（植物学专业论文）vdtoxins与拟南芥互作过程中no信号和微管骨架动态的研究.pdf

摘要 本实验以大丽轮枝苗毒素( v e r t i c i l l i u md a h l i a et o x i n s ，v d t o x i n s ) 和模式植物拟南芥为材料， 研究v d t o x i n s 与拟南芥互作过程中，一氧化氮( n o ) 信号和微管骨架的动态变化及两者的相互关 系，为了解v d t o x i n s 的信号转导途径及寄主植物与大丽轮枝菌的互作机理奠定基础。 n o 作为一种信号分子参与植物与病原菌的互作已经被普遍承认。但是有关n o 的来源，尤其 是植物与病原菌互作中的n o 来源仍然存在争议。我们利用c o n f o c o l ，采崩d a f 2 d a 荧光探针标记 n o ，对v d t o x i n s 诱导拟南芥野生型、a t n o s l 和n i a l ，n i a 2 突变体中n o 的变化过程进行研究。结 果发现：a m o s l 突变体和野生型在v d - t o x i n s 的作州f 有n o 的快速爆发，且两者爆发的动力学特 征曲线相似；而n i a l ，n i a 2 突变体中只检测到弱的n o 荧光。外加n o 合成抑制剂处理的结果表明， 硝酸还原酶( n r ) 的抑制剂完全阻断v d t o x i n s 诱导的n o 爆发，而一氧化氮合酶( n o s ) 抑制 剂只能部分的减弱v d t o x i n s 诱导的d a f 2 d a 荧光。进一步利_ l f = i 磺胺染色法分析v d t o x i n s 对n r 活 性的影响，结果发现：v d t o x i n s 诱导一f n o s l 突变体中n r 活性升高9 3 倍；v d t o x i n s 诱导野生型 拟南芥巾n r 活性升高5 5 倍；而n i a l ，n i a 2 突变体中n r 活性在v d t o x i n s 处理前后没有明显变化。 以上结果表明，v d t o x i n s 处理能够强烈诱导拟南芥产生n o ，并且n o 的产生主要来源 - n r 途径， n o s 途径是n o 产生的次要途径。 植物细胞对外界生物或非生物的胁迫做j | j 反府时，微管骨架动态转变，这对植物本身具有重 要的意义。我们利用c o n f o c o l 观察g f p 标记, t u b u l i n 的拟南芥野生型取l a t n o s l 突变体，住v d t o x i n s 处理前后微管骨架的动态变化。结果发现：v d - t o x i n s 处理引起拟南芥叶片表皮细胞的微管骨架发 生解聚，解聚程度随处理时间的延k 而加剧；且“t n o s l 突变体的微管解聚程度比野生型的更剧烈。 药理学分析发现：3 b h y o 的吞噬剂( c p t l 0 ) 和n r 的抑制剂( t u n g s t a t e ) 处理可以减弱v d t o x i n s 对微管骨架的破坏作f l j ；但微管的解聚剂( o r y z a l i n ) 羊i l 稳定剂( t a x 0 1 ) 不影响v d t o x i n s 诱导的 n o 爆发。这些结果表明，v d - t o x i n s 处理能诱导微管骨架发生动态改变，且微管的动态改变受n o 信号的调控。 p r 1 基陶( 编码病程相关蛋白) 的表达是植物防下反应的标忐性特征。为了分析拟南芥抗 v d - t o x i n s 的反应中n o 信号和微管骨架的动态变化与防卫反应间的作_ l l 关系，我们利用r e a lt i m e p c r 的技术分析了v d t o x i n s 及相关药物作用下p r 1 基因的著异表达。结果发现：v d t o x i n s 诱导 p r 。1 基冈的表达急剧上调，其中a t h o s l 突变体增加1 9 0 倍，野生型增加1 3 3 倍；在v d t o x i n s 处理的 同时，分别加入n o 的吞噬剂以及微管的稳定荆( t a x 0 1 ) 均降低v d t o x i n s 诱导的p r 1 基冈的转录 水平。 综上所述，我们认为，在v d - t o x i n s 与拟南芥的互作中，v d - t o x i n s 处理能诱导内源n o 的人量 释放、微管骨架的动态变化和p r 1 基因表达增强，且三者之间存在密切关系。可能的作用机制是： v d t o x i n s 诱导的内源n o 的释放是早期的信号分子，微管骨架作为信号的中间体能够感受n o 信 号，并通过其解聚和聚合的动态变化传递信号，激活下游的p r 一1 基因的表达，进而启动植物的防 卫反应。 关键词：拟南芥，大丽轮枝菌毒素，一氧化氮，微管骨架 a b s t r a c t n i t r i co x i d e ( n o ) l e v e la n dm i c r o t u b u l ec y t o s k e l e t o n s ( m t s ) d y n a m i c sw e r e i n v e s t i g a t et o u n d e r s t a n dt h ev d - t o x i n ss i g n a lt r a n s d u c t i o na n d p o t e n t i a lm e c h a n i s m so fi n t e r a c t i o nb e t w e e n a r a b i d o p s i st h a l i a n aa n dv e r l i c i l l i u md a h l i a et o x i n s ( v d - t o x i n s ) n of u n c t i o n sa sas i g n a lt oi n v o l v ep l a n t - p a t h o g e ni n t e r a c t i o n h o w e v e r , t h es o u r c eo fn oi ss t i l l u n k n o w n b yu s i n gd a f - 2 d a ，ak i n do fs p e c i a lf l u o r e s c e n c ed y e ro fn o ，w ei n v e s t i g a t en ol e v e li n w i l d - t y p e 、a t n o s lm u t a n ta n dn i a l ，n i a 2n r d e f i c i e n tm u t a l l to fa r a b i d o p s i st h a l i a n at r e a t e dw i t h v e r t i c i l l i u md a h l i a et o x i n s ( v d t o x i n s ) t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a ta r a b i d o p s i sr e a c t st ov d - t o x i n sw i t h ar a p i db u r s to fn i t r i co x i d e ( n o ) i nw i l d t y p ea n da t n o s lm u t a n t b u tr a t h e rw e a kf l u o r e s c e n c ew a s d e t e c t e di nn i a l 。n i a 2n r d e f i c i e n tm u t a n ti nr e s p o n s et ov d - t o x i n s t h en ri n h i b i t o rh a das i g n i f i c a n t e f f e c to nv d t o x i n s - i n d u c e dn op r o d u c t i o n ；w h e r e a sn o si n h i b i t o rh a das l i g h te f f e c t n ra c t i v i t yw a s a s s a y e di nt h ep r e s e n c ea n da b c e n c eo fv d t o x i n s t h er e s u l t ss h o w e dn ra c t i v i t yw a s9 3 一f o l dh i g h e r i na t n o s l m u t a n ta n d5 5 - h o l dh i g h e ri nw i l d - t y p et h a nu n t r e a t e dc o n t r o l s ，w h i l el i t t l ec h a n g e sw e r e d e t e c t e di nn i a l ，n i a 2d o u b l em u t a n t t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tv d t o x i n s i n d u c e d - n ow a sm a j o r d e p e n d e n to nn rp a t h w a y m t sd y n a m i c sp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nb i o t i cm a da b i o t i cs t r e s sw ed e t e c tt h em t s d y n a m i c s t r e a t e dw i t hv d - t o x i n si n t r a n s g e n e t i c g f p - t u b a l i na r a b i d o p s i sw i t h c o n f o c 0 1a n df o u n dt h a t v d t o x i n si n d u c et h ea l t e r a t i o n so fm t s t h er e l a t i o n s h i pw a sf u r t h e ri n v e s t i g a t e db e t w e e nn o p r o d u c t i o na n dm t sd i s r u p t i o ni n d u c e db yv d t o x i n s t h er e s u l t si n d i c a t e db o t hn os c a v e n g e r ( c p t i o 、 a n dn ri n h i b i t o r ( t u n g s t a t e ) c a ni n h i b i tt h e d y n a m i c so ft h em i c r o t u b u l e s h o w e v e r , m i c r o t u b u l e i n h i b i t o r ( o r y z a l i na n dt a x 0 1 ) h a dl i t t l ee f f e c to nn ol e v e lw i t ho rw i t h o u tv d t o x i n s t h er e s u l t s i n d i c a t et h a tm i c r o t u b u l ed e p o l y m e r i z a t i o nw a si n d u c e da n dm e d i a t e db yn ob u r s ti n r e s p o n s et o v d t o x i n s t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f p a t h o g e n e s i s r e l a t e dg e n e ( p r 一1 ) ，ak i n do f c h a r a c t e rg e n eo f p l a n td e f e n s e r e s p o n s e ，w a sa s s a y e db yr e a l t i m ep c ri n o r d e rt od e t e c tt h ee f f e c to fn ob u r s ta n dm t s d e p 0 1 y m e r i z a t i o ni np l a n td e f e n s er e s p o n s e i tw a ss h o w e dt h a te x p r e s s i o no f t h ep r - 1w a ss i g n i f i c a n t l y i n d u c e di nw i l d - t y p e ( 1 3 3 - f o l d ) a n da m o s lm u t a n t ( 1 9 0 一f o l d ) b yv d t o x i n s ，a n db o t hn os c a v e n g e r a n dm t si n h i b i t o rc a nb l o c kt h ei n c r e a s e de x p r e s s i o no f t h ep r 1i n d u c e db yv d t o x i n s a b o v ea l l ，v d - t o x i n si n d u c e dn ob u r s t 、m t sd y n a m i c sa n di n c r e a s e dt r a n s c r i p t i o nl e v e lo ft h e p r - i t h e p o t e n t i a l m e c h a n i s m m a y b en ob u r s tw a s e a r l ys i g n a l t om e d i a t em i c r o t u b u l e d e p o l y m e r i z a t i o n a n db o t hn op r o d u c t i o na n dm i c r o t u b u l ed y n a m i c sa p p e a rt ob ep a r t so fi m p o r t a n t s i g n a l i n ga n di n v o l v e dt h ed e f e n s em e c h a n i s m si na r a b i d o p s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，v e r t i c i l l i u m d a h l i a e t o x i n s ，n i t r i co x i d e ，m i c r o t u b u l e c y t o s k e l e t o n s i i 缩写 b s a c a t c 阿o d a f - 2 d a d e p c d m s o h 2 0 2 h r l - n n a m 1 i n o n o s n r p a l p c d p c r p l p c p 1 0 l r o s r j r p c r s 从 s n p s o d y 1 ) i t o x i n s 缩略词表 英文名称 b o v i n c 簧帆h n 丑l b m n i n c a t a l 黜 c a r b o x y - 2 - p h e n y l - 4 ，4 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l i m i d a z o l i n e - i - o x y l - 3 - o x i d e 4 ，5 一d i a m i n o f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i m e t h y ls u l f o x i d e h y d r o g e np e r o x i d e h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n n g - n i t r o - l - a r g i n i n e m i c r o t u b u l ec y t o s k e l e t o n s n i t r i co x i d e n i t r i co x i d es y n t h a s e n i t r a t er e d u c t a s e p h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s e p r o g r a n m l e dc e l ld e a t h p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p r o t e i nl i p o p o l y s a c c h a d d ec o m p l e x p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dlg e n e r e a c t i v eo x i d a t i v es p e c i f i e s r e v e r s eu a n s c r i p t i o na n dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s y s t i m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e s o d i u mn i t r o p m s s i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e v e r t i c i l l i u md a h l i a et o 妯a s 1 1 1 中文名称 牛血清蛋白 过氧化氢酶 羧基2 - 苯基- 4 ，4 ，5 ，5 - 四甲基 咪唑1 羟基- 3 氧化物 4 。5 - 二氨基乙基乙酸荧光素 焦碳酸二乙酯 二甲基皿枫 过氧化氢 超敏反应 左旋硝基精氨酸 微管骨架 一氧化氮 一氧化氮合成酶 硝酸还原酶 苯丙氨酸解氨酶 细胞程序化死亡 聚合酶链式反应 蛋白脖多糖复合物 病程相关基因一l 活性氧 逆转录p c r 系统获得性抗性 硝普钠 超氧化物歧化酶 大丽轮枝菌毒素 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 仍编物 时问：卯7 年月i gf 1 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中围农业大学有关保留、使用学位沦文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农h k 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：俑编掏 时间：沙刁年，月g 日 跏繇稻靠 帆一 年m 孑目 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 1 1 棉花黄萎病 1 1 1 棉花黄萎病简介 第一章文献综述 棉花黄萎病，俗称为棉花癌症，是一种世界范围内的土传性真菌病害。首次发现于美国弗吉 尼亚州。1 9 3 5 年因引进美国棉花传入我国，7 0 、8 0 年代在中国发展和蔓延开来。其后多次在我国 各产棉区爆发造成严重损失棉花黄萎病寄主广泛，多达6 0 0 多种植物；危害严重，已成为世界 棉区主要病害( d a a y f e t a l l 9 9 5 ；s u b b a r a o e t a 1 9 9 5 ；b h a t a n ds u b b a r a o , 1 9 9 9 ) 。拟南芥被报道也是 大丽轮枝菌的寄主，在受到病原菌侵染时发生失绿，黄萎等疾病症状( v e r o n e s ee t a l , 2 0 0 3 ) 1 1 2 大丽轮枝菌的致病机理 棉花黄萎病的病原菌属于真菌的半知菌亚门( d e u t e r m y e o t i n a ) ，淡色孢科( m m o n i l a e e a e ) ，轮枝 菌属( v e r t i c i l l i u m ) ，属内有若干种引起棉花黄萎病的病菌有黑白轮枝菌( v e r t i c i l l i u m a l b o - a t r u m ) 和大丽轮枝菌( v e r t w 饼l l i w nd a h l i a ek l e b a h n ) ，我国的黄萎病菌多属大丽轮枝菌( 章元寿等，1 9 8 9 ) 。 大丽轮枝菌是一种维管系统发病的致病菌，不适宜的环境下，在土壤中以孢子、黑化的菌 丝体和休眠的微菌核的形式存在( s c h n a t h o r s t , 1 9 8 1 ) 在合适的环境中，病原真菌在寄主根部 表面形成菌群克隆，其孢子或休眠的微菌核，萌发形成菌丝刺入根部皮层、内皮和木质部，连 续生成孢子通过木质部运输到到植物的地上部分，分泌出有毒性的代谢产物( 毒素、酶类等) 导致植株系统性的病害( g a r a se ta ，1 9 8 6 ) 大丽轮枝菌变异力强，致病机理复杂早期相关 酶类( 果胶酶、半乳糖醛酸酶) 一直被认为是诱导黄萎病的主要因子而备受关注，但是随后的 研究表明不产生果胶酶的突变体依然具有致病力( h o w e l l , 1 9 7 6 ) ，没有半乳糖醛酸酶活性的大 丽轮枝菌菌株经紫外照射筛选出的感病菌株依然缺失半乳糖醛酸酶活性( p u h a l l aa n dh o w e l l 。 1 9 7 5 ) 这些证据说明这些酶类参与大丽轮枝菌与植物的互作反应，但是它们对黄萎病的发生并 不是至关重要的。 有关大丽轮枝菌的致病机理，目前普遍认可的是毒素致萎学说，即认为是大丽轮枝菌分泌 的毒素( v d - t o x i n s ) 是导致黄萎病发生的关键因子( 房卫平，2 0 0 1 ) 研究发现毒素破坏寄主植物 的叶片，改变细胞膜透性，使细胞内钾、钠离子外流，导致植株萎蔫枯死( 吕金殿，1 9 9 0 ；罗孟 军，2 0 0 1 ) 但是v d - t o x i n s 的致病机理复杂，迄今为止仍不知其有效的致病成分目前国内外 研究小组一致认为，v d - t o x i n s 的主要成分是真菌释放出的蛋白质一脂类一多糖复合物( p l p c - p r o t e i n - l i p o - p o l y s a c c h a d d e - c o m p l e x e s ) 及小肽( k e e na n dl o n g , 1 9 7 2 ：m e y e r , 1 9 9 4 ：n a e h m i a s , 中国农业大学博七学位论文 第一章文献综述 1 9 8 7 1 9 9 0 ；d a v i d , 1 9 9 3 ) 有关棉花黄萎病菌毒素的分离纯化工作国内外有过一些报道，但还 都没有得到单一的活性蛋白或多肽组分本实验室贾芝琪同学的研究表明，初步提纯的 v d - t o x i n s 中具有致萎活性的成分多数具有耐受高温高压的特性，当v d - t o x i n s 蛋白中的蛋白组 分和糖组分受影响后，其致萎性降低，进一步说明v d - t o x i n s 中的蛋白和糖组分具有致萎活性 ( 待发表) 利用液相色谱和质谱分析等技术对大丽轮枝菌外泌毒素进行分步纯化，通过接种 拟南芥观察致病性状确定各分离组分的致萎活性，结果得到一个有致萎活性的组分h l l 2 ，化学 分析表明其可能含有糖基或类似物，对h 1 1 2 进一步分析表明，其中一个活性i c 4 - i 的主要组 分是m z 5 2 0 7 的片段( 刘世忠，2 0 0 5 。博士论文) 1 1 3 大丽轮枝菌与植物互作的机制 大丽轮枝菌在棉花上引发的黄萎病是典型的整株系统性发病的维管束系统病害在棉株上的 症状表现是叶片上先在主脉间出现褪绿褐色斑块，叶缘褪绿，病斑逐渐坏死干枯叶片由下而上 逐渐脱落，而后整株萎蔫枯死。大丽轮枝菌在许多寄主植物上都会引起叶片失绿、衰老，枯萎、 落叶、生长迟缓甚至死亡的普遍症状( g o t ha n dw e b b ，1 9 8 1 ；w i h e l m ，1 9 8 1 ) 。作为大丽轮枝菌的寄 主之一。受侵染的拟南芥也会发现这些典型的致病症状，包括花青素的积累、生长迟缓和叶片失 绿等( v e r o n e s e e t a l ，2 0 0 3 ) ) 。寄主植物的这些致病症状是由包括生理生化异常在内的许多因素导 致的。 大丽轮枝菌侵染引起寄主植物许多生理生化机制的异常，而且在植物出现明显的疾病症状之 前就会发生这些生理生化的变化。g o i c o e c h e a 等报道大丽轮枝菌在侵染1 8 d 以后，引起胡椒植株出 现黄萎失绿甚至坏死等症状，但在侵染7 d 以后就会引起叶子水势的降低、叶片总蛋白和淀粉含量 降低、脯氨酸和可溶性糖的积累，他们认为病原菌在根部侵染的时候就可以释放毒性物质影响整 株植物的生理状态，这和l o r c n z i n 等人的看法一致。因为蛋白、淀粉和a b a 水平的降低是植物衰 老的特征，因此他们认为这些生理指标的变化是植物感受真菌侵染引起的伤害反应 ( g o i c o e c h e a , 2 0 0 0 ；l o r e n z j n e t a l 。1 9 9 7 ) 。大丽轮枝菌还会引起棉花，马铃薯、花椰菜和向日葵植 株电导系数的下降、碳同化速率的减弱和a b a 水平的变化等( b o w d e n , 1 9 9 0 ；s a d r a s ，2 0 0 0 ；t z e n g a n d d e v a y , 1 9 8 5 ；x i a oa n ds u b b a r a o ，1 9 9 8 ) 。 植物与病原菌之间经过长期的进化形成十分复杂的互作关系大丽轮枝菌形成对植物的寄 生性和致病性的同时，植物也主动形成了抵抗大丽轮枝菌攻击的防卫机制：一方面是结构上的 防御功能加强，生成天然的抗菌物质( 如类黄酮和萜类化合物) 在维管系统沉积，或者在细胞 壁上堆积类木质素物质，将菌丝包围起来的同时增加细胞壁的厚度，在结构上形成限制病原菌 生长的物理屏障( 李兴红。1 9 9 5 ；s m i ta n dd u b e r y , 1 9 9 7 ) ：另一方面发展了一套可以诱导激活的 防卫反应系统，如一些抗性基因的诱导表达或一些防卫反应中发挥作用的重要酶类的活性诱导 上升 大丽轮枝菌诱导番茄和棉花植株的苯丙氨酸裂解酶转录水平升高( l e ee ta ，1 9 9 2 ；d u b e r y 甜a 。1 9 9 4 ) 大丽轮枝菌激发子诱导细胞色素p 4 5 0 单氧化酶表达上升( l u o , 2 0 0 1 ) 大丽轮 2 中国农业大学博士学位论文 第一章文献综述 枝菌诱导海岛棉和陆地棉h m g r ( 调节类萜合成中的关键酶) 转录水平的上调( j o o s te t a l ，1 9 9 5 ) 大丽轮枝菌诱导植物抗毒素的水平和保护性酶类的活性升高大丽轮枝菌还能诱导 植保素的积累，抑制入侵的苗丝，孢子，起到杀菌抗病的作用( m a c e , 1 9 7 8 ) 大丽轮枝菌的培 养滤液能诱导细胞中单宁含量的增加( 姚明镜，1 9 9 5 ) 单宁的含量直接与植株的抗病能力相关， 单宁含量越高，棉苗抵抗大丽轮技菌的能力就越强( 朱荷琴，1 9 9 5 ；沈其益，1 9 9 2 ) 苯丙氨酸解 氨酶、过氧化物酶和多酚类物质的活性也在病原菌的诱导下发生改变( s m i t a n d i ) i i b e r y 1 9 9 7 ) 棉花受到大丽轮枝菌侵染时，抗性品种的维管组织中植物抗毒素甲基化类萜化合物含量升高 ( g a r a sa n dw a i s s , 1 9 8 6 ) 大丽轮枝菌还诱导植物体内几丁质酶和b 1 , 3 葡聚糖酶活性升高( l ie t 口k2 0 0 3 ；d u b e t ya n ds l a t e r , 1 9 9 7 ) v d - t o x i n s 也诱导棉花愈伤组织内源过氧化物酶和超氧化物 歧化酶的活性发生变化，且与植物的抗病能力相关( 李颖章，2 0 0 0 ) 这些植物抗毒素的水平和 保护性酶活的诱导升高是植物延迟病菌繁殖自我保护的一种机制。 植物与病原菌的互作是受植物与病原菌的相应基因调控的，最经典的就是“基因对基因假说” ( f l o r , 1 9 7 1 ) 假说提出：植物与病原菌的关系分为亲和( c o m p a t i b l e ) 和不亲和( i n c o m p a t i b l e ) 两类。亲和病原菌带有毒性基因( v i r u l e n c e g e n e ，v i r ) ，不亲和病原菌带有无毒基因( a v i r u l e n c e g e n e ， a w ) 不亲和寄主带有抗病基因( r e s i s t a n c eg e n e ，r ) ，亲和寄主则不带有r 基因其中无毒基因 和抗性基因是显性基因，毒性基因和感病基冈是隐性基因，只有带a w 基因的病原菌和带有r 基因 的植物互作时，植物才会表现抗性，其它情况下植物都是感病的。通常认为r 基因的产物是病原 菌的受体分子，能与a v r 基因的产物相互识别，进而启动植物的防卫反应。 在病原菌与植物互作过程中，病原菌的a v r 蛋白、分泌物以及寄主植物细胞释放的化合物目前 都被认为是激发子，即能够诱导植物产生防卫反应的信号物质。激发子的成分多为寡糖、糖蛋白 和脂类化合物。从激发子攻击寄主植物开始，到引起植物下游的防卫反应，这中间有许多的胞内 胞间因素参与，行使传递信号、激活下游反应等功能。b a k e r 等1 9 9 1 年提出植物通过受体激酶识 别激发子后立即激活膜上的g 蛋白、诱导脂膜离子通道、活性氧爆发及改变蛋白质的磷酸化水平 等许多信号转导过程，并可能通过这些信号转导过程激活体内的防卫反应( b a k e r e t a l 1 9 9 1 ) c 矿+ 作为细胞的第二信使参与植物的许多生理生化过程，其在病原菌与植物互作中的可能作用也 首先被关注。现已证实c 矿对激发子敏感，c a 2 + i 勾流是激发子诱导的早期反应参与寄主植物防 卫反应的激活( z i m m e r m a n a , 1 9 9 7 ；k u r u s u , 2 0 0 5 ) 活性氧( 0 2 、h 2 0 2 等) 也是病原菌与植物互 作中的活跃分子，在受到激发子攻击后，许多植物在攻击原位发现活性氧的大量积累( 俗称氧爆) n o 具有高度活性的特性被认为具有作为信号分子的可能，1 9 9 8 年的两篇报道提出n o 作为一种信 号分子参与植物防卫反应( d e l l e d o n n e ，1 9 9 8 ；d u m e r , 1 9 9 8 ) 随后n o 在植物与环境胁迫中的信号 功能备受关注 近十几年来，有关v d - t o x i n s 与寄主植物互作的研究也有不少作为大丽轮枝菌的主要致 病因子，v d - 铡m 对寄主植株有下列影响：凝固植物细胞原生质体；干扰棉花植株的水分平衡， 破坏原生质的保水能力；破坏原生质膜半透性，改变正常的离子渗透率；破坏抗坏血酸过氧化 物酶，改变棉苗呼吸强度；改变植株体内a b a 水平等( 章元寿。1 9 8 9 ；吕金殿等。1 9 9 0 ) v d - t o x i n s 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 的主要成分与激发子的成分相同也是蛋白质一脂类一多糖复合物，但是v d - t o x i n s 是否为激发 子目前尚无确切证据有关v d - t o x i n s 与寄主植物互作间的信号传递及下游可能的反应缺乏深 入研究黄萎病菌分泌的毒素与棉花细胞质膜具有高度的亲和位点( d u b e r y a 9 9 6 ) 而且在与毒 素的亲和能力上，根组织的质膜蛋白比子叶和下胚轴的显示出更高的亲和性，这种亲和性质膜 蛋白被认为是一种诱导抗病性的识别分子，与植物的防卫反应强度直接相关( 陈旭升等。2 0 0 1 ) 1 2 信号分子n 0 n o ( n i t r i co x i d e ，n o ) 自制取至今已有3 0 0 多年的历史。其间，尽管人们对其特性作过大 量研究，但近2 0 多年来，其合成途径、生理功能及作用机制等才日益引起各国科学家的关注1 9 8 0 年，f u r c h g o u 等发现血管内皮细胞可产生并释放一种舒血管活性物贡一内皮细胞衍化松弛因子 ( e d r f ) ，1 9 8 7 年p a l m e r 定量证明e d r f 就是n o 。1 9 9 1 年n o 合酶( n o s ) 克隆成功1 9 9 2 年 世界最具权威性的杂志( s c i e n c e ) 遴选n o 为当年的“明星分子”1 9 9 8 年的两篇重大报道认为n o 作为一种信号分子在植物防卫反应中发挥重要作用( d e l l e d o n n o ，1 9 9 8 ；d u m e r ，1 9 9 8 ) ，将n o 的研究引领到一个全新的研究高度，尤其是n o 在植物体内的信号功能再次成为人们关注的焦点 1 2 1n o 与植物逆境的关系 图i - ln o 在各种胁迫中的可能机制( i c , r n n e t a l 2 0 0 6 ) 4 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 植物的抗逆性包括抵抗生物胁迫和非生物胁迫n o 被报道能够对生物性和非生物性的各种 胁迫作出反应，并且作为一种重要的信号物质参与植物体的抗病防御反应( 见图1 i ，2 j i g r o ne t a 2 0 0 6 ) 1 2 1 1n 0 与生物胁迫 n o 参与病原苗引发的生物胁迫已经被广泛证实拟南芥叶片在受到非致病菌刺入之后在3 或 5 h 检测到n o 的产生( z h a n ge t a l ，2 0 0 3 ) 。受到真菌激发子侵染的大豆子叶和拟南芥以及受到烟草 花叶病毒( t m v ) 侵染的烟草，分别在4 和6 h 检测到n o s 活性的峰值( d u m e re ta 。1 9 9 8 ；m o d o l oe t a 。2 0 0 2 ；c h a n d o ke t a 2 0 0 3 ) 真菌激发子c r y p t o e g i i l 仅仅在数分钟内就引发了番茄叶片的n o 的快 速积累( f o i s s n e re ta ，2 0 0 0 ) 大豆和拟南芥悬浮细胞在受到非致病性的病原菌侵染之后，伴随 着活性氧的爆发n o 的积累在6 h 出现峰值( d e l l e d o r m ee ta 。1 9 9 8 ；c l a r k ee ta 2 0 0 0 ) 植物在抵抗病原菌的攻击时会发生超敏反应( h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ，h r ) 。h r 反应是一种以 宿主细胞在病原攻击位点发生快速死亡为特点的反应，可以限制真菌的生长和发展，并阻止其向 植物其它部分传播，是植物抵御病原菌入侵的一种防卫反应n o 也被证实参与h r 反应烟草花 叶病毒( t m v ) 侵染烟草时，n o 诱导细胞发生死亡，c a s p a s e 特异的蛋白片断被证实参与t n o 诱 导的细胞h r 反应，而且动物中c a s p a s e 的抑制剂可以阻断n o 诱导的细胞死亡( c l a r k ee t a 2 0 0 0 ) 大豆细胞悬浮液中接种假单胞菌可以刺激n o 的产生，生成的n o 与活性氧互作引起大豆悬浮细胞 的死亡，并独立诱导防卫基因的表达和保护物质的生成( d e l l e d o n n e e t a ，1 9 9 8 ) n o 和活性氧同 时自发的快速升高能够激活番茄悬浮培养细胞的超敏死亡，但是n o 或者是活性氧单独的升高对 诱导细胞的超敏死亡几乎没有作用( d e p i n t oe t a 2 0 0 2 ) 。分别带有m , r b 和a w r p t 2 基因的两种丁 香假单胞菌菌株侵染拟南芥叶片，发现分别在接种后3 h 和5 5h 大量积累n o ，n o 作为细胞间的 信号在促发超敏细胞死亡中发挥作用但是对n o 积累的动力学和超敏反应的发生程度进行分析 表明，n o 的功能是参与超敏反应在细胞问的传递而不是触发细胞死亡( z h a n g e l a 2 0 0 3 ) 有关n o 参与生物胁迫的报道多数都与活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 相关n o 信号 同活性氧信号关系密切：h 2 0 2 和n o 都是逆境信号分子；两者都具有保护和毒害的二元性特征； 两者可以发生化学反应。我们知道在植物与病原菌的互作中，会发生活性氧( 0 2 、h 2 0 2 等) 的 爆发( m i t t l e r , 2 0 0 2 ) 。过度产生的活性氧具有毒性作用而n o 却可以中和过量的r o s ，从而减轻 r o s g i 起的诸如d n a 片段化、离子渗漏和细胞死亡等毒性效应n o 可以和超氧阴离子发生反应 生成过氧化亚硝基阴离子o n o o ，可以和许多的细胞组分发生反应从而损伤蛋白质，脂、r n a 和 d n a 研究表明，拟南芥受到无毒丁香假单胞菌侵染后会形成病斑。o n o o 的吞噬剂( 尿酸盐) 可以减轻这种病斑的形成。然而尿酸盐对n o 和h 2 0 2 造成的损伤却没有保护功能( a l a m i l l oa n d g r a e i a - o l m e d o ，2 0 0 1 ) ，而且研究表明，大豆悬浮细胞在受到一定浓度的o n o o 处理时细胞活性不 发生明显的改变( d e l e d o n n e e t a ，2 0 0 1 ) 。正如在动物中报道的一样，我们猜想0 1 怩灯在植物中 具有重要的生理和信号功能，尽管它不是n o 诱导的细胞死亡所必须的中间产物( b e c k m a ne t a ，1 9 9 0 ) n o 和h 2 0 2 维持浓度的相对平衡可以调控超敏反应的细胞死亡，这具有生理上的重要意 5 中国农业大学博士学位论文第一章文献综述 义。确切的说n 0 ，r o s 信号如何触发生物胁迫中的超敏细胞死亡。仍然是需要广泛研究的问题 1 2 1 2n o 与非生物胁迫 n o 也参与水分和盐胁迫、机械损伤以及紫外线等各种非生物胁迫 干旱是常见的环境胁迫因素我们已知缺水胁迫下植物合成a b a ，通过一系列复杂的信号 级联机制诱导气孔关闭n o 信号同h z 0 2 信号一样被证明与a b a 诱导的气孔关闭关系密切：h 2 0 2 和n o 都是逆境信号分子；两者都参与a b a 诱导的气孔关闭；两者在不同的生物体中的信号转导 途径类同( n e i l ，2 0 0 2 b , c ；d e s i k a n , 2 0 0 4 ) l u m 等人认为在此信号转导途径中，n o 位于h 2 0 2 和c a 2 + 的下游诱导绿豆气孔关闭，因为v e r a p a m i l ( c 矿+ 通道抑制剂) j a b a 诱导的绿豆气孔关闭 ( l u r m 2 0 0 2 ) 。也有研究表明，a b a 诱导的n o 诱导了h 2 0 2 继而调节了气孔的关闭，即在a b a 诱 导的气孔关闭的信号途径中，n o 信号位于h z 0 2 的上游( d e s i k a ae t a l , 2 0 0 2 ) 吕东等发现n o 的清 除剂c - p t i o 可以减轻e 自a b a 或h 2 0 2 所引起的蚕豆气孔关闭的程度，而c a t 则不能减轻n o 诱导的 气孔关闭程度结合c o n f o c o l 检测细胞学荧光染色。结果共同表明a b a 诱导的蚕豆气孔关闭的实 验中，n o 位于h 2 0 2 的下游调节气孔关闭( 吕东等, 2 0 0 5 ) 最近的研究结果是，在a b a 诱导的拟 南芥气孔关闭试验体系中，a b a 和h 2 0 2 都诱导n o 的产生和气孔的关闭，而且n o 的清除剂可以抑 $ 1 j h 2 0 2 诱导的气孔关闭，但是n o 并不诱导 - 1 2 0 2 的产生，n o 诱导的气孔关闭也不需要h 2 0 2 ，而且 他们用突变体进一步证实了这个结论， y r n i a l ，n i a 2 突变体q a a b a 和h 2 0 2 都不能诱导气孔的关闭， n a d p h 氧化酶缺失的突变体舯的 口“砷ab a 诱导的n o 和气孔关闭都被严重的减弱，这个试验 有力地证明在a b a 诱导的拟南芥气孔关闭过程中，a b a 诱导h 2 0 2 和n o 的生成进一步诱导气孔的 关闭( m i g h t e t 以，2 0 0