（发酵工程专业论文）β葡聚糖酶高产菌as63的发酵动力学及酶学性质的研究.pdf

浙江工业大学硕士学位论文 摘要 1 3 一葡聚糖酶高产菌a s 6 3 的发酵动力学及酶学性质的研究 摘要 b 一葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效消除谷物b 一葡聚糖在酿造 和饲料工业中产生的负面影响。本文用u v 和d e s 对出发菌株进行诱 变育种，得到高产突变株a s p e r g i l l u sn i g e r a s 6 3 ，发酵单位为4 5 6 u m l ， 是出发菌株的2 6 8 倍，遗传稳定性试验表明该菌株产酶性能比较稳定。 用单因素和正交试验对产酶条件进行了优化。最佳培养基配方 ( g 1 0 0 m l ) ：大麦粉5 ，黄豆饼粉3 ，( n u n ) 2 s 0 4o 3 ，k 2 h p 0 40 1 ，m g s 0 4 0 0 6 ，f e s 0 40 0 0 1 ，c a c l 20 5 ，t w e e n8 00 0 1 m l 。最佳培养条件：初始p h 6 o ，接种量2 m l ( 孢子浓度1 0 8 个m l ) ，装液量4 5 m l 2 5 0 m l ，转速 2 0 0 r p m ，3 1 培养5 5 6 5 h 。最优条件下用3 l 发酵罐进行分批发酵试验， 最大酶活达1 6 0 8 u m l ，比摇瓶培养提高了2 3 ，周期缩短2 5 h 。基本 酶学性质：最适反应温度5 5 。c ；最适p i a 值6 o ：酸碱稳定性范围p h 5 - 7 ； 热稳定性范围6 0 。c 以下；有严格的底物专一性，只水解含1 3 。l ，3 1 ，4 键的大麦1 3 一葡聚糖和地衣多糖，可能是b 一1 , 3 1 , 4 一葡聚糖酶；f e 3 + 、l i + 、 b a ：+ 、a 1 3 + 对酶活性有明显的抑制作用，f e “、m g “、c a 2 + 有明显的激 活作用。以大麦1 3 。葡聚糖为底物的酶促反应符合米氏方程，k i t l 为 5 8 2 1 4 m g m l ，v m 为o 2 0 8 1 m g m l r a i n ，动力学方程为：v = 罴。 关键词：d 葡聚糖酶，诱变育种，发酵，酶学性质，动力学 浙江工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t s t u d i e so nt h ep r o d u c i n gk d 忸t i c s o f p - g l u c a n a s e b y a s p e r g i l l u sn i g e r a s 6 3 a n dt h ee n z y m e ，sp r o p e r t s a b s t r a c t 3 - g l u c a n a s e i sa l l i m p o r t a n t i n d u s t r i a l e n z y m e t h a t m a yl a r g e l y e l i m i n a t et h en e g a t i v ee f f e c t sc a u s e db yc e r e a l1 3 - g l u c a ni nb r e w i n ga n d f e e di n d u s t r i e s a f t e rm u t a t e db ym u t a g e n ss u c ha su va n dd e so nt h e s t r a i n ，ah i g h y i e l d i n gp - g l u c a n a s ea s p e r g i l l u sn i g e r a s 6 3w a so b t a i n e d t h ep r o d u c t i v i t yo f 3 - g l u c a n a s eb ym u t a n ta s 6 3w a s4 5 6 u m l ，2 6 8 t i m e sh i g h e rt h a nt h a to ft h ei n i t i a ls t a i nw 3 15 s u b c u l t u r et e s ti n d i c a t e d t h a tt h eh e r e d i t a r yc h a r a c t e ro fm u t a n ta s 6 3 w a ss t a b l e i nt h i s d i s s e r t a t i o n ，t h em e d i u mc o m p o s i t i o na n dt h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lm e d i u m c o m p o s i t i o n ，w h i c hw a s o b t a i n e d t h r o u g hs i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s a n d o r t h o g o n a ld e s i g n e x p e r i m e n t s ，w a sa sf o l l o w s ( 1 0 0 m l ) ：b a r l e yf l o u r5 ，s o y b e a nf l o u r3 ， ( n h 4 ) 2 s 0 40 3 ，k 2 h p 0 4o 1 ，m g s 0 4 0 0 6 ，f e s 0 40 0 0 1 ，c a c i z0 5 ， t w e e n 8 0o 0 1 m l t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rf e r m e n t a t i o nw e r ea sf o l o w s ： t e m p e r a t u r e 31 。c ，i n i t i a l p h 6 0 ，2 0 m l s e e dc u l t u r e c o n t a i n i n g i0 8 c e l l s m l 4 5 m lm e d i u mi n2 5 0 m ls h a k i n gf l a s k ，r o t a t i n gr o t e2 0 0 r p m a n dc u l t u r et i m e5 5 - 6 5h o u r s b a s e do i lt h ea b o v ee x p e r i m e n t a ld a t a ，t h e i i 浙江工业大学硕士学位论文 a b s t r a c r f e r m e n t a t i o nw i t h3 lf e r m e n t o rw a s2 5h o u r ss h o r t e rm a l lt h a ti nt h e c o n i c a lf l a s k sw i t ht h eh i g h e s t1 3 - g l u c a n a s ea c t i v i t y1 6 0 8 u m l ，w h i c hw a s 2 3 h i g h e r t h a nt h a ti nt h ec o n i c a lf l a s k s a tl a s tt h ee n z y m e sp r o p e r t i e s o f1 3 - g l u c a n a s ew e r es t u d i e d ，i t so p t i m u ma c t i v et e m p e r a t u r ew a s 5 56 c ，i t s o p t i m u m a c t i v ep hv a l u ew a s6 0 ，a n dt h ee n z y m ea c t i v i t yw a ss t a b l ea t 6 0 ca n dp h5 - 7 t h e1 3 - g l u c a n a s eg e n e r a m db ya s p e r g i l l u sn i g e ra s 6 3 w a sh i g h s p e c i f i c t os u b s t r a t e s i tw a sa b l et o s p e c i f i c a l l yh y d r o l y z e 1 3 - ( 1 ，3 ) ( 1 ，4 ) b o n d si nb a r l e y1 5 - g l u c a n a n df i c h e n i n s t h i si n d i c a t e dt h a tt h e e n z y m ec o u l db ec l a s s i f i e d a s 1 3 - ( 1 ，3 ) 一( 1 ，4 ) 一g l u c a n a s e s o m e m e t a li o n s s u c ha sf e 3 + 、l i + 、b a 2 + 、触3 + h a dr e l a t i v e l ys t r o n gi n h i b i t o r ye f f e c t , w h i l e f e 2 + 、m 一、c a 2 + h a d s t i m u l a t i v ee f f e c t so ne n z y m ea c f i v i 锣s t u d y i n go n t h ek i n e t i c so ft h ee n z y m es h o w e d t h a tt h e e n z y m a t i c r e a c t i o nw i t h 1 3 - g l u c a na st h e s u b s t r a t ea c c o r d e dw i t ht h em i c h a e l i s - m e n t e ne q u a t i o n k m w a s5 8 2 1 4 m g m l ，v 。w a s0 2 0 8 l m g m l m i n ，a n dk i n e t i c s m o d e lw a s v ：0 2 0 8 1 c s 5 8 2 1 4 + c s k e yw o r d s ：1 3 - g l u c a n a s e ，m u t a t i o nb r e a d i n g ，f e r m e n t a i o n ，e n z y m e p r o p e r t y ，k i n e t i c s 1 1 i 浙江工业大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的研究成果。除文中已经加以标注引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得浙江 工业大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的 法律责任。 作者签名： 多界 日期：p 声牛月习日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权浙江工业大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密刚。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者弛多辑 导师签名：周吃弓 日期： p 步年 日期：文“年 月砂日 v 月吐硼 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 3 一葡聚糖酶属半纤维素酶类，广义而言，包括了一切能分解b 一糖苷键的葡萄 糖聚合物的酶系。八十年代国内外开始该酶的研究工作，主要应用于啤酒工业， 能缩短麦汁和啤酒过滤时间。九十年代后国内外尤其是北美、欧洲等国家将b 一葡 聚糖酶作为一种颏型饲料酶添加到饲料中。大量研究证明该酶在一定条件下能促 进动物的生长，其原理在于【l 】：动物饲料主要由植物类原料组成，其细胞壁由b 一 葡聚糖等非淀粉多糖啊s p ) 组成，单胃动物不能分解饲料中的n s p ，而n s p 是饲料 的重要抗营养因子，能结合大量的水，使消化道中食糜的粘度增加，养分与消化 道内源酶的作用降低，营养物质的消化率下降。而b 一葡聚糖酶能分解n s p 使得谷 物饲料中的粘稠度降低，从而改善大部分营养物质的消化率和吸收率；另外还能 使肠道中微生物活性降低，排泄物的含水量和排泄总量减少，从而减少了排泄物 对环境的污染捌。冯定远等4 1 报道：添加酶制剂能够明显提高猪日粮营养物质的 消化率，其中以粗纤维消化率的改善最为明显，可达到4 8 9 ，另外粗蛋白消化率 提高1 6 9 ，干物质的消化率提高1 1 3 。因此b 一葡聚糖酶作为一种新型饲料酶， 已引起了全球范围内饲料行业的高度重视，而b 一葡聚糖酶能否在饲料行业广泛推 广应用的关键在于如何生产出高活性的p 葡聚糖酶和如何降低酶的生产成本。生 物技术的发展，使利用发酵性能好的微生物来生产b 一葡聚糖酶成为了可能，并可 从根本上降低酶的成本，为该酶的应用开辟了广阔的天地。 大麦是我国的主要栽培作物之一，也是啤酒酿造的主要原料和饲料的主要用 粮，但b 一葡聚糖含量普遍较高，给啤酒和饲料工业的应用带来麻烦。因此先详细 了解b 一葡聚糖的一些结构、性质、功能，对研究b 一葡聚糖酶有十分重要的意义。 1 1b 一葡聚糖概述 1 1 1b 葡聚糖的结构、性质 0 一葡聚糖是一种纤维多聚糖，来源于烘焙用酵母的细胞壁、燕麦、大麦和许 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 多药用蘑菇5 1 。一般来说，酵母和药用蘑菇形成的是p 1 ，3 一或p 一1 ，6 一葡聚糖，而燕 麦和大麦形成p 一1 ，3 一或p 一1 ，4 一葡聚糖嘲。小麦中的1 3 - 葡聚糖含量相对较低，主要集 中在亚糊粉层，胚乳细胞壁中则很少川。表1 - 1 为各种麦类的1 3 一葡聚糖的含量及 其比例，表1 - 2 为组成大麦胚乳细胞壁的各种成分。 表1 - 1 各种麦类中b 葡聚糖的含量及比例嘞 表1 2 大麦胚乳细胞壁组成 成分( 训r w ) b 1 3 1 争葡聚糖( 1 3 1 , 3 1 ，4 - g l u c a n ) 阿拉伯木聚糖( a r a b i n o x y l a n ) 甘露聚糖( g l u c o m a n n a n ) 纤维素( c e l l u l o s e ) 蛋白质( p r o t e i n ) 阿魏酸( f e r u l i ca c i d ) 1 3 一葡聚糖包括不溶性和水溶性两种，与蛋白质结合的b 葡聚糖大多不溶于 水，未与蛋白质结合的多能溶于水，在水中形成高粘性的溶液。1 3 一葡聚糖的溶解 性决定于结构中b 一1 , 3 一糖苷键和聚合度，水溶性1 3 一葡聚糖的b 一1 ，3 一键与b 一1 , 4 一键 之比为l ：2 5 。2 6 ；非水溶性1 3 一葡聚糖的这两种糖苷键之比为1 ：4 2 。水溶性t 3 一葡聚 糖中约9 0 由b 一1 , 3 一键连接的，使其形成了不规则分子形状，b - 1 , 3 一键的含量和比 例决定分子中的葡萄糖单元能否排列成稳定的聚合体，这是影响b 一葡聚糖溶解性 的根本原因。 1 9 4 2 年，n l q t t o v a 等 9 1 首次从燕麦中分离得到种粘胶状的非淀粉多糖，并对 5 3 2 1 宝 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 其结构进行了初步鉴定，提出它是一种多聚葡萄糖，而且结构与地衣多糖很相似 遂命名为昼一葡聚糖( b g l u c a n ) ，其结构式如图1 1 所示： 图1 - 1b - 葡聚糖的结构单位1 ” 纤维素和b 一葡聚糖的基本单位都是b ，吡喃葡萄糖，两者不同点在于b 葡聚 糖的结构中含有b 一1 , 3 和口一1 , 4 两种糖苷键【i 1 1 ，排列无规则，而对某一种特定来源 的1 3 一葡聚糖来说，这两种糖苷键的比例是较为恒定的。p a n f i s h 掣1 拍用纤维素酶或 地衣多糖酶对具有混合键的b 葡聚糖进行选择性水解，证实1 3 葡聚糖主要由两种 成分组成：一是含1 个b 1 , 3 一糖苷键和3 个1 3 1 , 4 糖苷键的四糖单位：另一种是含1 个1 3 1 ，3 一键和2 个b 一1 a 一键的三糖单位，从而推断出b 一葡聚糖可能是由纤维四糖和 纤维三糖以b 一1 , 3 一键和b 1 , 4 一键连接而成的高聚物。但w o o d 等用甲基化分析发 现，b 一葡聚糖中存在着少量长链的1 3 1 , 4 一键：e d n e y 等“4 1 发现不同品种大麦的b 一 葡聚糖结构有所不同，均无连续的1 3 1 , 3 一键存在，这就影响了分子内的联系，使其 内部结构较为松散，使b 葡聚糖部分能溶于水，产生较高的粘性，但有些1 3 一葡聚 糖不溶于水，可能与其含长链1 3 1 , 4 一糖苷键有关。一般来说，所有的b 一葡聚糖均 溶于酸和碱，所以要完全抽提b 一葡聚糖多以酸和碱为溶剂【l ”。 1 1 2b 葡聚糖的抗营养作用 1 1 2 1 影响消化道粘度 大麦或黑麦含有的b 葡聚糖能结合大量水分，增加了消化道内容物的粘稠度， 使食糜在肠道的停留时间增加，降低了单位时间内养分的同化作用，使饲料脂肪、 蛋白质和碳水化合物的消化作用降低，导致畜禽的生产性能下降。w h i t e 等”州对大 麦0 一葡聚糖研究后发现，其粘度依赖于许多因素，包括b 一葡聚糖分子的大小，是 分枝结构还是直链结构，荷电基团的存在以及b - 葡聚糖的浓度等等。l e o n g 等1 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 研究了1 3 葡聚糖的浓度变化后认为： 溶液的粘度增加；随着浓度的提高， 1 3 一葡聚糖在低浓度时与水分子相互作用而使 b 一葡聚糖分子与分子之间发生碰撞，从而缠 绕成网状结构，引起溶液粘度大大增加，到一定程度就可能形成凝胶。 1 1 2 2 影响饲料表观代谢能 p 一葡聚糖的含量直接影响饲料的表观代谢能值。禾谷类植物的b 葡聚糖是组 成n s p 的主要成分，c h o c t 等u 8 1 检狈l j t n s p 和表观代谢能的关系，发现随着n s p 含 量的增加，表观代谢能几乎呈线性降低。 1 1 2 3 影晌脂肪的消化吸收 c a m p b e l l 1 9 1 发现b 一葡聚糖能使脂肪消化率降低，特别是能引起家畜对饱和长链 脂肪酸吸收不良，这种影响在大麦、燕麦、黑麦日粮中均有发现。由于b 一葡聚糖 能相互缠绕成网状结构，降低了饲料的扩散率，阻止脂肪形成脂肪微粒，从而限 制了内源酶与肠道内容物接触。 1 1 2 4 影响消化道酶活性 h e i y 等捌发现，p 葡聚糖能直接与消化道中的胰蛋白酶、脂肪酶等消化酶楣 结合，使这些酶的活性降低。而由于代谢补偿作用，使得蛋白质、脂类和电解质 等内源物质的分泌增加，从而使这些营养物质在体内的贮备减少。 1 1 2 5 影响肠道微生物 b 一葡聚糖能使食糜在消化道内的停留时间延长，这有利于微生物的增殖，微生 物增殖又使动物消化吸收养分减少，原因可能是：a 、亲水性b 一葡聚糖与肠粘膜表 面的多糖蛋白复合物相互作用，导致粘膜表面水层厚度增加，降低了对养分的吸 收，因为表面水层厚度是养分吸收的限制性因素；b 、同消化酶、胆酸结合，使胆 酸呈束缚状态，导致胆固醇及其前体吸收减少，也影响脂肪微粒的形成；c 、引起 肠道微生物形态和功能上的变化；d 、减少肠道内容物停留时间。 1 1 3 大麦中水解1 3 葡聚糖的相关酶系 随着大麦籽粒萌发，淀粉质胚乳细胞壁中的大部分多糖被分泌自糊粉层和盾 鳞的系列酶所降解1 ，细胞壁的部分溶解给其它分泌自糊粉层和盾鳞的水解酶( 如 a 一淀粉酶、内( 外) 肽酶等) 与包被在胚乳细胞壁的底物接触提供必要条件贮“。细胞壁 多糖水解产生的单糖被运输到胚，为幼苗的生长提供必要的能源口”。 1 ，1 3 1b 1 3 1 4 葡聚糖内水解酶 在大麦萌发的早期，至少存在两种不同的内源b 一葡聚糖酶，即且一1 ，3 一d 一葡聚 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 糖水解酶( e c 3 2 1 3 9 ) $ i 11 3 1 , 3 1 ，4 一d 4 一葡聚糖水解酶( e c 3 2 1 7 3 ) ，同时还存在t 3 一 葡萄糖苷酶和嚣，葡聚糖胞外水解酶。b 1 , 3 一葡聚糖酶与大麦抵御病原真菌的侵染 有关，属病程相关蛋i 刍( p r 蛋白) ，而且一1 , 3 1 ，4 。葡聚糖酶是水解大麦1 3 葡聚糖的主 要酶类。 大麦萌发时产生的两种b 一1 , 3 1 ，4 一葡聚糖酶的同工酶为e i 和e 阱】，均为简单蛋 白，由3 0 6 个氨基酸组成，在同工酶e l l 的天冬酰胺a s n l 9 0 处存在约4 ( w w ) 的碳水 化合物，导致其电泳迁移性明显降低。e i 的表观分子量为3 0 k d a ，e l 为3 2 k d a 2 5 1 。 序列分析表明，它们的n 末端4 0 个氨基酸中有3 7 个相同，因大麦为自授精，其品 质基本上为纯合型，故可推断这两个同工酶起源于不同的基因，可能源于共同原 始基因的复制嘲。编码大麦1 3 1 , 3 1 ，4 一葡聚糖酶的基因为单拷贝基因，e u 的基因位 于大麦染色体1 上，编码e i 的基因位子染色体5 上田1 。e l i 基因的完整核酸序列为 5 1 5 9 b p ，编码3 3 4 个氨基酸的开放阅读框被一个大的内含子( 2 9 5 2 b p ) 间隔，序列还 包括编码区上游1 0 3 5 b p 和下游1 7 1 b p 。编码e i 的基因长6 2 6 0 b p ，序列包括1 8 8 5 b p 的5 7 侧翼区域，2 4 9 6 b p 的内含子和7 9 2 b p 的37 一侧翼区。两基因的编码区域有9 2 同 源，两个基因都有一个大的内含子，破坏信号肽( 2 8 个氨基酸) 中的第2 5 个氨基酸的 密码子1 2 8 , 2 9 1 。虽然同功酶e i 和e l i 在核酸和氨基酸水平上9 2 的位置一致，但是两 基因的核酸序列在其37 一非转译区明显不同。用37 一非转译区特异的寡核苷酸进行 n o r t h e 分析，通过p c r 反应扩增特异性c d n a s ，对两基因表达位点进行研究。显 示e l i 基因的转录被限制在萌发谷物的糊粉层内，而同功酶e i 在幼叶、幼根、胚鳞 和糊粉层中均有较高的活性 3 0 , 3 ”，但这种组织特异性表达是如何进化而来的还不 清楚。 1 1 3 21 3 1 3 1 4 葡聚糖外水解酶 1 3 1 , 3 1 ，4 一葡聚糖酶水解产物为含有混合键的寡糖，为b 一3 ( o ) ，纤维二糖一d - 葡 萄糖( g 4 g 3 g r ) 和1 3 3 ( 0 ) 一纤维三糖一d 一葡萄糖( g 4 g 4 g 3 g r ) ( g - f i ：表p 一葡萄糖苷基，数 字代表键型) 【3 2 1 ，水解后释放出的寡糖是幼苗生长所需要葡萄糖源。据估计，成熟 谷物1 8 以上的糖苷残基存储在细胞壁1 3 一i ，3 一l ，4 一葡聚糖中【j 。 将b 1 , 3 1 ，4 寡聚糖水解为葡萄糖的酶包括b 一葡聚糖胞外水解酶和b 一葡萄 糖苷酶 3 4 , 3 5 1 。b 葡聚糖胞外水解酶e x o i 和e x o 水解b 一1 ，3 一葡聚糖，1 3 1 , 3 1 ，4 一葡聚 糖和由内水饵酶释放的1 3 1 , 3 一l ，4 一寡聚糖，从底物非还原末端开始释放葡萄糖，在 水解过程中保持异头碳构型，酶对1 3 1 ，3 一键连接的底物有特异性，能将g 4 g 3 g r 和 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 g 4 g 4 g 3 g r 快速水解成为小分子结构的葡萄糖矧。b 一葡萄糖苷酶能水解寡糖中的 g 4 g 4 g 3 g r 狃g 4 g 3 g r 3 7 3 鼢，两个同功酶8 i 和胃麓快速水解s l t 4 键连接的b 一 寡糖。1 3 一葡萄糖苷酶的分子量为6 2 k d a ，从底物的非还原端释放葡萄糖，异头碳 构型保持不变。因对g 4 g 3 g r 和g 4 g 4 g 3 g r 中1 3 1 , 3 一键的水解速度相对较慢，还不 清楚p 一葡萄糖苷酶在原位水解这些寡耱中所起的作用。表i 3 为麦芽中嚣一葡聚糖 水解酶的性质。 表1 3 麦芽中p 一葡聚糖水解酶的性质 1 2b 一葡聚糖酶的应用现状 b 一葡聚糖酶最早应用于啤酒工业，国外一些酶制剂公司如丹麦n o v o 公司、荷 兰g i s t 公司和美国m i l e s 公司都推出自己的产品，这些产品有的是单纯含b 一葡聚糖 酶制剂，也有的产品是混合酶性质，如含有。一淀粉酶、1 3 一淀粉酶和朊酶等等，表 1 4 为国外一些具有代表性的常用的酶制剂产品。 八十年代初，这些国外酶制剂产品逐渐进入国内市场，添加外源1 3 一葡聚糖酶 的糖化和酿造工艺也逐渐为国内一些大型厂家所采用，我国已将1 3 葡聚糖酶的生 6 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 产及研究列入国家“火炬计划”，并于9 0 年建厂生产和推广应用。但是用于啤酒生 产和饲料加工的国产大麦品质普遍不太好，含t 3 一葡聚糖较高，而进口酶价格较贵、 货源无法保证。我国年进1 ：3 大麦近6 0 万吨，约需外汇2 亿美元，为了改善国产啤酒 质量并使其走向国际，b 葡聚糖酶的推广应用是当务之急。但是国内中、小型啤 酒厂目前尚未全面使用1 3 一葡聚糖酶，这与国产大麦质量参差不齐、b 一葡聚糖酶的 应用性研究不深入有关，也受国产酶的数量、类型的推广力度不足影响，随着国 内消费群对啤酒质量要求的提高，啤酒厂家也将更重视新技术的应用。从长远上 看，含1 3 ，葡聚稽低的大麦品种可选育出来，但从现实国情出发，厂家使用国产大 麦和外加酶技术，可能是增产、降低成本、节省外汇和提高设备利用率的途径之 一。除啤酒生产外，b 葡聚糖酶还用于酒精工业；在一些果汁和葡萄酒生产中用 来改善成品的质量；在饲料行业添加该酶来获得高蛋白饲料；又由于大麦一葡聚 糖酶的高度作用特异性，在国外已被制成纯生化制剂，用于确定植物和微生物细 胞壁中的1 3 一葡聚糖结构及类型。 表l _ 4 国外常用1 3 葡聚糖酶类型瑚 1 3b 一葡聚糖酶的分类及作用方式 b 一葡聚糖酶是指能分解仅由b 一葡萄糖以1 3 一构型连接的多聚糖的一类酶蛔， 包括纤维素酶、昆布多糖酶、1 3 一葡萄糖苷酶、内切b 一1 , 3 一葡聚糖酶、外切b 一1 , 3 一 葡聚糖酶、内切p 一1 , 2 一葡聚糖酶、内切口一1 , 3 1 ，4 一葡聚糖酶、外切母一1 , 4 一葡聚糖酶 和内切b 一1 ，6 一葡聚糖酶，这些酶的命名及作用方式见下表1 5 。 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 表1 - 5b 一葡聚糖水解酶的命名及作用方式 酶编号常用名 系统名 水解方式 狭义的葡聚糖酶特指一1 , 3 1 , 4 一葡聚糖酶( e c 3 1 3 1 7 3 ) ，其底物为b 1 ，3 和 b ，1 , 4 一混合键。b d 一葡聚糖酶主要指分解大麦中的b 。葡聚糖和细菌地农多糖的酶 类，所以又叫地衣多糖酶，在啤酒生产中特指能分解大麦胶的大麦b 一葡聚糖酶。 大麦和麦芽中分别含有6 7 和2 3 的b 一葡聚糖胶性物质，其组成以7 0 的8 1 , 4 一 糖苷键和3 0 的b 一1 ，3 一糖苷键连接，对溶解性能良好的麦芽而言，其本身所产生的 内切b 葡聚糖酶、外切b 一葡聚糖酶、纤维二糖酚及昆布二糖酶能完全分解大麦胶， 而一些劣质或变质的大麦需借助外加的b 葡聚糖酶才能分解大麦胶。大麦b 一葡聚 糖酶是一种内切酶，其作用特异性是对大麦b 一葡聚糖酶中g 4 g 3 g 4 位置有亲和力， 并切断且一1 , 4 键部位，对羧甲基纤维素和昆布聚糖则不起作用。外源添加的b 一葡 聚糖酶主要由细菌和丝状真菌产生，细菌产b 一葡聚糖酶的作用特异性类似于大麦 b 一葡聚糖酶，而丝状真菌产b 一葡聚糖酶作用范围较广，常常对昆布聚糖和羧甲基 纤维素也能降解。细菌产b 一葡聚糖酶的分子量约在1 0 3 0k d a 之间，等电点在p 1 5 6 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 左右，在酶分子的氨基酸组成中，发现含有大量的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及亮 氮酸，却不含胱氨酸、半胱氨酸和色氨酸，也未发现有游离的硫氨基。一般情况 下细菌产b 一葡聚糖酶的耐热性强于真菌酶。 1 4 t 3 葡聚糖酶的结构与特点 2 0 世纪9 0 年代中期，m h a h n l 4 2 和t k e i t e i a a j 通过质谱结合x - 射线结晶体学的 方法对1 3 一葡聚糖酶进行了大量研究，其结果表明：b 葡聚糖酶为一反向平行的b 一折叠体系，每出现一处折叠就剧增大量的蛋白质，因而人们最初将其描绘成如同 伴刀豆球蛋白般的植物血凝素，其模型如图1 2 所示。 图1 21 3 一葡聚糖酶的三维构象 由图1 2 可看出，蛋白质中心由两个b 一折叠堆砌在其顶端构成两个三明治样 式，中心处由7 条经弯曲的反向平行链通过蛋白质一端构成一个裂隙，底物作用时 便结合于此。每一环都由b 一转角形成稳定结构，并且只在一个转角处存在着n 一 螺旋结构。在主环的表面由b 一折叠形成了部分结合位点裂隙，此处通过c y s 3 0 年d c y s 5 9 之间的二硫键将主环与蛋白中心相连接。在远离分子活性位点的凸起的一端 上有c a “，它起到了稳定蛋白质结构的功能【。在分子裂隙的凹段，被视为是低聚 糖底物的结合位点，在其壁上线性排列了大量的芳香族残基，顶端则分布着一些 酸式催化残基，这些催化残基都分布于同一条能发生极性与非极性转换的b 链上。 浙扛工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 该链的第一个催化残基指向蛋白质分子表面，可以与底物结合，后部则指向疏水 的分子内部1 4 ”。 b - 葡聚糖酶是一种重要的病程相关蛋白( p r 蛋白) ，不同类型的p r 蛋白之间 有很大的差异，但是所有的p r 蛋白有如下一些共同的特点 4 6 , 4 7 ： ( i jp r 蛋自的分子量相对较小。根据目前的报道，植物p r 蛋白的分子量一般不 超过4 0 k d a ，大多数是单体，仅少数有两个亚基； ( 2 ) p r 蛋白不完全是酸性蛋白，也有碱性蛋白。p a r e n t 等研究了1 5 个土豆栽 培种的蛋自发现：9 种为酸往蛋白0 i 为3 9 5 - 5 6 0 ，分子量为2 8 ，2 0 0 - 4 0 ，7 0 0 ) ，6 种 为碱性蛋白q i 为7 2 9 2 ，分子量为1 4 ，1 0 0 3 4 ，3 0 0 ) ； ( 3 ) p r 蛋白有较强的稳定性，在强酸性环境中也相对稳定，p h 值为3 0 时仍保 持可溶状态，而此时大多数的植物蛋白都已经变性蜘，p r 蛋白对许多蛋白酶如植 物内源蛋白酶和商品蛋白酶( 乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链蛋白酶等) 的降解有 抵抗作用5 仉5 1 1 。 1 5b 葡聚糖酶的来源 b 一葡聚糖酶广泛存在于高等植物细胞壁中，尤其在大麦、小麦、黑麦和高梁 等谷类经济作物的胚乳细胞壁中含量更为丰富。谷物种籽在其发芽过程中能产生 内源性1 3 1 , 3 和b 一1 , 4 一葡聚糖酶，功能是分解胚乳细胞壁中的且一葡聚糖，保证种 子的正常发芽。 b 一葡聚糖酶也可由微生物产生，如细菌( 芽孢杆菌) 、真菌( 曲霉、毛霉等) 和瘤胃微生物等【5 2 j 3 1 。微生物产1 3 一葡聚糖酶系对b 一葡聚糖多无特异性，只分解由 p 一1 ，2 、0 一l ，3 一、b 一1 ，4 和0 1 , 6 一键构成的纤维素及昆布聚糖等。这些产酶菌广泛 存在于青霉属、木霉属、曲霉属、镰刀菌属、毛霉属和纤维素诺卡氏菌属中，如 娄地青霉和木素木霉等等。而能特异分解b 一葡聚糖的酶主要来源于芽孢杆菌属和 曲霉属，包括枯草芽胞杆菌a c i l l u ss u b t i l i s ) 、浸麻芽胞杆菌a c i l l u sm a c e r a n s ) 、 解淀粉芽胞杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c & n s ) 、环状芽胞杆菌( b a c i l l u sc i r c u l a n s ) 、地 衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i ：o r m i s ) 、短小芽胞杆菌( b a c i l l u sp u m i l u s ) 、黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、臭曲霉( a s p e r g i l l u s f o e t i d u s ) 、冻土毛霉( m u c o r h i e m a l i s ) f f n 米曲霉 1 0 浙江工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 ( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 、溶黄质厄氏菌( q p 船幻v 泐n 胁f n p d f y 如4 ) 5 4 , 5 5 5 6 】，其中已工业 化生产的菌株及其酶学特性见表l 一6 。 植物和微生物产e 葡聚糖酶无论在氨基酸序列上还是在三维空间结构上都没 有相似性。植物产b 谁聚糖酶属糖苷水解酶1 7 家族，有一个( b ，a ) 8 桶状三维结构： 微生物所产8 葡聚糖酶则被划分为糖苷水解酶1 6 家族的一员，有一个环状的8 一 三明治结构刚。 袁i 6 微生物产b 葡聚糖酶的特性5 5 ” 注：“+ ”表示酶能分解该种底物，“一”表示不能分解 1 6b 葡聚糖酶的作用机理 b 一葡聚糖酶能降解b 一葡聚糖分子中的b 1 , 3 一和b 一1 ，4 糖苷键，使之降解为小 分子物质，改变了b 一葡聚糖的亲水性和粘稠度，也改变了单胃动物肠道内容物的 特性、消化酶的活性、肠道微生物的作用环境等等，从而有利于动物对营养物质 的消化和吸收，提高生长性能和粮食的转化率5 9 侧。 ( 1 ) 降解b 一葡聚糖，降低小肠内容物粘度 添加以b 一葡聚糖酶为优势的复合酶制剂，可将完整的b 一葡聚糖切成低分子量 片段，降低食糜的胶化作用，从而降低肠道内容物的粘度，有利于消化酶和营养 物质的充分混合，降低不动水层的厚度，减少胆汁酸的排出，有利于肠道对营养 塑垩三些奎兰堡主兰焦丝兰 墨二兰塞整簦堕 物质的消化吸收。 ( 2 ) 提高内源性消化酶活性 大麦饲粮中添加b 一葡聚糖酶能显著提高肉鸡食糜中的淀粉酶和胰蛋白酶的活 性。高宁国和韩正康6 1 3 研究发现，大麦饲粮添加以b 一葡聚糖酶为主的粗粮制剂， 使肉鸡2 1 日龄食糜的淀粉酶活力提高7 5 ，胰蛋自酶提高1 9 6 。 ( 3 ) 减少肠道微生物 酶制剂的添加可以降低因粘度引起的营养物质在肠道的蓄积，从而减少肠道 菌落，使肠壁交薄，改善肠道对营养物质的吸收，同对肠道中沙门氏杆菌的减少 可以避免胆汁盐的早期解离，有助脂肪的消化。另外细菌群落的减少可以减少畜 禽的腹泻率，预防疾病的发生，有利于畜禽的健康生长。 ( 4 ) 破坏植物细胞壁结构 饲料中的n s 畦要是植物细胞壁的成分，在采谷类中主要是阿拉伯糖、木聚糖 和b 一葡聚糖。畜禽内源性消化酶不能分解这两种多糖中的化学键，细胞壁内的营 养物质难以释放出来。而b 一葡聚糖酶可以分解这种化学键，从而破坏细胞壁结构， 使消化酶能与营养物质充分接触：另一方面，多糖的降解，可以使与之相接触的 蛋白质、淀粉和脂肪都游离出来，有利于营养物质的消化吸收。王振来等 6 2 1 试验 证实，在大麦日粮中加入一种含有母一葡聚糖酶的酶制剂，能量的利用率提高1 3 ， 蛋白质的消化率增 j 1 2 1 。 1 7b 一葡聚糖酶的应用 1 ，7 1 在啤酒工业上的应用咿，6 4 1 在国外，且葡聚糖酶最早应用于啤酒工艺。啤酒生产中糖化醪粘度往往很高， 这是因为大麦b 一葡聚糖含量普遍过高造成的，添加b 一葡聚糖酶能降低麦汁分离速 度和浸出量。发酵液中过量的b 一葡聚糖与蛋白质结合，可以使酵母早期沉积，使 啤酒双乙酰还原期延长，发酵度降低，严重的会形成0 一葡聚糖蛋白胶体层，沉积 于发酵罐下部，影响着啤酒过滤速度，酒损失大幅度上升。此外b 葡聚糖含量过 高会增加啤酒浑浊度和胶状沉淀物，影响酒体清晰度、泡沫等感官指标，进而影 响其保质期。近年来我国利用1 3 一葡聚糖酶分解b 一葡聚糖来改善啤酒质量取得了良 2 浙扛工业大学硕士学位论文 第一章文献综述 好效果。总的来说，b 一葡聚糖酶在啤酒中的应用可从以下三个方面来分析： ( 1 ) 内源性b 一葡聚糖酶的作用 所谓内源性1 3 葡聚糖酶的作用，就是大麦在发芽过程中自身产生的1 3 葡聚糖 酶的作用。首先内切且一1 , 3 一葡聚糖酶作用t 3 一葡聚糖中的糖苷键，将大分子降解为 小分子；随后内切、外切一1 , 3 一和8 1 , 4 一葡聚糖酶作用，使b 葡聚糖分解为还原 糖和b 葡聚糖残片。但b 葡聚糖分解程度由b 一葡聚糖酶的能力决定，一般只能 分解3 0 7 0 。麦芽焙燥时，外切1 3 一葡聚糖酶失活，内切b 一葡聚糖酶活性只保留 5 0 。当内源性t 3 一葡聚糖酶活力减弱时，就不能使麦汁中b 一葡聚糖全部分解，造 成糖化醪过滤时间长、麦汁浊、原料浸出物收率偏低、制成的啤酒易形成混浊、 保质期短和泡沫较少。 ( 2 ) 外源添加1 3 ，葡聚糖酶的作用 所谓外源添加就是利用1 3 一葡聚糖酶分解1 3 一葡聚糖的能力，在啤酒生产中添加 适量的1 3 葡聚糖酶制剂来降低麦芽汁粘度和改善啤酒质量，促进细胞自溶，提高 得率和协助酵母自溶。添加外源性0 葡聚糖酶受到多种因素影响，如酶量太少不 起作用，原料利用率下降且液化力差，生产中会发生管道堵塞现象；而加入量过 多，增加生产成本，同时还原糖增多产生抑制作用，影响了酶的作用和酵母生长； 再者还要考虑酶的作用时问、p h 值、温度等综合因素。因此外源添加1 3 葡聚糖酶 也有局限性。 ( 3 ) 利用改良酿酒酵母 国外已有厂家利用基因工程技术构建优良酵母菌株，产生特定的昼一葡聚糖酶 来分解不同的b 一葡聚糖，用来改善啤酒的感官和质量。但是通常的酵母菌也只能 产生几种类型的1 3 葡聚糖酶，但没有一种能同时降解b 一1 , 3 ，和1 3 1 , 4 这两种糖苷 键，且分泌量相对较少、作用较弱，因此也存在着局限性。 1 7 2 在畜禽饲料生产中的应用6 5 ，6 6 # _ 7 】 研究发现，反刍动物能够借助肠胃中的瘤胃微生物产生的b 一葡聚糖酶消化利 用1 3 一葡聚糖，而单胃动物由于自身不具备合成b 一葡聚耱酶的微生物以及分解该酶 的酶系，使食糜在肠道中具有较高的粘度，阻止肠道消化液与食糜的充分混合， 从而限制了营养物质的吸收，降低了饲料的转化率，成为一种抗营养因子，限制 了大麦等作物在饲料中的应用。大麦是我国主要谷物之一，产量仅次于小麦、稻 谷和玉米，位居第4 。近年来随着畜禽饲料生产的规模化、现代化，谷物饲料尤其 浙江工业大学硕士学位论文第一章文献综述 是大麦饲料的用量不断增加，但其成分中的b 葡聚糖这一抗营养因子的存在严重 制约了饲料的利用率。2 0 世g g o g 代以来，世界上许多国家以璺一穗聚糖酶为主要 酶系的复合酶制剂在大麦型猪饲料中的成功应用，为解决大麦等谷物饲料资源开 辟了一条具有较高经济价值的重要途径。目前我国已经在饲料中推广应用含b 一葡 聚糖酶的复合酶制剂。 1 7 3 在植株抗病中的应用 真菌细胞壁主要由b 一1 ，3 葡聚糖和几丁质组成，植株感染真菌病时，b 一1 , 3 一 葡聚稽酶活性增加，植株有可能用口1 , 3 葡聚糖酶和几丁质酶降解真菌细胞壁而阻 止真菌繁殖。b 一1 , 3 葡聚糖酶是病原诱导蛋白质的主要成分，而且纯化的酶也可在 体外抑制真菌生长，通过替代b 1 , 3 1 ，6 - 葡聚糖酶来水解真菌细胞中的b 一1 , 3 - 1 ，6 一 葡聚糖嘲。用基因特异性探针研究表明受大麦自粉病诱导的基因只有同工酶g ， 也有报道b 1 , 3 葡聚糖酶蛋白能抗冻，大麦叶片经冷冻适应后的离体蛋白质有显著 的积累，经抗血清测定分析该蛋白质是防冻蛋白嘶9 刑。 1 7 ，4 用于胞内物质的提取 酵母提取物在食品工业中具有广泛的应用，虽然酵母内源酶能够破坏细胞壁， 但是添加外源b 一葡聚糖酶可以加速胞内物质的溶出。王云川等口研究发现在面 包酵母和啤酒酵母的自溶过程中添加外源酶，蛋白质得率分别提高t 4 6 、9 6 、 4 7 5 、1 3 _ 3 。 1 7 5 多糖的改性 自然界有着丰富的多糖资源，而这些多糖很多具有潜在的医药应用价值，然 而它们大多不溶于水而影响了多糖的应用。以前对多糖的改性倾向于化学法，但 由于酶具有选择性而更具优越性，因此可以使用p 一葡聚糖酶( 内切酶) 将多糖部分 水解，使其水解成为高分子量水溶性的多稽，同时又能保持多糖的生物活性。 1 8 葡聚糖酶的多样性 1 8 1 分类的多样性 根据酶的作用位点不同可分为外切酶和内切酶，b 一1 ，3 一葡聚糖酶属于水解酶 类，包括内b 一1 , 3 一葡聚糖酶( e c 3 2 1 3 9 ) 、内b 一1 , 3 1