（制糖工程专业论文）出芽短梗霉g58的发酵条件及动力学研究.pdf

摘要 摘要 短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 是由出芽短梗霉菌株( a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 生产的胞 外多糖。具有易溶于水、不凝胶化、不老化和无任何毒性等优良特点，可以应用到食品、 医药、化妆品等行业，并且可以被微生物降解，不会对环境造成污染，是很有发展前途 的微生物多糖。 本文以出芽短梗霉g 5 8 为生产菌株，以实现发酵过程的高产量、高转化率、高生产 强度为主要研究目标，主要研究内容包括：( 1 ) 短梗霉多糖摇瓶发酵的培养条件；( 2 ) 温 度，p h 和溶氧对短梗霉多糖分批发酵过程的影响及其优化控制策略；( 3 ) 短梗霉多糖分 批发酵的动力学模型。通过以上研究得到如下结果： ( 1 ) 摇瓶最适培养条件为：蔗糖5 0 9 l ，硫酸铵0 6 5 2 9 l ，磷酸氢二钾5 8 9 2 9 l ，硫酸 镁0 5 9 l ，氯化钠4 9 l ，酵母膏0 4 l ，种龄为3 6 h ，接种量为3 ，初始p h 6 0 ，培养温 度为2 8 ，装液量为5 0 m l 2 5 0 m l 。多糖产量2 4 6 5 + 0 9 8 9 l ，比优化前提高2 8 4 。另外， 在p l a c k e t b u r m a n 设计中发现氮源和磷源是影响多糖产量的重要因素。 ( 2 ) 在摇瓶发酵条件优化的基础上，采用5 l d , 型发酵罐，对短梗霉多糖的分批发酵 过程进行了研究。结果表明：搅拌转速3 0 0 r m i n 和p h 6 0 为菌体生长和多糖合成的适宜条 件。较高的发酵温度( 3 4 ) 适合菌体生长，而较低的温度( 2 8 ) 有利于多糖的合成， 基于不同温度下的动力学参数，提出了分阶段温度控制策略：l i p 0 - 4 8 h ，发酵温度为3 4 ， 4 8 h 后将温度切换至2 8 。经实验验证：最高多糖产量、生产强度和底物转化率比单一 温度下的最大值分别提高了2 2 8 ，5 0 3 和8 8 7 。 ( 3 ) 基于分批发酵实验结果，对短梗霉多糖发酵过程动力学的模型化进行了研究。 采用l o g i s t i c 方程和l u e d e k i n g p i r e t 方程，建立了菌体生长、产物合成和底物消耗动力学 模型。应用l s t o p t l 垂l 产优化软件对模型参数估计和非线性曲线拟合，采用的算法为修正 高斯牛顿法和通用全局优化算法，以均方差和最小为目标，获得待估参数。非线性拟合 得到的3 个发酵动力学的数学模型为： 菌体生长动力学模型：x ( f ) ：j 塑旦生 一 7 8 4 2 + 0 7 5 9 e 产物合成动力学模型：尸( ，) = 1 2 4 5x ( f ) 一4 3 7 4 + 2 0 3 7i n ( 7 8 4 2 + o 7 5 9 e 。) 底物消耗动力学模型：s ( f ) ：5 8 9 9 1 2 3 7x ( t ) 一3 2 8 4i n ( 7 8 4 2 + o 7 5 9 et ) 结果表明模型的相对误差较小，能很好地反映出芽短梗霉生产短梗霉多糖的分批发 酵过程，为实验数据的模拟放大，以及从分批发酵过渡到补料发酵乃至连续发酵提供了 理论基础。 关键词：短梗霉多糖 出芽短梗霉发酵条件优化动力学模型 a b s t r a c t a b s t r a c t p u l l u l a ni sam a j o rp o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e db ys t r a i n so fa u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s t h e p u l l u l a nh a st h ec h a r a c t e r i s t i c so fw a t e r - s o l u b l e ，n o - g e l a t i o n , n o - a g i n ga n dw i t h o u ta n y t o x i c i t y p u l l u l a ni so n eo ft h en e u t r a lw a t e r s o l u b l em i c r o b i a lp o l y s a c c h a r i d e st h a tc a nb ep r o d u c e d i n l a r g eq u a n t i t i e sb y f e r m e n t a t i o n i tc a l lb ew i d e l yu s e di n f o o d ，c o s m e t i c ，a n d p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r i e s i tc a nb ed e c o m p o s e db yc e r t a i nm i c r o o r g a n i s m sa n dw i l ln o t p o l l u t et h ee n v i r o n m e n t t h eo b j e c t i v eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st od e v e l o paf e r m e n t a t i o nb i o p r o c e s sw i t hh i g hy i e l d ， 1 l i g hy i e l dc o e f f i c i e n t , a n dh i g hp r o d u c t i v i t yb ya u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sg 一5 8 t h er e s e a r c h c o n t e n t si n c l u d e ；( 1 ) c u l t u r ec o n d i t i o n so fp u l l u l a ns h a k e - f l a s kf e r m e n t a t i o n ；( 2 ) p r o c e s s o p t i m i z a t i o na n ds t r a t e g yo ft e m p e r a t u r e ，d i s s o l v e do x y g e na n dp hd u r i n gp u l l u l a nb a t c h f e r m e n t a t i o n ；( 3 ) k i n e t i cm o d e lo fp u l l u l a nb a t c hf e r m e n t a t i o n m a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ep r o p e r c u l t u r ec o n d i t i o n so fs h a k e - f l a s kw e r ea sf o l l o w s ：s u c r o s e5 0g l ， ( n i - h ) 2 s 0 40 6 5 2 l ，k 2 h p 0 45 8 9 2g l ，m g s 0 4 。7 h 2 00 5g l ，n a c l4g l ，y e a s te x t r a c t0 4 l ，s e e da g e3 6 h , i n o c u l u ms i z e3 ，i n i t i a lp hv a l u e6 0 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e2 8 ， f e r m e n t a t i o nm e d i u ms i z e5 0 m l 2 5 0 m l u n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n , t h ep u l l u l a ny i e l d c o u l dr e a c h2 4 6 5 2 9 la n dw a si n c r e a s e db y2 8 4 m o r e o v e r , i tw a sf o u n dt h a tb o t h ( n h 4 ) 2 s 0 4a n dk 2 h p 0 4h a das u b s t a n t i a li n f l u e n c eo np u l l u l a ny i e l db yt h ep l a c k e t b u r m a n d e s i g n ( 2 ) b a s e do nt h ea b o v eo p t i m u mc o n d i t i o n , b a t c hf e r m e n t a t i o np r o c e s so fp u l l u l a ni n5 l b i o r e a c t o rw a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t3 0 0 r m i na g i t a t i o na n dp h 6 0w e r eg o o d f o rc e l lg r o w t ha n dp u l l u l a ns y n t h e s i s a tah i g h e rt e m p e r a t u r e ( 3 4 ) ，t h ec e l lc a p a b i l i t yo f a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sw a se n h a n c e d o nt h eo t h e rh a n d , a tt h el o w e rt e m p e r a t u r e ( 2 8 ) ， t h ep r o d u c t i o nc a p a b i l i t yo fp u l l u l a nw a sp r o m o t e d b a s e do nt h ek i n e t i cp a r a m e t e ra n a l y s i s ，a t w o - s t a g et e m p e r a t u r ec o n t r o l l i n gs t r a t e g y , i nw h i c ht e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e da t3 4 ci nt h e f i r s t4 8ha n dt h e ns h i f t e dt o2 8 。c w a ss u g g e s t e da n de x p e r i m e n t a l l yv e r i f i e d f o l l o w i n gt h i s s t r a t e g y , t h ef o l l o w i n gr e s u l t sw e r eo b t a i n e dt h a tt h em a x i m u my i e l d ，p r o d u c t i v i t ya n dy i e l d c o e f f i c i e n tw a si n c r e a s e db y2 2 8 ，5 0 3 a n d8 8 7 ，r e s p e c t i v e l y , b yc o m p a r i s o nw i t ht h a t o fc o n s t a n tt e m p e r a t u r e2 8 c ( 3 ) o nt h eb a s i so ft h ee x p e r i m e n t a ld a t ao fb a t c hf e r m e n t a t i o ni nt h e5 lb i o r e a c t o r , t h e m o d e l i n go ft h ek i n e t i c so fp u l l u l a nf e r m e n t a t i o np r o c e s sw a ss t u d i e d m a t h e m a t i cm o d e l so f c e l lg r o w t h , p r o d u c tg e n e r a t i o na n ds u b s t r a t ed e p l e t i o ni nb a t c hf e r m e n t a t i o nw e r ep r o p o s e d a c c o r d i n gt ot h el o g i s t i ce q u a t i o na n dt h el u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o n 1 1 1 ep a r a m e t e r so ft h e m o d e l sw e r ee s t a b l i s h e db yu s i n g1s t o p ts o f t w a r ew i t he x p e r i m e n t a ld a t aa n dt h em o d e l s t h e m o d e sc o n s i s to f ： c e l lg r o w t h m 。d e l ：x ( f ) = 而西6 4 7 丽9 e 丁 p r o d u c t i o nf o r m a t i o nm o d e l ：p ( f ) = 1 2 4 5x ( f ) 一4 3 7 4 + 2 0 3 7i n ( 7 8 4 2 + 0 7 5 9 e ) i i a b s t r a c t s u b s t r a t ed e p l e t i o n m o d e l ：s ( t ) = 5 8 9 9 1 2 3 7x ( t ) 一3 2 8 4i n ( 7 8 4 2 + o 7 5 9 e ) t h ea b o v em o d e l sc o u l df i tt h ep r o f i l e so fc e l lg r o w t h , p r o d u c t i o nf o r m a t i o na n ds u b s t r a t e d e p i c t i o nw e l l i tm i g h tb eh e l p f u lt ou n d e r s t a n da n dg u i d ef u r t h e ro p t i m i z a t i o no fp u l l u l a n f e r m e n t a t i o ni nt h ef u t u r e k e y w o r d s ：p u l l u l a n , a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so p t i m i z a t i o n , k i n e t i c ， m o d e h i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 垄曼迄 日 期： 2 旦丝生昱堡旦 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 焦至渔 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 前言 多糖是一类可再生资源，它提供给人类多种极具使用价值的产品。多糖广泛存于各 种动物、植物、微生物及海藻中，被广泛应用于食品、化工、医药等领域。多糖作为一 种高分子化合物，传统的天然多糖和化学合成的高分子化合物都有其局限性。微生物多 糖具有生产周期短( 远低于植物和海藻多糖) ，产量、质量和价格受季节、气候影响不 大，而且可以被微生物降解等优点，可以安全地应用于食品，医药，化妆品等行业。 短梗霉多糖( p u l l u l a n ) 是一种真菌多糖，是出芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) 合成的一种细胞外水溶性大分子中性多糖。短梗霉多糖具有极佳的成膜性、成纤维性、 阻氧性、可塑性、粘结性及易自然降解等独特的理化和生物学特性，无毒无害，对人体 无任何副作用，用途广泛。因此，短梗霉多糖是一种有极大开发价值和前景的多功能新 型生物制品。 1 2 短梗霉多糖的筒介 1 2 1 短梗霉多糖的结构 图1 - 1 短梗霉多糖的化学结构 f i g 1 - 1s h 。u c t l l r eo f p u l l u l a n l 短梗霉多糖分子量一般在4 8 1 0 4 2 2 x 1 0 6 ( 商品普鲁兰糖平均分子量为2 x 1 0 5 ，大 约由4 8 0 个麦芽三糖组成) 之间，聚合度1 0 0 5 0 0 0 ，是一种线性聚合物，其结构式如图 1 1 所示。在1 0 9 l 的浓度下其旋光度为1 9 2 。 短梗霉多糖的化学结构是以a 1 ，6 糖苷键连接的聚麦芽三糖，即葡萄糖按a 1 ，4 糖苷 键结合成麦芽三糖，两端再以洳l ，6 糖苷键同另外的麦芽三糖结合，如此反复连接而成 的高分子多糖。这是现今大家所普遍接受的短梗霉多糖结构，但它也存在局部的结构异 常。c a t l e y 等【l 】就发现了一种含有麦芽四糖的短梗霉多糖，但这种结构异常不会对短梗 霉多糖的整个理化性质有大的影响。 1 2 2 短梗霉多糖的性质 1 2 2 1 溶解性能 短梗霉多糖是线性高分子物质，溶解于水，溶液为中性，不离子化，不凝胶化，也 江南大学硕士学位论文 不结晶。此外，短梗霉多糖还可溶于二甲基亚砜( d m s o ) 、甲酰胺、乙二醇、叔丁醇 等溶剂，可利用此特性制备各种短梗霉多糖衍生物以适应各种不同用途。 1 2 2 2 稳定性能 短梗霉多糖水溶液为中性，耐酸耐碱，只有在极端p h 值( p h l1 ) 才不稳 定，发生缓慢水解。在碱性溶液中加热，会同其它糖一样发生褐变反应( 美拉德反应) 。 干燥状态的短梗霉多糖对热反应与淀粉相同，加热不熔化，1 0 0 。c 以上即失去平衡水分， 2 5 0 以上迅速分解炭化，颜色由白变淡黄、褐色至黑色，不产生有毒气体。 1 2 2 3 短梗霉多糖水溶液的流变学性能 对于平均分子量在1 0 0 5 6 0 x 1 0 3 的短梗霉多糖水溶液样品，其限制性粘度、临界浓 度及盘绕缠结参数分别为0 3 8 0 7 0 d l g 、1 4 - 3 1 9 d l 及1 0 1 2 d l g 【2 】。短梗霉多糖分子为 线性结构，其水溶液的粘度远低于其它多糖。与其它多糖一样，它的粘度随平均分子量 的增加而增加，但比其它高分子物质增加的要少。在1 0 2 0 c 时，短梗霉多糖水溶液 的粘度随温度的增加略有上升，在2 0 7 0 时则基本不变；溶液的p h 值对短梗霉多 糖水溶液粘度的影响很小；变性剂( 如脲) 会使短梗霉多糖水溶液粘度略有增加；而金 属离子对短梗霉多糖水溶液粘度有显著影响，其中m 9 2 + 使其粘度增加最大，n a + 的影响 则很小【3 1 。短梗霉多糖水溶液的临界浓度随多糖分子量的增加而增加【2 】。在临界浓度以 下，短梗霉多糖水溶液的粘度随浓度的增加较慢，而在临界浓度以上，短梗霉多糖水溶 液的粘度随浓度的增加较快【2 】。 1 2 2 4 粘结性 短梗霉多糖水溶液对具有一定亲水性的材料如木材、纸张、纤维、低油干燥食品、 玻璃、金属、水泥等有很强的粘结作用，因而可以作为粘结物质加以利用。分子量为1 5 万的短梗霉多糖粘合木材的抗张强度约为7 0 k g c m 2 ，高于氧化淀粉粘合的1 7 倍，玉米 淀粉的3 5 倍，变性纤维素的6 3 倍，酚树脂的2 5 倍。如果在短梗霉多糖溶液中添加固 体粉末，抗张强度随添加量增加而加强，而添加聚丙烯酸等高分子材料反而会降低其抗 张强度。短梗霉多糖的耐水性差，为增加其耐水性，可预先用乙二醛进行耐水处理，同 时可增大抗张强度m 】。 1 2 2 5 短梗霉多糖膜的机械学性能 短梗霉多糖可塑性强，可通过挤压、热压、模铸、辊压、喷涂等方法制成各种膜或 挤压成丝。短梗霉多糖膜具有透明、弹性强、耐油、可热封、可食、可生物降解、几乎 不透氧气、氮气和香气等其它气体及表面摩擦系数小等特点。对于平均分子量在1 0 0 - 5 6 0 x1 0 3 的短梗霉多糖膜，应用动态热机械分析仪( d m t a ) 分析发现，在不同含水量膜的 玻璃化转变温度( t 。) 时，贮能模量( e ) 都有大幅下降( 1 0 1 1 0 3 p a ) ，同时都出现了 内耗峰t a n6 峰；随着膜中含水量的增加，e 下降幅度增加，t a n6 峰的高度增加；山梨醇 和水的增塑作用明显，t 广水分含量关系符合g o r d o i 卜- t a y l o r t 至验公式；在测定的分子 量范围内，分子量对t 。无影响；d m t a 谱图中含水量增加使t p 向低温移动而添加了山梨 醇则会向高温移动：多频测量时旷松弛( e a ) 和卜松弛( e p ) 过程的激化显热分别为 1 7 1 6 4 0 k j m o l 和l1 8 2 5 6 k j m o l ；随着水分含量的增加，e a 和“脆性 参数下降；基于 2 第一章绪论 时一温叠加方法，在k t 叠+ 4 0 c 的范围内，分析得到的粘弹性数据符合w l f 方程；大 量机械变形测试显示随着膜中水分或山梨醇含量增加，拉伸模量( e ) 和拉伸强度( o 麟) 明显下降，断裂伸长率增加；由拉伸参数( e 和。一) 和水分关系表明：在水分含量为 3 - 7 范围内，短梗霉多糖膜硬度加强，而在高水分含量范围内，则显示强的柔软性【2 】。 1 2 2 6 化学性质 短梗霉多糖为含有丰富羟基的多糖，可利用这些羟基的化学性质对短梗霉多糖进行 化学改性，以获得有不同用途的短梗霉多糖衍生物，如酯化、羧基化、烷基化、接枝共 聚等短梗霉多糖衍生物。在可化学修饰的四个羟基中，硫酸化时化学活性顺序依次为： c 6 c 3 c 2 c 4 【6 】。短梗霉多糖分子末端有活泼的还原性半缩醛羟基，可发生许多相关 的化学反应。 1 2 2 7 安全性及生理功能 短梗霉多糖的急性、亚急性、慢性实验和致畸实验【7 】表明，短梗霉多糖并没有明显 的毒性作用和致畸作用，因而用于医药及食品行业是安全的。由于人体肠道缺乏可水解 a 1 ，6 糖苷键的酶，所以短梗霉多糖在人体内消化很慢，可利用此特点来生产低热量食 品和饮料。用短梗霉多糖代替淀粉进行小鼠喂养，替代的百分比越高，小鼠增重减小， 最近发现，短梗霉多糖具有使双歧杆菌增殖和治疗便秘的作用。 1 3 出芽短梗霉及茵种选育 短梗霉多糖产生菌出芽短梗霉，又名出芽茁霉( a u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) ，为半知菌 类短梗霉属，是一种具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。由于遗传上的不稳定性，可 形成许多变种，菌落最初粘稠，呈暗白色，很快转变为淡绿色，最终为黑色。菌落质地 由粘稠状到坚硬，菌落边缘呈明显的根状。无性繁殖方式多样，主要类似于酵母茵的多 边芽殖形式到形成明显的真菌丝。常具有节孢子、厚垣孢子、芽分生孢子。幼龄营养细 胞呈椭圆形至柠檬形，代谢为氧化型【8 】。 从自然界获得的出芽短梗霉菌株，一般生产短梗霉多糖的能力较低，产色素水平高， 造成后提取工艺中必须多次脱色，每次都会损失大量的多糖，得率很低。采用物理( u v ) 或化学( 溴化乙锭、亚硝基胍、亚硝酸钠等) 方法诱变，可以筛选出优良菌株，提高出芽 短梗霉的发酵效率，减少色素生成。国内外对短梗霉诱变筛选做了大量研究，如s p r a s o n g s u k 9 】等人还对泰国土壤中的出芽短梗霉菌株进行研究，希望能获得低色素高产 的短梗霉多糖。p o l l o c k 1 0 】等人从s a nd i e g o 县的一种植物树叶表面分离到一种出芽短梗 霉菌株，能生产高分子量的短梗霉多糖，同时，色素产量大大降低。赵红【l l 】通过紫外线 照射诱变得到高产变异株b 9 ，其多糖转化率达到5 2 ，色素较少；方宣钧【1 2 】也通过紫 外照射得到变异株z y 0 4 7 ，通过优化培养条件多糖转化率达到5 4 1 ，色素水平较低；金 其荣【1 3 】等以出芽短梗霉为出发菌株进行紫外线、n t g 诱变，从大量诱变菌株中筛选分泌 黑色素较少而且转化率较高的诱变菌株；朱一掣1 4 】等对出芽短梗霉b 1 菌株进行6 0 c o 诱 变，获得了一株产色素能力缺失型菌株c 0 3 ，该菌株发酵颜色淡绿色，能简化多糖纯化 步骤，有利于保持多糖的生物活性和提取过程中多糖的损失；腾利荣【1 5 】等采用紫外照射 江南大学硕士学位论文 法对出芽短梗霉菌株( 日本h n 6 3 2 0 5 ) 进行诱变和筛选，得到一株高产短梗霉多糖变异菌 株t l ，使短梗霉多糖的转化率达3 0 1 4 ，是原始菌株的5 7 倍。 1 4 短梗霉多糖的合成 国内外虽然对出芽短梗霉的细胞学及生理学特征进行了大量的研究，但短梗霉多糖 的生物合成机理目前还未完全搞清楚。在菌体细胞内，通过磷酸戊糖途径合成a t p 。对 加入出芽短梗霉培养基中的葡萄糖进行放射性标记，实验表明，葡萄糖c 1 转变成c 0 2 ， 导致c 0 2 浓度的迅速上升，同时伴随着溶解氧浓度的下降，这可以通过在开始阶段p h 值迅速下降来得到监控。值得注意的是，菌体利用糖后，随之产生乙醇，当氧气浓度上 升时，乙醇被菌体利用，乙醇产生的酸性化合物同样使可观察到的初始p h 值下降。p h 值的恢复通常发生在发酵的后续阶段，这归因于增加的通风速率。因而，总体上来，从 培养基p h 值变化情况来看，这象是一个u 模式，取决于底物的消耗速率和氧气的供应 情况【16 1 。 在无细胞的出芽短梗霉酶系中，加入a t p 和u d p g ( 尿苷二磷酸葡萄糖) 时，短梗 霉多糖可以得到合成，而且，u d p g 不能被a d p g ( 腺苷二磷酸葡萄糖) 取代，表明短 梗霉多糖链或短梗霉多糖前体起源于u d p g ，而且证实，作为葡萄糖和淀粉合成主要途 径的a d p g 的转糖苷过程并没有在短梗霉多糖合成中发生。可靠的实验结果证明，在短 梗霉多糖的生物合成过程中，含有葡萄糖的脂质体中间物起着关键性的作用。在总结这 些信息和自己实验结果的基础上，c a t l e y 和m c d o w e l l 【。7 】提出了短梗霉多糖形成的反应进 程。最初阶段是u d p g 脱下葡萄糖残基和脂质分子( l p h ) 通过磷酸酯键结合，然后另 一个u d p g 的葡萄糖残基通过转移反应，形成与脂质体连接的异麦芽糖基( i s o m a l t o s y l ) 。 在下一反应阶段，异麦芽糖基与和脂质分子连接的葡萄糖基形成异潘糖残基 ( i s o p a n o s y l ) 。接下来，异潘糖残基通过聚合反应形成短梗霉多糖链( 图1 2 ) 。除了 葡萄糖或蔗糖，出芽短梗霉能利用甘露糖、半乳糖、果糖以及其他的糖作为碳源，利用 这些物质合成短梗霉多糖的反应途径还不清楚，仅仅知道的是，含有麦芽糖的培养基中， 聚合物的形成需要碳水化合物的代谢，也就是说，潘糖【a g l c ( 1 _ 6 ) a g l c ( 1 4 ) a - g l c 】 和异麦芽糖 a g l c ( 1 6 ) a - - g l c 通过糖基转移反应生成短梗霉多糖【ls j 。据报道，非生长 型培养基中，除了把葡萄糖残基直接转入多糖外，短梗霉多糖的生产还包括细胞内储备 的碳水化合物前体的聚合，可以认为，细胞内首先积累糖分然后在生命循环周期的后续 阶段利用它们来生产短梗霉多糖，这些假设为c a t l e yk e l l y 等的实验结果证实，而且最近 据s i m o n 1 9 】等的实验结果，发现短梗霉多糖浓度与细胞内糖原含量呈负相关关系，虽然 与糖原转变成短梗霉多糖相一致的机制仍不清楚，但这些发现对于解释短梗霉多糖生产 和细胞生长的各自独立过程还是有帮助的。 4 第一章绪论 u d 户gu d pu d p gu d p ir k 警啪1 卜g i c 4 1 _ 斟c 喀叩嘟a 回i 图1 2 短梗霉多糖生物合成途径 f i g 1 - 2s c h e m ef o rt h eb i o s y n t h e s i so f t h ep u l l u l a np r e c u r s o r 1 5 研究与发展概况 b a u e 厅19 3 8 年首次报道【2 0 】出芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n s ) 的某些菌株在适当 条件下可产生一种黏性物质。1 9 5 8 年西德的b e r n i d 2 1 】进而对该物质进行了分离提纯，次 年b e n d e r t 2 2 】等人将之命名为p u l l u l 锄。1 9 6 1 年b e n d e r 和w a l l e n f e l s 2 3 1 发现了特异性极高的 短梗霉多糖酶( 专一性水解0 【1 ，6 葡萄糖苷键) ，其水解产物为麦芽三糖。在此基础上1 9 6 5 年w a l l e n f e l s 等人确认短梗霉多糖是由3 个0 1 ，4 糖苷键连接的麦芽三糖经q 1 ，6 糖苷键聚 合而成的。 国外从1 9 6 0 年开始进行研究，1 9 7 6 1 9 8 0 年为第一个研究高峰，主要是对性质和发 酵方法的研究，1 9 8 4 1 9 9 6 年为第二个研究高峰，主要集中在对其产生机理和应用的研 究。其中包括短梗霉多糖衍生物的结构鉴定、性质、应用的研究以及短梗霉多糖改善食 品品质方面的研究。 国内从1 9 8 0 年开始研究，已经2 0 多年，是“八五 “九五攻关项目，在研究中筛 选到了一些多糖产量高色素含量低的菌株。但是国内生产技术与先进国家相比还有差 距，原料利用率还不高，后提取成本较高，目前尚未见工业化生产报道，很有继续研究 的必要。 日本在短梗霉多糖的研究中做了大量工作，1 9 7 6 年，日本的h a y a s h i b a r a ( 林原) 公 司开始商业生产短梗霉多糖；1 9 8 2 年，这家公司把短梗霉多糖膜也推向市场，日本目前 年产量已达l o 万吨，价格3 0 0 元k g ，至今仍垄断国际市场。 1 6 短梗霉多糖用途 1 6 1 在农产品保鲜上的应用 短梗霉多糖具有良好的成膜性，可广泛应用于水果、蔬菜、鸡蛋等农产品保鲜。许 时婴等【刎应用大豆分离蛋白、硬脂酸和短梗霉多糖复合成的可食用膜来保存猕猴桃，结 果显示，猕猴桃的成熟过程被推迟，经过3 7 天的保藏，用可食用膜保藏的猕猴桃和对照 的软化率分别为2 9 和1 0 0 ，用可食用膜保藏的猕猴桃的货架期延长了约3 倍；马海蓉 等【2 5 1 用不同分子量的短梗霉多糖进行苹果保鲜实验，结果表明：不同分子量的短梗霉多 糖都有较好的保水作用，尤其以高分子量的短梗霉多糖效果更好；用2 0 万分子量的短梗 霉多糖处理苹果，2 个月后保水率为9 9 ，4 个月后保水率为9 8 7 。进行鸡蛋涂膜保鲜 实验结果为：用短梗霉多糖或其衍生物涂层，单独使用或混合其它物质使用效果都好。 5 江南大学硕士学位论文 分子量约3 0 万、质量浓度为1 的短梗霉多糖溶液在4 0 c 浸渍产出后1 0 h 的鸡蛋3 0 r a i n ， 在3 0 c 的流动空气中干燥，2 5 c 放置7 d ，蛋黄质量分数自1 8 5 降到1 3 8 ，蛋白质质量分 数自5 6 2 降到3 0 5 ，不处理的对照组降n o 和0 2 3 p j 。 1 6 2 在食品加工工业上的应用 作为主食、糕点的低热值食品原料和食品品质的改良剂和增塑剂，短梗霉多糖广泛 地应用于食品工业中。如短梗霉多糖与适量的小麦粉、豌豆粉混合可制成低热值人造米、 人造面等：糕点中添加部分短梗霉多糖可提高其风味；在高档豆腐中与盐卤、葡萄糖酸 内酯等共同保持良好的表面光泽度并且有大豆香味，改善豆腐品质；在制造鱼糕时添加 质量分数0 1 的多糖可增强其强度，保持原型；用短梗霉多糖制成的袋包装油炸食品、 脂肪丰富食品，可防劣化、防蛀、保鲜，火腿、火腿肠、速冻食品等用短梗霉多糖或衍 生物喷涂成膜或短梗霉多糖膜袋包装，可保鲜、防腐，使保藏期增加4 5 倍；用短梗霉 多糖作为微胶囊壁材，使调料及调味品微囊化，达到保鲜、保香的目的；在米、面、肉 类加工中使用，可防止加热时粘连，并增加蓬松度；利用其膜结性能和成膜性能在烤制 食品上用于装饰性附料，防止开裂、保形，增加表面光泽；在口香糖类加工中添加1 - 4 短梗霉多糖，可改善产品的口感、延长咀嚼时间和香味；在无糖咀嚼胶加工中添加4 短梗霉多糖，可增加延伸性和强度，不龟裂、耐咀嚼、保香、口感好、保质期长，在冰 激淋生产中添加短梗霉多糖酯或短梗霉多糖，产品的滑润性能增强，风味好，口感好； 在巧克力加工中使用短梗霉多糖，成型性好，表面光泽、平滑，口味和风味优良；在果 汁饮料中使用，可适度增加浓郁感，滑润，分散性好，稳定性增强；在高盐食品中添加， 可起到增稠效果，使酱油、调味品、熬煮食品、淹菜等增稠、增光泽，防止离浆【2 6 】。 1 6 3 在环境保护领域中的应用 短梗霉多糖与无机絮凝剂( 硫酸铝) 复配使用时，浊度去除率达n 8 0 、c o d 的去 除率达到3 0 ，效果明显好于单独使用无机絮凝剂，并且有效降低了硫酸铝的投加量， 大大拓宽了处理范围。同时，由于出水无机絮凝剂残留量少，生成的圬泥易于沉降，生 物可降解性提高，污水回用和后续的污泥处理和处理方法变的更加容易和多样化【2 7 2 8 】。 陶涛等【2 9 】研究了微生物絮凝剂短梗霉多糖处理味精废水的絮凝效果及最佳反应条件。小 试结果表明，短梗霉多糖用于高浓度味精废水的预处理，可以有效地降低出水的c o d 和 s s ，并且不需要调节p h 值。 1 6 4 在包装行业中的应用 短梗霉多糖是一种非离子性、非还原性的稳定多糖，因而在水中容易溶解，可作粘 性、中性、非离性的不胶化水溶液。质量分数为1 0 的水溶液，经干燥或热压能制成厚 度为0 0 1 m m 的薄膜，这种薄膜透明、无色、无臭、无毒，具有韧性、高抗油性，能食 用，可做食品包装。其光泽、强度、耐折性能都比高链淀粉制得的薄膜好。 1 6 5 在医药工业上的应用 在制药工业中用2 0 的短梗霉多糖代替动物胶，可简化防氧化胶囊的生产；添加 6 第一章绪论 2 1 0 的短梗霉多糖，可适当提高软胶囊的弹性柔性和粘着性，使它能在肠胃预定区域 溶解，释放内容物，以提高药物的疗效。 1 7 微生物发酵动力学的研究进展 微生物分批培养( b a t c hc u l t u r e ) 动力学是研究分批培养过程中微生物浓度、产物浓 度和底物浓度随时间变化的规律及其与控制变量( 温度、p h 值等) 之间的关系的科学。其 核心是微生物生长动力学部分【3 1 1 。近年来，环境科学与工程中的微生物动力学方程的 研究越来越活跃 3 2 - 3 5 】，如对序批式反应器中污水厌氧处理的动力学过程的研究【3 6 1 、序批 式活性污泥工艺核心微生物生长动力学和有机污染降解动力学研究【3 7 1 ，在河流、湖泊、 水库等的生物学水质模型和城市生活垃圾的微生物降解模型研究中，也大量用到了微生 物动力学方面的模型【3 8 1 ，早在1 9 4 2 年m o n o d 就提出了微生物比生长速率“和底物浓度娴 关的理想模型；此后在其基础上发展起来了许多微生物生长动力学模型，并被广泛应用 于分批培养中的微生物生长过程的模拟，但由于这些模型大多是对m o n o d 模型进行修 正，具有一定的局限性【3 9 】。本文试图将生态学领域中的l o g i s t i c 方程引入微生物分批培 养动力学研究中。用实验数据进行拟合。由于l o g i s t i c 方程直接描述了微生物比生长速率 “与时间t 的关系，使模型的推导与参数估计比较方便。并有利于推导出微生物浓度五 产物浓度尸，底物浓度s 2 _ 间的关系式以及三者与时间t 的关系式。研究发酵动力学的目 的在于为最佳发酵工艺条件的控制提供理论基础。通过发酵动力学建模，可以进行发酵 过程中菌体浓度、基质浓度、温度、p h 值、溶解氧等工艺参数的优化，可以进行设计合 理的发酵过程。通过利用计算机运行发酵动力学模型来设计程序，模拟最合适的工艺流 程和发酵工艺参数，可以使生产控制达到最优化【柏】。 国内外报道的文献中短梗霉多糖的发酵大多采用的是好氧的分批发酵方式，但由于 短梗霉多糖是一种高分子量的胞外聚合物，其培养基也因为菌体和产物的产生而变得具 有高粘性。粘度的增加导致转移氧气量和含氧量的减少，限制了短梗霉多糖的产量。为 了提高多糖的产量，所以有必要采用补料分批发酵。在补料分批发酵中，添加营养物的 方法会影响细胞的生长和产物的形成，这种发酵方式的基础就是对发酵过程动力学的研 究。 1 8 课题的研究意义及内容 由于我国水果和蔬菜资源十分丰富，研究和开发果蔬保鲜新技术和新材料也将具有 十分广阔的市场前景。 我国作为一个农业大国，糖资源十分丰富，由于生产过剩，企业效益下降，我国已 强行关停了许多蔗糖生产企业，淀粉生产企业效益也十分低下，而蔗糖和淀粉都可以作 为很好的底物发酵生产高附加值的短梗霉多糖。为此，应加快短梗霉多糖的工业发酵生 产的研究，为工业化实施作好准备。 本实验室在前期工作中筛选得到一株低产色素短梗霉变异株g - 5 8 ，发酵时间4 n 5 天，发酵液颜色为淡黄色，可简化后提取的脱色工艺，从而避免在脱色中过程中损失多 糖，而且可以降低成本，基本上解决了后期的脱色难题。而该菌株的多糖产量还不够理 7 江南大学硕士学位论文 想。为了尽快在国内实现工业化生产，必须将该菌株的产量和转化率提高到工业生产要 求的水平。 但是目前关于出芽短梗霉的具体代谢途径还未完全研究清楚，所以从代谢的角度来 解释和提高工业发酵过程中生物量和短梗霉多糖产量还有一定的困难。特别在国内的前 期研究中发现菌体量和多糖产量随培养基的组成、培养条件等因素的变化而变化的特征 给工业发酵的生产控制带来了难题。但由于动力学模型可以在许多具体代谢途径未知的 情况下可以根据少数可以检测的关键参数来预测发酵产量、控制微生物反应过程以及可 以分析反应过程特征等优点，故本文重点研究了用出芽短梗霉的发酵动力学来了解发酵 过程中的动态行为如菌体的生长、多糖的合成，底物的消耗，使其反映各变量如最大比 生长速率、最大比合成速率、茵体得率系数等等之间的关系，供人们对出芽短梗霉发酵 过程全面、深刻地认识，以便克服工业生产过程中出现的一些问题。目前出芽短梗霉发 酵过程中代谢产物以及底物如蔗糖、葡萄糖、无机盐等物质的分析方法已经成功的建立， 无疑给其代谢动力学模型的建立提供一个可靠的平台。此外，本实验室多年来对出芽短 梗霉的诱变育种、发酵后处理工艺以及上游技术的研究，也给动力学模型的建立和检验 提供了依据。 第二章出芽短梗霉摇瓶发酵条件的研究 第二章出芽短梗霉摇瓶发酵条件的研究 2 1 引言 目前，短梗霉多糖国内还未能够实现大规模生产，主要原因在于：出芽短梗霉在发 酵过程中伴有深绿色和黑色的色素产生，对短梗霉多糖的提取和纯化造成困难，降低其 品质，因此在发酵过程中要控制色素的产生，同时还要提高多糖的产量，在实际研究过 程中往往不能二者兼备。本实验室在前期工作中通过紫外线、硫酸二乙酯( d e s ) 交替诱 变，筛选得到一株低产色素短梗霉变异株g 5 8 t 4 1 】，基本解决了后期的脱色难题。而该菌 株的多糖产量还不够理想，因此，有必要对其发酵条件进行优化，以提高其产量。 但到目前为止，所采用的优化手段几乎都是每次改变一个因素的单因素实验【4 2 】，或 是在单因素实验的基础上采用正交实验补充考察了碳源、氮源等各因素的交互效应【4 3 】。 这些方法仅能比较各因素已选定水平的优劣，无法提供未考察区域的信息，不能进行预 报和控制。而影响出芽短梗霉液体发酵的因素众多，选择哪些因素和哪些交互效应作为 重点考察对象是值得深入研究的，一旦研究中遗漏了一些重要因素，那么所得结论的可 信度及其意义将受到很大影响。 p l a c k e t t - b u r m a n 法基于不完全平衡块原理，能从众多变量中快速筛选出最为重要的 因素】，响应面方法( r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y - r s m ) 能将实验设计和数学建模综 合起来，通过局部实验回归拟合因素与结