（农产品加工及贮藏工程专业论文）荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究.pdf

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8 型大孔吸附树脂的精制， 荷叶黄酮的得率达到5 9 3 1 。 4 荷叶黄酮性质初步鉴定纯化后的样品通过颜色反应法、薄层层 折法( 展开剂为：甲醇：氯仿：乙酸乙酯：乙酸= 5 ：3 ：1 ：1 ) 、紫外吸收光谱 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 和商效液相色谱法( h p l c 分析条件为：a l l t i m a - c 1 8 柱( 4 6 m m 2 5 0 r a m ) ； 流动相；甲醇- 水一磷酸( 4 5 ：5 5 ：0 2 ) ；流速0 6 m l m i n ；柱温3 0 c ；进样量 2 0 u l ；检测波长3 5 8 n m ) ，可以初步确定主要为黄酮类化合物中的黄酮醇 类黄酮和黄酮类黄酮。 关键词：荷叶黄酮超微粉碎提取分离纯化抗氧化 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t l o t u sl e a rc o n t a i n sl o t so ff l a v o n o i d s f l a v o n ei nl o t u sl e a fi so n eo ft h e m o s ti m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a la n da c t i v em a t t e r sw h i c hh a sab e t t e rc a p a c i t yo f a n t i - o x i d a t i o na n da n t i - c a d u c i t y , c u r i n gb l o o dv e s s e ld i s e a s e s , d r o p p i n gl e v e l o fc h o l e s t e r i na n ds oo n 1 1 l c & a i i 枷o i lt e c h n i c s a n t i - o x i d a t i v ec a p a c i t y , p u r i f i c a t i o nm e t h o da n dc h a r a g t e ro ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a fw c i em a i n l y s t u d i e di nt h i sp a p e ra n dt h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 0 p t i m u me x t r a c t i o nt e c h n i co ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a l1 1 l es u p e r f i n ec r u s h i n gt e c h n i q u ew s sp u ti n t oe x t r a c t i o nt e c h n i co ft r a d i t i o n a l e i r c u m f l u e n c ea n du l t r a s o n i c b yc o m p a r i n gt w od i f f e r e n te x t r a c t i o nm e t h o d s , i tw a sa na d v a n t a g et h a tp u t t i n gt h es u p e rf i n ec r u s h i n gt e c h n i q u ea n d u l t r a s o n i ct e c h n i q u et o g e t h e r , w h i c hc o u l ds a v et i m e , s a v e c 缸a c d o ne n e r g y , i n c r e a s ea ( h t i o ne t f i c i e n e ya n dh a dh i g h e ra p p l i e dv a l u e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m u me 】( 乜枷o nc o n d i t i o n sw e r es i z eo f m a t e r i a ld 5 0 t h e p o w e ro f u l t r a s o n i c , e t l l a l l o lc o n c e n t r a t i o n , s o l i d l i q u i dr a t i oa n dt h ee x t r a c t i o n t i m ew e r e7 2 5 i _ t m , 2 0 0 w , 7 0 1 ：2 0a n d9 r a i nr e s p e c t i v e l y 1 1 1 ey i e l do f t h e f l a v o n o i d sw a s5 3 5 u n d e rt h ea p p r o p r i a t ec o n d i t i o n s s u p e rf i n ec r u s h i n g a n du l t r a s o n i cc o u l dh e l pt h ee x t r a c t i o no f f l a v o n o i d sc o n s t i t u e n t si nl o t u sl e a f 2 t h es t u d yo fa n t i - o x i d a t i v ec h a r a c t e ro ft l a v o n o i d si nl o t u sl e a 低d e o x i d i z ea b i l i t y , e l i m i n a t i v ea b i l i t yo f 0 2 a n d 0 ha n t i - o x i d a t i v ea b i l i t y w e r os t u d i e d i tw a sf o u n dt h a tl o t u sl e a rf l a v o n o i d sh a dh i g h e rd e o x i d a t i v e a b i l i t yt h a nv c ，w h i c hc o u l de l i m i n a t e0 2 a n d 0 ho b v i o u s l ya n dr e s t r a i nt h e o x i d a t i o no f t h el i p i nw i t ht h ec i t r i ca c i d 3 t h ei s o l a t i o no ff l a v o n o i d so fl o t u sl e a fb ym a c r o p o r o u sr e s i n s m a c r o p o r o u sr e s i n sh a dg o o da d v a n t a g e so fb i ga d s o r p t i o nc a p a b i l i t y , g o o d e n r i c h m e n te f f e c t , m i l dd e s o r p t i o nc o n d i t i o n s ，s i m p l er e b i r t hc o n d i t i o n s ，l o w c o s t s ，l o n gu s i n gl i f ea n ds oo n , w h i c hw e r ea d a p t t op u r i f i c a t i o no f f l a v o n o i & t h r e et y p e so fm a c r o p o r o u sr e s i nw e r ec o m p a r e di nt h ea b i l i t yo fa d s o r b i n g a n dd e s e r b i n gf l a v o n o i d so f l o t u sl e a r 1 1 1 eo p t i m a la d s o r b e n tf o rf l a v o n o i d so f l o t u sl e a fw a ss e l e c t e da n di t sd y n a m i ca b s o r b i n gb e h a v i o rw a ss t u d i e d 1 1 l c r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea b - 8r e s i np o s s e s s e dh i g h e ra b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o n c a p a c i t ya n dt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r et h ef l o wr a t eo f a b s o r p t i o ns o l u t i o n , s u h n i o nc o n c e n t r a t i o n , p h , e l u t i o ns o l v e n tc o n c e n t r a t i o n , f l o wr a t ea n dd o s a g e o fe l u t i o nw e r 03 b v h , a b o u t2 m g m l ，6 ，8 0 e t h a n o l ，1 5 b ha n d3 b v 3 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 r e s p e c t i v e l y t h ep r o d u c ty i e l dc o u l db e5 9 3 1 b yr e f i n e m e n to ff l a v o n o i d s f r o mi o t u si e a r 4 t h ep r o p e r t i e so ff l a v o n o i d si nl o t u sl e a l1 k f l a v o n o i d sw h i e hh a d b e e np u r i f i e dw e r ed e t e c t e da sf l a v o n o la n df l a v o n eb yc o l o rr e a c t i o n , t l c m e t h o d s o l v e n to ft l c ：m e t h y la l c o h o l ：c h l o r o f o r m ：e t h y la c e t a t e ： a c e t i ca c i d = 5 ：3 ：l ：1 ) ，u va b s o r bs p c c 衄ma n di - t p l cm e t h o d ( t h ec o n d i t i o n s o fa 1 r i r m - c l sc o l u n m , m o v i n gp h a s e ：m e t h y la l c o h o l ：w a t e r ：p h o s p h o r a c i d = 4 5 ：5 5 ：0 2 ，3 5 8 n mo fd e t e c t i n gw a v e l e n g t h , o 6 m l m i no ff l o wv e l o c i t y , 3 0 co f p o l et e m p e r a t u r e ) k e yw o r d s ：l o t u sl e a ff l a v o n o i d s , s u p e rf r e ec r u s h i n gt e c h n i q u e ，e x t r a c t i o n ， i s o l a t i o n ，a n t i o x i d a n t 4 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 荷叶的化学成分 荷叶自古以来就是一种药食两用的植物，在民间有着非常广泛的应 用。 荷叶除了含有普通植物所共有的碳水化合物、蛋白质、脂质、单宁 等常规化学成分外，还含有荷叶碱、原荷叶碱、亚荚罂粟碱、n - 去甲基 荷叶碱( 福田真雄，日本) 及丰富的莲甙、槲皮素及异槲皮素等黄酮类 化合物( 中国医学科学院，1 9 9 4 ) 。本草纲目载“荷叶服之，令人瘦 劣”，“生发元气，散瘀血，消水肿”。本草再新言其“清凉解暑，止 渴生津”本草通玄言其“开胃消食，止血固精”。中医认为，荷叶性 味甘、寒、入脾、胃经，有清热解暑、平肝降脂之功，适用于暑热烦 渴，口千引饮，小便短黄，头目眩晕，面色红赤，高血压、高血脂症。 清代叶天士在临症指南医案中指出治暑热、暑感、劳伤夹暑，皆用 荷叶汁；治风头痛，暑热头胀，以及暑邪闭窍，耳听失聪用鲜荷叶 孔伯华医集中记载9 8 9 医案，使用荷叶者就达2 6 0 案，使用率达 2 6 3 。荷叶入食味清香，可口宜人，入药可理脾活血，祛暑解热，治疗 暑天外感身痛及脾湿泻泄。1 9 9 1 年1 1 月中华人民共和国卫生部卫监发 ( 1 9 9 1 ) 第4 5 号文件中，荷叶被列为“既是食品又是药品”其在食用及药 用两方面均有较广泛的作用( 范继善，1 9 9 3 ) 。 1 1 1 黄酮类化合物 荷叶中的黄酮类化合物主要是荷叶苷，其次是槲皮素、异槲皮素等 常见的黄酮类物质。( a w a t i f 等，2 0 0 3 ) 从荷叶中分离出n y m p h o l i d ea ， n y m p h o l i d eb 和m y r i c e t i n - y - ( 6 “p - c o u m a r o y l ) g l u c o s i d e ( 见图l ，图2 ，图 3 ) - - 种黄酮类物质。 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 图1n y m p h o l i d e a 图2n y m p h o l i d e b 图3m y r i c e t i n - 3 - ( 6 ”p - c o u m a r o y l ) g l u c o s i d e 1 1 2 生物碱类物质 生物碱是存在于植物中的碱性含氮化合物，大多数具有含氮杂环， 有旋光性和明显的生理效应。生物碱的发现起始于1 9 世纪初，是研究的 山东农业大学硕士学位论文 最早也是最多的一类天然有机化合物，迄今已知的生物碱多达1 0 0 0 多 种。植物碱是一类极有药用价值的化合物。日本人富田真雄等从荷叶中 分离出荷叶碱( n u c i f e r i n e ) 、莲碱( g o e m e r i n e ) 及0 一去甲基荷叶碱 n o m u c i f e r i n e ) 3 个单体成分以来，至今己从荷叶中分离出众多生物碱化合 物。根据母核结构不同可将荷叶生物碱分为以下三类： ( 1 ) 单苄基异喹琳类：包括亚美婴粟碱( a r m e p a v i n e ) ，n - 甲基异衡州乌 药碱( n - m e t h y l i s o c o c l a u r i n e ) ，n 甲基衡州乌药碱( n - m e t y l c o c l a u r i n e ) 。 圆阿朴啡类：包括融白e ，n - 去甲基荷叶碱( h l - n o m u c i f e f i n e ) ，o n o m u c i f e r i n e ，番荔枝碱( a n o n a i n e ) ，r o e m e r i n e ，鹅掌揪碱 ( l i r i o d e r i n e ) ，1 4 - 去甲基亚美婴栗碱( n - n o r a r m e p a v i n e ) ，2 - 羟基1 甲氧基 阿朴啡( 2 - h y d r o x y - l - m e m o 碍a p 唧岫l e ) 。 ( 3 ) 去氢阿朴啡类：去氢荷叶碱( d e h y d r o n u c i f e d n e ) ，去氢莲碱 ( d e h y d r o m e m e r i n e ) ( 刘淑萍，樊淑彦，2 0 0 4 ) 荷叶中的生物碱碱性较弱，不能直接溶解于水中，但生物碱与酸作 用生成盐类后，则可溶于水中，故荷叶碱可用偏酸性的水溶液提取。 1 1 3 挥发性精油 新鲜荷叶具有令人愉快的清香气味，香气淡雅，带有田园气息，可 以作为香料资源加以开发。( 刘密新等) 用色谱法，色谱质谱法和标准 样品核对，对荷叶精油成分进行了分析研究，从其中共鉴定了4 8 种精油 成分，占总峰面积的9 2 5 。( 傅水玉) 等用x a d - 2 型树脂采集荷叶天 然香气，以双柱毛细管。跏m s d s 联用法和三柱毛细管保留指数法分离 鉴定了8 7 种组分，占总峰面积的9 3 2 6 0 ，其中含量较大的组分有顺- 3 己 烯醇( 4 0 4 1 ) ，二苯胺( 8 3 5 0 0 4 ) ，长叶烯( 5 6 ) ，正己醇( 3 6 5 哟。苯 0 1 2 ) ；同时用蒸馏萃取法( s d e ) 提取荷叶精油，以双柱毛细管 g c m s d s 联用法分离鉴定了9 t 种组分，其中顺3 己烯醇( 2 7 4 9 1 ，反 2 戊烯醇( 1 1 0 7 ) ，1 - 戊烯3 酵( 9 0 1 哟，反- 2 己烯醛( 5 3 6 呦以及部分烃 类和含氧化合物。 1 1 a 有机酸类物质 ( 许嘉祥) 利用纸上层析法，以戊醇乙酸水及丁醇乙酸水为溶剂 系统，在荷叶中检出了酒石酸( t a r t a r i ca c i d ) ，柠檬酸( c i t r i ca e i d ) ，苹果酸 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 ( m a l i ca c i d ) 和草酸( o x a l i ca c i d ) ，葡萄糖酸( m a l t o n i ca c i d ) ，琥珀酸( a m b e r a c i d ) 等7 种非挥发性有机酸。( 李志诚等) 经多次柱层析，得到没食子 酸( g a l l i ca c i m ，正二十八烷( o c t a c o s a n e ) ，正十八烷酸( s t e a r i ca c i d ) ，苯甲 酸( b e n z o i c a c i d ) ，邻羟基苯甲酸( o - h y d r o x y b e n z o i ca c i d ) 等。 1 2 荷叶功能性质的研究 1 2 1 抗氧化作用的研究 众多实验研究表明，黄酮类物质在抗氧化反应中不仅能清除链引发 阶段的自由基，而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基，阻断自由 基链反应，起到预防和断链双重作用。黄酮类化合物所具有的独特的抗 氧化活性正是这些基本化学性质的综合体现( 刘莉华等，2 0 0 2 ) 。 用现代的电子自旋共振法自旋捕集技术研究荷叶水提物( l l e ) 对羟基 自由基( o h ) 和超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 清除效果。结果显示2 6 9 4 1g m e 的l l e 对次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶体系产生0 2 的清除率达6 5 6 ，l l e 浓度大于8 9 8 m g m l 1 时可以全部清除由f e n t e n 反应体系产生的o h ，大 约4 0 9 m l 1 的l l e 就可以清除0 2 。可见荷叶的水提物是一种较好的抗 氧化剂，在较低的浓度下即可显示出非常强的抗氧化能力并且荷叶的甲 醇提取物的抗氧化性与b h a 相当，略高于a 生育酚( 余以光，陈海光 等，2 0 0 1 ) 。对于荷叶的生理活性研究，国外较少，只有台湾几位学者 对荷叶的抗氧化活性进行了研究。他们通过体外培养实验，认为荷叶的 甲醇提取物具有清除超氧自由基、羟自由基的能力，说明荷叶的甲醇提 取物具有保护细胞免受氧化损坏的能力。另外，荷叶的甲醇提取物还具 有抗血色素诱导的亚油酸过氧化的能力。 1 , 2 2 抑菌作用 荷叶具有抑菌的功能，目前主要进行抑制食品及口腔细菌的研究。 8 0 7 醇荷叶提取液对常见的几种食品微生物进行抑菌活性研究。 结果表明，对各种供试菌种均有抑菌活性。其中对细菌及酵母菌，特别 是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果最为显著，但对米根霉抑制作 用较弱。荷叶的乙醇提取物对大多数供试菌的m i c ( 最低抑菌浓度) 值小 于或等于8 。实验结果同时表明荷叶提取物在中、弱碱性条件下抑菌活 性最强，并能耐受超高温瞬时的热处理。荷叶的超临界c 0 2 萃取物( 精油) 山东农业大学硕士学位论文 对细菌、酵母、霉菌均有一定的抑菌活性，m i c 不超过1 5 6 9 l ( 纪丽 莲，1 9 9 9 ) 荷叶提取物有效成分( 金效桃苷) 经对口腔致病菌的药理筛 选实验显示，能明显抑制引起牙龈炎的致病菌，其有效抑菌浓度为 5 m g m l 。目前荷叶提取物己应用于牙膏产品中，并建立了其有效成分 ( 黄酮类化合物) 在牙膏中的定性定量检测方法。测得荷叶提取物中黄酮 质量分数在3 0 以上，添加在牙膏中的荷叶提取物黄酮量的定量测试方 法的回收率可达9 6 5 8 * , - 9 9 0 8 ( 陈健芬等，2 0 0 3 ) 。荷叶的抑菌活性 成分主要为抗有丝分裂的碱性成分，该成分抑制细胞的有丝分裂，故而 抑制细菌和酵母菌的繁殖( 唐峪芳，2 0 0 4 ) 1 2 3 降血脂、减肥作用的研究 研究开发毒副作用小、调脂效果好、服用安全、患者易于接受的调 脂药物或有调脂功效的保健食品，具有一定的现实意义 用含有不同荷叶成分的提取物对高脂血症模型大鼠进行灌胃研究， 结果表明均有降脂的功效，只是不同成分的提取物功效不完全相同。 ( 杜力军等人) 以急性高脂血症小鼠为整体模型，观察荷叶水提取物对 血清胆固醇及甘油三脂的影响。研究结果显示：荷叶黄酮、生物碱部分 对急性高脂血症小鼠的t g 有明显的抑制作用。荷叶黄酮对小鼠高胆固 醇表现出明显的抑制作用。荷叶水提取部分、生物碱部分及黄酮部分对 t o 均没有表现出明显的量效关系，且出现大剂量无效而小剂量有效的现 象。体外培养肝细胞合成t c 实验显示：荷叶黄酮在使肝细胞内t c 降低 的同时又使培养液t c 明显升高其作用主要表现在促进脂类代谢方 面，对其合成的抑制作用较弱主要活性部位集中在黄酮上，其次是生 物碱。( 涂长春等人) 单以荷叶生物碱灌喂肥胖大鼠。结果不反映机体 肥胖程度的增长指标如k fs 指数及血脂都有明显下降，肥胖大鼠的体 重受到明显抑制，与模型组比较具显著差异性口 o 0 5 ，p 5 0 0 0 m g k g 。 由此可见荷叶水提物基本无毒( 喻泽兰等，2 0 0 3 ) 。 1 3 荷叶黄酮的提取 由于黄酮类化合物的结构及存在状态不同，其溶解度存在很大差 异。目前，对苷类和极性较大的苷元，常用某些极性较大的混合剂( 甲 酵：水= 1 ：1 ) j 水、甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯进行提取，而对大多数 苷元则采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等极性较小的溶剂进行提取，并且一 些研究者为了提高所得产物的收率，还采用了外加物理场的方法，以下 是几种较新颖的提取方法：( 1 ) 超滤法。选用超滤法可以提高提取物的纯 度，并且在提取生产过程中，可以减少废水排放，避免臭水、污水的产 生，能降低生产成本。( 2 ) 微波提取法。大连化学物理研究所的( 李蝾等 人) 曾用微波法提取过银杏叶中的黄酮甙。发现溶剂萃取前对原料和水 的混合液进行短时间微波处理，能大大提高黄酮提取率和缩短溶剂萃取 所需的时间，同时因为水成本低廉、安全性高，提出了用水代替有机溶 剂浸取的新工艺的设想。( 3 ) 超声波提取法。( 郭孝武) 曾研究过超声波 和热碱提取对芦丁成分黄酮类化合物溶解特性影响，发现超声波辅助萃 取不会破坏芦丁成分差异也很大，因此应据其极性和水溶性的大小选择 合适结构，能够缩短提取时间，提高有效成分的提出率适当的溶剂进行 提取。 黄酮类化合物的分离纯化方法很多，有柱层析、薄层层析、铅盐沉 1 0 山东农业大学硕士学位论文 淀、硼酸络合、p h 梯度萃取、溶剂萃取以及近年来应用的高效液相色谱 ( h p l c ) 、液滴逆流层析( d c c c ) 、气相层析、微乳薄层色谱等。 1 a 超微粉碎 超微粉碎技术是近年在国际上发展起来的一项新技术。所谓超微粉 碎是指利用机械或流体动力的途径将物料颗粒粉碎至粒径小于1 0a m 以 下的过程。超微粉体是超微粉碎的最终产品，具有一般颗粒所不具有的 一些特殊的理化性质，如良好的溶解性、分散性、吸附性、化学反应活 性等( z h e n gx i a o l i ，1 9 9 3 ) 。超微粉碎技术己被广泛应用于化工、医药、 食品、农药、化妆品、染料、涂料、电子、航空航天等诸多领域( 郭辰 生，1 9 9 8 ) 随着我国中药产业化和现代化研究方向的确立，超微粉碎 技术逐渐被应用到中药制药中，且呈现出良好的发展态势。它可以增加 药物吸收率，提高生物利用度；有利于保留生物活性成分，提高药效； 节省原料，便于应用( 郭学东，2 0 0 0 ；吕海文等，2 0 0 1 ) 。超微粉碎在 中药生产中已显露出特有的优势，并会获得更大的发展。 1 5 超声波技术 天然植物药用成分大多为细胞内产物，提取时大多需要将细胞破 碎。现有的机械或化学方法有时难以取得理想的破碎效果。利用超声波 产生的强烈振动、高的加速度、强烈的空化效应、搅拌等特殊作用，可 以破坏植物药材的细胞，使溶媒渗透到药材的细胞中，以便使药材中的 化学成分溶于溶媒中，再通过分离提纯以得到所需要的化学成分( 曾 礼，2 0 0 2 ) 。所以用超声波提取化学成分可大大地缩短提取时间，提高 提出率，得到的化学成分结构和性质也不会改变。 1 6 富集分离黄酮类化合物 ( 麻秀萍等) 比较l o 种大孔吸附树脂对银杏叶黄酮的吸附性能及吸 附动力学过程，筛选试验研究的结果证明a b 8 树脂对银杏叶黄酮有很 好的吸附作用。( 刘中秋等，2 0 0 1 ) 以保和丸中主要药味陈皮的主要成 分橙皮苷富集程度为考察指标，考察大孔树脂富集保和丸有效成分的最 佳工艺条件，得出保和丸提取液( 5 0 0 9 l ) 5 m l 上大孔树脂柱( 1 5 m m + 1 0 0 m m ) ，吸附3 0 m i n 后，先用1 0 0 m l 水洗脱除去杂质，再用1 0 0 m l 5 0 乙 醇洗脱橙皮苷，大孔树脂富集橙皮苷洗脱率在9 5 以上，5 0 乙醇洗脱 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 液干燥后总固形物为处方量的4 。( 崔成九等) 利用大孔树脂分离葛根 中的总黄酮，将7 0 乙醇提取液浓缩后上大孔树脂柱，先用水洗脱，再 用7 0 乙醇洗至t l c 无葛根素斑点，葛根总黄酮收率为9 9 2 ，高于正 丁醇法。( 刘斌等，2 0 0 2 ) 考察1 3 种大孔树脂对蒲黄总黄酮的吸附分离 性能结果表明，a b 8 型树脂效果良好，工艺条件为：上样浓度2 0g l ， 吸附流速2 m l m i n ，洗脱剂5 0 乙醇，洗脱剂用量为7 倍于树脂体积， 洗脱流速2 m l m i n ，树脂可重复使用3 次，乙醇洗脱物中蒲黄总黄酮含 量达7 5 以上，回收率达8 0 以上。 开发选择性强的新型树脂可更有效地发挥其在中草药有效部位富集 中的作用，根据化合物的更细致的结构类型开发研制高选择性的树脂， 如开发研制可针对黄酮类化合物中的一种类型( 黄酮、异黄酮、黄烷等) 的吸附树脂，使树脂更具选择性，提高分离效率，为富集中草药中一种 或几种有效成分提供方便、快捷、省时、低成本的方法。 1 7 本课题的研究目的、内容和意义 。 1 7 。l 本课题研究的目的 由于荷叶有较好的去脂减肥、降血压、抑菌、抗氧化等功效，可将 荷叶有效成分浸提出来作成药剂用于临床，或将荷叶直接与其他中草药 配伍成中药合剂用于医疗或保健，或作无毒无副作用的天然食品添加剂 用于食品防腐保鲜，或直接入撰，既可食用又可药用等等。荷叶资源值 得进一步开发和研究，荷叶黄酮的功能性质值得深入细致的研究。目前 荷叶制剂或荷叶加工多以粗制剂和粗加工为主。对于荷叶黄酮的提取均 以粗原料为主，且传统的提取工艺不利于荷叶黄酮的深入加工。将现代 提取技术应用于荷叶黄酮的提取中，将有利于荷叶黄酮优化提取。同时 目前对于荷叶中主要活性成分的分离提纯以及各个单体的药理研究都有 待深入研究。荷叶黄酮的提取应该粗加工向提取、精致、深加工转化， 多途径、多学科的对荷叶黄酮进行系统研究，从而开发出高效、低毒廉 价的添加天然产物活性成分的保健制品，其将具有深远的研究价值和市 场前景。 1 7 2 本课题研究的内容 ( 1 ) 荷叶黄酮提取工艺的优化 山东农业大学硕士学位论文 ( 2 ) 荷叶黄酮抗氧化性质的研究 ( 3 ) 荷叶黄酮的富集分离 c 4 ) 荷叶黄酮的性质鉴定 1 7 3 本课题研究的意义 黄酮类化合物简称类黄酮，是一大类天然产物，广泛存在于中草药 的有效成分。目前很多具有世界先进水平的抗氧化剂、治疗心脑血管疾 病药物的功能因子都是类黄酮。临床试验证实：类黄酮既是药理因子， 又是重要的营养的因子，使一种新发现的营养素，具有良好的降血脂、 降血压、防止血栓形成、防治心脑血管疾病、增强免疫力等功能。当人 体内缺乏类黄酮时，易导致大脑和心脏功能不全、动脉硬化等疾病。人 体自身不能合成类黄酮，主要依靠从蔬菜、水果、谷物等食物中摄取一 定量的类黄酮，而且类黄酮在体内代谢很快，所以需要不断的补充。正 因为类黄酮对人体有如此重要的作用，加之近年来自由基生命科学的进 展，研究开发类黄酮这种天然活性物质便成为营养和医学领域的重要课 题，使具有强抗氧化和清除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。 我国荷叶资源极为丰富，但其应用价值相对不够充分，造成了荷叶 资源的极度浪费。因其使用价值较大且来源广泛，近来人们加大对其活 性化学成分和药理方面的研究，进一步明确其所含化学成分( 如黄酮、生 物总碱等) 与药效之间的关系。从极为丰富而又廉价的荷叶中提取功能性 极高的黄酮类物质具有重大意义。这些研究成果将为荷叶在食品、药品 中的应用提供科学依据。 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 2 材料与方法 2 1 实验原料 湖南韶山红莲莲叶，经过干燥脱水后成荷叶粗品。 大豆油、猪油，均购于泰安农贸市场。 h 1 0 2 0 型、n k a i i 型、a b 8 型大孔树脂，天津南开大学化工厂 2 2 主要试剂 试剂名称 芦丁 1 1 魁s 无水乙醇 亚硝酸钠 硝酸铝 邻苯三酚 盐酸 。 邻二氮菲 磷酸二氢钠 磷酸氢二钠 硫酸亚铁 双氧水 可溶性淀粉 碘 碘化钾 乙酸 三氯甲烷 b h t 抗坏血酸 酒石酸 柠檬酸 铁氰化钾 生产单位 国药集团化学试剂有限公司 上海生工生物工程有限公司 天津永大化学试剂开发中心 天津市大茂化学试剂供应站 天津市大茂化学试剂供应站 天津永大化学试剂开发中心 济南试剂总厂 上海山浦化工有限公司 天津市纵横兴工贸有限公司化工试剂分 公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市河北区海晶精细化工厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市河北区海晶精细化工厂 天津市科密欧化学试剂开发公司 天津市科密欧化学试剂开发公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 南京万达化学实业有限公司 上海山浦化工有限公司 上海四通化工厂 天津市巴斯夫化工有限公司 天津永大化学试剂开发中心 纯级 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 山东农业大学硕士学位论文 三氯乙酸 氯化铁 氢氧化钠 葡萄糖 蒽酮 硫脲 浓硫酸 镁粉 醋酸镁 醋酸铅 硼酸 甲醇 甲醇 氯仿 乙酸乙酯 氯化铝 碳酸钠 氨水 磷酸 甲基红 硫酸铜 硫酸钾 石油醚 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津永大化学试剂开发中心 上海伯奥生物科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 天津市大茂化学试剂供应站 莱阳市康德化工有限公司 天津永大化学试剂开发中心 天津市大茂化学试剂供应站 天津市大茂化学试剂供应站 天津市德兰精细化工厂 天津永大化学试剂开发中心 天津市北方天医化学试剂厂 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市泰兴试剂厂 天津市巴斯夫化工有限公司 天津永大化学试剂开发中心 天津永大化学试剂开发中心 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 2 3 主要仪器设备 名称型号 p w - i a 万能磨 w f j 高速气流粉碎机 g s l l o l b l 激光颗粒分布测量仪 i 2 0 0 0 型分光光度计 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 色谱级 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 产地 上海精密仪器仪表有限公司 常州市益球中亚干燥设备厂 辽宁仪表研究所有限责任公司 尤尼柯上海仪器有限公司 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 卸限s 恒温水浴锅 q l - 9 0 1 漩涡混和器 超声波细胞粉碎机 ) l - 4 台式离心机 r e - 5 2 a a 旋转蒸发器 马福炉 z f 7 三用紫外分析仪 层析缸 硅胶g 薄板 2 0 2 型电热干燥箱 z 型层析柱 a d v e n t u r e 电子天平 8 8 1 型定时恒温磁力搅拌器 f i n n p i p e t t e 数字式移液器 8 1 8 型台面式p h 测试仪 凯氏定氮仪 5 0 5 型w a t e r s 高效液相色谱仪 a l l t i m ac 1 8 柱( 4 6 m m x 2 5 0 m m ) 色谱柱 u v - 21 0 2 p c 扫描型紫外可见分光光度计 江苏省金坛市正基仪器有限公司 江苏海门市麒麟医用仪器厂 宁波新芝生物科技有限公司 上海安亭科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 龙口市先科仪器公司 上海康华生化仪器制造厂 上海分析仪器厂 青岛基亿达硅胶试荆厂产品 上海分析仪器厂 上海华美实验仪器厂 奥豪斯国际贸易( 上海) 有限公司 上海司乐仪器厂 芬兰雷勃集团 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 上海新嘉电子仪器有限公司 美国w a t e r s 公司 美国a l l t e c h 公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司 2 4 实验方法 2 4 1 芦丁标准曲线的制作( 魏永生，王永宁等，2 0 0 3 ) 根据黄酮类化合物能与金属离子形成稳定的红色络合物，选择以芦 丁为标准品，用n a n 0 2 - a i ( n 0 3 ) 3 - n a o h 体系络合物化学吸光法来制作标 准曲线( 图4 ) 。 1 6 山东农业大学硕士学位论文 1 1 1 毯l 1 蚕 | o 皇o _ 0 0 olz34 芦丁浓度 c o n c e n t r a t i o no fr u t i n ( a g m l ) 图4 芦丁标准曲线 f i g 4s t a n d a r dg u r v co f r u f i n u 得到回归曲线方程：y = 0 5 2 4 4 x x 一0 0 0 5 1 ，r 2 = o 9 9 9 9 2 4 2 荷叶的超微粉碎 样品1 ：干燥的荷叶粗样品经研钵粗磨。 样品2 ：万能磨多次粉碎，然后用8 0 目的筛予分级的筛下物，中位径 d s 0 为1 2 5 “m 。 样品3 ：对样品2 再进行一次气流粉碎，中位径d 5 0 为7 2 5 “m 。 样品4 ：对样品2 再进行两次气流粉碎，中位径d 5 0 为1 7 6 p r o 。 h 1 粒度区间的百分含量，2 - 累计百分含量 图5 样品2 的粒度组成图 f i 9 5 t h e 争a n 川鲥1 yc o n s t i t u t e so f s a m p l e 3 l，_咖隶粤4氅m鹫番 荷叶黄酮提取、富集分离及抗氧化功能研究 专 棚 即 隶 壁 菩 爱 am 蕾罩t 柚坩疆f 田，坷娜f 廿t 毋 妇i 1 粒度区间的百分含量，2 累计百分含量 图6 样品3 的粒度组成图 f i 9 6 t h eg r a n u l a r i t yc o n s t i t u t e so f s a m p l e 3 日- h 1 粒度区间的百分含量2 累计百分含量 图7 样品4 的粒度组成图 f i 9 7 t h eg r a n u l a r i t yc o n s t i t u t e so f s a m p l e 4 2 4 3 荷叶黄酮提取液中总黄酮含量的测定( 魏永生，王永宁等，2 0 0 3 ) 2 4 4 荷叶黄酮提取液还原能力的测定( j o a n - h w ay a n g ，f l s i u - c h i n gl i n , j e n g - l e u n ，2 0 0 2 ) 2 4 5 荷叶黄酮提取液对超氧阴离子自由基0 2 的检测邻苯三酚自氧化法 ( 文镜，贺素华，张博成等，2 0 0 5 ) 芝棚扣求缸扛睡 佃仰柚幻加向 幻岫瓤卸饵。 芝姐采细雹哩四谶符 山东农业大学硕士学位论文 2 4 6 荷叶黄酮提取液对羟自由基的检测邻二氮菲f c 2 + 氧化法( 金鸣，蔡 亚砍，李金荣等，1 9 9 6 ) 2 4 7 荷叶黄酮提取液在油脂体系中的抗氧化作用 ( 1 ) 标准曲线的绘制( 赵新准，张娜，王琳，2 0 0 3 ) 比色法利用碘与淀粉的显色反应并由标准曲线确定碘的生成量。以 碘量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，如图8 所示。 8 瑙g 鬟号 瞽8 蛊 012345 碘含量 c o n t e n to fi o d i n ( u m o l ) 匦8 碘一淀粉标准曲线 f i g 8s t a n d a r dc u r v eo f i o d i n e - s t a r c h 得到碘量吸光度的回归方程：y = o 0 9 6 6 x 工+ 0 0 2 1 4 ，r 2 = 0 9 9 0 4 ( 2 ) 油脂p o v 值得测定 取s o g 油脂，加入不同的抗氧化卉寸于l o o m l 的烧杯中，置于6 5 c 的 烘箱中。每隔4 8 h 进行取样测定。油脂测定p o v 值方法如下： 称取油样约0 6 9 于具塞试管中( 同时做平行试验与空白试验，以蒸 馏水为参比) ，加入2 0 0 m l 的氯仿冰醋酸溶液，摇匀溶解后，加入 1 o o m l 的1 0 的溶液，具塞摇匀3 0 s ，并置