（制糖工程专业论文）串联—循环超滤截留壳聚糖分子及溶析法纯化分离壳聚糖的研究.pdf

串联一循环超滤截留壳聚糖分子及溶析法纯化 分离壳聚糖的研究 摘要 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是由甲壳素经脱乙酰化反应转化而成的生物大分子， 由于其独有的结构和特性在医学、生物工程、化工、食品、化妆品、农业、 环境等领域得到了广泛的应用。据文献报道，不同分子量的壳聚糖在功能 和特性上有较大的差异性。 本课题初步研究了利用超微粉碎技术对壳聚糖进行粉碎处理以改变其 溶解速度，结果表明粒度对壳聚糖的溶解性有较大的影响，3 0 0 4 0 0 目是 壳聚糖溶解特性的转折点。对壳聚糖的粉碎处理达到4 0 0 目就可以在很大 程度上促进其溶解，再迸一步粉碎其溶解速度不会有太明显的提高。 将粉碎后的壳聚糖配成0 5 的乙酸溶液过超滤膜，初步应用单倍稀释 法对其超滤处理，并利用h p l c g p c 进行分子量分布分析，结果表明：浓 度为0 5 壳聚糖溶液的过滤效果不是很理想。将浓度降为0 1 后有所改 善，但尚未达到理想的效果。 配制0 1 壳聚糖溶液，在超滤过程中对壳聚糖进行逐级梯度稀释的方 式处理，稀释倍数依次为1 倍、2 倍、3 倍、4 倍和5 倍。对超滤后的截留 液进行分子量分布分析( g p c ) ，结果表明：壳聚糖的分子量均一性随着梯 度的递增呈上升趋势，当稀释5 倍处理后的截留液的分子量均一性已达到 较理想的效果。 根据壳聚糖的溶解原理，本课题的结晶处理主要采取p h 值控制。采取 了两种方式：一为一次结晶处理；二为间歇析出处理。g p c 结果表明，快速 结晶处理的分子量选择性较差，但是晶体的析出量大且结构紧密；逐步析 出处理的分子量选择性较好，但是结构松散呈絮状不溶物。 关键词：壳聚糖超微粉碎分离纯化循环一超滤溶析结晶法 s t u d i e so ns e p a r 。棚o na n dp u r j f i c a t l 0 n0 fc i r o s a n m o l e c u l ew i t hc y c l i cl t r a f 1 限a n 0 n t a n d 旧 i s o iv 文n n g0 u tc r y s t a l l i z a n o n c h i t o s a ni st h eb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l eb ya c e t y l a t i o nr e a c t i o no fc h i t i n i t i sa p p l i e dw i d e l yf o ri t su n i q u ec o n s t i t u t i o na n dc h a r a c t e r si ns o m ef i e l d s ， s u c ha sm e d i c i n e ，b i o e n g i n e e r i n g ，c h e m i c a li n d u s t r y , c o s m e t i c ，a g r i c u l t u r ea n d e n v i r o n m e n t a st h el i t e r a t u r er e p o r t e d ，d i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h to fc h i t o s a n h a sb i g g i s hd i v e r s i t y t h i se x p e r i m e n ts t u d i e do nc h i t o s a np r o c e s s e db ys u p e r f i n ec o m m i n u t i o n t oc h a r g ei t sd i s s o l u t i o nv e l o c i t y t h er e s u ri n d i c a t e dt h a tp a r t i c l es i z eh a ss o m e i n f l u e n c et od i s s o l u t i o n a w f u l l y , a n dt h em i l e s t o n ei sb e t w e e n3 0 0t o4 0 0m r t h es u p e r f i n ec o m m i n u t i o no fc h i t o s a na t t a i n e d4 0 0 m uc a na c c e l e r a t ei t s d i s s o l u t i o nv e l o c i t yi nl a r g ee x t e n ta n dh a sn oe v i d e n te n h a n c ef o rm o r e c o m m i n u t i o n t h ec o m m i u t e dc h i t o s a ni sc o n f e c t e da sa c e t i ca c i ds o l u t i o n ，t h e c o n c e n t r a t i o no fw h i c hi so 5 u s i n gt h es i n g l ed i l u t i n gm e t h o dp r o c e s st h e i c h i t o s a na n da p p l y i n gh p l c - g p cm e t h o dt o a n a l y s et h em o l e c u l a rw e i g h t d i s t r i b u t i n g , t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tc h i t o s a ns o l u t i o nw h o s ec o n c e n t r a t i o ni s 0 5 d o n th a v eag o o de f f e c ti nf i l t r a t i o n 。c h a r g i n gi t sc o n c e n t r a t i o nt o0 1 a n dh a ss o m ee f f e c t , b u tn o ta r r i v et h ei d e a l t h ec h i t o s a ni sc o n f e c t e d 鹤a c e t i ca c i ds o l u t i o na n di t sc o n c e n t r a t i o ni s o 。l u s i n gc y c l i cu l t r a f i l t r a t i o nt op r o c e s sc h i t o s a ns o l u t i o nb y g r a d i e n te l u t i o n , t h ed i l u t i n gm u l t i p l ei s1 ，2 ，3 ，4a n d5 a n a l y z i n gt h e m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i n go ft h ec a t c ha f t e ru l t r a f i l t r a t i o n ，r e s u l ti n d i c a t e d t h a tu n i f o r mo fc h i t o s a nm o l e c u l a rw e i g h ti si m p r o v e dw i t hg r a d i e n te l u t i o n u n i f o r mo fc h i t o s a nm o l e c u l a rw e i g h th a sa r r i v e d dan i c ee f f e c tw h e nt h e d i l u t i n gm u r i p l ew a $ 5 a st h et h e o r yo fd i s s o l v i n go fc h i t o s a n ，t h e c r y s t a lp r o c e s s o ft h e e x p e r i m e n ta d o p t sp hc o n t r o l l i n gm o s f l y i ta d o p t st w om e t h o d s ，f a s tc r y s t a la n d i n t e r m i s s i o nc r y s t a l t h eg p cr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ef a s tc r y s t a lh a sn o tg o o d m o l e c u l a rw e i g h t s e l e c t i v i t y , b u t t h e c r y s t a l s a r em o r ea n d t i g h t n e s s i n t e r m i s s i o nc r y s t a lm e t h o dh a sa9 0 0 d s e l e c t i v i t y , b u tt h es t r u c t u r ei sn o tt i g h t k e y w o r d s ：c h i t o s a n ；s u p e r f m ec o m m i n u t i o n ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ； c y c l i cu l t r a f i l t r a t i o n s o l v a t i n go u tc r y s t a l l i z a t i o n i v 广西大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有，本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文 的研究内容。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含 本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集 体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 学位论文使用授权说明 年月日 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本： 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 口即时发布口解密后发布 ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名： 聊鹕。p 铷 v 、f o - 1 年o b 月日 1 广曩r ，“乒萼【士掣曜电 文 联一话习a 置滤截留a 口t 翱嗡p 子a 匍和昕法眦分离瘫j l 糟的研究 第一章绪论 壳聚糖( c h i m s a n ) 又名脱乙酰几丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲壳素，是由甲壳素 经脱乙酰化反应转化而成的生物大分子。甲壳素( c h i t i n ) 又叫几丁质，是一种维持和保 护甲壳动物和微生物躯体的线性氨基多糖，广泛存在于海洋节肢动物( 如虾、蟹等) 的甲 壳中，也存在于昆虫、藻类、菌类和高等植物的细胞壁中，分布极其广泛，在自然界的 存储量仅次于纤维素。从1 8 1 1 年首次描述甲壳素至今，人们对甲壳素和壳聚糖的认识 与研究取得了长足进步。近几年，各国对壳聚糖及其衍生物的研究日益深入，认为壳聚 糖是自然界迄今为止发现的膳食纤维中唯一的阳离子商分子基团，并以其独有的结构和 特性在医学、生物工程、化工食品、化妆品、农业、环境等领域得到了广泛的应用。科 学家们将壳聚糖誉为继蛋白质、脂肪、糖类、维生素、矿物质之后人体必需的第六生命 要素“。 目前壳聚糖在功能性食品上的应用上最受瞩目，其具有多项生理调节机能，包括无 毒性的抗癌效果、改善消化吸收机能、降低脂肪及胆固醇摄取、降低高血压、强化免疫 力等蜘。 甲壳素除了具有生物活性外，同时具有抑菌性，因此很适合将其应用到医药领域“。 在食品加工上可用于食物防腐用，是较健康的食物保存剂。甲壳素还可以促进肠内益菌 增殖，因此可用作乳制品、病人所用食品的添加剂，增进入体抵抗力。由于甲壳素具有 强大的抗菌能力，故可利用抽丝技术制成抗菌防臭纤维与织品。2 0 0 3 年，香港一家公司 成功开发天然甲壳素防霉、抗菌、除臭口罩。上海海螺服饰公司目前推出了国内首创的 天然甲壳素护肤服装服饰，起到了保湿或吸湿快干等综合护理作用。甲壳素还具有吸附 及螯合性，可以和重金属离子形成螯合物，再加上其生物可分解特性，不至于造成二次 公害，因此可作为良好的水处理材料。 据文献报道，不同分子量的壳聚糖膜在功能和性质上各有所不同，这使其具有了不 同的用途。在组织工程中可选择易于降解的低分子量壳聚糖膜作为培养细胞的支架，为 组织工程提供一种可生物降解的细胞培养、移植的载体，用于骨修复、神经修复、人工 肝脏等研究与开发中；根据不同分子量壳聚糖膜的渗透特性来制备不同药物的缓释胶 囊；根据不同分子量壳聚糖膜吸附性的差异决定其在细胞及酶固定化中的应用等等。因 广1 可，v 学习e 士掣唯缸 邕文l 联一蕾习d 岜滤蕾留曩l j 旺翱| j 于子及溶幸拳弭匕分离亮蔫的习 巴 此，对不同分子量壳聚糖性质的研究对满足科研、生产的需要具有重要的科学意义。 综上所述，壳聚糖在各个领域都得到了广泛的应用研究。因此，对壳聚糖再进行深 入研究有着特殊的意义。 1 1 壳聚糖的研究溉述 壳聚糖( c h i t o s m ) ，又名甲壳素、几丁醣，是近年来最受注目的天然食品纤维之一。 与其它食品纤维的主要不同之处为其分子上的正电荷，产生多种功能，应用方式广泛。 近年来又有许多壳聚糖衍生物，增加更多功能。 壳聚糖的主要功能包括吸附脂肪酸、胆固醇等，减少人体吸收，同时也可减缓高血 压及糖尿病症状，增加细胞免疫功能，相关医学研究文献甚多，因此成为健康食品业界 之宠儿。壳聚糖以其特殊的基团一n h 2 ，在不同酸碱值的环境中会有不同的吸附阴离子 能力，因此对特殊香气、调味料及色素会有控释作用，延长其在食品中的寿命，其应用 也己延伸至药品的配方调制以延长药品的疗效。 1 1 1 壳聚糖的分子结构及构象 甲壳素的化学名称是( 1 , 4 ) 一2 - 乙酰胺基一2 一脱氧一旷d 一葡萄糖，化学结构是由2 一乙酰 胺基一2 一脱氧一d 一葡萄糖通过b l ，4 糖苷键形式连接而成的多糖，是唯一含氨基的均态多 糖。结构与纤维素极为相似，是纤维素第二位上的羟基被酰胺基置换的产物。它是由生 物合成再提取的天然产物，有良好的生物相容性，可被生物降解。甲壳素存在、p 、1 r 三种多晶型物，a 型最丰富，最稳定，不易分解、熔化，不溶于水、乙醇、乙醚、稀酸( 但 能溶于醋酸) 、稀碱，可溶于无机酸，但同时主链发生降解。甲壳素是白色或灰白色、 半透明、片状固体，其不溶性限制了应用范围，但是甲壳素与浓碱反应可以生成壳聚糖， 而壳聚糖具有较好的可溶性。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 是由甲壳素经浓碱水解脱乙酰基后生成的产物，又称脱乙酰甲壳 质、可溶性甲壳素、聚氨基葡萄糖，化学名称是聚( 1 ，4 苷) 一2 一胺基一2 一脱氧一d d 一葡萄糖。 它的一级结构( 如图1 1 ) 是个长链，壳聚糖由于分子内部的相互作用与分子间氢键的 结合可形成更为复杂的三级结构。 广西大掣u 曩士掌位论：乞l ，良一1 习d 毫漶【留壳，l 糖分子a 溶朝嚆分“匕铲离曩慊的习 电 vl 、l l - l zc h t o h hn 嗨 喇啦媳菏梅 c 弛o h i in 琏e h 2 0 h 1 1 。2 壳聚麓的生理学功能 图1 - 1 ，壳聚糖分子结构 f i g1 - 1m o l e c u l es t r u c t u r eo f c h i t o s a n 壳聚糖的降脂作用眇l ：高血脂症表现为血清总胆固醇和血清甘油三酯含量升高，同 时高密度脂蛋白含量降低。食物中脂类的消化需要胆汁酸盐作为乳化剂再经胰脂酶作 用。采用含高胆固醇和脱氧胆酸钠的复合饲料喂养并诱发大鼠高脂血症的同时给予壳聚 糖，研究它对高脂血症的影响，结果表明壳聚糖中、高剂量组与高脂对照组比较血清胆 固醇含量均有显著降低；壳聚糖低、中、高剂量组与高脂对照组比较血清甘油三酯含量 有显著降低，但血清高密度脂蛋白胆固醇显著升高。壳聚糖能够降血脂的原因可能与其 正电性有关。 壳聚糖的降血糖作用【4 ，5 】：由胰岛素不足引起的糖尿病，因病态糖代谢水平高。有过 量c 0 2 在体内堆积，使体液呈酸性，导致胰岛素的利用率下降。若人体液的p h 下降o 1 ， 机体对胰岛素的敏感度就下降3 0 ，糖的利用率便会降低。壳聚糖的降血糖作用在于壳 聚糖能将p h 调节至弱碱性，提高胰岛素的利用率，有利于糖尿病的防治 6 1 。p h 若提高 o 1 ，胰岛素的利用率就提高3 0 ，这种对糖尿病的细胞疗法不但改善了微循环和组织 细胞供氧，消除了体内有害物质，净化血液，还可使多种并发症得到康复和预防。此外， 壳聚糖还具有调节内分泌系统的功能，使胰岛素分泌正常，抑制血糖上升。 壳聚糖的免疫调节作用：壳聚糖对机体免疫系统的调节可能是通过提高吞噬细胞系 统的功能来实现的。巨噬细胞表面存在着细菌多糖的受体，而壳聚糖作为细菌多糖的类 似物，能刺激巨噬细胞活化，促进其吞噬能力，增强其在其它免疫应答中的协同作用， 从而实现机体对t 细胞、n k 细胞和b 细胞的调节，介导机体的细胞免疫应答和体液免 疫应答。 壳聚糖的改善胃肠道功能：壳聚糖对消化道的保护作用，是通过壳聚糖与胃酸作用 形成胶状液，附着在胃壁上形成保护膜，阻止了胃酸对胃损伤面的刺激、腐蚀，促进损 u 睢一谢环超滤l 膏囊l j t | 膏分子夏溶祈吲 纯化分薯啊t 聚糖的习 电 伤面的修复而实现的嘲。 壳聚糖的减肥作用：大冢贤龙、万邦和等在人的膳食中分别添加等量的纤维素和壳 聚糖，检验粪便并对两者进行比较，结果表明，食用壳聚糖增加了脂质的排出量。壳聚 糖在消化道中阻碍脂肪的吸收，并将其排出体外，显然这将导致人体血脂的降低m 。此 外，壳聚糖还可直接降低人体胆固醇，是降血脂的又一因素。食物中的胆固醇在体内胆 固醇酶的作用下转化为胆固醇酯，才能在肠道中被吸收，但这一过程必须在胆酸的参与 下才能实现。壳聚糖在肠道中很容易和胆酸结合，使胆固醇失去转化进而被吸收的条件， 而被排出体外。不仅如此，由于胆酸被壳聚糖结合，致使胆囊中胆酸量的减少从而刺激 肝脏增加胆酸的分泌，而胆酸是由肝脏中胆固醇转化而来的，这一过程又消耗了肝脏中 以及血液中的胆固醇，最终导致了减肥的功效。 1 1 3 壳聚糖的物理特性及应用 壳聚糖是白色或灰白色、略有珍珠光泽、半透明片状固体，不溶于水和碱溶液，可溶 于稀有机酸及部分无机酸如盐酸等，但不溶于冷的稀硫酸、稀硝酸、稀磷酸、草酸。壳 聚糖溶液不能配制的太浓，对于中等粘度的壳聚糖也只能配制成百分浓度小于5 的溶 液，浓度太大时转化为胶体甚至形成溶胀物。壳聚褚作为溶液存放和使用时，需处于酸 性环境中。由于其具有缩醛结构，在酸性溶液中将发生壳聚糖降解，溶液粘度也随之下 降。加入乙醇、甲醇、丙酮等，可延缓壳聚糖溶液粘度降低，以乙醇的作用最明显。壳 聚糖甲酸溶液比壳聚糖乙酸溶液稳定。抗氧化剂维生素c 对壳聚糖具有明显的促进降解 作用。 由于壳聚糖分子中含有大量的游离氨基，在适当条件下，能够表现出阳离子型聚电 解质，用于水处理中，具有强烈的絮凝作用，是一种很有发展前途的天然高分子絮凝剂。 因其天然、无毒、无味而被美国、日本等发达国家广泛用于饮用水的净化和食品添加剂 s l 。壳聚糖及其衍生物可作为吸附剂、絮凝剂、杀菌剂、膜制剂等，用于染料废水的脱 色、饮用水的净化、重金属离子的回收、硬水软化、糖蜜及果汁的澄清等。 壳聚糖是天然的阳离子型絮凝剂，对蛋白质、果胶有很强的凝聚能力，已被美国食 品药品管理局( f d a ) 批准为食品添加剂【9 】。应用壳聚糖于杨梅发酵果酒的澄清处理，不 仅可以提高其澄清度和稳定性，而且基本不影响其它营养成分，特别是对游离氨基酸的 影响极小【。 广1 r 舟明曩士掌位能i ， 睾戢一佣习瀚涟截留亮秉r 分子a 淳祈诸蚪匕分离寅j u 的研究 1 1 4 壳聚糖的制备及化学修饰 1 1 4 1 壳聚糖的制备 传统上制备甲壳素、壳聚糖的一般方法是：水洗、稀酸去杂质、碱提、高锰酸钾脱 色、亚硫酸还原制备甲壳素，然后脱乙酰基制备壳聚糖，此法繁琐。而李劲【l l 】通过二次 浸酸、一次碱煮的方法制备甲壳素及壳聚糖，与传统方法相比，此法具有以下优点：l 、 此法对原料的要求较低，生、熟、河、海虾蟹均可使用，而且与新鲜虾蟹壳有同样的结 果，这在国际上迄今尚未见类似的报道；2 、在萃取过程中无需高锰酸钾氧化脱色，再 经亚硫酸钠还原的步骤；3 、浸酸所用的盐酸溶液可以重复使用多次，碱液亦可多次使 用。另外，刘东【1 2 】利用超声波技术制备壳聚糖也取得了一定的进展。当然，人们已经注 意到目前传统的生产方式存在不少缺陷1 1 3 l 。利用生物的方法，如从真菌细胞壁中提取壳 聚糖具有许多优点【1 4 】，但此法目前存在的主要问题却是产量太低。我们相信通过基因改 良等途径，这一问题的解决只是时间的问题，利用微生物生产甲壳素、壳聚糖将是未来 重要的发展趋势。 1 1 4 2 壳聚糖的化学修饰 在改性壳聚糖对处理污泥脱水性能影响的研究中，由于羧甲基壳聚糖分子链上含有 - - c o o h ，一n h 2 ，一o h 等基团，它们能够通过范德华引力、氢键以及配位键等物理 化学作用与污泥颗粒发生作用，使它的吸附作用增强，因此用羧甲基壳聚糖作为絮凝剂 对污泥进行脱水，形成的絮体强度较大、不易破碎，便于污泥脱水，效果明显好于普通 的污泥絮凝剂。 n - 羧甲基壳聚糖的脱水效果要好于n ，o 羧甲基壳聚糖和0 羧甲基壳聚糖。经n 羧 甲基壳聚糖絮凝脱水后的污泥比阻抗最低，含水率从9 9 1 下降到7 3 ，污泥的体积下 降为原来的1 3 0 。热值提高4 0 倍，污泥密实，成型容易，剥离性能好，能够更有效地 焚烧，节省了处理成本【1 卯。 1 ，1 。5 不同分子量壳聚糖的功效特征 不同分子量壳聚糖膜性质：壳聚糖膜的各种特性和壳聚糖的分子量相关，高分子量 的壳聚糖膜表面较为光滑，透光性较好，透气性、渗透性和生物降解性较差；低分子量 的壳聚糖膜表面较为粗糙，透气性、渗透性和生物降解性较好，但透光性较差。经分析 认为膜的结晶性和超微结构决定了不同分子量的壳聚糖膜具有不同的性质“。 ，1 哼，“弗习【士掣啦截 文j 陵一翻r | 德鲁i 囊l 留囊妇t 糟分子a 高簟斩培“匕分离壳，潸的研究 不同分子量壳聚糖涂膜贮藏的研究；涂膜能明显抑制需氧细菌、厌氧菌的繁殖，延 缓挥发性盐基氮的增加。在4 c 贮藏条件下，鲫鱼的一级鲜度保藏期较对照组可延长l 2 d ，一级鲜度延长3 d 左右，并且分子量较大的壳聚糖的抑菌效果比分子量较小的壳聚 糖的抑菌效果好“”。 两种分子量壳聚糖抗疲劳作用的研究：以小鼠为实验对象，研究两种分子量和剂量 的壳聚糖对小鼠的抗疲劳作用的影响。结果：两种分子量和不同剂量的壳聚糖均能延长 小鼠游泳时间、加速游泳后血糖恢复和乳酸清除并提高游泳前后肝糖原和肌糖原的含 量；与同剂量的高分子量壳聚糖相比，低分子量壳聚糖显示了更优的抗疲劳作用。这说 明壳聚糖具有抗疲劳作用与其分子量的大小有关“”。 1 2 本课题的立题背景、研究现状和研究内容 1 2 1 立题背景 甲壳素在自然界的分布范围极广，但国内用于生产甲壳素的资源主要为蝤蛑科三疣 梭子蟹( p o r t u n u s t r i t u b e r e u l a t u s ) 的壳、中国养殖对虾( p e n a e u s o r i e n t a l i s k i s h i n o u y e ) 的头壳。 目前，甲壳素的生产地主要集中在沿海省、市( 浙江、江苏、山东、天津、上海) ，从内 陆省份难以购得甲壳素原料。我国对甲壳素的研究和开发应用，始于2 0 世纪6 0 年代。 近年来，对甲壳素的系统研究越来越热，并取得了可喜的进展。甲壳素不仅可以用作人 类的健康食品，还可用作外创敷料、植物生长剂、抗菌布料、人造皮肤、美容化妆品等， 产业化开发前景十分广泛。特别在医药保健领域，我国这一技术已达到国际先进水平“ “。作为自然界中存在量仅次于纤维素的天然聚合物及其独特的聚阳离子特性。“，使壳 聚糖具有广阔的应用领域，例如在医药嘲、生物嘲1 、食品加工、污水处理。1 等方面。 本研究是以壳聚糖( c h i t o s a n ) 为主要研究对象，采用超滤一溶析结晶法对其不同 分子量的壳聚糖进行分离纯化研究。 1 2 2 研究现状和意义 根据文献报导，全球虾蟹壳年产量近2 ，0 0 0 万吨，贝类、壳类年产几丁质1 3 9 万 吨，发酵副产品中的丝状菌类年产几丁质7 9 万吨，几丁质可谓取之不尽，用之不竭。 目前，全世界从事甲壳素开发的企业已达上千家。甲壳素的研究开发已成为世人瞩目的 广西大尊嘎士尊旺t 性文串联一啊| 王再每漶截留童u i r 分子a 溶朝- 法爿“匕分离奠d 的研究 科技领域和获利颇丰的新兴产业。1 9 8 2 年日本将甲壳素列入十年( 1 9 8 2 1 9 9 2 ) 开发计 划。1 9 8 4 年日本政府拨出5 0 亿美元启动经费委托全国1 3 所大学对甲壳素进行系统开发， 至今在基础研究及应用开发方面取得巨大成就。目前甲壳素是日本政府唯一准许宣传疗 效的机能性食品。1 9 9 3 年日本厚生省受理了甲壳素作用于癌细胞转移抑制剂静脉注射药 品的申请。1 9 9 6 年甲壳素又通过了美国药品、食品管理局( f d a ) 及欧共体( e c ) 核定， 核准在美国、欧洲销售。1 9 8 6 年美国华盛顿大学科学家首先发现甲壳素是具有生理活性 的物质。这一发现为今后研发甲壳素奠定了理论基础，引起全球科技界和产业界的重视。 壳聚糖是天然生物多糖甲壳质的脱乙酰基衍生物，其存在自由氨基，具有十分活泼 的物理化学性质，由于壳聚糖具有无毒副作用、良好的生物相容性、可控的生物降解性、 无抗原性等特性，又因为氨基性质活泼，可用很多基团和化学物质进行修饰或连上一些 促进细胞生长的细胞因子和激素等物质，因此壳聚糖及壳聚糖膜在生物医学、组织工程、 药物缓释、细胞及酶的固定化等许多方面有着十分广泛的应用。 由于生产工艺的不同，在工业生产中的壳聚糖产品分子量相差很大，从几十万到几 万之间不等，有的甚至为几千。在上世纪8 0 年代就有许多学者对壳聚糖的抗菌性能进 行了研究汹1 ，郑连英等报道，不同分子质量壳聚糖的抗菌抑菌作用亦不相同。据文献 报道，不同分子量的壳聚糖的生理活性不同嘲1 ，壳聚糖膜的结晶性、力学特性、渗透性、 透气透光性等都与壳聚糖分子量大小相关。3 。但是，对于壳聚糖的分子过滤纯化仍未有 相关报道。 本课题研究中拟采用膜分离技术和溶析结晶技术对壳聚糖进行了分离纯化研究。膜 分离技术具有无相交、高效、实用、可调、节能和工艺简单的特点，采用超滤分离技术 能够制备出分子量较均一的多糖。而结晶过程具有高度的选择性；析出的晶体纯度较高， 所以开发膜超滤和结晶分离提纯壳聚糖技术具有十分重要理论意义和现实意义。 1 2 3 本课题研究的主要内容 通过上述分析和充分的调查研究，本论文拟开展如下几方面的研究工作； l 、对壳聚糖溶解性进行研究，如壳聚糖固体粉末的粒度与溶解性质的关系及其不同分 子质量的壳聚糖溶解性与p h 值之间的关系的研究。 根据文献资料可知，影响壳聚糖溶解的主要因素为：脱乙酰度、相对分子量和酸的 种类。影响壳聚糖溶液的稳定性和粘稠度的主要因素为：酸的种类、酸的浓度、放置时 ，1 f 大茸“曩士掣膻忱使 联一啊隅再l l 滤蕾留曩妇i 糖分子a 扁彝衍浩一化分离壳曩麓的司 巴 间、p h 值、温度、有机溶剂的影响、无机溶剂的影响等等。根据影响因素设计实验， 探索不同分子质量壳聚糖的溶解性与p h 值之间的关系，为分离不同分子量的壳聚糖提 供依据。 2 、串联一循环超滤提纯分离壳聚糖溶液得到较单一分子量的多糖 通过串联循环超滤对壳聚糖溶液( 乙酸溶液) 进行分离提纯，利用两次分子过滤( 即 串联过滤) 达到较单一分子量的壳聚糖溶液，通过此实验确定影响分离壳聚糖的相关因 素并改善条件以提高纯度。 3 、对所得分离后的壳聚糖溶液进行理化分析，如其纯度，粘度值，分子量和分子量分 布等。 4 、对循环超滤得到的壳聚糖浓缩液，通过结晶条件( 如溶液的p h 值，乙酸的浓度等) 的控制，得到分子量较均一的壳聚糖晶体。 5 、通过h p l c g p c 测定壳聚糖的分子量和分子量分布范围啪3 “”，并与传统的粘度法 进行比较。 联一翻r | 再问h t 鲁l 曹曩妇隋分子a 溶幸基纯代分离彝口e 翱。的研究 第二章循环超滤一溶析结晶法的原理与特点 传统意义上的分离纯化工艺的第一步多是要从产物浓度较低并混有底物、细胞或细 胞碎片的液相体系中把目标产物分离提取出来，然后，再进行分级富集、纯化，直至获 得符合纯度要求的产品。然而，分离工艺的经济性正比于每一级分离过程的效率( 速率、 产品收率和比活) ，反比于所采用的级数。因此，强化分离单元操作、开发新型高效分 离方法是提高分离工艺经济性的基础，近年来，发展很快的分离新方法以及反胶束萃取 和双水相分配法、泡沫和液膜及各种高效层析法等，都在不断提高过程效率 3 3 - 3 1 。此外， 通过分离过程集成，将传统上分级串联的若干步骤予以并联甚至合而为一，缩短流程、 简化工艺，能更为有效地提高过程总的效率1 3 胡。 目前生物大分子物质的分离纯化所能选用的操作单元相当有限【3 9 】。分离纯化的装置 主要有离心分离装置、沉淀装置、离子交换装置、亲和吸附装置、凝胶过滤和超滤装置 等。这些装置各具特点i 盼、4 2 】：离心分离装置能适应很宽的规模范围，但其效能会受到原 料液浓度和沉淀操作效果所限制；沉淀装置同样能处理大量的物料，并且它受干扰物质 影响的程度比吸附或色层分离小，但要耗用大量的试剂和较长的处理时间；离子交换装 置用来除去对后续分离产生影响的化合物，产物纯度较高，但比起离心分离装置，在生 产能力上要小几个数量级；亲和吸附装置以亲和色谱最为典型，它的选择性和特异性极 强，是其它装置无法比拟的，但填充亲和色谱柱技术在发展中遇到了某些因素限制，如 流速低、填充颗粒的压缩和扩散传递慢，从而难以大规模应用；凝胶过滤常用于蛋白质、 多糖聚集体的分离和脱盐，由于涨胶过滤介质的容量比较小，故过程的处理量小，一般 常在纯化过程的最后一道处理中被使用；超滤可以常温操作、装置简单、能耗低，且选 择性高，已成为分离混合物的重要手段，但过滤速率下降和膜污染是超滤在实际应用中 遇到的主要问题。 近年来，随着对多糖等生物大分子物质研究和应用的不断深入，糖类作为支持组织 和能量来源的传统观念已被突破，糖类药物尤其是中药多糖，微生物多糖引起人们关注 而研究者众多，但由于生物大分子分离纯化技术条件的限制，多糖的构效研究尚处于初 级阶段。因此，关于以多糖为代表的生物大分子分离纯化的新工艺新方法的研究和开发 具有极强的现实意义和应用价值。 广西大尊q 曩士掌位裁! 文串联一啊r 爿d 曩漶截曹曩口脚分子a 高和，表洱七分离彝| u 膏的研究 2 。1 循环超滤一溶析结晶法的理论和实践基础咖 循环超滤一溶析结晶法( c y c l i c u l t m f i l l l r a t i o n - s o l v a t i n g o u t c r y s t a l l i z a t i o n ，c u s o c ) 的工艺构思和提出来源于化工过程强化的概念。所谓化工过程强化是指能显著减少设备 体积、高效节能、清洁、可持续发展的化工新技术。虽然化工过程的概念是在19 9 5 年第 一届化工过程强化国际会议才明确界定，但有关设备小型化、过程集成化的研究早已进 行多年，有的已取得工业化的成果。化工过程强化可分为设备和方法两个方面：过程强 化设备，即设备小型化，包括新型反应器和单元操作设备；过程强化方法主要是化工过 程的集成化，包括化学反应和分离、换热、物质相变的集成以及分离过程的组合等，还 有替代能源，超临界流体、离子液体、非定态操作等新技术嗍。 为使一项特定的工艺过程达到较高的选择性或较高的转化率，将两个或两个以上的 反应过程或分离过程相互有机的结合在一起进行联合操作，称之为过程耦合( p r o c e s s e s c o u p l i n g ) 【4 5 j ，如放热一吸热、反应一精馏、渗透一蒸发等工艺过程都是在过程耦合的 基础上发展而来的，并以其集成化程度高、工艺流程短的特点，分别在石油催化裂化、 甲基叔丁醚生产及无水乙醇制备等方面获得了实际应用并产生良好的效益。有效的过程 耦合将大大提高设备的生产能力及工艺性能，实现单一过程不能达到的目的。 2 1 1 超滤的研究和应用 膜分离是在2 0 世纪初出现，2 0 世纪6 0 年代后迅速堀起的一门新的分离技术。顾名 思义，膜分离是利用特殊制造的、具有选择透过性能的薄膜，在外力推动下对混合物进 行分离、提纯、浓缩的一种分离新方法。膜分离技术已被国际上公认为2 0 世纪末至2 1 世纪中期最有发展前途、甚至会导致一次工业革命的重大生产技术，是世界各国研究的 热点【6 3 】。 2 1 1 1 超滤分离的基本工作原理 超滤，即分子过滤，是根据分子体积或分子量大小对物质分离的一种膜分离技术。 其工作原理是在一定的压力作用下，当含有不同大小的溶质分子的混合溶液以一定的流 速流过具有一定孔径的超滤膜表面时，溶剂和小于膜孔的小分于溶质透过膜，成为渗透 液被收集；大于膜孔的大分子溶质则被膜截留作为浓缩液被回收，从而实现分离与浓缩 的目的( 如图2 1 所示) 。 广曩r ，叫鼻硪士掌位鼬文串联一翻晦r 赶滤_ 曹奠日i 瞪争子酿藩幸扫蚪匕分离奠订k 糟的习”电 压力 进液口上截留液 渗透液 图2 1 超滤工作原理示意图 f i g 2 - 1 u l t r a n l t r m i o n w o r k p r i n c i p l c 2 1 1 2 超滤技术在生物分离中的应用 超滤主要应用于将溶液中的颗粒物、胶体和大分子与溶剂等小分子物质分离，目前 在生物制品、生化制药、基因工程产品中已有工业化的规模生产。主要用于疫苗、血浆 制品、酶、发酵产品、一些注射剂除去热源，也用于基因工程产品和单克隆抗体的回收。 超滤不但可以用于分离不同分子量的大分子物质，而且还可以用于脱盐、脱去小分子色 素及浓缩各种不同大小分子量的物质 4 6 4 _ 7 】。 2 1 1 3 超滤分离的特点 超滤分离是典型的膜过程，超滤膜分离是通过特定的不对称膜的筛分作用，借助于 外界能量或化学位差的推动，对两组分或多组分混合的气体或液体进行分离、分级、提 纯和富集。作为新型的分离净化和浓缩技术，与传统的分离技术相比，超滤分离具有以 下特点【4 s j ： ( 1 ) 分离效率较高。按物质颗粒大小分离的领域，以重力为基础的分离技术最小 处理极限是微米( 肛m ) 级的悬浮颗粒，超滤膜分离却可以做到将相对分子质量为几千 甚至几百的物质进行分离，相应的颗粒大小为纳米( 珊) 级。蒸发过程中物质的相对挥 发度的比值( 选择系数) 大都是个位数，与之相比，膜分离中的选择系数要大得多，用 聚砜膜分离氮、氢，分离系数为8 0 左右，聚酰亚胺膜则超过1 2 0 。 ( 2 ) 能耗( 功耗) 比较低。大多数膜分离过程都不发生“相”的变化。对比之下， 蒸发、蒸馏、萃取、吸收等分离过程，都伴随着从液相或吸附相至气相的变化，而相变 广西，“啦习n b 掌位能? 文 联一翻r 习d 孽藏t 蕾曩妇e 糖分子a 溶辆幡“匕分育壳聚的研兜 化的潜热是很大的。很多膜分离过程通常是在室温附近的温度下进行的，被分离物料加 热或冷却的消耗很小。因此，超滤膜分离技术特别适用于热敏性物质的处理。 ( 3 ) 操作比较简便。超滤膜分离设备本身没有运动的部件，工作温度温和，所以很 少需要维护，可靠度高，可以频繁的启、停下工作。此外，膜分离通常可以直接插入已 有的生产工艺流程，不需要对生产线进行大的改动。采用超滤技术在一些产业( 如食品、 生化、制药和石油等) 中已取得显著的经济效益，故其发展相当迅速，应用也越来越广 泛。因此，以超滤为代表的膜分离技术被认为是二十世纪在分离科学中最引起轰动的成 就之一【4 9 】。 2 1 2 溶析结晶的特点 溶析结晶是利用被分离物质与溶剂分子问相互作用力的差异，通过改变溶剂的性质 来选择性溶解杂质，从而使目标组分最大限度地从溶剂中晶析出来的过程【矧。 应用溶析结晶分离生化产物的典型例子是蛋白质( 酶) 以及多糖的分离提取，无论 是实验室规模还是工业化生产，溶析结晶法都得到了普遍的应用【5 i 】。早在二战期间， e d w i n c o l i n 及其合作者就是用乙醇进行了蛋白质沉淀的经典实验，从人血浆中提取了白 蛋白溶液，所得产品成功的救治了1 9 4 1 年珍珠港空袭后的幸存者。 有机溶剂是影响生物大分子溶解性的重要因素。在一定范围内，有机溶剂通过争夺 生物大分子表面的水分子，减小介质的有效静电屏蔽，增加生物大分子间的静电相互作 用，从而降低生物大分子的溶解性并沉淀析出。在使用有机溶剂时，要尽可能在低温条 件下操作，以免造成生物大分子的变性【5 2 】。 结晶是固体物质以晶体状态从蒸汽和溶液中析出的过程，而沉淀是固体物质以无定 形状态从蒸汽和溶液中析出的过程。结晶和沉淀在本质上是一致的，都是新相形成的过 程。不同的是，结晶过程具有高度的选择性，析出的晶体纯度高。要提高沉淀物的纯度， 除了严格控制沉淀( 结晶) 的速度外，还要尽可能提高底物的纯度。 与传统的蒸发结晶方法不同，溶析结晶法是利用某些有机溶剂或盐对溶液中的溶质 进行“脱水”，使溶质达到或超过其饱和浓度而结晶沉淀析出，从而替代蒸发过程【5 3 1 。 溶析结晶法的优点是能耗低，可以提高洛质从母液中的回收率，可在低温下进行，特别 适合那些热敏性物质( 生物制品及医药产品等) 的结晶，常用于蛋白质、酶制剂、抗生 素、多糖制剂等高价产品如医药产品的分离提纯【划，但由于缺乏较为完善的理论指导， 联一事t 球怒漶l 冒奠口哺分子a o 蕾梆各“憎曹r 秃，h 的研完， 工艺技术水平较其它工业结晶方法( 如冷却结晶、蒸发结晶等) 落后，基本上是凭经验 操作。此外，该方法由于要多次使用大量的化学试剂所造成的运行成本过高也制约了该 技术的广泛应用。溶析结晶的缺点是溶剂耗用量大，所得晶体粒度小，杂质含量仍较高， 难以达到纯度及晶形要求。 目前，对于溶析结晶过程的研究仍有待深入。有学者认为，溶析结晶的机理是由于 加入的有机溶剂会使水溶液的介电常数降低，并使溶质分子间的静电引力( 库仑力) 增 大，导致凝集和沉淀；而另一种说法是由于溶质分子的溶剂化，使原来和大分子结合的 水被溶剂所取代，从而降低了大分子的溶解度。但不管何种理论，仍无法准确的描述溶 析结晶过程。 通过对蛋白质溶析结晶的研究，有学者提出，蛋白质溶解度与其溶液体系介电常数 之间的关系可用下式描述【2 】： i gs = ( 姘卜i gs o 式中，s o 为当( k a 2 ) 一0 时s 的外推值； 常数。 ( 2 - 1 ) a 为水一有机溶剂混合物的介电常数：k 为 而m o s s c r i 等人【5 习则认为，加入某种有机溶剂后，若溶剂对溶质有沉淀作用，则沉 淀物与有机溶剂添加量之间的关系可用式( 2 2 ) 描述： f = - g o l n ( v v o )( 2 - 2 ) 式中，厂为加溶剂后溶质的沉淀分数；v c 为刚开始沉淀所需加入的溶剂量( 最小溶剂加 入量) ；v 为实际已加入的溶剂量；k 为溶剂常数。 式( 2 2 ) 将有机溶剂的添加量与沉淀分数直接关联起来，与式( 2 1 ) 相比，在 应用上更为方便。 由式( 2 - - 2 ) 可知，沉淀分数厂直接受到参数瓜矿。的影响，而纸矿。的大小取 决于溶剂的种类和溶质的种类，因此，对于特定的目标产物而言，有机溶剂的选择是关 键，要求溶剂具有较强的选择沉淀性，否则需要进行多步分离，从而导致工艺路线冗长、 回收率低，且无法得到高纯度的产品，工业生产难以接受。 2 1 3 多糖类物质的分离纯化的技术难点 近年来，多糖类物质因其独特的功能和很低的毒性，已在抗肿瘤药、抗病毒药、抗 衰老药等多个方面得到开发和应用媳如。但由于多糖分离纯化较为困难，因而绝大多数 广西大掌硬士掌位论文 联一循环超滤截霄壳曩糟分子a 溶析法纯化分离壳曩- 的研究 用于实验药理学研究的多糖为粗制剂，使多糖药理作用的分子机制、构效关系等研究以 及临床应用等均受到极大限制闭。 有学者根据在水和乙醇中溶解度的不同，将糖类物质分为6 判5 9 l ： ( i ) 易溶于冷水和温乙醇类：包括各种单糖、双糖、三糖和多元醇类； ( 2 ) 易溶于冷水而不溶于乙醇类：包括果胶和树胶类物质，因为它们一般以钙、镁， 盐形式存在： ( 3 ) 易溶于温水、难溶于冷水、不溶于乙醇类；主要是粘液质的糖类，如木聚糖、 葡聚糖、糖淀粉、糖原等； ( 4 ) 难溶于冷水和热水，可溶于稀碱类：包括水不溶胶类、半纤维素、半乳聚糖、 甘露糖等； ( 5 ) 不溶于水和乙醇、部分溶于碱液类：主要包括氧化纤维素类物质，可溶于c u ( o h ) ： 溶液； ( 6 ) 以上溶剂均不溶类：如纤维素等。 通过以上的分类就知道目前多糖分离纯化中常用“水溶醇提”法的内在原因。但 是，经水溶醇提法处理所获得的产物纯度偏低，仍无法满足实际应用的要求，必须进一 步精制。 以现有的技术手段可以得到