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毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 摘要 毛细管电泳是8 0 年代初发展起来的一种分离新技术，它是以高压电 场为驱动力，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现样 品的分离，具有分离效能高、分析速度快、进样量少、溶剂消耗少、运 行成本低和应用面广的特点，已成为药物及中药分析的重要分析方法之 。o 本文综述了毛细管电泳及其在药物分析中的应用，介绍了毛细管电 泳技术的基本原理和特点，主要做了以下工作： l 、采用高效毛细管电泳分离药物莽草酸及其对映体。探讨了缓冲溶 液的种类、浓度、p h 值、分离电压、进样时间、添加剂对分离的影响， 建立了分离莽草酸及其对映体的方法。结果表明，以3 0m m o l l t r i s 3 0 m m o l l h 3 8 0 3 ( p h = 8 6 ) 为缓冲体系，在波长为2 1 4n l t i ，分离电压为1 5 k v ，进样时间为1 0s 的条件下，实现了对莽草酸及其对映体的分离。 2 、建立了毛细管电泳电导法快速测定西米替叮的方法。利用非涂层 弹性融硅石英毛细管( 5 0c mx 7 5l a r n ) 为分离通道，优化选择缓冲介质、p h 值、浓度、操作电压、进样时间等实验参数。结果表明，在最佳实验条 件下：3 0m m o l lt r i s + 1 0 0m m o l lc i t ( p h = 8 2 6 ) 为运行缓冲介质，分 离电压为1 0k v ，西米替叮在9 分4 0 秒内能得到较好的检测。标准品溶 液浓度在o 5 2 0m g l 范围内有良好的线性关系，回归方程为 h - - - - 9 0 9 2 3 c + 1 5 8 3 ，相关系数r - - - 0 9 9 8 4 ，回收率在9 8 0 o - - - 1 0 8 之间。 3 、采用p h 为1 1 的碱性c a ( o h ) 2 溶液，用超声波法提取叶下珠中的 黄酮。结果与传统的乙醇提取法进行对比显示，用超声波提取法具有快 速、高效等特点。最佳提取工艺为：c a ( o h ) 2 的p h 值为1 1 ，超声波提取 时间为4 0 分钟，料液比为1 5 0 。在该条件下，叶下珠中黄酮的提取率为 1 9 5 。 4 、采用高效毛细管电泳法分离叶下珠中的黄酮类化合物，对叶下珠 中芦丁的含量进行测定。研究了运行缓冲液的种类、浓度和酸度、电泳 电压、进样时间等因素对分离检测的影响。结果表明，以6 0m m o l l 硼 酸盐( p h - - 9 o ) 为缓冲液，s d s 的浓度为1 6m m o l l ，检测波长为2 4 5a m ， 分离电压为1 5k v ，进样时间1 5s ，黄酮类化合物能够得到较好的分离； 芦丁在2 0 5 0 0m g l 线性关系良好( 产o 9 9 8 ) ，回收率9 3 2 一1 0 5 之间， r s d 小于8 ，该法操作简单，回收率及重现性良好。 关键词：毛细管电泳莽草酸西米替叮叶下珠芦丁 i i t h ea p p l i c a t i o no f c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i so nt h ea n a l y s i s o fm e d i c i n ea n dc h i n e s em e d i c i n e a bs t r a c t h i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( h p c e ) i s an o v e l a n a l y t i c a lt e c h n i q u ed e v e l o p e di n 19 8 0f o rt h es e p a r a t i o no fc o m p o u n d s b a s e do nt h ed i f f e r e n c e si nt h em i g r a t i o nv e l o c i t yo fi o n so rs o l u t e st h r o u g h t h eg i v e nm e d i u mi nt h ee l e c t r i cf i e l d d u et oi t sh i g hs e p a r a t i o ne f f i c i e n c y , h i g hs e n s i t i v i t y , f a s ts e p a r a t i o n ，s m a l ls a m p l er e q u i r e d ，l o wc o n s u m p t i o no f c h e m i c a l sa n dad i v e r s er a n g eo fa p p l i c a t i o n ，h p c eh a sb e c o m eo n eo ft h e m o s t i m p o r t a n tt e c h n i q u e s f o r t h e a n a l y s i so fm e d i c i n ea n dc h i n s e s m e d i c i n e i nt h i s t h e s i s ，t h ep r i n c i p l ea n dc h a r a c t e r i s t i co fh p c ea n d i t s a p p l i c a t i o n si na n a l y s i so fm e d i c i n ew e r ei n t r o d u c e d t h em a i na s p e c t sa r e s h o w e da sf o l l o w i n g ： 1 s e p a r a t i o n o fs h i k i m i ca c i db y h i g h p e r f o r m a n c e c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s e f f e c t so fs e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e ds u c h a st h ep ha n dc o n c e n t r a t i o no fr u n n 吨b u f f e r , o p e r a t i o nv o l t a g e ，i n je c t i o n t i m ea n da d d i t i v e s h i k i m i ca c i dc a nb es e p a r a t e du n d e rt h eo p t i m i z e d c o n d i t i o n s ：3 0m m o l lt r i s + 3 0m m o l lh 3 8 0 3o h = 8 6 ) a sr u n n i n g m b u f f e r ，15k vo p e r a t i o nv o l t a g e ，10sa si n je c t i o nt i m e 2 a q u i c k a n d s i m p l e m e t h o do fh i g hp e r f o r m a n c e c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i sw i t hc o n d u c t i v i t yd e t e c t i o nw a se s t a b l i s h e df o rt h ed e t e c t i o n o fc i m e t i d i n e s e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u ti nau n c o a t e df u s e ds i l i c ac a p i l l a r y ( 5 0c m x 7 50 m ) e f f e c t so fs e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e ds u c ha s t h ep ha n dc o n c e n t r a t i o no fr u n n i n gb u f f e r , o p e r a t i o nv o l t a g e ，i n j e c t i o nt i m e ， i n j e c t i o nh e i g h t c i m e t i d i n ec a nb ed e t e c t e di nn i n em i n u t e sa n df o r t ys e c o n d s u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ：3 0m m o l lt r i s + 10 0m m o l lc i t ( p h = 8 2 6 ) a sr u n n i n gb u f f e r , 10k vo p e r a t i o nv o l t a g e t h ec o n c e n t r a t i o no fc i m e t i d i n e w a sl i n e dw i t l lt h e p e a kh e i g h t i nt h e r a n g e o fo 5 - 2 0 m e g l ， h - - 9 0 9 2 3 c + 15 8 3 ，r - - 0 9 9 8 4 r e c o v e r yr a t eb e t w e e n9 8 - - - - 10 8 3 w i t ha l k a l iw a t e ra st h es o l v e n t ，f l a v o n ec a nb ee x t r a c tf r o m p h y l l a n t h u su r i n a r i al b ym e a n s o fu l t r a s o n i cw a v e s t h ee f f e c ti sc o m p a r e d w i t ht r a d i t i o n a le t h a n o le x t r a c t i o n t h er e s u l t sd e m o n s t r a t eh i g h e re x t r a c t i o n r a t ea n de f f i c i e n c yb yu l t r a s o n i cw a v e s t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e i d e n t i f i e da st h ef o l l o w s ：p ho fc a ( o i - i ) 2w a s11 ，t h et i m eo fu l t r a s o n i c t r a t m e n tw a s4 0 m i n ，t h er a t i oo fs o l i dt ol i q u i dw a s1 5 0 t h ee x t r a c t i o nr a t e w a s1 9 5 u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s 4 am e t h o do fh i g hp e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sw a s e s t a b l i s h e df o rt h es e p a r a t i o no ff l a v o n ei np h y l l a n t h u su r i n a r i al ，t h e c o n c e n t r a t i o no fr u t i n i np h y l l a n t h u su r i n a r i alw a sd e t e c t e d e f f e c t so f s e v e r a li m p o r t a n tf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e ds u c ha st h ep ha n dc o n c e n t r a t i o n i v o fr u n n i n gb u f f e r , c o n c e n t r a t i o no fs d s ，o p e r a t i o nv o l t a g e ，a n di n je c t i o nt i m e u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n ：6 0m m o l ln a 2 8 0 4 + 16m m o ld s ( p h 9 o ) a s r u n n i n gb u f f e r , 15k vo p e r a t i o nv o l t a g e ，t h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a s2 4 5 n l n ，t h ec o n c e n t r a t i o no fm t i nw a sl i n e dw i t ht h ep e a kh e i g h ti nt h er a n g eo f 2 0 - 5 0 0m g l ( r - - 0 9 9 8 9 ) ，t h ea v e r a g er e c o v e r yr a t eb e t w e e n9 3 2 一l0 5 ， r s dl o w e rt h a n8 k e yw o r d s ：c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s ；s h i k i m i ca c i d ；c i m e t i d i n e ； p h y l l a n t h u su r i n a r i al ；r u t i n v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包 含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过 的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中 明确说明并致谢。 论文作者签名：却7 隆彼 m 艿年产月弓de t 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 嘶口时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 黼糍：多椎1 芪聊虢彳菊坪幽。裤v 和日 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 1 1 毛细管电泳 1 1 1 概述 第一章前言 毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sc e ) 又称高效毛细管电泳( h p c e ) 或毛细 管电分离法( c e s m ) ，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液 相分析分离技术，具有分离效率高( 理论塔板数已达l o e - 1 0 7 m ) 、快速( 一般2 0m i n 内 即可完成一次电泳操作，甚至几分钟即可完成几十个阳离子或阴离子的分离) 、样品 用量少( 仅需纳升级) 等特点。应用范围包括无机离子、有机分子以及生物大分子和对 映体等，在分析化学、生物化学、分子生物学、药物化学、食品化学、环境化学和医 学等许多领域，有着广阔的应用前景。在近十几年中，c e 受到分离分析化学家的极大 关注，成为生物化学和分析化学中最受人瞩目，发展最快的一种分离分析新技术。本 章简要介绍毛细管电泳的历史与发展、毛细管电泳的分离模式和检测技术、毛细管电 泳在药物分析中的应用。 1 1 2 毛细管电泳的历史发展过程 以毛细管等速电泳( c i t p ) 的发展为起点，毛细管电泳方法可以追溯至1 j 1 9 6 0 年代甚 至更远【l 】。多数学者以毛细管区带电泳( c z e ) 的出现为起点，即便如此，其历史也可 追溯至u 1 9 6 0 年代中期1 2 瑚。c z e 是瑞典科学家h j e r t e n 首先提出的 4 1 。他用涂壁甲基纤维 素的3m m i d ( 内径) 石英管进行电泳分离，为锐化区带，他令管子饶轴旋转。此法构思 奇妙，可惜操作麻烦，难以实用。1 9 7 0 年，e v e r a e r t s 等报道了其在( c i t p ) 系统上得 到了区带电泳( c z e ) 的结果【5 】，但效率不足以引人关注。1 9 7 4 年，v i r t a n e n 认为必须 使用细毛细管方可以提高分离效率1 6 ，此观点为m i k k e r s 等于1 9 7 9 年所证实 7 1 。m i k k e r s 等一方面从理论上研究了影响c z e 效率的电场聚焦现象，一方面在实验上用2 0 0g x n i d 的聚四氟乙烯管为分离通道，获得小于1 0 岬板高的空前效率，这是c z e 发展史中的 第一个重大突破。1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 和l u k a c s 使用7 5 岬内径的熔融石英毛细管做 c z e ，利用电迁移进样和荧光检测，在3 0k v 电压下分离效率高达4 1 0 5 片m 的效率， 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 这一开创性的研究成果轰动了分离科学界，成为毛细管电泳发展史上的一个里程碑。 1 9 8 3 年后，h j e r t e n 先后提出了毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦法，它们不仅可以 大幅度提高效率，而且可以实现自动化操作，便于定性、定量工作。1 9 8 4 年t e r a b e 运用含s d s 胶束的“电泳分离了中性组分，从而建成m e c c ( 胶束电动毛细管色谱) 。 1 9 8 6 年，l a u e r 报道其在蛋白质c z e 中获得了1 0 6 片m 的高效率。 国内的c e 研究首先由竺安教授于1 9 8 0 年开始。他先后在中国科学院化学研究所和 浙江大学建立了两个研究组并从1 9 8 6 年开始陆续在有关会议和杂志上发表研究结 果，其中关于红细胞c z e l 8 1 ，扁形毛细管区带电泳【9 ，1 0 1 、低背景毛细管凝胶电泳和毛细 管梯度凝胶电泳】等具有理论和实际意义。1 9 9 2 年后，c e 开始在国内受到广泛重视 发展很快。1 9 9 3 年，由中国科学院化学研究所和大连化学物理研究所共同组织，在北 京召开了第一届全国毛细管电泳学术讨论会，此后每两年举行一次 1 2 毛细管电泳技术 1 2 1 毛细管电泳的多种分离模式 随着毛细管电泳技术的发展，产生了多种分离模式，如今的c e 不再局限于分离荷 电的大分子粒子，也适合于分离阳离子、阴离子和中性分子。c e 按分离模式的不同主 要有c z e ，m e k c ，c g e ，c i e p ，c i t p ，a c e ( a f f i n i t yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， 亲和毛细管电泳) 、c a e ( c a p i l l a r ya r r ye l e c t r o p h o r e s i s ，毛细管阵列电泳) 等( 详 细见表i - i ) 。 2 广西大学硕士论文毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 表1 - 1 毛细管电泳类型 t a b l e1 - 1t y p e so f c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s 3 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 毛细管区带电泳( c z e ) 是毛细管电泳的最基本的工作方式。它的分离机制是基于 各被测物质在溶液中的淌度差异，影响组分淌度的因素有组分的荷质比、结构和体积。 c z e 是最简单也是应用最广的一种模式，可用于氨基酸、肽、蛋白质、简单离子和对 映体等分析。 胶束电动毛细管色谱( m e k c ) 是采用表面活性剂在运行缓冲液内形成动态胶束，利 用样品各组分在水相、胶束相两相间分配行为上的差异进行分离，是色谱技术和电泳 技术的结合。 毛细管凝胶电泳( c g e ) 是将凝胶充入毛细管中作支持物，不同体积的溶质分子在 起分子筛作用的凝胶中得以分离。凝胶粘性大、抗对流、能减少溶质扩散，柱效极高， 但是c g e 带j j 备困难，易产生空泡。后来发展了无胶筛分，用粘度低的线性聚合物溶液 代替高粘度的聚丙烯酞胺，同样起到了分子筛的作用，而且比凝胶柱便宜、寿命长， 但是柱效稍低。c g e 现已广泛用于d n a 片段的分析。 毛细管等电聚焦( c i e f ) 用两性电解质在毛细管内建立p h 梯度，使各种不同等电点 的蛋白质在电场的作用下迁移到等电点的位置，形成一非常窄的聚焦区带。可用于测 定蛋白质的等电点、分离异构体和其它方法难以分离的蛋白质。 毛细管等速电泳( c l t p ) 可用较大内径的毛细管，在微制备中很有用途，可作为柱 前浓缩方法用于富集样品。 毛细管阵列电泳( c a p i l l a r ya r r a ye l e c t r o p h o r e s i s ，c a e ) 的分离模式渐渐呈 现出了广阔的应用发展前景和趋势。与传统聚丙烯酞胺凝胶板电泳相似，可以进行多 道平行分析，毛细管阵列电泳即是采用多根毛细管组成的阵列进行多道分析的一种分 离模式。 1 2 2 毛细管电泳的检测技术 c e 以其高效、微量、快速等特点引起了广泛的重视，因为毛细管内径极小( 通常 为2 5 1 0 0 | ln 1 ) 和纳升级的进样量，对检测器的灵敏度要求很高。可以说检测是c e 中的 关键问题。经过人们的不懈努力，目前己有多种检测器成功地用于c e 中。( 见表1 - 2 ) 4 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 表1 - 2c e 的各种检测器、检测限和特点 t a b l el 一2c h a r a c t e r i s t i c s d e t e c t i o nl i m i ta n dd e t e c t o r so f c e 毛细管电泳中应用最广泛的是紫外可见检测器，其灵敏度低，但通用性好，十 分适合小分子的分析。缺点是受毛细管狭窄内径的限制，有效光程短，其灵敏度相对 较低( 一般为1 0 巧- 1 0 咱m o l l ) 。激光诱导检测器灵敏度可比紫外可见检测器高1 0 0 0 倍，但是造价昂贵，且大多数样品需要衍生。联用技术是解决毛细管电泳定性问题的 最佳方法。毛细管电泳和质谱联用，可以测定5 1 0 个红细胞当中的血红蛋白i l 列。发展 新的联用技术是c e 研究中的重大方向之一。 1 3 毛细管电泳的特点 毛细管通常使用内径为2 5 1 0 0 岬的弹性熔硅石英毛细管，标准外径为3 6 0 岬， 因此毛细管具有以下特性：容积小( 一米长的毛细管容积仅为几纳升到十几纳升) 、侧 面截面面积比大，有利于散热且可承受高电场( 1 0 0 - 1 0 0 0v c m ) 、可使用自由溶液和 凝胶等支持介质、能产生平流形状的电渗流。毛细管的这些特性决定了毛细管电泳具 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 有以下特点： l 、高效。效率在1 0 5 一1 0 6 片m 间，c g e 效率可达1 0 7 片m 以上； 2 、快速。几十秒至十几分钟就能完成分离任务； 3 、微量。进样所需体积可小到l 岬，消耗体积在卜5 0n l 之间； 4 、经济。实验消耗仅几个m 1 的缓冲溶液，维持费用可用人民币分来计算； 5 、洁净。通常使用水溶液，对人和环境无害； 6 、自动。c e 是目前自动化程度最高的分析方法之一； 7 、多模式。可根据不同需要选择不同的分离模式，且只需一台仪器； 8 、分析对象广。从无机离子到到整个细胞，具有“万能力分析功能和潜力。 虽然c e 有着以上的诸多优点，但c e 也有其弱点，即分析结果的精密度较差，用于 定性分析的迁移时间及定量分析的峰面积重现性较差，因此限制了它的广泛应用。分 析家们为了克服c e 这一缺点，从仪器和理论及操作上进行了大量的研究工作，分析影 响c e 精密度的因素，探求提高重现性，进一步改善定量准确性的途径，并取得一定的 成果。 1 4 毛细管电泳在药物分析中的应用 近年来毛细管电泳在药物分析中的应用得到了迅速的发展。在中药材、中成药制 剂、西药复方制剂及生物技术产品等药物和制剂的分离、定性和定量中，显示了高效、 快速的特点。 1 4 1 西药分析 1 4 1 1 一般药物 黄宝美、莫金垣【1 3 j 采用毛细管电泳柱端安培检测法测定了脂可平胶囊中的姜黄 素。谢玉璇、谢天尧等采用毛细管电泳一电导法分离磺胺药物，磺胺嘧啶、磺胺甲 嘧啶、磺胺二甲嘧啶3 种结构相近磺胺药物。汪尔康采用碳纤维电极c e e d 分离了局 部麻醉要普鲁卡因和利多卡因。吴明嘉等利用毛细管电泳柱端检测模式测定了尿样中 6 毛细管电泳在药物及中药分析e e e b b s 用 的异丙嗪。 1 4 1 2 抗生素药物 单瑞峰等【1 6 1 采用高效毛细管电泳一电化学检测法测定了氯霉素针剂和氯霉素片中 的氯霉素的含量。m a l o n e 等1 1 7 l 利用毛细管电泳法直接测定人血清中的丝裂霉素c 。方 禹之等采用毛细管电泳法以各种金属盘电极作检测电极用于双氢链霉素、小诺霉素、 林可霉素、卡那霉素等九种多羟基抗生素的分离分析检测【1 8 】。 1 4 1 3 复方制剂 毛细管电泳在药物分析中的另一应用是用来分离测定复方制剂中的有效成分。方 禹之等用c e 分离分析测定复方磺胺类药物、三磷酸腺苷【1 9 1 。 1 4 1 4 手性分离 当今化学和医学中，生物物质对映体的分离，特别是在生命界具有不同生物活性 的对映体的分离，引起人们极大的研究兴趣。近年来毛细管电泳在手性分离方面起着 重要的作用，最主要因为它有以下优点： 1 分离效率高，分离选择系数小的对映体可以达到很好的分离度； 2 可供选择的分离模式多且变换简单； 3 手性选择剂的消耗量小，运行成本低。 近年来也有许多关于毛细管电泳用于手性分离的研究。h a d w i g e r 等 2 0 l 利用毛细管 电泳法，在含有环糊精的电泳液中分离了异丙肾上腺素的两个对映体。方禹之等1 2 1 1 以6 一环糊精作为手性试剂，利用该方法在强碱介质中直接分离了两种氨的衍生物， 2 一氨基- 1 - ( 4 - 硝基苯基) - 1 ，3 一丙二醇和2 一二甲基苯基- 1 - ( 4 一硝基苯基) - 1 ，3 一 丙二醇。 1 。4 2 中药材有效成分分析 毛细管电泳在中药及中成药分析中的应用虽然起步较晚，但发展十分迅速。目前 应用范围以从生物碱类、黄酮类及其苷类、有机酸类扩展到香豆素类、苷类、酚酸类 等多种成分的分析。这些成分都可以用毛细管电泳法进行分析。 7 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 1 4 2 1 生物碱类 生物碱是植物中一类重要的化学成分，在植物中分布较广。已知的生物碱种类至 少在3 0 0 0 种以上，生物碱能解离带正电荷，可采用毛细管区带电泳进行分析。王峻梅等 1 2 2 1 用高频电导毛细管电泳法实现了对千金藤属植物粉防己中粉防己碱和去甲粉防己 碱两种生物碱的测定。 1 4 2 2 黄酮类 黄酮类化合物是植物中普遍存在的植物次级代谢产物，具有多种药理作用，比如 抗炎、抗菌、抗病毒、解痉、抗肿瘤以及在心血管系统等方面均具有生理活性 2 3 之6 1 。 由于黄酮类化合物在药用方面的重要性，对于黄酮类化合物分离分析则显得尤为重 要。c a o 等【2 7 1 采用c z e 钡g 定了葛根、天麻中的葛根素、大豆甙元、天麻素等黄酮。t h e n 掣2 8 , 2 9 1 采用毛细管电泳法在碱性条件下测定了植物中的芦丁、槲皮素、黄芩素和黄琴 甙等黄酮甙元和甙。彭友元等【3 0 1 利用毛细管电泳安培检测器分离测定了沙棘黄酮口服 液中的芦丁和5 一羟色胺。陈刚等3 1 1 用毛细管电泳电化学检测法测定了葛根和葛藤中 葛根素、大豆甙元和芦丁含量。吴婷等p 2 】用毛细管电泳一电化学检测法同时测定了益 母草及三种益母草冲剂中的根皮苷、橙皮素、芦丁、山奈酚、洋芹素和槲皮素六种黄 酮类化合物的含量。c h e n 等【3 3 1 用毛细管电泳法检测了黄芩中的黄芩苷和黄芩素这两个 化合物。 1 4 2 3 酚酸类 酚酸类经解离后带负电，可用毛细管区带电泳( c z e ) 模式分离，但分析时间较 长。在电解液中加入阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵，使电渗流方向翻转， 此时负离子先出峰，使酚酸类分析时间大大缩短。c a o 等1 3 4 1 以c z e 法分析了满山红中原 儿茶酸、丁香酸、香草酸等有机酸的含量。曾玉华、汪云【3 5 】采用毛细管电泳法测定了 胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量。陈刚等冈用c z e 法同时测定复方芦丁片及果汁中芦 丁和l 一抗坏血酸的含量。彭友元等【3 刀采用毛细管电泳法同时测定了烟草中的多元酚， 即芦丁、绿原酸，槲皮素和咖啡酸。傅亮等网采用毛细管电泳同时测定了蜘蛛香根中 香叶木素、山奈酚、芹菜素、绿原酸和咖啡酸等5 种主要生物活性成分的含量。 8 毛细蕾电泳在药物及中药分析中的应用 1 4 2 4 苷类 c a o 等1 3 9 1 p 以c z e 法分析了天麻中的天麻苷及其它7 种成分。陈刚等【删采用c z e n 定 了黄芩中的黄芩素和黄芩苷。陈缵光【4 1 1 等采用毛细管电泳安培法测定鸡矢藤中熊果苷 的含量。郑一宁等 4 2 1 采用毛细管电泳一电导法检测法分离检测了双黄连粉针剂中黄芩 苷的含量。 1 4 2 5 糖类 由于糖类结构极其相似，且缺少生色团，给它的分离与测定带来了困难。传统的 糖类测定多采用滴定法，不仅速度慢，而且仅能测定糖类的总量，对于低含量成分测 定结果也不准确。高效液相色谱法具有同时分离检测多种糖等优点f 4 3 】，但该方法须有 专门的分离柱，价格昂贵，操作较繁琐，其他检测手段多为灵敏度较低的紫外吸收。 毛细管电泳电化学检测法对于大多数易于氧化还原物质的浓度检测限比紫外低得多。 因此c e 越来越多地被应用于分析如糖类等的缺少生色基团的分子。单瑞峰等 4 4 1 采用高 效c e 同时测定了南瓜中的蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖的含量。傅崇岗等【4 5 1 采用c e 法同时测定了枣中的主要成分蔗糖、葡萄糖、果糖的含量。丁祥欢等m 1 利用c e 技术分 离测定牛膝多糖水解液中的葡萄糖、甘露糖和果糖3 种单糖。 1 4 3 农药分析 王文雷等 4 7 1 用c e 法对对氧磷、甲基对硫磷、乙基对硫磷、扑灭松四种常见有机磷 农药进行了分离检测，此方法对4 种农药的质量检测限较气相色谱法低3 - 4 个数量级。 1 4 4 中药物化参数的测定 中药中很多成分是弱酸或弱碱性化合物，它们的物理化学常数与其性能及药理作 用有直接的关系。比如解离常数( p k a 或p k b ) 与药物穿过细胞膜的过程有相关性，这对 药理研究和新药开发都具有重要意义。采用c e 测定中药活性成分的解离常数具有简 单、快速、不需要纯样品等特点。宋立楠等 4 s j 用高效毛细管电泳一安培检测研究了核 苷酸的水解常数。冯海清等1 4 9 1 利用自制微圆盘铜电极，建立了一种c e 同时测定色氨酸、 丝氨酸和半胱氨酸p k a 值的新方法。张兰等1 5 0 1 建立了一种用c e 法测定四种生物碱：苯 异丙胺、苯丙醇胺、麻黄碱和甲基麻黄碱电离常数的线性模型和测定方法，并测定p k a 9 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 值。方禹之、叶建农等【5 l ，5 2 ，5 3 】分别利用c e 测定了糖类物质的解离常数和水解常数，所 测定的值与文献值一致。 1 4 5 中药指纹图谱研究 鉴于中药本身的药理特性和成分复杂性，加之目前药材来源的多样性、生产工艺 的不规范和分析要求的特殊性，中药的质量控制标准仍然是一个有待解决的国际性难 题。我国中医药界对指纹图谱在中药质量控制中的作用已达成了重要的共识，并提出 了多维多息特征谱和中药材特征性总成分指纹图等概念。孙国祥掣5 4 j 建立大青叶药材 的电泳指纹图谱( c e f p ) 。所建立的c e f p 具有较好的重现性，可用于大青叶药材的质量 控制。利云1 5 5 】、王天松嗣分别对h p c e 法在药物分析中的应用进行了评述和展望，并 将其与h p l c 法进行了比较，肯定了其在中药指纹图谱研究中的应用。 1 5 本论文研究的背景 毛细管电泳由于其具有分离效率高、快速、样品用量少( 仅需纳升级) 应用范围广 等特点，近十几年中，受到分离分析化学家的极大关注，成为生物化学和分析化学中 最受人瞩目，发展最快的一种分离分析新技术。 莽草酸是合成生物体内新陈代谢化合物的中间体，也是合成许多生物碱、芳香氨 基酸与吲哚衍生物、手性药物( 如抗病毒药) 的原料，对禽流感病毒亦有一定的抑制作 用。目前，已有诸多关于莽草酸的研究报道【6 8 , 织7 0 l ，而采用毛细管电泳对莽草酸及其 对应体分离的方法研究尚未见报导。 西米替叮是一种h 2 受体拮抗剂，能明显地抑制食物、组胺或五肽胃泌素等刺激 引起的胃酸分泌，并使其酸度降低，对因化学刺激引起的腐蚀性胃炎有预防和保护作 用，对应激性溃疡和上消化道出血也有明显疗效，目前对于西米替叮检测的方法有分 光光度法【7 2 1 、偏最小二乘法同近红外漫反射光谱相结合【7 3 , 7 4 1 ，高效液相色谱法1 7 5 , 7 6 ， 以上方法都需配合一些辅助手段，过程复杂，选择性较差，不利于快速分析。毛细管 电泳电化学检测灵敏度高、分离效率高、样品不需要预处理，设备简单。 叶下珠( p h y i i a n t h u su r i n a r i al ) 为大戟科叶下珠属中的一种草本植物，别名 珍珠草，夜合草等，为一年生矮小草本植物。我区各地常见，主要分布于长江流域的 南方各省区，产量丰富，夏秋采收，鲜用或晒干备用。我国民间应用历史悠久，一般 1 0 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 以全草入药，具有清肝明目、解毒消肿的功效，常用于治疗腹泻下痢、尿路感染、小 儿疳积、肝炎、肾炎等疾病。国外民间也广泛用于黄疸病及其它疾病的治疗嗣。1 9 8 2 年印度学者t h y a g a r a j a n 等人报告苦味叶下珠体外能有效地清除乙肝病毒，2 0 0 2 年谢 志春等人通过体外及动物试验也证实珍珠草( 叶下珠) 具有较明显抗h b v 病毒。 我国叶下珠植物中已发现的化合物有：正十八烷、十八碳烯酸乙脂、丁二酸、1 3 谷甾醇、鞣花酸、没食子酸、阿魏酸、老鹳草素，3 ，3 ，4 三甲氧基鞣花酸、短叶苏木 酚、短叶苏木酚酸、短叶苏木酚酸甲脂、短叶苏木酚酸乙脂、叶下珠素f 和i s o s t r i c t i n i i n 、 胡萝卜甙、山茶素、柯里拉京、生物碱、去氢诃子次酸甲脂、芦丁、鞣云实精、槲皮 素、去氢柯子次酸三甲脂、原儿茶酸等。 近年来，国内外学者对叶下珠的化学成分作了一定的研究。如我国万振先【5 3 5 9 1 等用乙醇渗漉法从江西产的叶下珠全草中分离出鞣花酸、3 ，3 ，4 一三甲氧基鞣花酸、阿 魏酸、丁二酸，没食了酸，胡萝卜甙、三十烷酸和1 3 一谷甾醇，短叶苏木酚，槲皮素， 芸香甙，三十烷等；张兰珍 6 0 l 等人用丙酮渗漉法对陕西产叶下珠的新鲜全草进行了化 学分离，分离得到1 4 个化合物，其中7 个分别鉴定为鞣云实精，芦丁，短叶苏木酚酸， i s o s t r i e t i n i i n ，鹳草素，没食子酸，鞣花酸；陈玉武【6 1 j 等人从福建省同安县采集的叶下珠 全草中分离并鉴定了4 个多酚类化合物，分别为新的鞣花单宁、焦酚、咖啡酸和 b r e v i f o l i n c a r b o x y l i ca c i d ；沙东旭【6 2 】等人乙醇回流提取法从叶下珠中分离得到6 个化合物，鉴定为短叶苏木酚酸乙酯、短叶苏木酚、柯里拉京、原儿茶酸、没食子酸 和鞣花酸；姚庆耐6 3 j 等从叶下珠的干燥全草中分得1 1 个化合物，经光谱分析和化学 反应等鉴定了1 0 个化合物，其中两个为新化合物，分别为短叶苏木酚酸甲酯和去氢 柯子次酸三甲酯。 关于叶下珠药理作用的研究：印度学者t h y a g a r a j a n 报告苦味叶下珠 ( p h y l l a n t h u s a m a r u s l ) 治疗乙肝病毒携带者，可使5 9 患者的乙肝表面抗原( h b - s a g ) 转阴。叶下珠的体内外抗hbv 作用，对动物肝细胞损伤的有防治作用，对人肝癌细 胞有影响作用，抗单纯疱疹病毒型的作用，治疗乙型肝炎。叶下珠素和叶下珠次素对 c c l 。和氨基半乳糖诱发的肝细胞损伤有明显保护作用。去氢诃子次酸甲脂和短叶苏木 酚酸甲脂已初步证实其明显的抗病毒和抗乙肝表面活性【6 4 1 。 叶下珠毒性的研究：仲英等用叶下珠提取物( 2g m 1 ) ，每鼠灌胃3m l ( 3 6 0 k g ) 。 经7 天未见动物有不良反应。该药尚未发现因长期服用出现明显毒副作用。 虽然现今国内已经从叶下珠中提取到很多成分，人们对苦味叶下珠展开了广泛深 广西大掌硕士论文 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 、 入研究，但其疗效仍存在较大争议，至今尚未能确定并分离出抗乙肝病毒的有效成分， 也尚未见用h p c e 研究苦味叶下珠的文献报道。 1 6 本论文研究的内容 建立一种毛细管电泳分离莽草酸及其对映体的方法，对进而利用毛细管电泳研究 莽草酸的抗病毒作用奠定基础：建立一种用毛细管电泳电导检测器测定西咪替丁的方 法，用于西咪替丁片及西咪替丁注射剂i 的测定，达到快速、简便的目的，拓展了毛细 管电泳电化学检测法在药物分析中的应用；研究用超声波提取叶下珠中黄酮类化合物 的提取工艺用于叶下珠的提取，达到高效、低耗的目的，用毛细管电泳分离叶下珠中 的黄酮类化合物，为进一步研究叶下珠中黄酮类化合物的抗乙肝病毒作用做了基础工 作。 1 2 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 2 1 引言 第二章高效毛细管电泳分离莽草酸及其对映体 莽草酸( s h i k i m i ca c i d ) 是合成生物体内新陈代谢化合物的中间体，也是合成许多 生物碱、芳香氨基酸与吲哚衍生物、手性药物( 如抗病毒药) 的原料。莽草酸能通过影 响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，具有抗炎、 镇痛作用，还可作为抗病毒和抗癌药物中间体【6 5 ，刚，也是合成临床上对感染禽流感病 毒的人有效的药物“达菲 的重要原料拶丌，对禽流感病毒亦有一定的抑制作用。毛细 管电泳具有高效、快速、灵敏、样品用量少等特点，是近年来发展起来的一种新型高 效分离分析技术，已经广泛应用于药物的分离分析。 目前，已有诸多关于莽草酸的研究报道。王晓强【6 8 】等采用高效液相法测定八角属 部分植物果实中莽草酸的含量，高海燕 e l 等采用反相高效液相色谱法测定梨汁中莽草 酸的含量，高智席r 7 0 】等采用离子增强反相高效液相色谱法测定落羽杉中的莽草酸。而 采用毛细管电泳对莽草酸及其对应体分离的方法研究尚未见报导。 2 2 实验部分 2 2 - 1 主要仪器及试剂 c l 2 0 0 1 高效毛细管电泳仪紫外检测器( 北京彩陆科学仪器有限公司，中科院研究 生院应用化学所出产) ；a b 2 0 1 一e 电子天平( m a d ei i ls 诚z e d a n d ( 瑞士) ) ；p h 2 1 1 c 酸度 计( 北京哈纳科技有限公司) ；石英毛细管柱7 5 ”m ( i d ) 5 5c m ( 河北永年光纤厂) ； 微量移液器n i c e s te x ( o 5 1 0l il 和l o l o o i il ，m m ei 1 1j a p a l l ) ；紫外一分光 光度计( 澳大利亚，g b c ，u v n i s9 1 6 ) ；1 8 1 0 型石英自动双重纯水蒸馏器( 江苏省宜 兴市石英玻璃仪器厂) 。 莽草酸( s 战m i c i d ) ( n e wk m e lu s a ：1 - 8 0 0 a c r o s 0 1 ) ；三( 羟甲基) 氨基甲 烷( 晡s ) ( b r 上海东风生化技术有限公司) ；硼酸( o a ，中国上海试剂总厂) ；十二烷基硫 毛细管电泳在药物及中药分析中的应用 酸钠( s d s ) ，( 瑞兴科技有限公司) ；其余试剂均为分析纯，水为实验自备二次蒸馏水。 2 2 2 缓冲溶液和样品溶液 分别配制1 0 0m m o f l 柠檬酸( c i t ) 、h 3 8 0 3 、磷酸氢二钠、t r i s 、2 5m m o l l s d s 作为储备液。实验时，按比例各取适量配置成所需的电泳运行缓冲溶液。1 0m m o l l 莽 草酸标准样品用缓冲溶液