（发酵工程专业论文）假单胞菌lip35低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究.pdf

摘要 低温脂肪酶是一类重要的水解酶，由于其具有低温高催化活性，耐有机溶剂以 及对热敏感等特点，在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等工业上有着 巨大的应用潜力，本论文建立了一套操作简单、快速且费用低廉的假单胞菌l i p 3 5 低温脂肪酶的提纯方案，并系统研究了其酶学性质。 本论文以实验室保存的一株假单胞菌l i p 3 5 为出发菌株，采用1 0 l 发酵罐发酵 生产低温脂肪酶，离心得其粗酶液，然后经超滤浓缩、硫酸铵盐析、s e p h a d e xg 2 5 脱盐、d e a e - 纤维素离子交换层析及s e p h a c r y i s 2 0 0 凝胶层析进行分离纯化。实 验结果表明，通过控制离子交换层析和分子筛层析这两步的具体操作条件，大部分 杂蛋白被除去，所得的酶蛋白经p a g e 电泳鉴定为单一条带，达到电泳纯。测得该 纯化酶的比活达到8 3 4 7 2u m g ，比初始发酵液提高了2 6 0 2 倍，酶蛋白得率达到 1 5 7 6 。 在获得纯化低温脂肪酶的基础上，对其酶学性质进行了系统研究。经s d s p a g e 电泳测定，该低温脂肪酶的分子量为3 9 8k d a ，酶蛋白的最适催化温度为2 5 ，在 1 5 3 5 范围内趋于稳定，能达到最大酶活的8 0 ，对热敏感，6 0 处理1 0 r a i n ， 酶活性仅残留1 0 ；该酶最适作用p h 值为8 1 ，在p h 8 o 9 5 范围内趋于平稳，属 于典型的低温碱性脂肪酶，该酶在较宽的p h 范围内( 6 啦9 0 ) 稳定性较好，室温 处理2 4 h 后，酶活力能残留在8 0 以上，具有较好的p h 耐受性。金属离子试验中 发现：大部分金属离子对该脂肪酶均有不同程度的抑制作用，其中尤以a 1 3 + 、z n 2 + 、 f e 2 + 抑制作用最强，c a 2 + g 膏j - 酶有显著的激活作用，可将酶活性提高两倍以上，但e d t a 的加入几乎使酶失活，初步判定该酶是金属离子依赖酶，s d s 对酶蛋白的变性作用 抑制其酶活性。以p - n p p 为底物用双倒数作图法测得v m a x 为7 9 3mm o l l m i n ， k m 值为1 4 3 1 m m o l l 。 本论文对低温脂肪酶的提取、纯化及酶学性质做了基础性研究，为进一步研究 低温脂肪酶的催化机理，分子克隆以及工业化应用提供了一定的理论指导。 关键词：假单胞菌；低温脂肪酶；分离纯化；酶学性质 p u r i f i c a t i o no f c o l d - a d a p t e dh p a s ef r o mp s e u d o m o n a sl i p 3 5a n de n z y m e e h a r a c t e r i z a t i o n s a u t h o r ：x i n x i nm e n g s u p e r v i s o r ：y m g m i nj i a m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g ( c o l l e g eo f f o o ds c i e n c ea n dt e c h n o l o g y , a g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t yo f h e b e i ) a b s t l r a c t c o l d - a d a p t e dl i p a s ei sak i n do fh y d r o l a s et h a tm a i n l ya p p l i e di nf i e l d ss u c ha sf o o d , m e d i c i n e , e n v i r o n m e n tp r o t e c t i n ge r e t h i sr e s e a r c he s t a b l i s h e das e to fm e t h o dw h i c hi s e a s y , f a s ta n di n e x p e n s i v ef o re x 仃a 幽n ga n dp u r i f y i n gt h ec o l d - a d a p t e dl i p a s ef r o m p s e u d o m o n a sl i p 3 5 ，a n dt h e ns t u d i e dt h ec h a r a c t e r i z a t i o n so fp 谳f i e de n z y m e s y s t e m a t i c a l l y t h i se x p e r i m e n tu s eas t r a i no fp s e u d o m o n a sl i p 3 5w h i c hp r e s e r v e di nt h e l a b o r a t o r ya s t h ef e r m e n t a t i o ns t r a i nt of e r m e n tc o l d - a d a p t e d l i p a s e i n t h eio l f e r m e n t a t i o nt a n k c o l d a d a p t e dl i p a s ew a sp u r i f i e db yu s i n gu l t r a f i l t r a t i o n ，a m m o n i u m s u l f a t ef r a e t i o n a t i o n ，s e p h a d e xg - 2 5 ，d e a e c e l l u l o s ei o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y a n ds e p h a c r y l1 m s 一2 0 0g e lf i l t r a t i o n 1 1 1 er e s u l ti n d i c a t e dt h a tb yc o n t r o l l i n gt h ed e t a i l c o n d i t i o n so f i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h ya n dm o l e c u l a rs i e v ec h r o m a t o g r a p h y , m o s t m i s c e l l a n e o u sp r o t e i nh a db e e nr e m o v e d t h ep 耐f i e dc o l d a d a p t e dl i p a s es h o w e da s i n g l eb a n di np a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h es p e c i f i ca c t i v i t yr e a c h e d8 3 4 7 2u m ga n d w h i c hw a s2 6 0 2f o l d sh i g h e rt h a nt h ec r u d ef e r m e n t i n gl i q u o ra n dt h ey i e l dw a s15 7 6 i nt h eb a s eo fo b t a i n i n gas i n g l ec o m p o n e n tc o l d a d a p t e dl i p a s ef r o mp s e u d o m o n a s l i p 3 5 ，t h ec h a r a c t e r i z a t i o n so fp u r i f i e dc o l d a d a p t e dl i p a s ew a ss t u d i e d t h em o l e c u l a r w e i g h to ft h ee n z y m ew a se s t i m a t e dt ob e3 9 8k d ab ys d s p a g e t h eo p t i m u m t e m p e r a t eo ft h ec o l d - a d a p t e dl i p a s ew a s2 5 c t h ea c t i v i t yw a sa l m o s tu n c h a n g e d b e t w e e n15 3 5 ca n dw a sa l w a y sa b o v e8 0 t h ee n z y m ew a st h e r m a ll a b i l i t y , o n l y10 o fi t sa c t i v i t yw a sr e m a i n e da f t e r10m i ni n c u b a t i o na t6 0 a n dh i g h e rt e m p e r a t u r e 1 1 1 el i p a s es h o w e dh i 曲l i p o l y t i ca c t i v i t yf r o mp h8 0t op h9 5a n di t so p t i m a lp hf o r a c t i v i t yw a s8 1 ，b e l o n g e dt ot h ea l k a l i n ec o l d a d a p t e dl i p a s e i th a sag o o dp ht o l e r a n c e , t h er e l a t i v ee n z y m ea c t i v i t yw e r ea l la b o v e8 0 a f t e rb e i n g k e p t2 4 h a tr o o mt e m p e r a t u r e ( 2 5 ) i nt h ec o n d i t i o no f p h6 9 ：m e t a l l i ci o n sh a di n f l u e n c eo nc o l d a d a p t e dl i p a s e n l el i p a s ea c t i v i t yw a si n h i b i t e ds t r o n g l yb ya i ”，z n 2 + ，f e 2 + a n dw a si n h i b i t e dal i t t e rb y o t h e rm e t a l l i ci o n s b u tw a ss t i m u l a t e db yc a 2 + ( m o r et h a nt w ot i m e so ft h ei n i t i a l a c t i v i t yw a sa c h i e v e d ) ，n l ee d t at e s tt e s t i f i e dt h a tt h i sl i p a s ew a sc a 2 + d e p e n d e n t o n z y n l e t h ed e n a t u r a t i o ne n g e n d e r e db ys d so ne n z y m ep r o t e i nc a l ls e v e r e l ya f f e c tt h e e n z y m ea c t i v i t y f o rp - n p pt h ek mi s1 4 31 r e t o o l r a i n , v mi s7 9 3 m m o f lw h i c hi s t e s t e db yd u a l r e c i p r o c a lg r a p h t h i sp a p e rh a sd o n es o m er e s e a r c ho nt h ec o l d a d a p t e dl i p a s ei n c l u d i n g , p u r i f i c a t i o n a n dt h ee n z y m ep r o p e r t i e sa n dt h i sw i l lb eaf o u n d a t i o nf o rt h es t u d yo fi t sc a t a l y s e d m e c h a n i s m , c l o n ea n di n d u s t r i a la p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：p s e u d o m o n a sl i p 3 5 ；c o l d - a d a p t e dl i p a s e ；e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o n ； 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑童堡盛些盘鲎或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：歪私彳匕 签字日期： 训年乡月7 2 ，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑皇垦盛些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑皇堡垒些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 墨秘孝聊签名：触肜 签字日期：溯年乡月，二日 签字日期：夕吻年 厂月 j x f t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 假单胞菌l i p 3 5 低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究 1 1 低温微生物研究进展概述 1 引言 低温微生物资源近年来正成为研究开发的热点，除了其在适应低温环境的机理 和生命的起源等理论领域具有重大意义外，低温酶在工业应用中的优势和诱人前景 也是重要原因。 低温微生物是泛指生活在低温环境下的微生物。1 9 7 5 年，m o r i t a 1 】按生长温度 将这些生活在低温环境中的微生物分为两类：把能在低于0 缓慢生长，最适生长 温度不超过1 5 ，最高温度不超过2 0 的微生物，称之为嗜冷菌( p s y c h r o p h i l e s ) ： 而把能在0 生长，最适生长温度在2 0 - - 3 0 之间，生长上限温度低于4 0 的微生 物，称之为耐冷菌( p s y c h r o t r o p h s ) 。这两类微生物的生态分布和低温生物学特性均 存在差异，它们以独特的生理功能适应环境。研究这类微生物不仅具有重要的理论 意义，而且在实际应用中已经产生了日益明显的经济意义，同时它们是生物技术和 生物产业发展的十分重要的资源【2 3 j 。 1 1 1 低温微生物的来源和分布 低温微生物首先由f o r s t e r 发现 4 1 ，最初分离到的低温微生物大部分是耐冷菌， 随后嗜冷菌才被大量分离。这是由于在研究初期没有使用预冷的培养基，而嗜冷菌 对热十分敏感，短时间受热就可能致死。耐冷微生物则可在较宽的温度范围内生长， 从常冷到不稳定的低温环境中都可找到耐冷菌的存在。嗜冷菌在低温下比耐冷菌生 长快，如果在营养适合的条件下，在0 时，嗜冷菌的生长要超过耐冷菌【5 】。 目前在南北极终年常冷的环境中，分离到的微生物大部分也都是耐冷菌，嗜冷 菌只占很少的部分。己发现的低温微生物有真细菌、古细菌、蓝细菌、真菌和藻类， 有自养菌也有异养菌，有好氧菌也有厌氧菌，大部分为革兰氏阴性菌。低温菌种类 繁多，在己知的低温菌中，细菌是数量和种类最多的一类，涉及3 0 多个属，其中 属于革兰氏阴性的p s e u d o m o l l a s 属和革兰氏阳性的b a c i l l u s 属较多，这些低温菌广 泛地分布于各种低温环境中【6 ，7 j 。除低温细菌外，人们在南极的土壤和湖泊中还发现 了低温放线菌、霉菌和酵母，还在冰雪、海冰中发现了低温藻类，例如人们曾观察 到有的雪被染成红色，实际上是由一种低温菌“雪藻”引起的瞵】。 我国的低温环境较多，有4 9 ，1 9 8 条冰川，总面积达5 9 ，4 0 6 1 a n 2 ，仅次于俄罗斯、 加拿大和美国，为世界第四。特别是我国有低纬度冰川，尤其滇西北的一些冰川自 有特色。此外冰川周围的冻土区，雪线以上的地域，以及深海区，都蕴藏着丰富的 低温微生物资源p j 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 1 2 低温微生物的特点 低温微生物在长期的环境适应过程中，产生了独特的能耐受低温的细胞学特征 和生理生化特性。这些特征主要包括以下方面。低温微生物在更大程度上合成 了含有更多不饱和脂肪酸或短链脂肪酸的中性脂质及磷脂，细胞膜的流动性增强， 从而有利于细胞内外的物质交换l l o l 。细胞质低温防护剂如多元醇和海藻糖等浓 度的改变以及冷激蛋白和冷适应蛋白( c o l d - a c c l i m a t i z a t i o np r o t e i n ) 的表达【l l 】。冷 激蛋白和冷适应蛋白是指微生物在受寒冷刺激后过量表达的一类蛋白质，对低温条 件下蛋自质合成的调节以及m r n a 的折叠起重要作用。表达特异性的具有低温 催化活性的低温酶。在低温条件下，低温微生物能特异性地合成分泌具有低温催化 活力的酶，并利用这些酶在低温下高效地催化合成低温微生物生命活动所需的物 质，保证低温微生物在低温下能够进行正常的生命活动【l 引。 1 1 3 低温微生物国内外研究现状及应用前景 进入2 0 世纪9 0 年代以后，低温微生物及其相关产物( 如抗冻蛋白、低温酶类、 多聚不饱和脂肪酸、十四酰c o a 、色素、抗生素、抗肿瘤药物以及质粒等) 的研究 意义以及它们在现代生物工程中的潜在价值，逐渐为人们所认同并引起广泛关注， 成为一个新的研究热点领域。有关低温微生物及其代谢产物在生物适冷机制、生命 起源与进化、新菌种的收集鉴定与菌种系统发育分析、物质的生物地球化学循环与 能量传递以及新型生物活性物质的研究开发等方面，已有大量研究论文及综述文章 发表 1 3 , 1 4 。 目前在低温微生物研究领域，欧美及日本等一些传统生物技术大国，已开展了 多年的研究，在国际上处于领先地位：美国对来自极地及海洋的嗜冷微生物在低温 生存机制、生物工程潜在应用以及与天体生物学( a s t r o b i o l o g y ) 的联系等方面开展 了探索研究l i5 1 ，并且在国际上首次完成了对1 株北极耐冷细菌c o l w d l i a p s y c h r c r y t h r a e a3 4 h 的全基因组测序工作【1 6 1 ；加拿大科研人员对北极环境污染物( 如 链烷、甲苯、萘、多氯联苯等) 降解细菌进行了大量研究l l ”；澳大利亚利用其毗邻 南极大陆的地理优势，于1 9 9 0 年开始通过e m b a m ( e c o l o g ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y o f a n t a r c t i cm i c r o o r g a n i s m s ) 计划及后续的a c a m ( a u s t r a l i a nc o l l e c t i o no f a n t a r c t i c m i c r o o r g a n i s m s ) 活动，对包括适冷菌在内的南极及南大洋微生物资源进行了大规 模的调查研究与收集保藏，不但在低温微生物的多样性和适冷机制、生物环境修复 等方面开展了许多工作，还在新型药物筛选、低温酶类及多聚不饱和脂肪酸( p u f a , p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ) 的研究与开发应用方面进行了摸索【1 3 1 ；欧洲国家在 1 9 9 0 - - - 1 9 9 4 年第3 个欧盟框架计划生物工程部分，对包括嗜冷微生物在内的极端微 生物的研究投资超过4 5 百万欧洲货币单位l l 引，并在1 9 9 6 年启动的欧盟第4 个框架 计划中，设立了大规模、系统性的主要针对南极嗜冷微生物的“c o l d z ：y l e 研究项 2 假单胞菌l i p 3 s 低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究 目，参与国家包括英国、比利时、德国、法国、瑞典、奥地利、意大利、荷兰、希 腊等。他们在嗜冷酶的分子适冷机制、酶序列分析、酶分子定向诱变、酶基因克隆 表达以及应用开发等方面开展了大量工作，现已取得l 项低温夕半乳糖苷酶专利。 另外，在低温微生物冷激蛋白( c o l ds h o c kp r o t e i n ) 、特殊基因调控系统、特殊膜成 分以及不同的分泌机制等方面，欧洲也进行了重点研究。捷克、波兰等东欧国家， 也各自开展了针对低温微生物的研究工作；亚洲的日本早在2 0 世纪6 0 年代就开展 了针对南极适冷微生物的研究，进入9 0 年代后，更是在微生物的适冷机制与低温 酶学研究方面开展了大量工作，现已有2 项低温蛋白酶专利，日本花王公司还提交 了一系列应用于洗涤剂的低温蛋白酶的专利申请；另外，印度也注意到了研究南极 低温微生物适冷机制的意义及其在工业中的应用可能性。 国内一些研究机构从2 0 世纪9 0 年代初开始了针对低温微生物资源( 主要是南 极及深海微生物) 的初步收集、调查与研究工作。近5 年来，随着国际上对低温微 生物研究热度的逐步加强，以及国内科研人员对低温微生物及其产物在学术研究和 生物工程中潜在价值的不断认识，中科院、国家海洋局及水产科学院下属的部分研 究所及部分大学已经在低温微生物及其酶类( 主要是低温蛋白酶、低温纤维素酶) 、 新型药物筛选以及低温菌株的分子鉴定与系统发育等方面开展了一些研究工作并 取得了部分成果【1 9 2 。水产科学院黄海水产所已研制开发出主要应用于合成洗涤剂 方面的海洋低温碱性蛋白酶和应用于医疗方面的低温溶菌酶产品。但就总体情况而 言，国内对低温微生物的研究与开发力量还比较薄弱，研究范围较集中，研究深度也 不够。这一状况还有待国内生物科技人员的共同努力来加以改善。 低温微生物在自然界中的分布十分广泛，它们在低温条件下对自然界的物质循 环起着重要的作用。首先低温微生物温度适应范围是叽3 0 ，与许多环境污染物所 处的温度大致相同，因此在低温条件下，它们既可对有机污染物进行降解和转化， 对全球生态环境起到了十分重要的作用；其次低温发酵可生产许多风味食品且能够 节约能源及减少中温菌的污染【2 2 】；另外低温微生物资源成为生物技术开发的宝库， 如低温酶的开发，特殊药物的开发等。由于低温微生物能在酷寒自然环境中生存， 有的还具备抗冻融能力，如果能研究清楚其生理及其分子机制，提取出有用的相关 基因产物，将会在基础研究和开发利用( 动植物抗冻、医用疫苗、食品保鲜及低温 发酵) 两方面都给人类带来极大的好处。因此对低温微生物进行研究既可以丰富生 物多样性的研究内容，还可以利用它们特殊的基因及产物服务于人类。 1 2 低温酶研究简介 低温酶( c o l d - a d a p t i de n z y m e ) 也称嗜冷酶( p s y c h r o p h i l i ee n z y m e ) 或冷活性酶 ( c o l d a c t i v ee n z y m e ) 。低温酶是指在低温条件下能有效催化生化反应的一类酶。低 温微生物通过产生低温酶来调节他们的代谢活动并以此来适应低温环境。 低温酶与中温酶相比有以下特点：1 酶的最适反应温度较同功能的中温酶低0 3 0 ；2 在较低温度下( 4 0 ) ，酶的转换数( k e a t ) 或生理系数( k c a t k m ) 高于 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 来自中温菌中的同类酶；3 低温酶的热稳定性差，在高温下易失活，同时，由于低 温酶能在低温下有效发挥催化作用的特点，使其在生物工程领域有着广泛的应用前 景。因此，对低温酶的研究无论在理论上还是在实践上都有重要意义。 1 2 1 低温酶的来源 低温酶的来源相当丰富，原核和真核生物都能够产生低温酶。低温酶除了很少 一部分由中温酶突变而来 2 3 , 2 4 ，绝大部分是由生活在低温环境中的低温微生物产生 的。地球表面大部分地区属于低温环境，其中9 0 属于低于5 c 的海洋环境，其余 为包括永久冻结带、冰川、极地冰山以及雪山等环境，这些环境中都存在着大量的 低温微生物，它们是低温酶的主要来源。目前研究的低温菌主要来自各种低温环境 如南极、北极深海、高山、河流、冰川、低温动物体内等，如在南极地区，海水中 低温细菌所占的比例相当高，其密度可高达l o s m l 1 0 6 m l ，它们是低温酶的一个 重要来源拉。另一重要来源是深海沉淀物，目前已在低于3 c 的深海沉淀物中分离 出了多个种属的细菌，并从中成功分离纯化出了各类低温酶【2 8 1 。 1 2 2 低温酶的适冷机制 高温下能够快速失活是低温酶的一个显著特征。对于当前研究得较多的低温酶 来说，在5 0 - - - 6 0 下保温l o m i n ，或在4 5 下保温几小时后大部分的低温酶会丧失 一半以上的活性。这主要是由于形成低温酶活性位点的因子( 局部柔韧性) 和构象 稳定性( 整体柔韧性) 随着温度的升高逐渐丧失了结构平衡而导致的。因此，低温 酶在高温下的不稳定性往往是由它的结构特征所决定的 2 9 , 3 0 。蛋白质结构的柔韧性 对于酶在低温下保持高催化活性是至关重要的，现代酶学理论研究认为酶与底物的 作用必须经过相互诱导而产生构象互补。在通常的环境温度下，为了充分与底物反 应并且催化底物，酶必须具有一定的柔韧性l z 7 , 3 1 1 。基于物理学的常识，我们知道温 度的降低，将导致物质的分子热运动减少，同时引起蛋白质的刚性明显增加。因此 对于低温酶来说，要使其在低温下有效发挥催化活性，就必须优先解决好低温下柔 韧性不足的问题【3 2 , 3 3 】。因此，低温酶必须选择合适的分子组成才能保证酶以最低的 能耗就能与底物产生较好的互补性【27 1 。 与相应的中、高温酶相比，由于低温酶对构成其自身的氨基酸组成进行了巧妙 调整，而使其在不破坏整体结构的基础上显著增加了柔韧性，譬如减少脯氨酸和精 氨酸的含量，增加甘氨酸的含量；减弱分子内相互作用，增加酶与溶液的相互作用： 减少带电残基和二硫键的数目等，通过这些调整，使得低温酶的活性位点变得更加 紧凑和富有柔韧性，从而能够更好地适应低温环境3 4 , 3 5 】。这些结构的改变都有利于 分子柔韧性的增加，也是低温酶能够适应低温的分子基础，使之能够更加适应低温 环境。 低温酶的种类繁多，且都具有低温下高效催化的特性，因此对各种低温酶的生 4 假单胞菌l i p 3 5 低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究 物学特性进行分析，并将其结构特征与相应的中温酶进行比较，是研究低温酶冷适 应性机制最基本也是最重要的方法。 近二十年来对低温酶的研究越来越深入。低温酶在低温下具有很高的催化效 率，在0 1 2 甚至o c 以下仍具有较高的催化效率，但是对热却不稳定。由于低温酶 具有柔性较高的构象，是研究酶结构与功能的很好材料，因此许多科学家都在探讨 低温酶的结构与功能的关系，试图弄清楚低温酶在低温下保持高催化效率的机制， 同时探索低温酶在清除环境污染、洗涤、食品加工等行业中的应用 2 s 2 6 。 1 2 3 低温酶在应用上的优势 由于低温酶的低温催化能力，低热稳定性使其在工业应用上有以下优势：通过 温和热处理即可使低温酶失活，快速而经济地终止反应；生产过程在低温或室温下 进行，无需加热和冷却，可以降低成本；生产过程便于监控等优点。低温酶在工业 领域的应用包括以下方面。 洗涤添加剂：如蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶可以作为洗涤添加剂在冷洗 行业具有广泛应用。 食品工业：低温酶在食品工业中具有广泛的应用。例如，低温夕半乳糖苷酶可 以在低温条件下降低牛奶中乳糖的含量，而世界上有2 3 的人由于缺乏夕半乳糖苷 酶不能代谢乳糖；在果汁工业中，低温果胶酶可以降低果汁的粘性，使终产品变得 澄清；在肉食品工业中，低温蛋白酶有助于肉的嫩化；在面包工业中，低温淀粉酶、 蛋白酶、木糖酶可以减少生面发酵时问，提高面包质量；另外，低温酶还可以用在 奶酪，酿酒工业等方面。 环境生物治理：利用低温微生物来处理土壤和水体中的污染物具有特别的优势 1 3 6 。环境温度季节性大范围的变化，降低了微生物分解有机污染物的效率。低温酶 在低温或中温下有效发挥催化作用，所以低温菌是生物治理的理想材料。如多元醇 的低温降解已用于飞机跑道附近污染物土壤的治理：低温几丁质酶能够断裂几丁质 中的糖苷键而产生可溶性的低聚糖，然后通过, a - n 乙酰氨基葡萄糖酶进一步水解 成能被生物吸收的g l c n a c 。因此低温几丁质酶对于海洋底部的物质循环具有重要的 意义。 低水活条件下的生物催化：商业合成的脂肪酸脂、多肽、寡聚糖衍生物和其它 些化合物水溶性较差。这一问题可以通过使用低温酶在低水活条件下的生物催化 作用来解决，因为低温酶具有更强的柔韧性，在低水活条件下易与底物结合。 1 3 低温脂肪酶研究 脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 是一类在油一水界面上催化天然油脂( 甘油三脂) 降解为甘油和游离脂肪酸的酶，广泛存在于动物、植物和微生物中3 7 捌。它是最早 研究的酶类之一，已有上百年的研究史。1 8 3 4 年就报道了兔胰脂肪酶的活性，1 8 7 1 5 一 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 年报道了植物种子脂肪酶，微生物脂肪酶是在本世纪初才发现的，我国微生物脂肪 酶的研究始子6 0 年代1 3 9 1 。 1 3 1 脂肪酶的来源及分类 脂肪酶在微生物界的分布广泛，据估计，细菌有2 8 个属，放线菌4 个属，酵 母菌有1 0 个属，其他真菌2 3 个属，共计6 5 个属的微生物能产脂肪酶。而作为具 有低温活性的低温脂肪酶则大多是由低温微生物产生，这些低温微生物主要分布在 南、北两极以及大洋底部等长期处于低温的环境。目前所发现的产低温脂肪酶的低 温微生物大都属于假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、气单胞茵属( a m o m o n a s ) 等 4 4 , 4 习。 这些低温微生物在低温环境下经过长期的进化，形成了适应低温环境的特殊结构及 生理生化机制。 对脂肪酶的分类还没有形成一个完整的共识，目前主要有两种分类方法：( 1 ) 按最适酶活p h 值可分为酸性脂肪酶和碱性脂肪酶，一般植物种子和动物胰脏所含 的脂肪酶为酸性脂肪酶，而微生物所产生的脂肪酶大多为碱性脂肪酶【裕4 9 1 。( 2 ) 按 脂肪酶家族可将脂肪酶分为八个家族1 5 州【i 、i i ( g d s l ) 、i i i 、i v ( h s l ) 、v 、v i 、 、】。而脂肪酶家族i 又细分为6 个亚科，据报道，假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 微生物产生的低温脂肪酶是一个显著的代表，大多数假单胞菌属的脂肪酶可划分到 i 1 至i 3 亚科。i 1 亚科的脂肪酶分子量最小( 约3 0 k d ) ，绿脓杆菌( e a v r u g i n o s a ) 和草莓假单胞菌( p f r a g i ) 是这一亚科的代表。i 2 亚科与i 1 亚科具有6 0 的脂 肪酶氨基酸序列相似性，由3 2 0 个氨基酸残基组成，分子量约为3 3 k d ，包括荚壳 伯克霍尔德菌( b g l u m a e ) 和洋葱伯克氏菌( b c e p a c i a ) 的脂肪酶。这两个亚科的 脂肪酶分子都有一个二硫键，而且需要有助蛋白的帮助才能完成蛋白质的正确折叠 和分泌。i 3 亚科的脂肪酶分子量要比第一、第二亚科的分子量大的多，假单胞菌 属的 e f l u o r e s c e n ss i kw 1 ( 5 0 k d ) 】和假单胞菌属的 e s t m i n m i s 3 8 ( 6 5 k d ) 】以及沙 雷氏菌属中 s e r r a t i am a r c e s c e n s ，( 6 5 k d ) 】的脂肪酶是这一亚科的主要代表。这一亚 科的脂肪酶分子缺失了半胱氨酸残基，从而失去了形成分子内二硫键的能力。 1 3 2 脂肪酶的分子结构及催化特征 ( 1 ) 脂肪酶的分子结构 脂肪酶是一种糖蛋白，其糖基部分约占分子量的20 0 5 ，以甘露糖为主，整 个分子由亲水部分和疏水部分组成，活性中心靠近分子的疏水端。研究表明，来源 不同的脂肪酶，其氨基酸组成数目从2 7 0 - - 6 4 1 不等，分子量为2 9 1 0 0k d t 孔】。迄今 为止，人们已经对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利用x 衍射等手段以及定向修饰 等技术测定了酶的氨基酸组成、晶体结构、等电点等参数，确定了组成脂肪酶活性 中心的三元组( t r i a d ) 结构。绝大多数脂肪酶的活性中心都是由s v r 和h i s 参与组 成m j 。h i s 、s c r 与另一种氨基酸残基( 如c c l 和g c l 的g u j ，r m l 和m l 的a s p ) 6 假单胞菌l i p 3 5 低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究 一起构成脂肪酶催化中心的三元组【5 3 】，如图1 。人胰脂肪酶( h p l ) 5 2 】、r h i z o m u c o r m i e h e i 脂肪酶( r m l ) m j 和g e oc a n d i d u m 脂肪酶1 5 5 】等的蛋白晶体结构已经研究清 楚。对脂肪酶活性中心的研究发现，s e r - g l u h i s 组成一个有催化作用的三联体，g e o c a n d i d u m 的立体结构也证明这种三联体的存在。脂肪酶i - i p l 、r m l 三联体是 s e r - g l u h i s ，即a s p 取代了g l u 。上述3 种脂肪酶中，活性中心丝氨酸残基的侧链 构象在空间结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似，不同的是脂肪酶的活性中心隐藏 在蛋白质内部。 图1c a n d i d ar u g o s al i p a s e 多肽的拓扑和立体图解 f i g 1t o p o l o g i c a la n dt r i d i m e n s i o n a li l l u s t r a t i o no fc a n d i d ar u g o s al i p a s e p o l y p e p t i d e 不同的脂肪酶具有非常类似的立体结构，脂肪酶的氨基酸顺序可能会有较大差 别，但却有类似的折叠方式和活性中心。一般的脂肪酶的肽链折叠成两个结构域， 即n 末端和c 一末端结构域，n 末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性 的通道，该通道从催化部位的s e r 直到分子的表面( 5 6 | 。通常情况下，脂肪酶的活性 部位被一个螺旋片段( 又称为“盖子”) 所包住。在底物( 如醇、酸或酯等) 存在 的情况下，酶的构象发生变化，“盖子”打开，含有活性部位的疏水部分就暴露出 来。如图2 所示p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 脂肪酶活性位点的三维结构，“盖子”中 a 螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油水界面的结合能力，其双亲性的减弱将导 致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面则 相对疏水。由于脂肪酶与油水界面的缔合作用，使“盖子”张开，活性部位得以暴 露，这使得底物与脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性的通道而与 活性部位结合，形成酶底物复合物【57 1 。 图2p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s al i p a s e 活性位点的三维结构 f i g 2 t h r e e - d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo f p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aa e t i v e dp o i n t 多数脂肪酶都有变种，一般而言，不仅构成活性中心的三元组氨基酸种类相同， 而且位置不变，其分子量和等电点略有不同【5 5 - s 8 。多数脂肪酶都是单链蛋白，大多 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 成熟的天然蛋白还含有糖类组分，因此实际测得的分子量往往比理论分子量偏大 i s 4 o ( 2 ) 脂肪酶的催化特性 脂肪酶是生物体内一类重要的代谢酶，不同于其它多数水解酶催化的一个最显 著的特点是，该酶催化的水解反应是在一种非均相体系中进行，水溶性的酶在底物 ( 水不溶性) 和水的界面上催化底物反应，对水溶性底物不起催化作用。 脂肪酶催化反应的过程：底物结合在活性位点的s e r 上，产生一个由h i s 和a s p 参与帮助稳定的四面体中间体( t e t r a h e d r a li n t e r m e d i a t e ) 如图3 所示；释 放醇，形成酰基酶复合物；产生自由酶和酸、醇；通过亲核基团( 水解反应 中为水，转酯作用中为醇或酯) 的攻击重新行成四面体中间体筘列。 围3 脂肪酶催化甘三酯水解过程中形成的四面体中间体 f i g 3 t c 沲 a h e d r a li n t e r m e d i a t ef o r m e dd u r i n gl i p a s ec a t a l y s i z c st h eh y d r o l y s i so f e s t e r s 脂肪酶多功能催化作用的开发必须以脂肪酶的底物特异性为基础。众所周知， 酶的底物特异性取决于酶的分子结构，特别是酶活性中心的结构。因此，酶的来源 不同，其结构的差异使酶的底物特异性也不同。脂肪酶的底物特异性( s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y ) ( 见图4 ) 包括： c1 ) 霉牛譬异性艨膀囊 r c f g ) c i 融严o hil r r c d o c h ， - r c o o h + r 0 0 咖+ r c o o h4 - c i k ，h l r 屯_ c - o c l l l 1 ) 定向鬟肪 r c o o c h ：c h 觑i a l 一汁i ll r t o o t h 芦w c o o c h+ r c o o h ；= = 。譬0 x ) c h 4 - r 气2 0 0 h l | r c o o c h lr 0 0 c h i c h i o h ( 1 ) 鬻舫酸特异性寤肪酶 r c f r x ：h 2 r o d 【：) c i lc h 鼬h彰o 【) o c h i li r c 0 0 c h+ r c 0 0 c h ；= 域c 0 0 h 毒r c 0 0 c h+choh iii r c ；o c x ：h fr 弋0 ( ) c ：f b r c o o c h lr 弋0 0 c 心 圈4 不同类型脂肪酶的底物特异性 f i g 4 s u b s w a t cs p e c i f i c i t yo f d i f f e r e n tk i n do f l i p a s e s 作用于甘三酯时对进攻的位点和水解的脂肪酸均不显示特异性，甘三酯被 完全水解为游离脂肪酸和甘油，甘油二酯和一酯为中间产物 6 0 l 。 8 假单胞菌l i p 3 5 低温脂肪酶分离纯化及酶学性质研究 位置特异性( p o s i t i o n a ls p e c i f i c i t y ) 它是指酶对底物甘油二酯中艮l ( 或3 ) 和s 吨位酯键的识别和水解的选择性。o k u m u r a 比较了四种微生物脂肪酶水解甘油 三油酸酯的位置选择性，结果证明，黑曲霉和根霉的脂肪酶仅催化l ( 或3 ) 位酯 键水解，对2 位酯键无作用；白地霉和圆弧青霉的脂肪酶无位置特异性，水解甘油 三酯的所有酯键。但从这些酶水解可可脂( 混合脂肪酸组成) 的实验中得出，白地 霉和圆弧青霉的脂肪酸酶虽然都能水解2 位酯键，但是前者优先水解不饱和脂肪酸， 而后者对饱和与不饱和脂肪酸水解能力相同。大鼠脂肪组织的脂蛋白脂肪酶对甘油 三酯的三个位置的酯键水解速度相同；牛奶脂蛋白脂肪( 纯酶) 和人的脂蛋白脂肪 酶只水解1 ( 3 ) 位酯键1 6 。 立体特异性( s t v r e o s p e c i f i c i t y ) 一般是指酶对底物甘油三酯中立体对映结 构的l 位和3 位酯键的识别和选择性水解。a k e s s o n 等发现，来源于荧光假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sf l u o r e s c e n s ) 脂肪酶能区分s n - l 和s 们位二酰基甘油，但水解s 越、 s 瞄二酰基甘油比水解它的对映体速度快得多 6 2 j 。 脂肪酸特异性( y lc h a i ns p e c i f i c i t y ) 它是指酶对不同( 碳链长度和饱和 度) 的脂肪酸所表现出的特殊反应性。不同来源的脂肪酶水解甘油三