m 。) ，包括氯仿，一溴二氯甲烷，二溴一氯甲烷、溴仿； ( 2 ) 卤代乙酸( h a a 。) ，包括一氯乙酸、二氯乙酸三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙 酸、三溴乙酸、一溴二氯乙酸、一溴一氯乙酸、二溴一氯乙酸； ( 3 ) 卤代乙腈( h a b 。) 包括二氯乙腈、三氯乙腈、三溴乙腈、一溴一氯乙腈； ( 4 ) 卤化腈( x e n ) ，包括氯化腈、溴化腈； ( 5 ) 卤代苦碱，包括氯化苦味碱、溴化苦味碱； ( 6 ) 卤代乙醛，包括二氯乙醛、三氯乙醛； 2 第一章综述 ( 7 ) 卤代酚 ( 8 ) 卤代酮 ( 9 ) 卤硝基甲烷类，包括三氯硝基甲烷、三溴硝基甲烷； ( 1 0 ) 其它，包括m x3 一氯一4 一二氯甲基一5 羟基一2 ( 5 h ) 呋喃酮 1 1 4 水消毒副产物的毒害作用 ( 1 ) 致癌作用 美国环保局在全国范围的饮水检测中，发现氯消毒的饮水中普遍存在卤代烃 类，在被检测的2 2 9 种化合物中有1 1 1 种卤代有机物，占3 8 。在这类卤代有机物 中，以氯仿、溴仿、一溴二氯甲烷，二溴一氯甲烷、四氯化碳、1 ，2 - 二氯乙烷以及 某些高分子有机卤代物的致癌作用最为显著。据美国、日本、加拿大、挪威、芬兰 等国的研究，在有机卤化物含量较高的饮水区域，其胃癌、肝癌、膀胱癌等发病率 明显增高；国内也有这方面的报道，动物试验也证明饮用含这类物质的水甚至比皮 下注射更易引起肝癌”1 ”。 ( 2 ) 致突变作用 哈尔滨医科大学公共卫生学院甘卉芳等人对哈尔滨松花江水及氯化消毒的饮用 水进行大量的致突变性研究，发现原水及饮用水都具有肯定的诱变性，而且氯化消 毒后的饮用水比原水的致突变性明显增强，含有的致突变物主要是不需肝微粒体酶 活化的直接致突变物，致突变物的类型既有移码型又有碱基置换型的m 】。黄君礼等人 对氯化消毒水的致突变性进行了详细的研究，表1 为氯化消毒饮用水中8 种典型的 有机卤代物的致突变类性及性归纳。从表中可以看出，除一氯乙酸和三氯乙酸无致 突变作用外，其余6 种化合物均具有较强的致突变作用，其中三卤甲烷( c h c l 3 、 c h b r c l 2 、c h b r z c l 、c h b r 3 ) 均为移码型直接致突变物，除c h b r 3 外，c h c l 3 、c h b r c l 2 、 c h b r 2 c i 还是碱基置换型直接诱变物。c h c l 3 、c h b r 3 的代谢产物也出现较强的致突 变性。6 种有机卤代物的致突变活性顺序为c h c l 2 b r 、c h c l b r 2 c h b r 3 、c h c l 3 一 c 6 h 3 c 1 2 0 h c c l 3 c h ( o h ) 2 1 1 。1 ”。 ( 3 ) 内分泌干扰作用 水消毒副产物还具有内分泌干扰作用，科学家们已经认定的5 0 多种可影响内 分泌的化学物质，其中约有一半是氯化物，这些物质在水中浓度虽然很低，但由于 其与结构与生物激素非常相似，人或动物在不知不觉中摄入这些物质时会破坏生物 激素平衡，导致发育和生殖功能异常“。 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 表1 氯化消毒饮用水中8 种典型的有机卤代物的致突变类性及性归纳 直接诱变剂( - s 。)间接诱变剂( 十s 。) 样品名称 移码型碱基置换型移码型碱基置换型 c h c i 。是( + + )是( + + )是( + + ) 不是( 十) c h b r 3是( + + )不是是( 十十) c h c i 。b r是( + + + )是( h + ) c h c i b r 2是( + + + )是( + + + ) c c i 。c h ( o h ) 。不是是( + )不是是( + ) c h 。c i c o o h不是不是不是不是( + + ) c c l c o o h不是不是不是不是 c 。h ，c i ：0 h不是不是不是是( + + ) 1 2 国内外关于水消毒副产物的研究进展 由于水消毒副产物的研究尚处于起步阶段，报道很不系统，迄今国内外有关该方 面的研究主要集中于以下几方面的研究。 1 2 i 饮水氯化消毒副产物的毒性研究 目前，氯化消毒副产物的毒性研究主要采用a m e s 试验、微核试验( 洲) 、姊妹 染色体交换试验( s c e ) 和彗星试验等毒理学方法，从原核细胞、真核细胞、及动物 整体等水平进行饮水氯化消毒及其副产物的毒性研究。对饮水中监测到的主要副产物 涉及单个副产物的遗传损伤、致癌效应、作用靶器官及其作用机理等领域”“2 ”。有研 究者认为采用m n 、s c e 等研究饮水致突变性具有更高的敏感性。其中s c e 试验方法 简便、致突变性、致癌性高度相关，值得在该领域推广。 a m e s 试验比较饮水氯化消毒前后浓集物的致突变性证实：加氯消毒导致饮水致 突变性显著增加氯化烷基类化合物对d n a 的损伤作用强于氯乙酸类，且随含氯原子 数目增加而增强；溴化卤乙酸的d n a 致突活性比二氯乙酸和三氯乙酸强，能增强卤乙 酸的致癌作用“”“。 动物试验证实许多d b p 。致癌作用，它们的致癌部位及机理不同，且存在种类、性 别差异。氯仿通过其细胞毒性经管饲或者是空气途径暴露可诱导小鼠的肝和肾肿瘤产 生；在大鼠中三溴甲烷和二溴氯甲烷的致癌靶器官分别是肠、肝，而一溴二氯甲烷可 同时诱导肠和肾肿瘤的发生；但两者诱导肝肿瘤的发生有不同机理。m x ，3 一氯一4 一二氯 甲基一5 羟基一2 ( 5 h ) 一呋喃酮是直接致癌物，大鼠的肝和甲状腺是其作用的靶器官。“。 第章综述 1 _ 2 2 水消毒副产物生成的影响及控制研究 根据资料报道，目前水消毒副产物生成的影响因素主要有： ( 1 ) 前驱物浓度的影响 r e c k h o w 等人发现d b p s 的形成随n o m 中活性芳香族化合物的量增加而增加。1 。 黄小东等人研究表明，随着水中n o m 含量增加，氯化反应需氯量也相应增加，三氯 甲烷生成量也增加，三氯甲烷生成量与腐殖酸浓度呈良好的线性关系。“。 ( 2 ) 加氯量与氯化反应时间的影响 邵素萍等人对黄河水加氯消毒副产物作了全面探讨，认为当水体中有机物浓度 一定时，三氯甲烷生成量与游离氯的含量有关，加氯量越大，三氯甲烷生成量越大。 研究还明，加氯量一定时，氯化反应时间越长，三氯甲烷生成量越高“。 ( 3 ) p h 的影响。“2 ” 国内外资料都表明三氯甲烷在中性和碱性条件下的生成量比酸性条件下要高 2 3 】 o ( 4 ) 温度的影响 监测结果显示t h m 。的含量夏季最高，可能与温度有关 ( 5 ) 共存物的影响 研究表明t h m s 各组分生成量随溴离子浓度的增加而增加，当原水中同时含有n h 。+ 和b r 一时，c l 先与氨反应生成氯胺；当c l 浓度较低时，只有少量的三氯甲烷生成， 而无含b r 的t h m 。生成”。 关于控制d b p s 的生成的研究主要集中于对影响因素的控制，如降低原水中的有 机物、改进氯化消毒程序以及降低或消除已经生成的d b p 、改变p h 值等。为避免饮 水氯化消毒及其副产物对健康的潜在威胁，对许多取代氯消毒的方法及消毒剂进行 了大量的研究如臭氧、紫外线、超滤等物理方法和二氧化氯、氯胺等的应用，但由 于操作程序复杂、费用高以及对健康存在的潜在威胁评价不充分等原因，难以广泛 应用。”1 。 1 2 3 流行病学的调查研究 自氯化消毒饮水中发现三卤甲烷后，各国各地区进行了大量的流行病学研究， 但主要采用病历对照、历史队列研究和生态学等流行病学研究方法集中于评价d b p 与肿瘤的关系，但结论不全一致。1 9 9 1 年，国际肿瘤研究机构研究报告显示死亡率 与氯化消毒及其副产物具有强而稳定联系的癌有直肠癌、结肠癌、膀胱癌，其它如 胃、脑、肺、肝的癌症死亡率也与d b p 有关。但一项历史性队列研究随访癌症发病 5 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 率与死亡率，未发现任何器官的发病率与死亡率随氯化消毒而明显增加。生态流行 病学研究发现，饮水氯化消毒增加直肠癌、结肠癌发病的危险性，使两者发病率增 加2 0 4 0 ，但一病历对照研究提示，直肠癌与饮水氯化消毒无关，仅结肠癌与此 有较强的相关。还有病历对照研究提示氯化消毒及其副产物对生殖发育存在影响， 流产、早产及低体重儿、出生缺陷如神经管缺陷、先天性心脏病、泌尿系统畸形、 头部缺陷等与此有关。4 。”。 i 2 4 水消毒副产物的分离及监测手段的研究” 饮水中的d b p s 具有含量低、成分复杂等特点，所以样品的采集及前处理非常关 键。通常用的方法有液液提取法、液固吸附法、固相萃取法、顶空一固相微萃取法 等。m a r t i n e z 等用固相萃取、g c m s 法测定了不同自来水样并对不同自来水厂的消 毒效率进行评价。顶空一固相微萃取技术是一项新型的样品采集技术，c a n c h o 等使 用该技术时对样品的体积、加盐量、提取时间及吸附条件进行了研究。k o c h 等研究 表明，用顶空固相微萃取技术一g c 相结合方法测定氯化消毒副产物d b p s 时，方法 的线性范围可达两个数量级以上，相对标准偏差小于7 ，最低检出可达到p p t 级。 1 3 三氯甲烷的相关研究 i 3 1 简述 目前在氯化消毒的饮水中检测到3 0 0 多种d b p s ，其中t h m 。占总有机卤化物的一 半，浓度最高( o 卜3 1 i p g l ) ，资料表明，多数d b p s 在水中均为痕量水平( 低于1 u g l ) ，r o o k 等人曾对新奥尔良市卡洛顿水厂的出水进行测试和分析，检测出的6 6 种微量有机物中，三氯甲烷含量最高，含量达1 3 3 斗g l ，国内外许多研究都证实三氯 甲烷在消毒副产物中存在最广泛，邵素平等在郑州地区黄河水作为饮用水源的加氯 消毒研究发现水在沉淀前、过滤前、过滤后三处加氯后出厂水的三氯甲烷含量达 2 8 p g l 1 ，姜江等对北京市管网供水中三氯甲烷含量研究发现三氯甲烷浓度在二次 供水末梢水中明显高于水源水中的含量，浓度达3 0 6 7 几。，在上海、沈阳等城市 的自来水中也检测出三氯甲烷。另外，游泳池中的三氯甲烷也不容忽视。张静等对 深圳市7 家游泳池中的三氯甲烷进行测定，三氯甲烷浓度最高平均为1 6 9 肛g l ，最低 为1 2 5 几，远超过国家规定的饮水水质标准。由于三氯甲烷在d b p 。存在十分普 遍且含量较高故常作为d b p s 监测中的代表。 人主要通过大气、水、食品三种途径摄入三氯甲烷，其中饮水摄入的三氯甲烷 ( 美国环保部门报告) 最高是3 4 3 m g ，日本报告饮水中摄入三氯甲烷含量占总摄入量 6 第一章综述 的7 0 。世界卫生组织饮用水标准规定了3 3 种致癌、可疑致癌有机物及其含量， 其中三氯甲烷含量不能超过3 0j - t g l ，德国对饮用水中三卤甲烷含量要求更为严格，为 小于1 0u g l 。我国政府于2 0 0 0 年6 月为进一步改善饮用水水质，尤其是饮用水的 消毒副产物，又重新修订了饮用水水质标准，标准规定三氯甲烷含量不得超过 6 0 p g l 队4 0 。 1 3 2 三氯甲烷的性质及毒性 三氯甲烷( c h l o r o f o r m ，c h c l 。) 分子量1 1 9 3 8 ，比重1 4 8 4 ，沸点为6 卜6 2 ， 有浓厚的香甜气味的液体，其蒸汽在水中的溶解系数为8 9 1 ( 2 0 。c ) 4 6 7 ( 3 7 。c ) ， 在人血中为1 5 9 3 ( 3 0 ) ，1 1 5 7 ( 3 7 ) ，9 0 ( 4 0 。c ) 。三氯甲烷小鼠的l d * 是 1 0 0 0 m g k g ，大小鼠接触低浓度的三氯甲烷会引起肝脏脂肪出血，。肾机能障碍。“。据 美国国立癌研究所报告，三氯甲烷可诱发大鼠上皮细胞腺癌发生，据e s c h e n b r e n n e r 报告，三氯甲烷可致小鼠肝癌。致突变作用与致癌作用存在着某种必然联系，三氯 甲烷作为饮水中典型的有机卤代物，其致癌作用已经被证实。动物实验还表明三氯 甲烷是碱基置换型直接致突变物，也是移码突变型的直接和间接致突变物m 3 。邹梅 等人采用动物免疫检测法对三氯甲烷的免疫毒性进行研究，结果表明三氯甲烷既可 作用于外周血用a n a e 标记的t 淋巴细胞，使t 淋巴细胞数目减少，又可直接作用于 b 淋巴细胞，抑制抗体分泌，证明三氯甲烷在一定剂量下对细胞免疫和体液免疫均有 不同程度的影响“。加氯消毒一直是水产养殖业首选的水体消毒方式，吴伟等人进 行了主要的水消毒副产物三氯甲烷对鱼的毒性试验，研究表明，三氯甲烷对鱼有一 定的急性毒性，毒性强度为中等，并可对鱼类受精卵造成毒性，引起鱼苗的孵化率 下降，畸形率增高和存活率下降，同时还可以诱导鱼类外周血产生微核“。另外， 三氯甲烷还有其它危害，如慢性中毒可致呕吐、消化不良、食欲减退、虚弱并能患 神经过敏症、失眠症、精神错乱、精神病等。 1 3 3 三氯甲烷的研究动态及本文研究的主要内容及意义 三氯甲烷作为主要的水消毒副产物，其对健康造成潜在威胁已得到证实，国内 外在控制其产生方面也作了不少研究，如减少氯消毒剂的使用、采用其它的消毒方 式( 氯胺消毒、二氧化氯消毒) 或使用新的消毒剂( 臭氧、紫外消毒) 这在一定程 度上可以减少三氯甲烷的生成量，但考虑到处理费用及消毒效果等因素，氯化消毒 仍然是应用最广的消毒措施，尤其是在发展中国家和地区。目前国内大部分自来水 厂均采用氯消毒方式。国内外有关三氯甲烷与生物大分子作用报道也有，如m o h a m m a d 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 m k h a n ，s a l m a nm u z a m m i l 等研究了三氯甲烷诱导血清白蛋白复合物构象的变化，国 内也有关于三氯甲烷和d n a 作用的报道“”，但相关资料较少。 血清白蛋白是人和动物血浆中含量最丰富的蛋白质之一，约占血浆总蛋白的 6 0 ，也是血浆中少有的非糖蛋白之一。血清白蛋白的生理功能主要有：( 1 ) 血液缓 冲剂血清白蛋白像其它蛋白一样具有两性性质，能与酸碱结合。白蛋白的等电点低 于正常血液p h 值，它是弱酸，一部分以酸的形式存在，另一部分与阳离子( 主要是 n a + ) 结合成弱酸盐。这两部分构成血液中少部分的缓冲系统；( 2 ) 营养作用在生 命活动中，组成组织和器官的蛋白质，经常不断地进行新程代谢。血浆蛋白质在体 内分解产生的氨基酸可参与氨基酸代谢池，用于组织蛋白等合成，参与维持体内蛋 白质的动态平衡。白蛋白对细胞具有较高的营养价值；( 3 ) 维持血浆胶体渗透压和 液体交换正常人血浆渗透压在3 7 。c 时约为7 7 个大气压，血浆中蛋白质浓度大于 组织液，故具有较高的渗透压，它有从组织间隙吸收水分进入血液循环的作用。在 正常人体微循环中，血浆与组织液间不断地交换液体及溶于水的营养物质和代谢产 物，因此在新程代谢中起重要作用。( 4 ) 运输功能血清白蛋白是血浆蛋白质中具 有广泛结合能力的蛋白质，能结合外源性和内源的化合物，也能结合大、中、小分 子化合物，还能同难溶于水和溶于水的物质相结合“。”1 。一般来讲，外来物质进入人 体后要通过血浆的储存和运输才能到达受体部位发生作用，目前，研究较多的是金 属离子及各种药物如喹诺酮类药物、依诺沙星、百草枯、二氯喹啉等与血清白蛋白 的结合作用。”“1 。本文主要研究三氯甲烷与血清白蛋白的结合作用，有助于从机理 上探讨三氯甲烷的毒性。 丙种球蛋白又称r 球蛋白，是免疫球蛋白( i m m u n eg l o b u l i n ，i g ) 的主要成分， 它是浆细胞产生的一种具有免疫作用的球蛋白，能特异地与抗原相结合形成抗原一抗 体复合物，从而阻断抗原对人体的有害作用m 1 。本文研究三氯甲烷与球蛋白的作用 旨在从免疫的角度探讨三氯甲烷的毒性。 金属离子如铜离子、铁离子在环境中广泛存在，同时也是生物体所必需的微量 元素。铜在人和动物组织中以+ l 、+ 2 价状态存在，铜的主要功能是参与氧化还原反 应。铜还是血浆铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶细胞色素氧化酶等的构成要素，对中枢 神经系统的发育、骨及结缔组织的形成具有重要作用“”1 。对于铁，除了人们熟知 的血红蛋白( h b ) 之外，体内的肌红蛋白( m b ) 、细胞色素氧化物、过氧化氢酶等 都含有铁。“。金属离子缺乏会导致疾病，但如果过量也会对人体产生危害。研究表 明，超氧阴离子( 0 2 一) 是线粒体产生的主要反应性氧n ( r o s ) ，超氧阴离子经反应 第一章综述 产生过氧化氢( h 2 0 2 ) 。有金属离子如铜、铁存在时过氧化氢就变成高度反应性的自 由基( 0 2 _ 、o h ) 后者能引起d n a 和膜损伤，自由基的过量产生d n a 损伤，这 在癌症的发展中起一定作用。“”1 。金属离子进入体内的主要途径是通过饮水和食品 进入的。血清白蛋白是血液中含量最丰富的蛋白质，具有储存和转运外源性和内源 性物质的功能，金属离子与血清白蛋白的作用国内外已有不少报道。目前，关于金属 离子与血清白蛋白的作用主要集中在铜、锌、铁、钙、锰、镉、铅、铬、镍、汞、 银、金等金属离子“”“，宋峥等还研究了铜离子和锌离子与牛血清白蛋白的结合竞争 。”，梁宏等还研究了铜离子和铁离子与人血清白蛋白的结合竞争作用o “。关于人血 丙种球蛋白相关研究较少，常稀俊等研究了铱( i v ) 离子、钯( i i ) 离子与人血丙 种球蛋白的结合作用。2 7 “。本文在研究金属离子一蛋白质二元作用的基础上，进一步 研究金属离子一蛋白质一三氯甲烷的三元作用，讨论有金属离子存在时其对三氯甲烷 和蛋白质结合的影响。 1 - 4 本文采用的方法 目前对于水消毒副产物三氯甲烷的毒作用研究多采用a m e s 试验、动物实验以及 流行病学的调查研究等方法。本文采用荧光光谱法在体外研究三氯甲烷与生物大分 子蛋白质的相互作用。荧光光谱法是研究金属离子和有机小分子与蛋白质相互 作用的一种有效方法，该法能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产 率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，通过这些参数的测定，不但可以做一般 的定量分析，而且还可以推断蛋白质分子在各种条件下的构象变化。荧光法包括荧 光猝灭法和同步荧光法，本文主要采用荧光猝灭法。该法方法简便、灵敏度高，是 研究小分子与蛋白质结合常用的方法。 9 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 第二章三氯甲烷与牛血清白蛋白及 人血丙种球蛋白的作用研究 2 1 前言 本章选择饮水消毒副产物中普遍存在且含量较高的三氯甲烷为研究对象，采用 荧光光谱分析法在p h = 7 0 的t r i s h c l 缓冲体系中测定其与牛血清白蛋白和人血丙 种球蛋白以及蛋白质的发光基团一色氨酸的结合常数及结合位点数，并对它们之间可 能的作用机理进行分析。 2 2 材料与方法 2 2 1 仪器和试剂 岛滓r f 一5 4 0 型荧光分光光度仪；d t - 10 0 分析天平( 北京光学仪器厂) ；电热炉；牛 血清白蛋白0 3 s a ，分析纯，中国科学院上海生物化学研究所提供) ；人血丙种球蛋白 ( g s h ，分析纯，中国科学院上海生物化学研究所提供) ；色氨酸；酪氨酸；t r i s h c l 缓冲溶液( o 0 5 m o l l q ) ；无菌双蒸水；三氯甲烷( c h c l 3 ，) ；氯化钠( n a c i ) 以上试剂均 采用分析纯试剂。 2 2 2 实验使用液的制各 2 2 2 1 1 x 1 0 4 t o o l l - 1 的牛血清白蛋白( b s a ) 贮备液的配制 准确称取o 1 7 0 9 牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解，然后定容至2 5 m l ，置于冰箱中备 用。 2 2 2 2 1 1 0 。5t o o l l - 1 人血丙种球蛋白贮备液的配制 准确称取0 0 1 5 9 人血丙种球蛋白溶于2 m lo 1 m o l l 1 的n a c i 溶液中，用蒸馏 水定容至1 0 m 1 。 2 2 2 3p i t = 7 0 的t r i s - i t c l 缓冲液的配制 ( 1 ) o 2m o l l 。1t r i s 贮备液的配制 准确称取6 0 5 7 9 的t r i s ，用蒸馏水定容至2 5 0 m t ； ( 2 ) o 1m o l l “的h c l 贮备液的配制 准确移取4 1 5 m l 浓h c l ，用蒸馏水定容至5 0 0 m l ； ( 3 ) 准确移取2 5 m l0 2m o l l 1t r i s 和4 5 m lo 1m o l l 。1 的h c l ，用蒸馏水定容至 10 0 m l ，得到含o 0 5 m o l l 1t r i s 、p h = 7 0 的t r i s h c l 缓冲液。 2 224 三氯甲烷饱和液的配制 准确移取1 0m l 三氯甲烷，溶于2 0 0 m l2 50 c 的蒸馏水中备用。 第二章三氯甲烷与牛血清白蛋白及人血丙种球蛋白的作用研究 2 2 2 5 0 1 m o l l 1 的n a c l 溶液的配制 准确称取2 9 2 2 9 的n a c l ，用蒸馏水溶解后定容至5 0 0m l 备用。 2 2 3 实验方法 取几只1 0 m l 的比色管，分别加入0 ，5 m l 的牛血清白蛋白( b s a ) ，l m lo 0 5t o o l l d t r i s 的t r i s h c l 缓冲液，依次加入不同体积的三氯甲烷。用蒸馏水补充至5 m l 。设定 激发波长为2 9 0 r i m ，在3 1 0 5 0 0 r i m 波长范围内扫描牛血清白蛋白( b s a ) 在三氯甲烷作 用下的荧光光谱。用同样的条件扫描人血丙种球蛋白、色氨酸在三氯甲烷作用下的 荧光光谱。 2 3 结果与讨论 2 3 1 三氯甲烷与牛血清白蛋白( b s a ) 的相互作用 2 3 1 1 三氯甲烷对b s a 的荧光光谱的影响 b s a 中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基而能发射较强的内源荧光，蛋白质 是荧光体，三氯甲烷与b s a 相互作用的过程中能不同程度地猝灭b s a 的荧光强度， 荧光猝灭剂降低荧光体荧光强度的现象称为荧光猝灭作用”“7 。按实验方法固定b s a 的浓度分别为1 x 1 0 t o o l l 。1 和1 x 1 0 石t o o l l ，设定激发波长为2 9 0 n m , 于3 4 0 n m 读取荧光值并在3 1 0 5 0 0n r l l 波长范围内分别扫描三氯甲烷对两种浓度下b s a 的发 射光谱，如图2 - 1 ，2 - 2 所示： 九r i m c b s a = 1 1 0 + 5 m o l l ，九e x = 2 9 0 n m ； c c h c 】3 ：a ，0 ；6 x1 0 4 m o1 l - l - 6 x 1 0 m o l l 图2 1 三氯甲烷对b s a ( 1x1 0 4t o o l l - i ) 的荧光猝灭图 1 1 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 n m cb s a = 1 1 0 6 t o o l l ，九e x = 2 9 0 n m ； c c h c l 3 ：a ，0 ；b f , 6 x 1 0 。4 m o l l 1 6 1 0 一m o l l 。1 图2 - 2 三氯甲烷对b s a ( 1 1 0 石t o o l l q ) 的荧光猝灭图 从图2 - 1 、2 - 2 中可以看出b s a 荧光强度随三氯甲烷浓度加大显著降低，且三氯 甲烷对低浓度的b s a 猝灭强度更大，两种浓度的b s a 荧光随三氯甲烷的加入，发 射峰均出现紫移，但三氯甲烷对低浓度b s a 紫移更明显，可能是由于c h c l 3 与b s a 浓度比越大越有利于二者的相互作用。 2 3 1 2 三氯甲烷对b s a 荧光猝灭的猝灭机制 荧光猝灭作用因猝灭机理的不同分为动态猝灭作用、静态猝灭作用、非辐射能 量转移等。 动态荧光猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生的与扩散有关的相互 作用过程。对于动态荧光猝灭过程，蛋白质等荧光体与猝灭剂分子间的相互作用可 用动态猝灭公式( s t e m v o l m e r ) 来描述，即f o f = i + k qto 【q 】= l + k s v q 】。 式中f o 为无猝灭剂时b s a 的荧光强度；f 为有猝灭剂时b s a 的荧光强度；q n 猝灭剂的 浓度；to 为无猝灭剂时荧光分子的平均寿命，生物大分子的平均荧光寿命为1 1 0 弗s ，k q 为动态荧光猝灭速率常数，聪v 为动态荧光猝灭常数，显然k s v = k 。o 。 以f o f 与相应的 q 】作图，根据直线的斜率可求得动态荧光猝灭常数k s v 5 “”。 静态荧光猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发光的配合物，从而导 致荧光强度降低的过程。对于静态荧光猝灭过程，可用l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数方程 第二章三氯甲烷与牛血清白蛋白及人血丙种球蛋白的作用研究 描述，即假设生物大分子有n 个相同但又相互独立的键合位置，则有如下反应”+ 7 ” k a nq + p ；= = 兰qn p ( 1 ) k d 其生成常数k a 应由下式表示： k a ：嬲 ( 2 ) 【q 【n p 一 其中 p 是游离荧光体浓度，【q 是猝灭剂浓度， q 。p 】是配合物浓度， p o 是荧光体总 浓度且等于 p + q 。p ，代入式( 2 ) 可得 k 。：塑! 婴：旦一上 i 一 q n p 】 q 】 p q 当生成物q 。p 不发荧光时，游离荧光体的摩尔分数可用相应的荧光强度表示 p 】【p o = f f o 将式( 4 ) 代入( 3 ) 得 f o 厄= l + k a q 】( 5 ) 由式( 5 ) 变形可得 ( f o f ) 一1 = f o 一1 + k 0 1f o 一1 【q ( 6 ) 式中f o 为无猝灭剂时荧光体的荧光强度；f 为有猝灭剂时荧光体的荧光强度； q 为 猝灭剂的浓度；k a 为静态荧光猝灭结合常数，由式( 6 ) 作l i n e w e a v e r - b u r k 双倒数 图，可由直线的斜率和截距求得两种物质间的结合常数k a 。 仅仅通过改变猝灭剂浓度测量荧光强度所得到的荧光数据，无法判断猝灭现象 是属于动态还是静态的。区分动态与静态猝灭可以通过以下实验来确定【7 47 5 】： ( 1 ) 改变温度实验，动态猝灭与温度有关，温度升高将增大扩散系数，从而增大 双分子猝灭常数；而温度升高可能引起配合物的稳定性下降，从而减小静态猝灭的 猝灭常数。所以高温有利于动态猝灭，低温有利于静态猝灭。作出同一体系的不同 温度的s t e r n v o l m e r 曲线，根据温度对猝灭常数的关系及k 。的大d , n 断猝灭类型。 如果高温的斜率大于低温的斜率则为动态猝灭，如果高温的斜率小于低温的斜率， 则为静态猝灭。 ( 2 ) 测量吸收光谱，动态猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光物 质的吸收光谱，而静态猝灭中，基态配合物的生成往往会导致荧光物质的吸收光谱 水消毒副产物三氯甲烷、金属离子与蛋白质的作用研究 的改变，如果吸收光谱有变化则为静态猝灭。 ( 3 ) 测量荧光寿命，静态猝灭中，猝灭剂的存在并不改变荧光分子的激发态的寿 命；而动态猝灭中，猝灭剂的存在使激发态分子的荧光寿命缩短。这是区分静态猝 灭与动态猝灭最确切的方法，但荧光寿命的测量实验条件要求高，一般不易进行。 ( 4 ) 计算k q 值，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞速率常数为2 0 1 0 ”l t o o l s 。1 荧光分子的平均寿命为1 0 一s ，根据k s v 的值可求出k q 的大小， 如果求得的k q 值大于2 o 1 0 1 0 l m o l s ，则此猝灭为静态猝灭。 根据实验数据，在p h = 7 0 、温度为室温条件下，分别作三氯