（发育生物学专业论文）光物理因子对中华大蟾蜍早期胚胎发育影响的初步研究.pdf

山东人学硕士学位论文 符号说明 5 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：坐煎日 期：2 丝墨：丝，p 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：坐葱导师签名： 坞日期：蟹坠! 山东入学硕士学位论文 光物理因子对中华大蟾蜍早期胚胎发育影响的初步研究 中文摘要 激光和紫外线是非电离辐射光物理因子，为了研究其对两栖类早期胚胎发育 的影响，本论文以中华大蟾蜍为主要实验材料，分别用y a g 倍频激光器和3 0 2n l l l 中波紫外线( u v b ) 照射不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎，在发育形态、蛋白 质谱和核酸水平检测了照射前后的变化。1 ) 用u v b 分别以不同强度和不同时 间照射中华大蟾蜍二细胞期胚胎，观察记录胚胎的发育过程、统计死亡率与照射 时间和照射强度的关系。结果表明，3 0 9 w c m 2 强度的u v b 分别照射二细胞期胚 胎2 0 s 、6 0 s 和8 0 1 x w c m 2 强度分别照射2 0 s 、6 0 s 、1 2 0 s 后，对中华大蟾蜍早期 胚胎发育有促进作用，使发育过程中的死亡率降低，畸胚出现的类型较少且畸变 程度低；8 0 9 w c m 2 强度的u v b 照射二细胞期胚胎6 0 0 s ，10 0 1 a w c m 2 强度的u v b 照射2 0 s 、6 0 s 、6 0 0 s 和1 2 0 1 x w c m 2 强度的u v b 照射2 0 s ，导致胚胎发育过程中 死亡率明显升高，畸胚数量多且畸变程度高。由此结果可见，u v b 照射剂量和 时间不同，对中华大蟾蜍早期胚胎发育的影响有明显差异。2 ) 用y a g 倍频激光 器1 0 0 r d c m 2 、3 0 0 p j c m 2 和6 0 0 山c m 2 分别照射中华大蟾蜍原肠胚，提取各组样 品蛋白质组进行双向电泳，凝胶成像后用p d q u e s t 软件分析。结果表明：激光 照射对原肠胚蛋白质点的个数和分布都有显著影响，影响程度与照射激光的密度 有关。有些点只在照射组中出现，有些则只在对照组中出现，另外一些蛋白质点 的表达量在照射前后发生了明显的变化。3 ) 为了在分子水平上检测激光照射对 生物组织或细胞基因组损伤的程度，结合单细胞凝胶电泳技术建立了一种快速、 定量检测小鼠淋巴细胞受激光照射后d n a 损伤程度的方法。使用能量密度为 6 0 0 叫l c m 2 的y a g 激光照射小鼠脾淋巴细胞1 5 、2 5 、3 5 个脉冲后，采用单细胞 凝胶电泳法检测实验组和对照组细胞d n a 损伤程度，发现d n a 损伤程度与激 光照射脉冲数成正比。用强度为3 0 9 w c m 2 、6 0 9 w c m 2 、9 0 t w e m 2 、1 2 0 9 w c m 2 、 1 5 0 p w c m 2 的u v b 分别照射小鼠脾淋巴细胞3 0 m i n ，采用单细胞凝胶电泳法检 测u v b 照射对细胞d n a 的损伤，结果表明3 0 9 w c m 2 组d n a 损伤程度最高。 山东大学硕+ 学位论文 随着照射强度的加大，6 0 9 w c m 2 、9 0 9 w c m 2 、1 2 0 9 w c m 2 组损伤程度有所降低， 而1 5 0 1 x w c m 2 组又出现了高d n a 损伤。4 ) 分别提取经不同强度照射u v b 的四 细胞期胚胎、原肠胚和神经胚的基因组d n a ，然后进行琼脂糖凝胶电泳。发现 各组中随着照射强度的增加d n a 条带弥散的程度也加大，这可能与u v b 照射 胚胎生成了光产物，从而使d n a 链断裂有关。5 ) 提取未经照射的受精卵、四 细胞期胚胎、囊胚、神经胚、原肠胚、肌肉感应期胚胎和经8 0 9 w c m 2 的u v b 照射的四细胞期胚胎、原肠胚、神经胚的总r n a ，进行甲酰胺化r n a 变性琼脂 糖电泳。发现与对照组相比，照射后的胚胎r n a 条带均出现了不同程度的弥散。 本论文所涉及的激光、u v b 等环境物理因子对两栖类胚胎影响的研究，可为环 境生物学研究辐射对生物体的影响提供借鉴。 关键词：激光；u v b ；中华大蟾蜍；双向电泳；单细胞凝胶电泳 山东人学硕士学位论文 a b s t r a c t l a s e ra n du l t r a v i o l e tb e l o n gt on o n i o n i z a t i o nr a d i a t i o na n dh a v em a n y b i o l o g i c a l e f f e c t s t h em a i nb i o l o g i c a le f f e c t so fl a s e ra r ep h o t o c h e m i c a l i n t e r a c t i o n ，t h e r m a li n t e r a c t i o na n de l e c t r o m a g n e t i ce f f e c t u l t r a v i o l e t v ) m a y i n d u c es t r u c t u r eo fd n a ，p r o d u c ec y c l o b u t a n e p y r i m i d i n ed i m m e ra n d p y f i m i d i n e ( 6 4 ) p y f i m i d o n ep h o t o p r o d u c t sa n dr e s u l ti ni m m u n o s u p p r e s s i o ns o m u c ha st oc a n c e r i no r d e rt oe x a m i n et h ee f f e c t so fi r r a d i a t i o no fl a s e ra n du v o na m p h i b i a n se m b r y o s ，b u f ob u f og a r g a r i z a n s se m b r y o sw e r ee x p l o r e dt o y a g d o u b l e f r e q u e n c yl a s e rm i c r o b e a m sa n dl a m p so fu v b a tv a r i o u ss t r e n g t h a n dt i m e c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lg r o u p s ，t h ee m b r y o sw h i c hw e r ei r r a d i a t e db y l a s e ro ru l t r a v i o l e tb v b ) h a d m a n yc h a n g e si nm o r p h o l o g y ，n u c l e i ca c i da n d p r o t e i n s w h e nb u f ob u f og a r g a r i z a n s st w o - c e l ls t a g ee m b r y o sw e r ei r r a d i a t e d b yu v ba tv a r i o u sw a v es t r e n g t ha n dt i m e ，m a n yk i n d so fa b n o r m a le m b r y o s c o u l db eo b s e r v e di nt r e a t m e n tg r o u p s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ta f t e re x p o s e da t l o ws t r e n g t ha n ds h o r tt i m e ，s u c ha s3 0 j t w c m 2b y2 0 s ，6 0 sa n d8 0 l x w c m 2b y 2 0 s ，6 0 s ，12 0 sr e s p e c t i v e l y ，e m b r y o s d e v e l o p m e n tp r o c e s sw a sp r o m o t e da n d d e a t hr a t ea n dd e g r e eo fd e f o r r n i t i e sw e r er e d u c e dt h a nc o n t r o la n do t h e rg r o u p s o nt h ec o n t r a r y ，a f t e ri r r a d i a t e db yh i g hw a v es t r e n g t ha n dl o n gt i m e ，s u c ha s 8 0 r t w c m 2b y6 0 0 sa n dl0 0 t w c m 2b y2 0 s ，6 0 s ，6 0 0 sa n d12 0 1 x w c m 2b y2 0 s r e s p e c t i v e l y ，e m b r y o s d e a t hr a t ew a sh i g h e rt h a nc o n t r o la n do t h e rg r o u p s t h e r e s u l t ss u g g e s t e dt h a tu v bh a dt w os i d e so fe f f e c to nb u f ob u f og a r g a r i z a n s s e m b r y o s ，o n ei sb i o s t i m u l a t i n ga n dt h eo t h e ri sk i l l i n ga n dw o u n d i n g a f t e r i r r a d i a t e db yu v bw i t hs a l l et i m eb u tv a r i o u sw a v es t r e n g t h ；t h ef o u r - c e l ls t a g e e m b r y o s ，g a s t r u l a ea n dn e u r u l aw e r ef e t c h e da n dt h er e s u l t so fd n aa n d 剐n a g e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a tt h eh i g h e rw a v es t r e n g t ha n d t h em o r e d i s p e r s i o n an e wm e t h o d ，s i n g l e c e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s ( c o m e ta s s a y ) ，w a s u s e dt od e t e r m i n e dd a m a g eg r a d eo fd n aa f t e rm o u s e sl y m p h o c y t c sw e r e i r r a d i a t e db yl a s e r t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a th i g hi n t e n s i t yl a s e rl e dt os e v e r e d a m a g eo fd n a c h a n g e so fg a s t r u l ap r o t e i n se x p r e s s i o np a t t e r n sb e t w e e n c o n t r o lg r o u p sa n do t h e rg r o u p sw h i c hw e r ei r r a d i a t e db yy a gl a s e rw e r e e x a m i n e db yt w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s t h em a po fp r o t e i n ss h o w e dt h a t p r o t e i ne x p r e s s i o nw a si n f l u e n c e db yl a s e ri r r a d i a t i o na n dt h et o t a ln u m b e ro f 山东大学硕士学位论文 p r o t e i ns p o t sw a sr e l a t e dt ot h ei n t e n s i t yo ft h el a s e rb e a m t h e r ew e r es o m e p r o t e i n so b v i o u s l yc h a n g e di nl a s e rt r e a t m e n tg r o u p sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o la n d s o m es p o t sw e r ev i s i b l ei nt h et r e a t m e n tg r o u p sb u tn o to b s e r v e di nt h ec o n t r o l 。 i nf u r t h e rr e s e r c h ，i ti sn e c e s s a r yt op r o c e e dt o p o i n t o u tw h i c hg e n e sa n d p r o t e i n sc h a n g ea f t e ri r r a d i a t i o nw i t i ll a s e ra n du v b t h i sb a s i cr e a s e r c hc o u l d o f f e r e dr e f e r e n c et oe n v i r o n m e n t a lb i o l o g y k e yw o r d s ：l a s e r ；u l t r a v i o l e tb ；b u f ob u f og a r g a r i z a n s ；t w o d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s ；s i n g l e c e l lg e le l e c t r o p h o r e s i s 4 山东大学硕十学位论文 - _ - j 一 一、刖舌 近半个世纪以来，人类活动不仅带来了工业的发达、经济的发展和物质产品 的极大丰富，同时也给环境带来了巨大负面压力。但由于环境污染衍生的环境效 应具有滞后性，发现时污染已经发展到了相当严重的地步，如给生态系统造成沙 漠化、森林破坏等直接影响，而危害更大的是给生态系统和人类社会造成间接的 危害，如日趋严重的全球性气温升高，大气层中臭氧被破坏，平流层臭氧日渐减 少【1 】。由此而导致的到达地面的u v 辐射强度增加，尤其是u v b 的增加，对地 球生态圈造成了严重危害：促使死亡植物、南北极冰山以及陆地生态圈中产生了 更多c o 、n o 和卤代物 2 1 。更加严重的是氯和溴扩散又会导致臭氧层变薄f 3 一， 形成恶性循环。因此，研究u v b 对生物体的作用具有重要的理论和现实意义。 除u v b 外，激光是另一种在生物医学领域都得到广泛应用的光物理因子，它是 光受激辐射放大而产生的，其能量可以进行人为控制，因此可以依据激光的能级 模拟一种对生命活动产生影响的亚极端环境，进而探索非自然因素对生命活动的 影响。激光对受照组织和生物体产生某种生理、病理效应是由激光的波长、能量 密度等物理参数决定的。因此，调节激光照射参数，作为一种物理手段来探索光 对生命活动的影响有助于探讨生物在进化过程中光物理因素对其物种的演化、变 异所起的重要作用和认识生物在特定光物理环境条件下的遗传适应性。 紫外线的生物学效应 地球上所有生命形式的维持都直接或间接地与阳光辐射有关，虽然紫外 ( u l t r a v i o l e t u v ) 辐射只占阳光光线中很少的一部分，却具有很强的生物学作用， 是动植物正常生长发育必不可少的。物理学上一般将紫外线分为真空紫外区 ( 1 9 0 r i m ) 、远紫外区( 1 9 0 3 0 0r i m ) 和近紫外区( 3 0 0 - 4 0 0n m ) 。真空紫外区的 辐射被空气所吸收，所以除非所用光源很强，一般不会引起生物效应。根据生物 学差异，紫外线又可分为三个不同的波段：u v c ( 1 0 0 2 8 0 n m ) 、u v b ( 2 8 0 3 2 0 n m ) 、 u v a ( 3 2 0 4 0 0 n m ) 。u v a 可诱发许多物质发出荧光；u v b 又称“皮肤红斑区”( 5 6 】； u v c 又称“杀菌区”。由于阳光辐射到达地球表面的紫外线波长范围为 2 8 6 3 9 0 n m ，因而u v c 不能穿透大气层，对地球生物生长发育起效应的紫外线 6 山东大学硕士学位论文 类型是u v a 和u v b ，而这其中，到达地球的表面u v b 相对于u v a 只占很小 的比例，但却有着很重要的生物学作用。例如，波长3 0 0 n m 的u v b 对e c o l i 的 损伤作用和对小鼠的致癌作用较波长为3 3 0 n m 的u v a 高40 0 0 50 0 0 倍。另外， 在对小鼠的光致癌作用的研究中发现，如果u v b 能占整个紫外辐射的2 ，则 u v a 对生物的效应可忽略不计。w o o l l o n s 等【7 j 研究发现，u v i 只占u v a 的0 8 ， 却可造成7 5 c p d s 的生成和5 0 的d n a 氧化损伤。 1 1 紫外线的主要生物作用 紫外线与物质相互作用的主要方式是使物质分子的电子从基态跃迁到激发 态，紫外线光子则作为能量被物质的原子或分子吸收。许多生物大分子的最大吸 收波长是处于紫外线波段。因此在紫外线照射下，在生物大分子内会发生相应的 光化学反应，从而引起各种生理变化。紫外线对生物大分子的主要作用如下： 1 ) 断裂氢键作用。酶在紫外线照射下，引起组成酶的特异氨基酸残基的破坏和 维系酶的活性中心空间完整性的氢键断裂，使酶的活性丧失，从而引起酶的 光化学钝化。如核糖核酸酶在紫外线的照射下，组分中的胱氨酶受到破坏， 某些氢键断裂，酶的分子构象发生变化，使酶失活l s 】。照射胰蛋白酶和溶菌 酶时，也会发生同样的情况。 2 ) 光诱变作用。紫外线是一个很有效的致变因素，可诱发受照组织和生物体的 基因突变。因为紫外线的穿透性很弱，所以它很少被用作高等植物的诱变剂， 而多用于微生物、生殖细胞、花粉粒以及培养的细胞等。在低剂量紫外线的 照射下，细菌的突变频率可能会增加到自然突变水平的1 0 3 到1 0 4 倍。紫外线 诱发突变是由于它的能量被d n a 吸收，改变了d n a 结构，因而造成d n a 损伤。损伤的主要类型有：碱基损伤，如形成甲酰胺基嘧啶等，还可能导致 碱基脱落形成无嘌呤或无嘧啶位点，这些损伤可能进一步导致d n a 链断裂； 使d n a 形成链内交联，生成嘧啶二聚体；造成d n a 单链断裂。d n a 链内 交联生成嘧啶二聚体，最常见的是环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n e d i m m e r , c p d ) 和嘧啶( 6 - 4 ) 嘧啶酮光产物 p y r i m i d i n e ( 6 - 4 ) p y r i m i d o n e p h o t o p r o d u c t s ，6 4 p p t 9 1 0 】。其中c p d 的形成是由于d n a 受紫外线照射后，相 邻的嘧啶碱基共价交联形成环丁烷四圆环，两个碱基的5 、6 位键饱和，此时 山东人学硕十学位论文 b 型d n a 结构强烈地旋转、扭曲，以致两个嘧啶环充分靠近而形成了二聚体。 因此，易于解旋和弯曲的序列更易形成c p d ，d n a 双螺旋的柔性和弯曲角 度成为影响c p d 形成的重要参数。c p d 常在5 - t t ，5 - t c ，5 - c t 和5 - c c 二嘧啶d n a 序列中形成，其中5 - t t 最易形成c p d ，而5 - c c 最不易形成】。 通常可用d n a 测序凝胶电泳技术能够确定受紫外线照射的d n a 序列中c p d 的分布状态：用紫外线照射经末端标记的d n a ，然后用能够特异地识别c p d 序列的酶( 如紫外线内切酶或t 4 内切酶v ) 切割d n a 链中的c p d 位点， 形成长短不一的d n a 片段，通过测序凝胶电泳即可确定c p d 的位置。c p d 可在有氧或厌氧条件下由所有波长的紫外线照射产生，它对光解酶、切除修 复酶及各种重组修复都是敏感的。除c p d 外，另一种常见嘧啶二聚体6 - 4 p p 则是通过5 嘧啶的5 和6 位碳原子或3 嘧啶的4 位碳原子和位于4 位的氧原 子或亚氨基异构体间形成的二氧己烷或氮杂丁烷4 圆环而形成的，这种环能 够自发断裂，导致羟基或氨基转移到5 嘧啶和第5 位碳原子上，在相邻嘧啶 的6 位和4 位形成稳定的化学键。6 - 4 p p 的形成率由d n a 序列和染色体的环 境决定，是c p d 形成率的2 0 3 0 。它主要在5 - t c 和5 - c c 序列中产生， 特别是当3 碱基中有一串嘧啶相连时，否则如果一段序列里的嘧啶位点被嘌 呤分开了，则其形成6 - 4 p p 的能力就很弱了。与c p d 一样，6 - 4 p p 的形成同 样需要d n a 解旋和碱基的旋转，而6 - 4 p p 的嘧啶平面几乎是垂直的，因此 刚性的d n a 双螺旋结构形成6 - 4 p p 时它的d n a 双螺旋可能产生比c p d 更 显著的结构扭曲，在一定程度上刚性的d n a 双螺旋是抑制6 - 4 p p 形成的。 6 - 4 p p 光产物对碱不稳定，在六氢吡啶中加热后能够产生d n a 链断裂。此外， 尿嘧啶胞嘧啶、尿嘧啶胸腺嘧啶，胞嘧啶胸腺嘧啶以及尿嘧啶一胞嘧啶之间 都可以形成环丁烷型的天然嘧啶二聚体。这些嘧啶二聚体使d n a 双螺旋的 两链间的键减弱，d n a 结构局部变形，形成基因点突变，严重影响d n a 的 复制和转录。 3 ) 免疫抑制作用。免疫抑制在阻止皮肤癌发生过程中起重要作用。近年的研究 表明，紫外线能够通过免疫抑制等机制影响肿瘤的发生和发展【1 2 1 ，u v b 照射 能起到免疫抑制剂相同的作用，代替免疫抑制剂防止小鼠外源性肿瘤的排斥 反应。紫外线照射2 4 h 内主要由u v b 诱发免疫抑制，7 2 h 时发生的免疫抑制 山东大学硕士学位论文 则同u v b 和u v a 共同诱发引起f 1 3 , 1 4 】。紫外线引起免疫抑制的机制为：紫外 线照射后，其能量为细胞内的生基团所吸收，然后将能量转化为化学信号， 这些信号激活细胞或胞内一些生物分子的表达，这些细胞或分子进步调节 免疫系统的功能，如紫外线可激活抑制性c d 4 + t 细胞，在c d 4 + t 细胞介导 下阻止抗原特异性c d 8 + 效应t 细胞的增殖，从而最终抑制细胞的免疫功能 【1 5 】。u v b 还可抑制巨噬细胞、中性粒细胞、朗格汉斯细胞( l c ) 、树突状细 胞的免疫功能，也可抑制体液免疫【1 6 1 。 4 ) 辐射产生自由基。紫外线可使某些分子的共价键断裂，发生光化学反应，生 成含有未成对电子的自由基。自由基是作用核酸引起变异的重要因素，通过 自由基的直接间接作用导致碱基损伤、或糖基损伤、链的断裂以及嘧啶二聚 体的形成和核酸的蛋白质的交联等损伤；引起生物分子的生理、遗传变异 【1 7 l 鄹。 1 2 紫外线损伤的修复 紫外线损伤修复最常见的就是光复活作用。光复活是通过可见光照作为动力 的环丁烷型嘧啶二聚体在原位的酶促裂解。光复活酶在暗条件下与d n a 紫外损 伤的部位结合成酶底物复合物，吸收3 2 0 n m 和4 1 0 n m 之间的光，就能使这个复 合物激活，底物由环丁烷型二聚体转化为单体嘧啶，同时释放出酶【1 9 1 。 激光的生物学效应 “激光”是光受激辐射放大的简称，通过辐射的受激发射而实现光的放大。与 普通光相比，激光有许多特点。首先是其方向性好，能量集中、亮度高，因而单 位面积内能量密度大；其次是激光的光谱线宽度比较窄，波长比较单一，因而颜 色单纯，相干性好【2 0 1 。激光系统分为连续波( c o n t i n u o u sw a v e ，c w ) 激光器和脉 冲激光器( p u l s e dl a s e r ) 。激光器照射生物组织常用的参数有波长、脉宽、能量 密度和强度。波长决定激光辐射穿透组织的深度，即吸收和散射的效率；脉宽能 最终决定作用在生物组织上的效应；能量密度值则是产生某个特定效应的必要条 件f 2 l 】。由于生物大分子吸收激光能量而被激活，产生受激原子、分子和自由基 等，引起生物组织内发生一系列化学反应，从而产生相应的生物效应【2 2 】，因此 9 山东大学硕士学位论文 激光的生物学效应还与受照组织的性质有关。一般来说，激光主要有如下四种生 物学效应 2 3 乏5 】： 2 1 激光的光效应 组织或生物体受激光照射时，会在组织内产生光化学效应。这种光对生物组 织的光化学作用主要取决于分子的能级和激光的波长，其作用机理主要表现在七 个方面：共振吸收、非线性吸收、光致异构化作用、包含分子氧的光敏化作用、 光解离作用、断裂氢键、激发电子、光诱变及光复活作用。当照射激光的能量没 有达到破坏生物组织时，热效应和压强效应不占主要地位，此时生物组织内发生 的主要是光化学效应。当照射激光的波长和生物大分子中某些键的固有振动波长 相同或相近时就会产生同频共振，使这些键振动加剧，达到一定程度时会致使键 断裂。例如，d n a 分子中碱基的最大吸收波长约为2 6 5 n m ，适当的激光器通过 共振作用可打破这些键，从而造成染色体断裂。断裂重新结合时就形成染色体畸 变，如无着丝粒，染色体粘着，染色体数量的改变及倒位、重复、缺失等结构改 变。现在已有许多研究证实激光可导致d n a 分子氢键断裂，引起单链或双链的 断裂。从分子水平讲，当d n a 分子的固有频率与激光频率相同时，d n a 分子对 该频率的激光发生共振吸收，强烈地吸收激光能量，其后果是d n a 分子被激发。 它内部原子的振动加剧，原子与原子之间的结合变松，使氢键被破坏，造成单链 或双链的断裂。 受激光照射的组织中并不是一个生物大分子只吸收一个光子，而是有双光子 吸收或多光子吸收现象，即两个或多个相同的光子参与同一个光吸收过程，这种 吸收被称为非线性吸收。随着入射光辐射强度的增加，分子吸收光子发生能级跃 迁时吸收的几率猛烈增大【2 6 捌。相应波段激光的这种非线性吸收作用同样可以导 致d n a 分子结构的改变。双光子或多光子吸收还被用于研究生物分子内部或分 子之间的能量转移，以获得分子间相互作用的信息。 生物体的大多数细胞对可见光是不敏感的，因为它们的有机组分对可见光吸 收弱。但是，如果有光敏化剂存在，并在生物组织细胞内浓集时，某些细胞器大 分子能选择地吸收光能，并将光能转变成高度反应的新生态氧，新生态氧可以溶 解细胞膜，导致细胞死亡，这种效应就是包含分子氧的光敏化作用。目前，应用 山东火学硕士学位论文 光敏剂和适当能量的激光来治疗癌症的光动力治疗已经得到广泛应用，而且二者 结合起来的效果是单一的光敏剂或激光所达不到的【2 8 矧。 与紫外线辐射相同的是，激光照射同样能产生自由基以及引起d n a 光诱变 损伤。激光照射的光解离作用同样能产生自由基等活性物质。这是由于激发分子 将激光转移到一个特别的键上，这时振动加强，若没有其它消耗，结果产生一个 键的断裂，发生激光的光解离效应。与紫外线辐射产生自由基不同的是，激光的 光解离作用有时也可产生稳定的分子。激光的光诱变作用表现在，激光辐射可导 致d n a 分子或染色体发生诱变，因而性状发生变异。激光还可以起到光复活作 用。用适当剂量的激光代替可见光，也可以对电离辐射引起的损伤有修复作用， 使环丁烷嘧啶二聚体在原位酶促裂解。光复活酶在暗条件下与d n a 紫外线损伤 部位结合成酶底物复合物，底物由环丁烷二聚体转化为单体嘧啶，同时释放出 酶。 2 2 电磁场生物学效应 激光属非电离辐射，因为它对物质的电离作用很弱。在电场作用下，生物组 织内的非极性分子的正负电荷分别朝相反的方向移动，非极性分子就会发生极化 作用。在极化分子重新排列的过程中与周围分子发生碰撞磨擦，来回振动，产生 热作用，同时有机体内还形成不同程度的闭合回路，产生局部感应涡流，而导致 生热。热量产生太多，从而造成蛋白质等的热变性，即导致了有机体的热损伤【3 0 1 。 激光使生物分子发生改变或损伤的程度不但取决于波长，而且还与照射剂量和时 间有关。一般来说，波长越短，照射时间越长，强度越大，则损伤程度越大，甚 至致死。 2 3 热效应 热效应是辐射引起生物物质变动的主要机制。这是因为激光光子被基态生物 分子吸收后，可能引起生物分子跃迁到电子激发态，分子从激发态回到基态过程 中激发能主要用于光化学反应，引起光作用，也可以转变为热能，引起热作用。 激光提高温度是诱发突变的一个因素。可改善照射部位细胞和组织功能，可加快 酶的催化作用，促进生化热化反应，促使动物组织局部血管扩张加快血流，促使 山东人学硕七学位论文 局部代谢旺盛，加强细胞吞噬功能等【3 1 。引。m c g u f f 等1 3 4 】用1 8 0 j 红宝石激光辐射 黑鼠颊囊内移植性恶性肿瘤，并利用热电偶合红外辐射温度计等仪器测量肿瘤组 织温度。测量结果表明，肿瘤组织温度至少上升到4 6 ，并持续l m i n 以上，证 实了激光热效应是存在的。 热效应主要与辐射能量密度和照射持续时间有关，将随着入射激光的能量增 加而温度升高，但生物组织的耐热性有个临界温度，超过临界温度就会变性。假 设体温为3 7 ，温度超过5 0 时，可观察到酶活性明显地减弱【3 5 】，结果导致了 在细胞内传递的能量减少，并且导致细胞固定。而且，细胞的某些修复机理也被 损坏。因此，活下来的细胞数量也会大大减少。在6 0 时，蛋白质和胶原蛋白 就会产生变性作用，这样就导致了组织凝结和细胞坏死，相应地宏观上可看到组 织变暗。温度大于8 0 时，膜通透性急剧提高，因此就会打破在其他方面保持 的化学浓度的平衡。在1 0 0 。c 时，大多数组织中所含的水分子开始汽化。由于水 蒸汽的产生带走了多余的热量，并且有助于阻止邻近组织温度大幅度升高，所以 水分子大量的汽化热是有益的。由于相位转换期间体积会有很大增加，就形成了 气泡，从而引起了组织碎片的机械破裂和热分解。温度高于1 0 0 时，就会发生 碳化作用，可看到邻近组织变黑并且冒烟。受辐射组织所达到的温度和在这个温 度上持续的时间在组织产生不可逆损伤方面都起着很重要的作用。 2 4 压力生物学效应 光不仅具有波动性，而且具有粒子性，具有一定动量的光子入射到物体上时 无论是被吸收或反射，光子的动量都会发生变化，因而必然会有光压作用在物体 上。对入射激光束来说，细胞的膜层结构是浸泡在液体中的无数个界面。当光予 被迫吸收时，在这些界面上被散射、衍射和折射，最后被捕获。在此吸收过程中， 将产生辐射压强。 激光在生物学研究中的进展 b a n d a z h e v s k i i 和e m e l i a n c h i k t 3 6 】将不同妊娠期雌性大白鼠暴露于一定红外 激光束下，发现可导致胚胎植入前死亡增加和胚胎骨骼形成紊乱。c a m p o t 3 7 1 等 用低功率激光照射鸡胚的视泡和中脑一间脑边界区，照射后出现了无眼、小眼、 山东人学硕+ 学位论文 晶状体异位和视网膜中隆四种胚胎畸形。徐在宽f 3 8 j 等用红宝石激光微束照射黑 眶蟾蜍受精卵，发现激光照射可导致各种畸形胚产生，胚胎死亡率与激光微束能 量密度有关。激光照射对胚胎发育产生抑制作用，激光照射后胚胎细胞线粒体超 微结构出现异常变化，出现了明显肿大、嵴断裂等。激光照射不同时期受精卵和 八细胞时期胚胎的灰色新月区，导致受精卵畸形率和相对死亡率增高。张开兴等 【3 9 】用红宝石激光微束照射黑眶蟾蜍二、四细胞期的分裂球时，发现可诱发胚胎 发育、致畸和死亡，产生双头或双头双尾的骈联胚，畸胚线粒体崩溃、乳酸脱氢 酶酶谱明显变化。l i n 和c h a l l 【4 0 】用氦镉激光持续或反复照射2 细胞小鼠胚胎的 一个或两个核，导致卵裂率的降低。结果提示，脉冲和持续激光微照射方法可以 进一步用于灭核，用于哺乳类卵去核损伤较小。a b e r g e l l 4 l _ 】等用n d ：y a g 激光照 射鸡胚的主动脉后，抑制了细胞外基质蛋白的合成，而且对胶原合成的抑制程度 远远大于对弹性蛋白合成的抑制。因此认为产生胶原的生物合成途径比弹性蛋白 合成途径对激光抑制作用更敏感。i a k y m e n k o 4 2 r k j 日本鹌鹑胚胎进行低水平红色 激光照射，发现1 5n o 的剂量导致1 d 龄鹌鹑肝中脂类过氧化物水平和自由基含 量明显增加，三周龄鹌鹑肝中可检测到红色激光照射的抗氧化剂效果。实验组肝 中脂类过氧化物产物的减少和血浆铜蓝蛋白的合成证实了这一点。这些变化伴随 着细胞色素p - 4 5 0 水平的增高，并不导致能量系统的抑制。a b d e l m a s s i h 【4 3 】等在 胞浆内精子注射前用激光束在卵母细胞透明带上打一微孔，结果胚胎发育率较传 统方法高。s h e f e r l 4 4 1 等研究提出低能量激光可能是通过特异受体的磷酸化作用特 异性激活m a p k e r k ( m i t o g e n - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e e x t r a c e l l u l a r s i g n a l r e g u l a t e dp r o t e i n1 【i n a s e ) 途径；进一步研究发现低能量激光促进细胞进入 细胞周期，激光照射后2 4 h 抗凋亡蛋白b c l 2 表达明显增加，而前凋亡蛋白b a y 表达降低，这些变化伴随着p 5 3 和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子p 2 1 表达降低【4 5 1 ；用低能量激光照射骨骼肌细胞，结果表明低能量激光可以促进蛋 白质合成，对细胞增殖起关键作用的细胞周期蛋白d l 在激光照射6 m i n 时即可 被诱导产生【矧。h a m a j i m a 等研究表明低能量激光照射2 h 后成骨细胞成骨诱导因 子的基因表达上调2 3 倍。 激光的综合生物效应能使农作物产生基因突变，染色体结构重排等，形成多 种多样的突变体，选择优良的突变体可以进行动、植物育种。如经激光辐射后的 山东人学硕十学位论文 沙f f j 柚嫁接到沙田柚树上，可以长出无核、少核的沙田柚果实。诱变的芽在发育、 传代过程中，与对照相比，在形态、酶活性、花粉育性、d n a 分子水平上存在 差异，表明激光诱变产生的性状变异是可以遗传的。谭石慈等用激光辐射观赏鱼 “锦鲫”的受精卵，育出具3 8 尾的变异新品种。其中双尾的新品种体色多样， 生长快，并可遗传，其观赏价值高于亲本。目前激光诱变育种研究的重点在提高 诱变品种的种类和数量上。 4 细胞水平检测d n a 损伤的新方法一单细胞凝胶电泳 单细胞凝胶电泳( s c g e ) ，又称彗星试验，是基于c o o k 提出的类核模型f 4 7 】， 由o s t l i n g 等于1 9 8 2 年建立，后又经s i n 曲等改进阿4 9 1 。c o o k 等提出了一种用 非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法，可用浓盐提取几乎所有的组蛋白 以除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂，处理后剩下的就是由核基质或r n a 、 蛋白质组成的支架以及d n a 所构成的类核。类核中的d n a 双螺旋以核小体组 蛋白为核心形成负超螺旋结构，因而d n a 不能自由旋转。c o o k 等提出一个模 型，d n a 片段虽有断裂，但仍能间断的附着在基质上，呈双螺旋结构，有效的 形成一系列环状、而不是线性分子，当加入嵌入剂溴乙锭时，负超螺旋松散，环 状结构从类核核心伸展开来，便会形成单链断裂【5 0 1 ，在荧光显微镜下看到的便 是彗星状的拖尾，那实际上可看作是被电场拉向一边的晕圈。同样，用电离辐射 来破坏环状结构时可发现相似的效应，单链断裂就足以使超螺旋松散1 5 1 1 。 单细胞凝胶电泳最常用的形式是细胞被包埋于琼脂糖中后，用去污剂和浓盐 溶解，这样d n a 就被固定，用于后续的电泳。目前广泛使用的碱性单细胞凝胶 电泳技术，是将待测的受损细胞与低熔点琼脂糖混合后铺于正常熔点胶上，以碱 性裂解液( p h = 1 0 ) 裂解细胞，破坏细胞膜、核膜等，使细胞质及蛋白和r n a 等进入胶板，继而弥散到裂解液中，而核d n a 仍呈双螺旋，紧密的附着在核骨 架上，因而仍保留在原位。在碱性电泳液( p h = 1 3 ) 的作用下，d n a 双链解旋成为 单链。此时，已经受损断裂的片段便会游离出来。电场作用于细胞时，断裂的核 酸片段因带负电而向阳极迁移。小片段迁移速度快，同样的电泳时间内迁移距离 更长，较大的片段迁移距离短，形似“彗尾。细胞受损程度与产生的d n a 断 裂片段数成正比，即受损越严重，断裂片段越多，电泳时发生迁移的d n a 片段 1 4 山东大学硕士学位论文 也越多，“彗尾 部分所占d n a 比例越高。因此，评价u v b 和激光照射致单个 细胞d n a 损伤程度的依据是“彗尾部分d n a 占总d n a 的比例。 两栖类的模式生物中华大蟾蜍 b u f o6 咖g a r g a r i z a n sc a n t o r ) 广泛分布于中 国各地区以及日本、俄罗斯等地。每年3 月初惊蛰前后产卵，每次可产5 0 0 0 粒 卵。中华大蟾蜍的卵为黑褐色，有一细长管状的胶带将卵连结起来，卵在胶带内 呈双股螺旋交错排列。胚胎发育至神经褶期才会从胶带中脱出，并附着其上，直 到发育成蝌蚪于当年完成变态长成幼蟾。中华大蟾蜍体外受精且受精卵在体外发 育，卵体积较大，直径约1 2 1 4 m m ，因此非常适合做研究光照对胚胎发育影响 的实验材料。为了进一步研究生物在特定光物理环境条件下的遗传适应性以及胚 胎发生过程中的分子机理，本论文以中华大蟾蜍早期胚胎为实验材料，用激光和 u v b 照射，分别检测了照射前后胚胎形态、蛋白质谱的变化以及d n a 受损程度 和表达差异，为环境生物学研究辐射对生物体的影响提供借鉴。 山东火学硕士学位论文 二、材料与方法 1 实验材料、试剂和仪器 1 1 实验动物 选取人工冬眠健康的雌、雄中华大蟾蜍，注射l r h a ，雌体注射2 0 单位 只，雄体注射1 0 单位只。注射后2 4 - 一4 8 h 抱对产卵，体外自然受精。待产卵后 o 5 h ，观察受精情况，受精卵为双螺旋排列，均呈饱满的正圆形。取出受精卵， 培养在晾过的自来水中，水与受精卵的体积比大于2 0 ：1 。 1 2 主要实验试剂 1 ) d e p c 处理i - 1 2 0 ：配制0 i d e p c 水溶液，3 7 。c 处理l h 后，于1 5 k g c m 2 的 液体循环下，高压蒸汽灭菌1 5 m i n 。 2 ) h o l f r e t e r 原液：n a c l0 3 5 9 ，k c l0 0 0 5 9 ，c a c l 20 0 1 9 ，n a h c 0 30 0 2 9 ，加d d h 2 0 定容至1 0 0 m l 。 3 ) 双向电泳样品裂解液：尿素5 4 9 ，2 n p - 4 02 m l ，0 2 r n la m p h o l i n ep h 3 9 ，5 ，巯 基乙醇0 5 m l ，加d d h 2 0 定容至1 0 m l 。 4 ) 胶条平衡缓冲液母液：尿素( 6 h d ，3 6 9 ，s d s ( 2 ) 2 9 ，t r i s h c i ( 0 3 7 5 m ，p h 8 8 ) 2 5 m l ，甘油2 0 ，2 0 m l ，用m i l l i q 水定容至1 0 0 m 。 5 ) 胶条平衡缓冲液i ：胶条平衡缓冲液母液1 0 m l ，d t t0 2 9 。 6 ) 胶条平衡缓冲液i i ：胶条平衡缓冲液母液1 0 m l ，碘乙酰胺0 2 5 9 。 7 ) 1 0 x 电泳缓冲液：t r i s 碱3 0 9 ，甘氨酸1 4 4 9 ，s d s1 0 9 ，加m i l l i q 水定容至 1 l 。 8 ) 双向电泳第一向