（发酵工程专业论文）中温α淀粉酶编码基因剂量对其生产水平提升的重要作用.pdf

摘要 摘要 中温i f , 淀粉酶是重要的工业酶制剂之一，广泛用于淀粉糖生产、味精生产、 啤酒和酒精生产中辅料的加工、织物退浆、以及其它酿造、有机酸和医药行业。 目前，国内主要的工业生产菌株为b f 7 6 5 8 和b a c i l l u ss p m 1 3 。近2 0 年来，我 国学者一直未对中温0 【淀粉酶生产菌株进行有效的遗传改良，使得其发酵生成水 平落后于世界先进水平。因此，通过现代育种技术对中温i f , 淀粉酶工业生产菌株 进行遗传改良，将有助于提升我国中温a 淀粉酶的发酵生产水平，实现其高效低 成本制各。 本课题以中温a 淀粉酶工业生产菌株ba m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 2 1 2 5 为 研究对象，纯化了该菌株产生的中温i f , 淀粉酶并进行了酶学性质研究；克隆了中 温仅淀粉酶全长基因并验证了该基因的功能；对中温0 【淀粉酶基因进行了定点 突变，改变了中温0 【淀粉酶的酶学性质；建立了中温伐淀粉酶工业生产菌株的 遗传转化方法，并通过提高中温0 【淀粉酶基因拷贝数显著增强了仅淀粉酶的分 泌。 1 纯化了丑a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i m2 1 2 5 产生的a 淀粉酶( b a a ) 并首次确 定了纯酶的酶学性质。通过纯化，从发酵液中获得了电泳纯的b a a 。酶回收率 为2 0 1 ，纯化倍数为2 6 9 。对纯化的b a a 的酶学性质进行了测定，该酶的分 子量为5 8k d a ，最适反应温度为5 5 ，最适反应p h 为6 0 9 0 。p h 稳定范围为 7 0 1 0 0 。添加1 0m m o l lc a 2 + ，可以使酶在5 5 下保温1h ，还残留8 5 左右 的活力。无c a 2 + 情况下，该酶在5 5 下保温1 5m i n ，丧失活力。c a 2 + ，m n 2 + ， c 0 2 + 可以显著增强酶的活力。薄层层析分析表明：酶的淀粉水解产物主要为糊精 和一些寡糖。 2 克隆了b a a 全长编码基因a m y q 。该基因由启动子区( 2 2 0b p ) ，结构基 因( 1 5 4 4b p ) 及终止序列( 3 2 0b p ) 构成。在启动子区有3 个碱基序列发生了突 变，分别位于4 9 位的碱基发生改变( c t ) ，7 9 和8 0 位的碱基由( t a a t ) ， 结构基因与已报到的b a a 编码基因( g e n b a n k 登录号：j 0 1 5 4 2 ) 一致。 3 克隆的a m y q 基因在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中获得活性表达。将无信 号肽的b a a 结构基因( a m y q i ) 克隆入表达载体p e t - 2 8 a ，构建了重组载体 p e t - 2 8 a - a m y q 7 ，通过i p t g 诱导，在大肠杆菌中表达，重组菌的i f , 淀粉酶活力 为2 8u m l 培养液。重组酶的相对分子量为5 8k d a 。将携带有全长基因a m y q 的重组载体p l y - a m y q ，转化丑s u b t i l i s1 a 5 1 0 后，实现a m y q 的分泌表达，所表 达的重组b a a 经纯化后，分析其酶学性质，发现其与天然b a a 在酶学性质上 没有明显差异。 4 进一步选取了b a a 中c a 2 + 结合位点上的3 个氨基酸残基( 2 3 1 ，2 3 3 ，4 3 8 ) 进行定点突变，对突变体的酶学性质进行比较。与天然b a a 相比，突变体d 2 3 3 n 的比酶活下降了的8 4 8 ；上升了5 5 6 ，k 缸值下降了8 5 ；热稳定性明显 下降，最适反应温度范围也减小了1 0 ；最适反应p h 下降了o 5 个单位，p h 稳定范围下降了3 4 个单位。与对照相比，突变体d 2 3 1 n 和d 4 3 8 g 的比酶活分 别下降了6 3 和3 5 ，g m 和值与对照相比没有显著变化；最适反应温度， 热稳定性及最适反应p h 及p h 稳定性变化不显著。 5 成功构建了重组b a a 工业生产菌株，产酶水平显著提升。建立了b a a 生产菌株优化的电转化方法，转化效率可达4 8 1 0 2 。将p l y - a m y q 转化丑 a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 2 1 2 5 ，获得了携带多拷贝b a a 编码基因的重组菌。重 组菌在无选择压的培养基上传代1 0 0 代，质粒稳定性保持在8 0 左右，可以基本 满足工业生产对菌株的遗传稳定性的要求。重组菌的b a a 分泌能力与出发菌株 相比，在摇瓶水平上提高了5 0 以上，在3 0 吨生产规模提高了3 0 左右，发酵 周期缩短了8 1 2h 左右。 关键词：中温a 淀粉酶，酶学性质，基因克隆，定点突变，遗传转化，发酵 v i a b s t r a c t m e s o p h i l i ca a m y l a s ei s o n eo fi m p o r t a n ti n d u s t r i a le n z y m e s ，w h i c hh a s e x t e n s i v ea p p l i c a t i o n si ns t a r c hp r o c e s s i n g ，b r e w i n g ，d e s i z i n g ，o r g a n i ca c i da n d p h a r m a c e u t i c a l i n d u s t r i e s b f - 7 6 58a n db a c i l l u s s pm13a r et h et w om a i n m e s o p h i l i ca - a m y l a s ei n d u s t r i a lp r o d u c i n gs t r a i n sb yf a ri nc h i n a t h ep r o d u c t i o n a b i l i t yo ft h es t r a i nw a sn o te f f e c t i v e l yi m p r o v e dd u r i n gt h e s et w e n t yy e a r sa n dw a s v e r yl o wc o m p a r e dw i t l lt h em o s ta d v a n c e dt e c h n o l o g yi nt h ew o r l d t h e r e f o r e ，i ti s v e r yi m p o r t a n tt oe n h a n c et h es e c r e t i o na b i l i t yo ft h ei n d u s t r i a lp r o d u c i n gs t r a i nb y g e n e t i ci m p r o v i n gt h es t r a i nt h r o u g hm o d e mb r e e d i n gt e c h n o l o g ya n dl o w e r t h ec o s t o fp r o d u c t i o n t h em e s o p h i l i ca - a m y l a s ew a sp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yf r o mt h e0 【一a m y l a s e i n d u s t r i a lp r o d u c i n gs t r a i nb a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 212 5a n dt h ee n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o n sw e r es t u d i e di nt h i sp r o j e c t t h ef u l ll e n g t hg e n ee n c o d i n gf o r a - a m y l a s ew a sc l o n e da n dt h ef u n c t i o no ft h eg e n ew a sv a l i d a t e d m o r eo v e r , t h e e n z y m ep r o p e r t i e s w e r e c h a n g e db ys i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s a no p t i m i z e d e l e t r o p o r a t i o nt r a n s f o r m a t i o nm e t h o dw a sd e v e l o p e df o rb a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i m b 212 5 t h es e c r e t i o na b i l i t yw a si m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yb yi n c r e a s i n gt h ea - a m y l a s e g e n ec o p i e so ft h ei n d u s t r i a ls t r a i n 1 t h ea a m y l a s ef r o mb a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 212 5 ( b a a ) w a sp u r i f i e d t oh o m o g e n e i t ya n dt h ee n z y m ep r o p e r t i e sw e r er e v e a l e df o rt h ef i r s tt i m e t h e r e c o v e rr a t eo ft h ee n z y m ew a s2 0 1 a n df o l do fp u r i f i c a t i o nw a s2 6 9 t h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h ee n z y m ew a s58k d a t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp hw e r e 5 5 a n d6 0 - 9 0 ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ew a ss t a b l ea tt h ep hr a n g eo f7 0 - 10 0 i t k e p ts t a b l ea t5 5 。cf o r1hi nt h ep r e s e n c eo f10m m o l lc a 2 + a n dr e m a i n e d8 5 r e s i d u ea c t i v i t y t h ee n z y m ea c t i v i t i e sw e r es i g n i f i c a n t l ya c t i v a t e db yc a + ，l v l n e + a n d c 0 2 + t h em a i ne n d o p r o d u c t st os o l u b l es t a r c hw e r eo l i g o s a c c h a r i d e sa n dd e x t r i n a n a l y z e db yt h i n n e rl a y e rc h r o m a t o g r a p h y 2 t h ef u l l - l e n g t hg e n ee n c o d i n gf o rm e s o p h i l i c 仅一a m y l a s e ( a m y q ) w a sc l o n e d f r o mb ，a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 212 5 t h eg e n ec o n s i s t so f2 2 0b po fp r o m o t e r r e g i o n ，15 4 4b po fs t r u c t u r a lg e n ef r a g m e n ta n d3 2 0b po ft e r m i n a ls e q u e n c e t h r e e b a s e sw e r ea l t e r e di nt h ep r o m o t e rr e g i o na tt h es i t eo f 一4 9 ( c _ da n d - 7 9 ，- 8 0 ( 1 a a t ) ，h o w e v e r , t h es t r u c t u r a lg e n es e q u e n c eo fa m y qw a st h es a m ea st h e a m y l a s eg e n e ( g e n b a n ka c c e s s i o nn o j 0 15 4 2 ) i x 3 t h ec l o n e da - a m y l a s eg e n ew a se x p r e s s e di ne c o l ia n db s u b t i l i s t h e a a m y l a s eg e n ef r a g m e n td e v o i do fs i g n a lp e p t i d es e q u e n c e ( a m y q ) w a sc l o n e di n t o t h ep l a s m i dp e t - 2 8 a t h ed e g e n e r a t e dp l a s m i dp e t 2 8 a - a m y q w a si n t r o d u c e di n t oe c o l it oe x p r e s sa - a m y l a s ea n di n d u c e dw i t hi p t c tt h ee n z y m ea c t i v i t yw a s2 8u m l i nt h es u p e m a t a n to fc u l t u r em e d i u m t h ef u l l l e n g t hg e n e ( a m y q ) w a sc l o n e di n t o p l a s m i dp l y l2 1a n dt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp l y - a m y qw a st r a n s f o r m e di n t ob s u b t i l 西1a 510 t h ea - a m y l a s eg e n ew a se x p r e s s e da n dt h er e c o m b i n a n te n z y m ew a s p u r i f i e db yt w o - p h a s es y s t e m t h ec h a r a c t e r i z a t i o n so ft h er e c o m b i n a n te n z y m ew e r e a l m o s ts a m ec o m p a r e dw i t ht h en a t i v ee n z y m e 4 r o l eo f t h ec a l c i u m b i n d i n gr e s i d u e sa s p 2 3 1 ，a s p 2 3 3a n da s p 4 3 8o f b a c i l l u s a m y l o l i q u e f a c i e n sc t - a m y l a s e ( b a a ) o nt h ee n z y m ep r o p e r t i e sw a si n v e s t i g a t e db y s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s t h ec a l c i u m - b i n d i n gr e s i d u e sa s p 2 3 1 ，a s p 2 3 3a n da s p 4 3 8 w e r er e p l a c e dw i t ha s 玛a s na n dg l yt op r o d u c em u a n t sd 2 31 n ，d 2 3 3 na n dd 4 3 8 g , r e s p e c t i v e l y t h es p e c i f i ca c t i v i t yf o rd 2 3 3 nw a sd e c r e a s e db y8 4 8 ，w h i l ed 2 31 n ， d 4 3 8 gs h o w e dad e c r e a s eo f6 3 ，3 5 t ot h a to ft h ew i l d - t y p ee n z y m e r e s p e c t i v e l y n os i g n i f i c a n tc h a n g e si nt h e v a l u e ，t h e r m o - s t a b i l i t y , o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n d o p t i m u mp hw e r eo b s e r v e di nt h em u t a t i o n so fd 2 31 na n dd 4 38 g , w h i l es u b s t i t u t i o n o fa s p 2 3 3 、析ma s nr e s u l t e di nad r a m a t i cr e d u c t i o ni nt h ev a l u eo fc a t a l y t i c e f f i c i e n c y ( k 新) a n dt h e r m o - s t a b i l i t ya t6 0 0 c t h er a n g e so fo p t i m u mt e m p e r a t u r e a n do p t i m u mp hf o rd 2 33 nw e r ea l s or e d u c e da b o u t10 0 ca n d3 - - 4u n i t sr e s p e c t i v e l y 5 t h ee n z y m es e c r e t i o na b i l i t yw a ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e db yt h er e c o m b i n a n t s t r a i n b a m y l o l i q u e f a c i e n s c i c i mb 212 5 a n o p t i m i z e de l e c t r o p o r a t i o n t r a n s f o r m a t i o nm e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rb a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 212 5 t h e t r a n s f o r m a t i o ne f f i c i e n c yw a ss a t i s f i e df o rg e n e t i cm a n i p u l a t i n gt h es t r a i n t h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dp l y - a m y qw a st r a n s f o r m e di n t o 丑a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i m b 212 5 a b o u t8 0 o ft h er e c o m b i n a n t p l a s m i dp l y - a m y qw a sk e p ti n 丑 a m y l o l i q u e f a c i e n sc i c i mb 2 12 5d u r i n g10 0 g e n e r a t i o ng r o w t hi n t h em e d i u m w i t h o u ta n t i b i o t i c i tc o u l dm e e tt h er e q u i r e m e n to fg e n e t i cs t a b i l i t yo fr e c o m b i n a n t s t r a i nd u r i n gi n d u s t r i a lp r o d u c t i o n t h es e c r e t i o na b i l i t yo ft h er e c o m b i n a n ts t r a i nw a s i n c r e a s e db y5 0 a n d3 0 i nf l a s ka n d3 0t o nf e r m e n t o rr e s p e c t i v e l y , c o m p a r e d 、析t h t h ep a r e n t a ls t r a i n t h ep r o c e s so ft h eq a m y l a s ep r o d u c t i o nw a sr e d u c e da b o u t8 12 h k e y w o r d s ：m e s o p h i l i cs - a m y l a s e ，e n z y m ec h a r a c t e r i z a t i o n s ，g e n ec l o n i n g ， s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s ，t r a n s f o r e a t i o n , f e r m e n t a t i o n x 缩略词表 d n a p c r l b n c b i c m k m e r y t e t i p t g x g a l o d 6 0 0 k b k d a o i 疆 缩略词表 d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n l u r i a - b e r t a n im e d i u m 聚合酶链式反应 l u r i a - b e r t a n i 培养基 n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n 国家生物信息中心 c h l o r a m p h e n i c o l k a n a m y c i n e r y t h r o m y c i n 氯霉素 卡那霉素 红霉素 四环素 i s o p r o x y l - 1 3 一d t h i o g a l a c t o p y a n o s i d e 异丙基一1 3 - d - 硫代半乳糖苷 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 1 3 d g a l a c t o s i d e 5 - 溴4 氯3 吲哚1 3 d 半乳糖苷 o p t i c a ld e n s i t ya t6 0 0n i n k i l ob a s e k i l od a l t o n o p e nr e a d i n gf r a m e v i 6 0 0n l n 波长下的光密度 千碱基对 千道尔顿 开放阅读框 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：沙。7 引狷川 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：2 d a 第一章绪论 1 1 淀粉酶概述 1 1 1 淀粉酶 第一章绪论 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中， 是最重要的一类酶，也是最早实现工业生产、产量最大、用途最广的酶制剂品种 之一。淀粉酶作为工业酶制剂的重要组成部分，约占酶制剂市场3 0 左右的份 额【z j 。它被广泛应用于多种工业中，如食品、发酵、纺织、造纸业、制药业和化 学药品工业等，还被扩展到其他领域，如临床医学和分析化学等【3 】。 ( 1 ) 淀粉酶及其分类 淀粉酶的分类方式有很多种。根据淀粉酶作用淀粉长链时，作用方式不同， 可以简单分为外切淀粉水解酶和内切淀粉水解；根据淀粉酶水解淀粉时作用糖苷 键的方式不同，将淀粉酶分为水解0 【1 ，4 d 糖苷键和水解a 1 ，6 d 糖苷键或同 时能够水解这两个键的三类淀粉酶。目前淀粉酶的分类主要是根据其作用糖苷键 的方式及生成产物不同，将淀粉酶分为：a 淀粉酶、b 淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、 脱支酶、环糊精转移酶等【3 1 ( 图1 1 ) 。 a 一淀粉酶( e c3 2 1 1 ) 以随机作用方式水解淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子 内的0 【1 ，4 葡萄糖苷键，主要产生糊精和少量麦芽糖和葡萄糖等。 b 一淀粉酶( e c3 2 1 2 ) 以还原糖末端，两个糖单位方式切断淀粉、糖原、寡 聚或多聚糖分子内的q 1 ，4 葡萄糖苷键，主要产生麦芽糖和b 极限糊精等。 糖化酶( e c3 2 1 3 ) 以1 个糖单位方式切断淀粉、糖原、寡聚或以缓慢方式 水解的a 1 ，6 葡萄糖苷键，主要产生葡萄糖。 脱枝酶主要特异性切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的0 【1 ，6 葡萄糖苷 键，主要产生线性寡糖。主要包括异淀粉酶( e c3 2 1 6 8 ) 和普鲁兰酶( e c 3 2 1 4 1 ) 两种类型。 环糊精转移酶( e c2 4 1 1 9 ) 主要将切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子供 体内部的a 1 ，4 葡萄糖苷键并将其转移到受体糖链上重新形成0 【1 ，4 葡萄糖苷键。 环糊精转移酶具有很低的水解活性，使6 - 8 个寡糖分子环化，并形成具有高度分 枝和分子量的糊精，环状极限糊精。 ( 2 ) a 淀粉酶 仅淀粉酶是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一，目前已广泛应用于变性 淀粉、淀粉糖、焙烤、啤酒酿造、酒精、发酵以及纺织等许多行业中【4 】，其具体 江南大学博士学位论文 用途见表1 1 。工业中主要应用的是真菌和细菌来源的0 【淀粉酶。不同来源的a 淀粉酶的性质有一定差别。 岫却肭一岫 o o g 0 叫 图1 1 根据淀粉酶的作用淀粉的方式分类【3 l f i g 1 - 1c l a s s i f i c a t i o no f a m y l a s ea c c o r d i n gi n t ot h em o d eo f a c t i o n 3 】 表1 1f t - 淀粉酶的工业用途 t a b l e1 - 1t h ei n d u s t r i a la p p l i c a t i o no f - a m y l a s e 用途说明 淀粉加工工业 制造麦芽糖浆 制造饴糖 制造葡萄糖 酿造发酵工业 纺织品工业 面包工业 医药工业 饲料工业 其他 制造各种粉末糊精 制造各种浆糊、粘着剂 啤酒原料液化 酒精原料糖化、液化 酱油醋原料处理 其它以淀粉为原料的发酵工业中淀粉的液化 各种纺织物退浆 改善质量风味，缩短时间，节约用糖 消化药、诊断试剂 与其他酶一起添加促进消化 香料加工、造纸、石油压裂、果汁制造 2 第一章绪论 根据a 碇粉酶的热稳定性和最适反应温度，n - 淀粉酶被分成高温型廿淀粉 酶、中温耐热型* 淀粉酶、非耐熟性旺淀粉酶和低温淀耪酶。高温小淀粉酶 作用的最适温度为9 0 9 5 。c ，对9 5 1 0 7 c 耐热性好，中温耐热型小淀粉酶作用的 最适温度为5 0 7 0 ，9 0 ( 2 以上处理一般会失活，非耐热性一淀粉酶作用最适温 度为5 0 左右，低温廿淀粉酶则一般在1 0 - 2 0 还能表现出活性。 ( 3 ) 口一淀粉酶结构、催化机制 对细菌a 一淀粉酶x 光衍射研究表明，细菌来源的肝淀粉酶都具有相对保守 的结构特征，含有3 个结构域a 、b 、c 。结构域a 由( 一d ) 8 t i m 桶状结构、n 端 和活性位点组成，具有酶催化反应活性中心区域【5 ”( 图1 2 绿色) 。结构域b 由不规则p 片层结构组成，结构上具有高度变异性，主要是底物结合区域，决定 不同底物结合的特异性( 图1 2 紫红色) 。结构域c 在结构域a 的外面，含有c 端( 图1 - 2 蓝绿色) 。大部分已知的q 一淀粉酶在结构域a 和b 之间都含有保守的 c a h ，对于酶的稳定性和活性起重要作用。 一图l 2 淀粉酶的三堆结构模型f 5 1 h gi - 2t h em o d e t o f c t a m y l a s e d o m a i n a i ss h o w n i ng r i n ；d o m a i n b i ss h o w n i n m a g e n t a ；d o m a i n c i ss h o w n i ne y a n a - 淀粉酶水解淀粉的机制研究表明m 】，廿淀粉酶在切割一1 ，4 一d 糖苷键时， 使糖链末端的c 原子的构型发生a 构型变化。水解过程主要分为3 步：第一步 由质子供体g l u 2 6 1 使得糖苷键上的0 2 原子质子化，井由催化氨基酸残基a s p 2 3 1 向糖环上的c 1 发起攻击并使底物还原糖末端断裂。第二步由檄活的水分子水解 位于糖链c 1 和d 2 3 1 之间的共价键。第三步起始质子化状态的再生( 囤1 3 ) 。 在活性位点上的氨基酸残基a s 2 8 没有直接参与催化反应，目前对于它在催化 反应中所起的作用还不是很清楚。通过对活性中心的氨基酸残基进行定点突变对 于研究催化机制有重要意义。位于活性中心的氨基酸的单个氨基定点突变对于酶 的活性具有重要影响，有可能使酶完全失活。 江南大学博士学位论文 g l u 2 61 i i a s p2 3 1 图1 - 3 糖苷水解酶的催化机制7 j f i g 1 - 3c a t a l y t i cm e c h a n i s mo fr e t a i n i n gg l y c o s y lh y d r o l a s e s 7 】 ( i ) p r o t o n a t i o no ft h eg l y c o s i d i co x y g e na n da t t a c ko nt h eg l u c o s ec 1b yd 2 3 1 d e p a r t u r eo ft h e r e d u c i n ge n do f t h es u b s t r a t e ( i i ) a c t i v a t i o no faw a t e rm o l e c u l e ，c l e a v a g eo fcl - d 2 31c o v a l e n t b o n d ( 1 1 1 ) r e g e n e r a t i o no ft h ei n i t i a ld r o t o n a t i o ns t a t e s 1 1 2 中温泓淀粉酶的来源及性质 中温0 【淀粉酶的最适作用温度在5 0 7 0 左右，通常在6 0 。c 以下较为稳定， 9 0 以上时失活很快；晟适作用p h6 0 ，在p h6 0 7 0 较为稳定，p h5 0 以下失 活很严重。其来源比较广泛，一些丝状真菌可以产生中温a 一淀粉酶，如黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、米曲菌属( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 。个别酵母和一些放线菌也可 以产生中温q 淀粉酶，但大部分中温0 【淀粉酶来源于细菌中的芽孢杆菌属，如 枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、解淀粉芽孢杆菌( b a c i l l u sa m y l o l i q u e f a c i e n s ) 、 短小芽孢杆菌( b a c i l l u sb r e v i s ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌 f g e o b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 等【9 】。目前，大部分细菌及真菌来源的a 淀粉酶已被纯化， 不同来源的中温仅一淀粉酶的酶学性质如表1 2 。 有许多方法可以对淀粉酶进行纯化，目前已报道的淀粉酶纯化的方法主要 有： 凝胶色谱法。根据淀粉酶的分子量大小、溶解度、所带电荷差异，运用盐析、 离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水作用层析等方法从菌体细胞或发酵液中分离 纯化淀粉酶。目前大部分不同来源的淀粉酶都是通过该方法进行纯化的。g u p t a 等综述了2 4 种不同来源的淀粉酶的纯化的方法，均是通过凝胶色谱进行分离纯 化【3 1 。 4 第一章绪论 表1 2 不同来源的中温t l - 淀粉酶的酶学性质 t a b l e1 2t h ee n z y m ep r o p e r t i e so fm e s o p h i l i ca - a m y l a s ef r o md i f f e r e n tr e s o u r c e s 亲和吸附法。根据淀粉酶对一些特定的吸附基质具有吸附的特性，再选择合 适的洗脱液进行洗脱，将淀粉酶进行快速纯化。运用亲和吸附方法纯化淀粉酶需 要找到合适的吸附材料和洗脱方法。s 硼a r 报道了褐藻酸钙盐( c a l c i u m a l g i n a t e ) 可以作为淀粉酶的吸附材料1 1 9 1 。s a f a r i k o v a 等报道了球状磁性的褐藻酸盐颗粒可 以用做淀粉酶的吸附材料，亲和吸附淀粉酶的回收率可达到8 8 1 2 0 】。t e o t i a 等报 道了运用褐藻酸盐从黑曲酶和解淀粉芽孢杆菌的发酵液中吸附淀粉酶，再用1 0 m o l l 的麦芽糖溶液进行洗脱纯化淀粉酶的方法i 2 1 1 。r a o 报道了运用淀粉作为吸 附材料，用2 糊精进行洗脱，快速纯化地衣芽孢杆菌淀粉酶的方法【2 2 】。 双水相萃取法。双水相萃取是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水 中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相。利用溶质在两相间的分配系数的差 异进行萃取的方法。蛋白浓度、双水相体系组成、温度、p h 等因素影响双水相 萃取效果。z l l i 等报道了利用p e g 4 0 0 0 磷酸盐n a c l 双水相系统和高速逆流色谱 ( c o u n t e r - c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ) 对枯草芽孢杆菌重组菌发酵液中的淀粉酶，进行 了快速纯化，并研究了p e g 分子量、p h 、n a c i 浓度对淀粉酶纯化的影响【2 弼5 1 。 1 1 3 中温伍淀粉酶在工业中的应用 中温a 淀粉酶主要用于淀粉糖生产、味精生产、啤酒和酒精生产中辅料的加 工、织物退浆、以及其它酿造、有机酸和医药行业【4 ，2 6 1 。目前的工业生产菌株主 要为b f 7 6 5 8 和b a c i l l u ss p m 13 。 ( 1 ) 在淀粉工业中的应用 在淀粉深加工工业中，特别是在淀粉糖制造工业及以淀粉为原料的发酵工业 中，酶制剂的应用已十分普遍。淀粉水解成葡萄糖的过程包括液化和糖化。液化 江南大学博士学位论文 过程中，淀粉颗粒首先在受热过程中吸水膨胀，体积迅速增加晶体结构破裂， 颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体，这一过程被称为液化1 2 7 j 。在淀粉液化 工程中，通常会使用高温a 淀粉酶或中温a 淀粉酶进行液化。采用中温肚淀粉 酶液化时，液化液的d e 值上升速度比采用耐高温a 淀粉酶时快，因此，采用耐 高温a 淀粉酶液化时需要有更多的液化时间保证液化过程的完成。在实际生产 中，使用中温淀粉酶液化时，液化时间一般为4 0 6 0m i n 。 中温a 淀粉酶还可以用于变性淀粉生产。淀粉在高温条件下易发生糊化，因 此生产多孔淀粉多采用中温a 淀粉酶。由于0 【淀粉酶在适宜条件下对淀粉具有 较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而将淀粉水解成 多孔状的多孔淀粉。多孔淀粉可以作为微胶囊芯材和吸附剂，作为香精香料、风 味物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸附载体，成本低，可自然降解【2 6 1 。 ( 2 ) 在纺织工业中的应用 在纺织退浆中由于棉织物在编织过程中需使用较大的张力，容易使丝线断 裂，因此需加入一些浆料对其保护。由于淀粉资源广泛，廉价易得，易退浆，因 此纺织工业中多采用淀粉浆。织物退浆主要使用中温q 淀粉酶，它会使淀粉大分 子发生分解，生成可溶性的水解产物，减弱了对纤维的粘附力，因此可以通过水 洗将其除去，最后从纤维上脱除。早期是用麦芽产生的一种内生酶来进行退浆， 现在则主要使用真菌或细菌n 淀粉酶进行退浆。细菌a 淀粉酶尤其适用，因为 它们能够耐高温，在碱性的环境里有一定的稳定性，具有一个中性的最适p h 值， 在p h5 0 7 5 酶的催化效率高，有利于提高生产效率。如，使用碱分解淀粉退浆 需要1 0h 1 2h ，而用中温a 淀粉酶只要2 0 3 0m i n 即可完成退浆过程【2 6 j 。细菌0 【 淀粉酶退浆的另一原因是比其它退浆剂( 如酸或氧化剂) 更环保。在退浆浴中添 加钙盐，还可提高细菌0 【淀粉酶的稳定性和水解效率，从而可用较高的温度或较 低的酶剂量来达到退浆的目的。 ( 3 ) 在造纸工业中的应用 当代造纸工业中，需要使用中温a 淀粉酶生产的变性淀粉。变性淀粉的使用 在提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等方面发挥着极 为重要的作用。由于淀粉与造纸用植物纤维素结构相近，相互间有良好的亲和作 用，资源广泛，廉价易得，尤其是经变性处理的淀粉，能赋予纸张优异的性能， 各类变性淀粉在造纸中广泛用于湿部添加、层间喷雾、表面施胶和涂布粘合工程 中。此外，中温a 淀粉酶还应用于纸的表面施胶。由于造纸施胶过程中要保持淀 粉乳的粘度，压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度，而且天然淀粉的 粘度较高需经中温0 【淀粉酶处理方可使用【z 6 j 。中温0 【淀粉酶还应用于纸张脱墨。 在静电复印纸进行脱墨过程中，利用纤维素酶和中温0 【淀粉酶混合，最大的脱墨 效率可达到9 6 。 6 第一章绪论 在其他方面的应用。中温淀粉酶还在啤酒生产、味精、酒精原料处理、柠 檬酸等方面都有广泛应用。啤酒生产中使用大米、玉米为辅料时，先要磨粉通过 4 0 目以上的筛孔，在糊化锅中调浆后加中温i x 淀粉酶，加酶量在6 个单位克原 料左右，在8 5 9 0 液化3 0 分钟左右。味精中的应用，使用淀粉质原料时，需要 加入中温i x 淀粉酶进行原料液化。酒精和柠檬酸工业中，需要使用大量的淀粉质 原料，原料的预处理需要使用中温a 淀粉醪2 7 j 。 1 2 中温a 淀粉酶的分子生物学 1 2 1 中温o i t 淀粉酶基因 产生中温i x 淀粉酶的菌株来源广泛，大部分来源于细菌和真菌的仅淀粉酶 基因已被克隆。目前工业上使用的中温i x 淀粉酶生产菌株，经菌种鉴定为丑 a m y l o l i q u e f a c i e n s 。p a l v a 等首次通过鸟枪法在枯草芽孢杆菌中克隆了来源于丑 a m y l o l i q u e f a c i e n s 的i x 淀粉酶基因。通过在克隆的2 3k bi x 淀粉酶基因片段并插 入l d n a 的方法初步研究了该基因的结构，并确定了结构基因信号肽序歹l j 2 8 , 2 9 。 喇n e n 等测定了克隆的2 3k b 淀粉酶基因的核苷酸序列