（发酵工程专业论文）产多糖海洋菌的筛选与发酵动力学研究.pdf

产多尊- 洋细菌的蕾葺向冀翻t 动力掌研究 产胞外多糖海洋菌的筛选及其发酵动力学研究 摘要 本论文研究内容为从大量海洋菌种进行筛选，得到能产生硫酸酯 多糖的细菌。在多糖发酵条件研究中，考察了不同碳源、氮源、培养 基的初始p h 值、摇瓶装液量及盐度等管理重要因素对多糖产量的影 响。结果表明，海洋菌m 4 的适宜发酵培养基组成为：蔗糖：4 ； ( n h 4 ) 2 s 0 2 ：0 4 ：人工海水；n a c i ：5 ；p h ：8 0 ： ， 适宜的发酵条件：装液量为2 0 0 m l ( 5 0 0 r a l 三角瓶) ，接种量为 8 ，温度为3 1 ，转速2 0 0 r m in 。在最优条件下，多糖产量可达到 8 m g m l 。 应用i o g i s t i o 方程和l u e d e k i n g - p ir e t 方程通过产多糖海洋细 菌m 4 发酵过程得到菌体生长，多糖合成，底物消耗的动力学参数， 确定了动力学方程，经验证，动力学模型与实验数据较好拟合。 发酵过程可分为菌体生长与多糖生产两个阶段，当菌体生长阶段 转速为2 0 0 r m n ，多糖生产阶段转速为1 0 0 r m i n 时，多糖产量相对 与恒转速2 0 0 r m in 时提高2 5 ，达到1 0 l 。 应用超滤方法，凝胶柱层析方法，阴离子交换柱层析方法能够较 好的纯化多糖。使用凝胶柱层析方法估计多糖分子量为1 5 0 0 0 。 关键词：海洋菌多糖发酵优化动力学凝胶柱离子交换柱 产，l 捌r 海洋_ r 的雄避与毫 动力掣河，巴 s c r e e n i n go fe x o p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c i n g s t r a i nf r o mm a r i n eb a c t e i u a la n d f e r m e n t a l t i o nk i n e t i c ss t u d y a b s t r a c t m a s s e so fm a r i n em i c r o o r g a n i s m sw e r es c r e e n e d o n eb a c t e r i a l w h i c hc a n p r o d u c e s u l f a t e d e x o p o l y s a c c h a r i d e s w e r e g a i n e d t h e m e d i u ma n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r eo p t i m i z e d t h i sp a p e rs t u d i e ds u c hf a c t o r sa sc a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e a n dt h e i r c o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p h ，s h a k i n gs p e e d ，s a l i n i t y , i n o c u l u m ss i z e ，a n ds oo n b ys t u d yo ff e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g y ，t h e o p t i m i z e dm e d i u mc o n s i s t e do f s u c r o s e4 ，( n i 1 4 ) 2 s 0 2o 4 ，a r t i f i c i a l s e a w a t e r ，n a c l5 ，p h8 0 t h eb e s tc u l t u r ec o n d i t i o n s 5 0 0 m lc o n i c a lf l a s k c o n t a i n i n g2 0 0 m l l i q u i dm e d i u m ，8 i n o c u l u m ss i z e ，31 ，s h a k i n gs p e e ds h o u l db e 2 0 0 r m i n ，7 d a y so nar o t a r ys h a k e r u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ，t h e y i e l do f p o l y s a c c h a r i d e sc a nr e a c h8 9 l t h ef e r m e n t a t i o nk i n e t i cp a r a m e t e r so fb i o m a s s ，p o l y s a c c h a r i d ea n d s u c r o s ec o n s u m p t i o nb ym 4w e r ec a l c u l a t e db ya p p l y i n gt h el o g i s t i c ，t h e l u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o nr e s p e c t i v e l y b yc o m p a r i n gt h ee x p e r i m e n t a l d a t aw i t ht h em o d e l s ，t h r e em o d e l sw e r et e s t i f i e da n dc o u l dd e s c r i b et h e f e r m e n t a t i o nc o u r s ew e l l 产多籍海洋白_ r 的弹捆河生捌 动力掌研，巴 t h ec o u r s eo ff e r m e n t a t i o nc o u l db ed e v i d e di n t ot w o s t a g e s ，w h i c h a r eb i o m a s sg r o w t hs t a g ea n dp o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o ns t a g e t h ey i e l d o fp o l y s a c c h a r i d ei n c r e a s e db y2 5 p e r c e n ta f t e rt h er o t a t i o ns p e e dc h a n g e d f r o m2 0 0 r m i nt o10 0 r m i na st h ec o u r s eo ff e r m e n t a t i o nc h a n g e df r o m b i o m a s sg r o w t hs t a g et op o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o ns t a g e u l t r a f i l t r a t i o n ，g e l f i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw e r eu s e dt op u r i f yt h ep o l y s a c c h a r i d e s o n es o l es y m - m e t r i c a lf r a c t i o nw a sg o t t e nr e s p e c t i v e l yi nt w oc h r o m a t o g r a p h y t h er e s u l t si n d i c a t et h ep o l y s a e c h a r i d e sc a nb ew e l lp u r i f i e db yt h e s e m e t h o d s t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep o l y s a e c h a r i d ew a se s t i m a t e d t ob e15 ，0 0 0t h r o u g hg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y k e y w o r d s ：m a r i n em i c r o o r g a n i s m ：e x o p o l y s a c c h a r i d e s ；f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ；k i n e t i c s ；g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o 铲印h y ；i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i 产多。嗣 洋细r 的l 捆河鬟e 动力掌研，巴 第一章前言 1 多糖介绍 多塘是一种可再生资源，它提供给人类多种可能极具使用价值的产品。多糖 广泛存于各种动物、植物，微生物及海藻中，被广泛应用于食品、化工、医药( 中 药) 等领域。由于多糖特殊而良好的理化性质，现阶段多糖的应用主要集中在化 工与食品领域，但随着对多糖理化性质、结构和生物活性的深入研究，分子生物 学和细胞生物学的发展，发现多糖及其复合物分子具有重要的生物学功能，它与 机体免疫功能的调节、细胞( 病毒) 与细胞之间的识别、细胞间物质与信息的运 输、癌症的诊断与治疗都有着密切的关系，多糖的应用领域正在向医药应用方面 迅速拓展“1 。 目前发达国家纷纷成立以糖( g l y c o - ) 命名的公司，集中人力物力致力于糖 类物质的研究。作为肿瘤、糖尿病、抗病毒等的治疗药物，或手术辅助药物，多 种多糖产品已进入临床试验阶段。但是由于多糖结构十分复杂，所携带的信息量 大大超过肽链和核苷酸，人们对其功能还未认识清楚。许多研究机构都在开展多 糖结构与生物活性方面的研究，也已取得一定的进步。例如不断积累的证据表明， b ( 卜2 ) 连接的葡聚糖，9 ( 卜3 ) 连接的葡聚糖和半乳糖，b ( 卜3 ) 为主链的葡聚 糖，含( 卜6 ) 支链的多糖均有一定的抑瘤活性“1 。 随着对多糖研究的深入，作为理想的免疫强化剂，无毒副作用的优点，多糖 在药物领域的研究应用必然越来越广。 总结多糖最受关注和最有潜力的生物活性和药用价值如下： ( 1 ) 增强机体免疫能力 多糖主要影响免疫系统中的网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞及白细胞， 促进r n a ，d n a ，蛋白质的合成、抗体的生成、补体的生成以及对干扰素的诱生作 用，增强机体的免疫功能，使抗病能力增强，从而达到抗衰老、抗放射线、抗癌 以及抗肝炎的目的啪。 ( 2 ) 降血糖作用旧 具降血糖作用的多糖中有单聚糖、杂多糖、粘多糖，其构效关系和作用尚不 清楚。t o m o d a 认为在粘性多糖中的乙酰基的存在是降血糖活性的重要抑制因子。 ( 3 ) 抗放射线作用 它是通过强化造血系统和活化吞噬细胞等作用提高机体对辐射的耐受性。如 酸枣仁多糖、海带多糖、黑木耳多糖、银耳多糖等，对放射性损伤小鼠有明显保 ，多糟海洋细r 的捌l 嗣内，：捌 窜，力阜u 井兜 护作用，使动物存活率增加 ( 5 ) 抗病毒( h i v ) 作用嘲 硫酸化多糖通过抑制逆转录酶活性( h i v 为逆转录酶病毒) ；抑制靶细胞与 病毒结合；增强机体免疫功能而发挥作用。科学家们已进一步发现硫酸化多糖能 从多个环节、步骤上干扰h i v 对宿主细胞的侵袭，对其具有很高的选择性抑制作 用。在美国，硫酸化右旋糖酐和多硫酸聚戊糖已进入i 型临床实验。在德国，人 工合成的木聚糖( h o e b o y 9 7 6 ) 也试用于临床。实验证明，硫酸化多糖抑铝i h i v 的 作用不仅与浓度呈量效关系，而且与分子中的硫酸盐含量有关。硫酸盐阴离子是 其抑匍j h l v 的必需离子结构。 ( 6 ) 抗肿瘤作用 多糖通过增强机体的免疫功能、改变细胞膜生化活性、诱生肿瘤坏死因子、 抗自由基作用而达到抗癌活性，并非直接杀伤瘤细胞，所以对正常细胞无杀伤作 用，优于细胞毒抗癌药，如香菇多糖、云芝多糖、获荃多糖、银耳多糖等。它可 与一些抗癌药物( 如5 一f u 、环磷酞胺等) 作用，恢复由化疗所导致的免疫功能低下， 增强抗肿瘤活性。目前除香菇多糖外，已有不少糖类化合物作为抗癌免疫药物通 过了卫生部门的批准，正式应用于临床。代表的有裂褶多糖、云芝多糖、猪荃多 糖等。 2 微生物多糖的介绍 2 i 微生物能产生三种不同类型的多糖“： ( 1 ) 胞外多糖，以包裹着微生物细胞的荚膜形式或以无定形物质形式分泌到周 围培养液中； ( 2 ) 结构多糖，可以作为细胞壁的组成部分； ( 3 ) 胞内储存多糖。 2 2 微生物产生的多糖能在科学和工业上取得成功基于以下几点： ( 1 ) 可以通过选择合适的菌种在受控条件下生产； ( 2 ) 多糖通常存在着高度的结构一致性； ( 3 ) 不同微生物能够合成很多非常特殊的离子型和中性多糖，这些多糖在组成 和性质方面有着很大的不同，而在植物多糖中并没有这样的多样性，并且，也 许更重要的是，它们不能通过化学合成的方法来仿制。 虽然现在已经可以获得很多种微生物多糖，但实际上实现产业化的多糖数量 并不多，而且可以预见，将来实现微生物多糖产业化的数量也不会有太大的增长。 2 产多奢- 弹细r 的砷鱼与置翻t 动力掌研究 对于微生物多糖而言，只有黄原胶的生产公司较多且产量很大，估计每年在全世 界的供应量有2 0 0 0 0 吨之多忉。与许多植物来源的多糖相比，微生物来源的多糖 产品价格相对较高，产量较低。 表卜1 主要商品化的微生物多糖。1 多糖来源 纤维素细菌 葡萄糖醋酸杆菌属( o l u c o n a c e t o b a c t e r ) 凝胶多糖细菌 土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u m ) 右旋糖酐及其衍生物细菌 明串珠均( l e u c o n o s t o c ) 古兰糖细菌 鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o m o n a s ) 透明质酸细菌 链球菌属( s t r e p t o c o c c u ss p p ) 支链淀粉真菌 出芽短梗霉( a u r e o b a s i d i u mp u l l u a n s ) 黄原胶细菌 野油菜黄单胞菌( x a n t h o m o n a sc a m p e s t r i s ) 2 3 已工业化生产的微生物多糖 2 3 1 黄原胶( x a n t h a ng u m ) 黄原胶是黄单胞菌( x a n t h o m o n a s ) 细菌产生的胞外多糖，黄原胶由晓葡萄 糖、傀甘露糖、屁葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸聚合而成。黄原胶易溶于水，在冷 水、热水中分散性稳定，在低浓度下能产生很高的粘度，增稠性良好，水溶液呈 透明胶状，具有较高的假塑性，耐酸耐碱，抗盐，抗温，优良的兼容性能，具有 良好的分散和乳化作用，在可用作稳定剂、乳化剂、悬浮剂、增稠剂、泡沫增强 剂和加工辅助剂0 1 。 图1 1 黄原胶分子结构 f i g u r e1 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fx a n t h a ng u m j - 多- 蔫雄囊i r 的弗曩河生翻 ，力尊断竟 目前黄原胶的生产主要以淀粉，淀粉水解糖浆为底物，由黄单胞杆菌发酵制 得。在美国的k e l c o 公司早在2 0 世纪6 0 年代初即开始了大量商业化生产黄原胶。 世界上生产黄原胶的国家和地区有1 0 余个。我国自2 0 世纪7 0 年代以来黄原胶工业 从无到有，迅速发展起来。黄原胶广泛应用于食品，医药，日化，石油等2 0 余个 行业，有3 0 4 0 个品种。近3 0 年来，对黄原胶的需求量年均增长5 7 ，它已成为 世界上生产规模最大，用途较广的微生物多糖“”。 2 3 2 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，h a ) 透明质酸可由链球菌生产，结构为d 葡萄糖醛酸和d n 一己酰氨基葡萄糖胺以 b l ，4 一，和b 一1 ，3 一糖苷键连接而成。透明质酸，又名玻璃酸，是一种广泛存在 于人体和其它生物内的高分子非蛋白酸性粘多糖。 图卜2 透明质酸的分子结构 f i g u r e 1 2t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fh y a l u r o n i ca c i d h a 在空间上呈刚性的螺旋柱构型，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈 的亲水性。h a 分子间的这种特定的构型，使其具有很高的粘度和润滑作用。 透明质酸在医药方面的应用： ( 1 ) 在2 0 世纪8 0 年代，透明质酸被注射到眼镜前室以保护角内皮等组织。现在 透明质酸钠作为必备的填充剂被广泛应用于白内障囊外摘除术、人工晶体 植入术、视网膜剥离术和角膜移植术等多种眼科手术“” ( 2 ) 透明质酸的润滑与缓冲作用可用于骨关节炎、肩周炎、类风湿关节炎的治 疗。在患关节炎的人体中，通过关节炎注射透明质酸，可以缓解疼痛和改 善关节运动性，可替代传统的甾体药物用于治疗严重退化的关节疾病“”。 ( 3 ) f i a 对细胞外基质的组织粘度、冲击吸附和空间溢满起着决定性作用。对于 烧伤和慢性溃疡病人，一类改良透明质酸产品在欧洲由c o n v a t e c 公司投放 4 j ，- 糖海洋由i r 的弗爿l 与童：，力掌研完 至市场，可加快伤口的恢复过程。g e n z y m e 公司的透明质多糖产品可减少由 于外科手术造成的组织损伤。 ( 4 ) 透明质多糖是一种理想的药物载体分子，可将各种药物导向送到各病理部 位，特别适宜局部给药。让药物定位于作用部位同时缓慢释放，可以大大增 强药物的疗效。有关用改良的透明质多糖作为局部和静脉药物输送系统的 研究正在进行之中“”。 ( 5 ) 透明质多糖寡糖的作用：透明质多糖寡糖能促进成纤维细胞的增殖和迁移， 刺激新的血管的形成，并激活巨噬细胞。 ( 6 ) 在人体内肺癌临床前研究中，透明质酸丁酸酯具有良好的抗肿瘤效果洲 2 3 3 凝胶多糖( c u r d l a n ) 凝胶多糖主要由产碱菌属( a l c a l i g e n e s ) 和土壤杆菌属( a g r o b a c t e r l u m ) 生产，是一种新型的微生物胞外多糖，它是由d 葡萄糖以b 一( 1 3 ) 键连接而成 的线性大分子，结构“”见图卜l _ 0 1 图卜3 凝胶多糖的结构示意图 f i g u r e1 3t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc u r d l a n 凝胶多糖在医药方面的应用： ( 1 ) b 一葡聚糖家族的免疫刺激作用已被广泛接受。平均相对分子量为3 0 0 4 0 0 0 的凝胶多糖水解产物可作为免疫激活剂，不会产生任何副作用。 ( 2 ) 据报道具有口一1 ，3 - 葡聚糖骨架的硫酸凝胶多糖表现出良好的肿瘤抑制作 用“”和高度抗a i d s 病毒活性和很小的副作用“”。从1 9 9 2 年开始，硫酸凝胶 多糖用于治疗h i v 携带者的i 期临床实验就已在美国f d a 的支持下在美 国进行。研究发现平均聚合度从1 0 - 4 0 0 的低分子量凝胶多糖硫酸酯具有高 度的水溶性、低毒性和高效抑制人体逆转录病毒增殖的活性，因而对于预 产，l 糟海洋细 r 的姊矗与冀i 动力掌研，巴 防和治疗感染很有帮助。 ( 3 ) 线性凝胶多糖硫酸酯被发现具有强烈的抗凝血作用，所以可以作为血浆抗 凝剂防治血栓病。 ( 4 ) 凝胶多糖也可作为含活性药物如吲哚美辛，双氯灭痛和异布洛芬的缓释基 质“”。凝胶多糖羟乙基衍生物可作为蛋白药物的输送载体。 ( 5 ) h i r o s h i 等曾报道凝胶多糖可有效地治疗痴呆症。 表i - 2 凝胶多糖药物专利”3 专利号发明者名称 年份 j p - o l1 3 7 9 9 0 ai f u m i o ，i k i m i k a z u ，双歧杆菌增殖 1 9 8 9 j p - 0 2 1 2 4 9 0 2 a t s u n e o血液凝集抑制剂1 9 9 0 j p 一0 3 2 1 8 3 1 7 t t a k a s h i抗逆转录病毒剂1 9 9 1 j p 一0 7 2 2 8 6 0 1 k m i k i o 抗病毒剂 1 9 9 5 j p - 0 9 2 5 5 5 7 9 s h i r o s h i治疗痴呆症 1 9 9 7 j p - 1 0 1 9 4 9 7 7 k m a s a h i r o免疫激活剂1 9 9 8 2 3 4 壳聚糖( c h i t o s a n ) 壳聚糖学名聚氨基葡萄糖，又名可溶性甲壳质，在自然界中的含量十分丰富， 其贮量仅次于纤维素的第二大天然聚合物，在许多方面有着广泛的用途。 c h i l i n c h i t 0 置日n h 一门 图1 - 4 壳聚糖的分子结构 f i g u r e1 4t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc h i t o s a n 目前工业生产壳聚糖以提取法为主，但由于真菌等微生物具有壳聚糖的潜在 资源，近年来人们开始了其发酵法生产的研究。中国首创的利用废菌丝体发酵生 产壳聚糖等生化产品的技术，通过了国家的鉴定和验收，该成果壳聚糖发酵水平 6 产多糖鼻雌细r 的姊嗣i 与冀t 动力掌研究 达1 5 3 9 l ，提取收率达8 l “”。 壳聚糖在医药方面的应用： ( 1 ) 作为固定化酶的载体。 壳聚糖是一种网状载体，具有机械性能良好、化学性质稳定、耐热性强等优 点，特别是分子中存在的氨基易与蛋白质或酶结合，可络合金属离子，使酶免受金 属离子的抑制，同时它又易于通过接枝而改性，因此是一种良好的蛋白质和酶的 载体。现已成功地在壳聚糖上固定了碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、淀粉酶、天冬氨 酸酶、纤维素及半纤维素酶等。”。 ( 2 ) 基因重组用微载体。 壳聚糖来t l 于生物体，细胞毒性极低、亲和性好、安全性高，可用作d n a 的载 体胁】。 ( 3 ) 生产具有生理活性物质的生物膜。 阳离子的壳聚糖溶液与阴离子的藻酸溶液可相互作用形成不溶于水的生物 膜，这种生物膜的相容性好，能渗透细胞产物胰岛素，如将其移植到切除了胰脏的 动物体内，可成功地控制血糖浓度嘲。 ( 4 ) 促进凝血和伤口愈合。 壳聚糖具有促进血液凝固的作用，可用作止血剂。它还可用于伤1 3 填料物质， 具有灭菌、促进伤口愈合、吸收伤口渗出物、不易脱水收缩等作用。 ( 5 ) 作为药物的缓释基质。 壳聚糖能被生物体内的溶菌酶降解生成天然的代谢物，具有无毒、能被生物 体完全吸收的特点，因此用它作药物缓释剂具有较大的优越性。日本已有以壳聚 糖作为基质的缓释药物出售嘲。 ( 6 ) 用作人造组织和器官。 壳聚糖与磷酸钙的复合物可作为骨的替代物，用于骨的修补及牙的填料：壳 聚糖衍生物与聚酯的复合材料可用作人造血管。 ( 7 ) 具有免疫调节活性。 巨噬细胞表面存在着细菌多糖的受体，而壳聚糖作为细菌多糖的类似物，能 刺激巨噬细胞活化，产生如下反应：促进其吞噬功能，增强它在其它免疫应答中的 协同效应，从而实现机体对t 细胞、n k 细胞和b 细胞的调节，介导机体的细胞免疫 7 ，- ，i 糖海洋鼻日r 9 翻l 鼍 r 童翻 动力攀研，巴 应答和体液免疫应答。 另外壳聚糖对许多物质具有螯合吸附作用，其分子中的氨基和与氨基相临的 羟基与许多金属离子( 如h g ”、n i ”、c u 2 + 、p b ”、c d ”、a g + 等) 能形成稳定的螯合物， 用于治理重金属废水、净化自来水及在湿法冶金中分离金属离子等嘲1 。日本是最 早利用壳聚糖治理废水的国家，每年用量达5 0 0 t ，美国环保局也已批准将壳聚糖 用于饮用水的纯化。 、 3 海洋资源的开发利用 掘了解，占地球面积7 1 的海洋里生活着约4 0 万种生物，是地球生物物种 总数的8 0 。生长在海洋这一特殊环境( 高盐、高压、缺氧、缺少阳光等) 中的 海洋生物，在其生长和代谢过程中，产生并积累了大量具有特殊化学结构并具有 特殊生理活性和功能的物质，是开发新型海洋药物和功能食品的重要资源。 海洋天然产物、海洋多糖、海洋微生物和海洋生物技术的研究成为我国海洋 药物研究的四大特点。国家自然科学基金、国家“8 6 3 ”高技术研究发展基金以 及各省市的重点基金都逐年加大了对海洋药物的资助。 海洋微生物种类高达1 0 0 万种以上，其次生代谢产物的多样性也是陆生微生 物无法比拟的。但能人工培养的海洋微生物只有几千种，不到总数的1 ；目前 为止，以分离代谢产物为目的而被分离培养的海洋微生物就更少。由于微生物可 以经发酵工程大量获得发酵产物，药源得到保障。此外，海洋共生微生物有可能 是其宿主中天然活性物质的真正产生者，具有重要的研究价值嘲。 4 海洋微生物多糖的研究 在海洋细菌多糖研究方面，各国科研工作者对深海热水出口附近采集来的微 生物产生的多糖非常感兴趣，因为深海热水旁极端的环境( 高压，高温度梯度， 高浓度有毒物) ，产生的多糖在结构和生物化学性质方面有其特殊性。海洋假单 胞菌( p s e u d o a t e r o m o n a s ) 可产生一系列具有生物活性的胞外多糖，如抗体、 酶、抗毒素及抗肿瘤和抗病毒的物质，其胞外多糖也引起了广泛的关注。 国内外学者从海洋微生物中研究发现了大量的具有新颖结构和良好生物活 性的多糖类物质，成果众多。 ( 1 ) u m e z a w ah 等啪1 从海水、海泥和海草中分离出海洋细菌，经过人工海水的培 养后，从培养液中分离出1 6 7 种胞外多糖，对这些多糖进行抗肿瘤活性筛选， 8 产，l 鞠f 洋由l r 的讳麓与冀 暂力攀研，巴 有6 的多糖有明显抗s 。活性。其中有一种新的杂多糖m a r i n a c t a n ，是由葡萄 糖、甘露糖和盐藻糖按7 ：2 ：1 的比例组成，对s 。抑瘤率为7 9 - 9 0 。 ( 2 ) e g u c h ih 等。7 1 从一种海洋病原细菌中用l p s 的温和酸性处理方法获得一种多 糖p s - 1 ，其组成为2 一氨基一2 一去氧一右旋葡萄糖，2 一氨基一2 ，6 一去氧一右旋葡 萄糖，4 一氨基一4 ，6 - - 去氧一右旋葡萄糖，n 一乙酰化的2 ，4 一二羟基一3 ，3 ， 4 一三甲基吡喃葡萄糖糖氨酸。 ( 3 ) w o r a w a t t a n a m a t e e k u lw 。3 从褐藻u n d a r i ap i n n a a t i f i d a 中分离的一种名为 w r k 一1 的假单胞菌能够产生一种硫酸多糖b _ 1 ，能在含蔗糖的海水中培养产 生。用乙醇和c e t a v l o n 沉淀，并通过d e a e - 纤维素柱分离纯化，结果表明b - 1 多糖含有2 ：1 ：1 的半乳糖，葡萄糖和硫酸盐。 ( 4 ) h a s h i m o t ok 汹1 等人从海洋假单孢菌分离得到硫酸多糖o k u 4 1 ，分子量为 5 0 1 0 5 ，硫酸含量为5 4 ，可以抑制h i v _ l ，h i 卜2 病毒引起细胞病变的 效果。 ( 5 ) 海洋细菌1 2 0 2 为厦门大学苏文金等从2 0 0 0 余株海洋微生物中分离筛选获得 的微生物胞外多糖高产菌株，该菌株产生的胞外多糖以b 一葡聚糖为主要成 分。通过培养基及培养条件的优化后进行中试扩大生产，1 2 0 2 多糖产量及 转化率分别为8 3 1 9 l 和2 0 7 8 。采用乙醇沉淀获得的粗多糖等工艺精制而 成的多糖胶囊产品经实验动物测定，在1 ：1 ) 艮3 0 m g k g 多糖的剂量下，对机体 的非特异性免疫( 吞噬鸡红细胞实验和n k 细胞活性) 、细胞免疫和体液免 疫( 淋巴细胞转化、迟发型变态反应、血清溶血素测定) 等均有显著的免 疫增强活性；3 0 m g k g 剂量连续给药l o 天，1 2 0 2 多糖对s - 1 8 0 肉瘤抑制率达 3 2 以上，具有较强的抗肿瘤活性。与抗肿瘤化疗剂连用，能够有效地提高 抑瘤效果和机体的生存质量。该多糖胶囊经小鼠口服急性毒性实验测定， l d s o 为6 9 k g 以上，属实际无毒级产品；a m e s 实验表明该多糖产品无致突变 毒副作用侧o ”。 ( 6 ) 中国海洋大学研究开发了一系列命名为9 1 1 至9 1 7 的海洋多糖类物质，有些 已进入临床研究阶段。结果表明，海洋硫酸多糖9 1 1 的适宜剂量能较弱地刺 激小鼠胸腺、脾脏淋巴细胞增殖，明显促进c o - h a 诱导的t 淋巴细胞及l p s 诱 导的b 淋巴细胞增殖，显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，且免 9 j - 宴l 糟海洋抽r 的姊鼍与冀i 动力掌研究 疫细胞均能染上9 1 1 一f i t c 。说明9 1 1 增强机体免疫力，起到免疫调节作用嘲 9 1 1 可明显抑制病毒逆转录酶活性，对h i v - 1 无明显直接灭活作用，但可明 显干扰h i v l 与细胞的吸附，半数有效浓度( i c 5 0 ) 为3 6 5 1 m g l 。提示9 1 1 的 抗a i d s 作用与抑制逆转录酶活性和干扰病毒与细胞的吸附有关。 ( 7 ) 抗肿瘤一类新药y c p ：南京大学、中国药科大学从采自黄海底部淤泥中的一 株海洋真菌中分离得到的一个全新结构的多糖y c p ，药理学研究表明y c p 多 糖能促进巨噬细胞n o ，i l 一1 的合成，并能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 中性红的作用。y c p 可调节动物的免疫功能，对小鼠移植瘤s l s o 和h e p s 等都 有显著的抑制作用。y c p b 显著降低荷瘤小鼠瘤重，增加小鼠脾重，促进n k 细胞和c t l 细胞对靶细胞的杀伤活性，增加荷瘤小鼠脾脏c d 4 、c d 8 阳性细胞 的含量，其生物学作用优于现有的香菇多糖、云芝多糖。目前，该项目已 完成临床前的大部分工作，生产已通过中试，正拟定临床试验计划，准备 申请进行临床研究1 。 ( 8 ) 庞宗文，梁静娟研究的海洋短小芽孢杆菌( b a c i l l u sp u m i l u sp l m 4 ) 所产生的生物活性物质抗肿瘤胞外多糖( a n t i t u m o r e x o p 0 1 y s a c c h a r i d e ) 项目也已取得可喜的成果。由该多糖的活性研究证明纯化多糖具 有显著的体外抗h e p 一2 喉癌细胞活性，高、中剂量的多糖粗品对小鼠体 内对s 1 8 0 和h 2 2 移植实体瘤也有明显的抑瘤作用。初步确定该多糖对肿 瘤细胞具有直接的杀伤作用。 1 0 产多_ 簿群细曹的姊避与冀畔蕾 力掌崭竞 5 研究目的与内容 5 1 研究目的 鉴于多糖的优良特性，在各领域特别是医药领域良好的应用前景，广西 大学在多糖研究方面的良好基础，例如周河治研究的凝胶多糖技术已达到国 内先进水平，其产品已填补国内空白，以及广西北部湾优越的海洋环境，本 课题旨在通过对海洋细菌进行分离纯化筛选出产多糖的菌株，为进一步研究 海洋微生物来源多糖生物活性，药用价值打下基础，做一些前期准备工作。 5 2 研究内容 本课题主要从以下几个方面进行了研究： l 、采集海洋样品，从中分离纯化一定数量的不同菌株。 2 、由已分离纯化的海洋菌中筛选出产硫酸酯多糖的菌株 3 、进行紫外诱变育种实验复筛多糖产量有较大提高的菌株。 3 、对得到的产多糖菌株进行发酵培养基和发酵工艺条件的研究。 4 、对产多糖菌株进行发酵动力学的研究。 5 、变转速发酵条件对多糖生产的影响 6 、对多糖提取纯化的研究 产多辅- 嗣皓细r 的赡蚺冉黛捌 锄力掌研究- 第二章产多糖海洋细菌的分离筛选与菌种鉴定 l 材料与方法 1 1 样品来源 由北部湾涠洲岛附近水域采集得到样品。 1 2 主要仪器 s w - c j 1 f 超净工作台苏州安泰空气技术有限公司 1 0 1 2 b s 电热恒温鼓风干燥箱上海跃进医疗器械厂 s h b i i i 循环水式多用真空泵郑州长城科工贸有限公司 w d s 0 0 s l 2 3 k 4 格兰仕微波炉顺德格兰仕电器实业有限公司 国华牌s h a - c 恒温振荡器中外合资深圳天南海北有限公司 c 1 5 a 乐邦微电脑电磁炉广州电子电器有限公司 精密移液器1 5 1 本n i c h i r y o ( 立洋) u v - 1 6 0 1 紫外分光光度计日本s m m a d z u 公司 b a c k m a n j 2 2 1 高速冷冻离心机美国b a e k m a n 公司 s l b 5 0 l 型立式压力蒸汽灭菌器上海医用核子仪器厂 s p x - 2 5 0 型生化培养箱上海跃进医疗仪器厂 分析天平( 分析感量0 0 0 0 0 1 9 )瑞士梅特勒 b c d 2 3 5 w bt c l 冰箱t c l 集团有限公司 y p l 2 0 0 型电子天平上海精科实业有限公司 荧光分光光度计l d o d e l 一9 6 0上海第三分析仪器厂 1 3 试剂 葡萄糖氯化钠酵母膏 蛋白胨琼脂粉硝酸铵 七水合硫酸亚铁磷酸二氢钠氟化钠 苯酚 氯化钾氢氧化钠 溴化钾氯化锶碳酸氢钠 氯化钙柠檬酸铁硫酸钠 硼酸硫酸镁硅酸钠 9 5 乙醇硫酸3 ，5 一二硝基水杨酸 荧光试剂细胞染色剂 1 2 产多辅- 海洋细r 的辨琏与量 动力攀研竞 1 4 培养基 ( 1 ) 佐贝尔分离培养基( z o b e l l ) ：葡萄糖1 ，酵母膏0 1 ，蛋白胨0 5 ，琼脂 1 5 2 0 ，p h 7 5 ，人工海水溶解，加入杀真菌素至浓度为1 0 0 垤m l 。 ( 2 ) 斜面培养基：蛋白胨0 5 ，酵母膏0 1 ，人工海水，琼脂1 5 。 ( 3 ) 固体鉴别培养基：葡萄糖1 ，酵母膏0 1 ，蛋白胨0 5 ，人工海水，p h 7 0 ， 另加入荧光染料2 0 0 m g l 。 ( 4 ) 发酵培养基：葡萄糖2 ，酵母膏0 1 ，蛋白胨0 5 ，人工海水，p h 7 0 ， ( 5 ) 人工海水配方：硝酸铵0 0 0 0 1 6 ，硼酸0 0 0 2 2 ，氯化钙0 1 8 ，磷酸氢 二钠0 0 0 0 8 ，柠檬酸铁0 0 1 ，氯化镁0 8 8 ，溴化钾0 0 0 8 ，氯化钾0 0 5 5 ， 碳酸氢钠0 0 1 6 ，氯化钠1 9 4 5 ，硅酸钠0 0 0 0 4 ，硫酸钠0 0 3 2 4 ，氯化 锶0 0 0 3 4 ，氟化钠0 0 0 0 2 4 。 1 5 分离筛选方法 主要步骤如下： 样品采集 i 富集培养 i 按1 0 倍稀释法至1 0 - 6 平板分离 i2 8 培养7 d 菌株纯化 i2 8 培养7 d 平板鉴别培养 i 选取多糖生产菌 细胞染色鉴别 i 选取硫酸酯多糖生产菌 摇瓶培养测定多糖 l u v 紫外诱变 摇瓶培养测定多糖筛选正突变者 l 菌种初步鉴定 l 保藏 产多嶙洋细r 的御捌坷量i 动力攀研兜 1 6 固体培养多糖产生菌的检测方法 将有菌落生长的含有荧光染料的琼脂平板，置于紫外线光下，菌落发出荧光， 表明含有胞外多糖1 。 1 ，7 硫酸化多糖的检测方法 基于硫酸化多糖的显著且特殊的生物活性啪“”，试验用细胞染色法呻1 对已筛 选出的产胞外多糖菌进行再次筛选。 1 8 多糖含量的检测方法 由斜面接种到液体发酵培养基，2 8 c ，1 5 0 r m i n 摇床发酵培养7 d 。发酵结 束后，于8 0 0 0r m i n 离心2 0m i n ，去菌体蒸馏水洗涤沉淀。取适量上清液，中 空纤维超滤系统超滤去除小分子，超滤内液加三倍体积9 5 乙醇溶液，置4 c 下 过夜沉淀，再于3 0 0 0r r a i n 离心2 0m i n ，去上清液，沉淀以蒸馏水按原体积溶 解，稀释适当倍数后，用苯酚硫酸法测定多糖的产量。 ( 1 ) 苯酚一硫酸法嘲： 表2 - i 苯酚一硫酸法测多糖步骤 序号 l23 456 标准葡萄糖( u 1 )o 2 04 06 08 01 0 0 补水到2 m l 5 的苯酚1 - o l i l l 摇匀 浓硫酸5 m l 静置显色1 5 分钟 4 9 0 n m 测吸光值 o0 1 6 5 30 3 2 7 40 4 7 3 60 6 3 2 6 0 7 8 0 8 ( 2 ) 苯酚一硫酸法测糖的标准曲线 曼 量 8 图2 - 1 苯酚硫酸法测得的葡萄糖的标准吸收曲线 f i g u r e2 - 1s t a n d a r dc u r v eo f g l u c o s eb yp h e n o l - v i t r i o lm e t h o d 1 4 产多冉洋翻l r 的辩翻河生e 动力掌研究 该标准曲线的回归方程为：y = 7 7 8 8 7 x + 0 0 0 7 2 ，相关系数r 2 = o 9 9 9 6 ， 把所测定得的试样的吸光度代入回归方程计算相当的葡萄糖浓度，记为c ( m g m 1 ) ，则： 多糖含量x = f xc v d f ：换算因子“( 多糖量= 葡萄糖0 9 ) ；d ：测试液的稀释倍数；v ：测 试液的总体积。 1 9 紫外诱变实验方法 用人工海水从保存斜面将菌体洗下，倒入无菌三角瓶，加入几颗无菌玻璃珠 振荡1 0 分钟。取直径5 c m 的小培养皿，每个加入约5 m l 菌体悬液，标记为诱变组和 非诱变组。 无菌操作，在预热1 5 分钟的紫外灯下打开诱变组的培养皿盖，分别照射菌体 悬液3 0 秒，6 0 秒，9 0 秒，1 2 0 秒，1 5 0 秒，1 8 0 秒后盖上培养皿。在红光下，取诱 变后的菌液进行适当稀释，取三个相邻稀释度涂板，每个作三个平行，涂布不含 杀真菌素的z o b e l l 培养基平板，2 8 x 2 暗培养7d ，观察菌落生长情况，计数。 非诱变组样品不经紫外线照射，其他处理方法同诱变组。 1 1 0 菌种保藏方法 斜面临时保藏 在斜面培养基上划线接种，2 8 c 培养至菌落明显，然后放于4 c 保存，每个 月传代培养一次。 石蜡封存保藏 将无菌的石蜡液倒入培养了2 天的菌种斜面试管里，没过培养基的上沿，放 于一2 0 冰箱保藏，备用。 1 1 1 菌种快速鉴定 采用测定1 6 s r d n a 的办法，委托上海基康公司进行序列测定。 2 结果与讨论 2 1 菌株分离纯化结果 2 1 1 环境样品的富集培养 将环境样品放入无菌三角瓶，按照1 0 ：1 的比例加入无菌的不含杀真菌素和 琼脂的分离培养基，2 8 c ，1 5 0r m i n 培养4 8h 。 2 2 2 初筛 产孽l 捌| 膺洋翻- r 的翻l 翻由童捌i 动力掌研究 将富集培养物进行适当稀释，取稀释悬液涂布分离培养基平板，置于2 8 培养至菌落明显，最多培养至7 d 。挑取单菌落，在新的分离培养基上划线，培 养后再次选择单菌落，连续转移划线3 次，得到形态均一的纯培养，共得到4 2 株形态各异的菌株。 将纯化得到的各菌株分别接种到斜面培养基，临时保藏。 2 2 产多糖菌株的筛选结果 由荧光法得到8 株产胞外多糖的菌株。命名为f 1 ，f 2 ，f 3 ，f 4 ，f 5 ，f 6 ，f 7 ， f 8 。 2 3 硫酸化多糖的筛选结果 由于硫酸化多糖的筛选方法为细胞染色法，因此不能直接用固体鉴别培养基 进行筛选，只有在筛选确定多糖生产菌株后才能进行。实验用细胞染色法对上述 多糖产生菌进行筛选，得到f 3 所产多糖为硫酸化多糖。 2 4 紫外诱变结果 经对照诱变组与非诱变组菌落生长情况，计数菌落数，对不同的诱变剂量分 别计算菌体致死率，得到诱变剂量一致死率关系曲线如下。 表2 2 诱变剂量一致死率关系表： l 诱变剂量( 秒)o3 06 09 0 1 2 01 5 01 8 0 l 致死率( ) o2 5 4 66 78 29 5 1 0 0 美 = 昌 c 墨 图2 2 菌体f 3 紫外诱变剂量效应曲线 f i b r e2 - 2t h ee f f e c tc u r v eo fu l t r a v i l o to i lf 3 紫外线诱变方法操作简便，效果明显，是最常用的物理诱变方法。紫外线可 引起d n a 形成共价结合的嘧啶二聚体，改变基因的正常阅读顺序，从而影响基 1 6 产多糟爿f 洋自苗的弹鼍与量捌 动力掌研完 因的复制，转录，翻译一系列过程，使基因表达异常甚至引起细胞死亡紫外诱 变具有积累效应。随着照射时间的延长，致死率和突变率随之提高。从上一效应 曲线可以看出，在诱变时间达到1 5 0 秒时，紫外线对菌体的致死率可以达到9 5 。 由于菌株f 3 是原始菌，试验中应选取致死率较大的剂量，故确定1 5 0 秒为诱变 剂量，对f 3 菌株进行诱变。 经过紫外诱变和传代培养后，筛选得到6 株与出发菌f 4 菌落形态类似、生 长速度较快、表型稳定的菌株。进行发酵培养和测定多糖的产量，得到3 株多糖 产率高于出发菌f 3 的菌株，结果如下表。选取产量最高的m 4 作为下一步研究的 对象。 表2 3 紫外诱变前后菌株多糖产量 诱