（发酵工程专业论文）丙酮酸发酵光滑球拟酵母过程功能的强化.pdf

摘要 捅要 在利用微生物细胞过量合成生物基化学品的过程中，需要考虑的问题是：如何优化 或强化微生物细胞的过程性能，以提高目标代谢产物的生产效率。本文以一株能在胞外 大量积累丙酮酸的光滑球拟酵母营养缺陷型菌株( t o r u l o p s i sg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 0 1 9 ) 为研究菌株。以动力学模型和过程控制为技术手段，围绕如何调控光滑球拟酵母的营养 环境条件以强化zg l a b r a t a 的过程功能开展研究。主要研究结果如下： l 不同初始维生素浓度下，细胞生长和丙酮酸合成具有显著差异：较高的初始维生素 浓度( 1 4m l l ) 可提高最终细胞浓度( 2 0 0 3v l ) 和细胞生长持续时间，但降低了丙酮酸 对葡萄糖得率( o 4 1g g ) ；较低的初始维生素浓度( 6m l l ) 能提高丙酮酸的得率( o 8 2 g l ) 但使细胞生长微弱( 6 7 1g l ) ；通过指数流加维生素可将比生长速率控制在设定值 附近，但控制较高比生长速率饥n 为0 0 5h 1 ) 时最终碳流较多流向细胞生长，控制较 低比生长速率为0 0 1h - i ) 可以获得较高的最终丙酮酸浓度( 8 1 3g l ) 和得率( o 6 7 g g ) ，但丙酮酸生产强度较低( o 9 1g ( l h ) ) 。在上述分析基础上，提出了基于维生素 指数流加的比生长速率分步控制策略：在1 6 3 4h 时将风n 定为0 0 5h - 1 ，在3 4h 和 6 4h 分别切换到0 0 2h 1 1 和0 0 1h ，使最终丙酮酸浓度、产率和和生产强度比分批发 酵分别提高了3 4 5 、2 2 9 和6 9 ； 2 对不同葡萄糖浓度下光滑球拟酵母分批发酵生产丙酮酸的动力学模型分析发现，葡 萄糖浓度是影响光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸过程功能的关键因素之一。在发酵初 始阶段，低浓度葡萄糖可维持较高的菌体比生长速率；对数生长中前期，葡萄糖快 速进料使菌体浓度达到最大值，并实现碳流从菌体生长转向丙酮酸积累；对数生长 后期葡萄糖浓度控制在3 3 4g 儿以维持高丙酮酸对葡萄糖产率系数( o 7 1g g ) 。采用 奇异控制的葡萄糖流加方式，在7 l 发酵罐上控制不同发酵阶段葡萄糖浓度处于最佳 水平以强化光滑球拟酵母过程功能，丙酮酸产量( 8 3 1e d l ) 、产率( o 6 2 1g g ) 、生产强 度( 1 o o ( l h ) ) 与分批发酵对比，分别提高了2 1 3 、2 1 6 和2 9 9 ； 3zg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 0 1 9 分批发酵生产丙酮酸过程中，较高的发酵温度加速z g l a b r a t a 积累丙酮酸；而较低的温度则可减轻高浓度丙酮酸对细胞生长和产酸的抑 制，提高细胞后续产酸能力。运用考虑产物抑制的l o g i s t i c 方程等对发酵过程进行模 拟，得到不同温度下发酵动力学参数，然后运用不同的方程对动力学参数进行拟合， 进而得到丙酮酸分批发酵的最佳温度控制策略：在发酵初始阶段( o 8h ) 发酵温度控制 在3 4o c 以维持较高的菌体生长速率和丙酮酸合成速率；发酵中期( 9 4 2h ) ，逐步将 发酵温度降到2 7 0 c 以获得代谢流强化和细胞衰亡之间的最佳平衡；然后维持2 7o c 至发酵结束。采用这一最佳温度控制轨迹，最终发酵周期缩短1 2h ，丙酮酸产量( 8 0 4 g l ) 、对葡萄糖产率( o 7 0g 儋) 和生产强度( 1 3 2 皿l h ) ) 则分别提高了1 2 9 、6 9 和 3 2 8 ，而发酵副产物甘油和洳酮戊二酸产量则比3 0o c 恒温发酵分别下降了5 9 2 江南大学硕士学位论文 和4 4 7 。 关键词：丙酮酸，光滑球拟酵母，动力学模型，过程功能，强化策略。 a b s t r a c t a b s t r a c t i no r d e rt og e tah i g hy i e l d ，h i g hc o n c e n t r a t i o na n dh i g hp r o d u c t i v i t yo ff i n ec h e m i c a l s p r o d u c t i o n ，t h ep h y s i o l o g i c a la n dp r o c e s sp e r f o r m a n c eo ft h em i c r o o r g a n i s m sm u s tb e i n v e s t i g a t e dt oi m p r o v et h ee f f i c i e n c yo ft h ea i mm e t a b o l i t e sp r o d u c t i o n t h i st h e s i sc h o s e t o r u l o p s i sg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 019 ，am u l t i v i t a m i na u x o t r o p h i ca n do v e r - p r o d u c t i o n p y r u v a t ey e a s t ，a sam o d e ls y s t e m ，t od e v e l o pt h en o v e la n df e a s i b l es t r a t e g i e st oe n h a n c e p y r u v a t ep r o d u c t i o n i nt h i st h e s i s , t h ee f f e c t so fe n v i r o n m e n t a la n dn u t f i t i o n a lc o n d i t i o n so n t h ep y r u v a t ep r o d u c t i o nw e r ec a r e f u l l yi n v e s t i g a t e d t h em a i nr e s u l t so ft h i st h e s i sw e r e d e s c r i b e da sf o l l o w i n g ： 1i tw a sf o u n dt h a tt h ec e a s eo fc e l lg r o w t ha n dp y r u v a t ep r o d u c t i o nw a sd u et ot h e d e f i c i e n c y o ft h el i m i t e ds u b s t r a t e ( v i t a m i n ) a n dt h ec e l ls p e c i f i cg r o w t hr a t e ( 肋w a sd e t e r m i n e db yt h e v i t a m i na v a i l a b i l i t yi nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h h i g hc e l lc o n c e n t r a t i o n ( 2 4 8e l ) w a s a c h i e v e da th i g h e r 雎nw i t i ll o wp y r u v a t ey i e l d ( o 4 8g g ) ，w h i l et h ep y r u v a t ec o n c e n t r a t i o n ( slg m ) w a sh i g ha tl o w e r 雎斌w i t hl o wc e l lc o n c e n t r a t i o n ( 1 7 6g l ) b a s e do nt h ea n a l y s i s o fc e l lp h y s i o l o g i c a ls t a t e sa td i f f e r e n tv a l u e so f s e t , an o v e la n ds i m p l e a 吼c o n t r o l l i n g s t r a t e g y ，i nw h i c ht h ev a l u e0 f 风e tw a ss h i f t e df r o m0 0 5t o0 0 2a t3 4ha n dt h e nt o0 0 1h - 1a t 6 4h ，w a sp r o p o s e dt h r o u g hav i t a m i na s s i g n i n gs t r a t e g y b yu s i n gt h i ss t r a t e g y ，ah i g h p y r u v a t ec o n c e n t r a t i o n ( 9 1 2g 几) a n dy i e l d ( o 7 5g g ) w e r ea c h i e v e d ，h i g h e r3 4 5 a n d 2 2 9 t h a nt h ec o r r e s p o n d i n gv a l u e so ft h eo p t i m a lb a t c hf e r m e n t a t i o n ，r e s p e c t i v e l y 2t h eb a t c hc u l t i v a t i o np r o c e s s e so fz g l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 0 19f o rp y r u v a t ep r o d u c t i o n u n d e rd i v e r s ei n i t i a lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e d i tw a sc o n c l u d e dt h a th i g h c o n c e n t r a t i o n ，h i g hy i e l da n dh i g hp r o d u c t i v i t yo fb o t hy e a s tc e l la n dp y r u v a t ec o u l dn o tb e c o n s o l i d a t e di nab a t c hp r o c e s s h i g hg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nc o u l di n h i b i tc e l lg r o w t ha n d p y r u v a t ep r o d u c t i o n ，w h i l el o wg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nc o u l d n tp r o v i d es u f f i c i e n ts u b s t r a t ef o r p y r u v a t ep r o d u c t i o n w i lt h ea i mo fe n h a n c i n gt h ep y r u v a t ep r o d u c t i o nb yzg l a b r a t a ， f e d - b a t c hc u l t u r es h o u l db ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l t h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc u l t i v a t i o nm o d e s s u c ha sb a t c hf e e d i n g ，c o n s t a n t - r a t ef e e d i n ga n dc o n s t a n tg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nf e e d i n go n p y r u v a t ep r o d u c t i o nw e r ea l s os t u d i e d a saw h o l e ，f e d - b a t c hc u l t u r e 、i t hl o wg l u c o s e f e e d i n gr a t ea n d2 0 - 3 0g l 哲u c o s ec o n t r o l l e di nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hw a st h em o s ts u i t a b l e a p p r o a c ht oa t t a i nn o to n l yh i g hc o n c e n t r a t i o n sb u ta l s oh i g hy i e l d sa n dh i g hp r o d u c t i v i t i e so f y e a s tc e l la n dp y r u v a t ei nt h ec u l t i v a t i o no fzg l a b r a t ac c t c cm 2 0 2 0 1 9 f u r t h e r m o r e b a s e do nk i n e t i cm o d e la n a l y s i s ，af o u r - s t a g eg l u c o s e c o n t r o ls t r a t e g yw a sp r o p o s e d ah i g h c o n c e n t r a t i o n ( 8 3 1g l ) ，y i e l d ( 0 6 2 1g g ) a n dp r o d u c t i v i t y ( 1 0 0e d ( l - h ) ) o fp y r u v a t ew e r e a c h i e v e db ya p p l y i n gt h i ss t r a t e g y ，w h i c hw e r eh i g h e r2 1 3 ，2 1 6 a n d2 9 9 t h a nt h e c o r r e s p o n d i n gv a l u eo fb a t c hf e r m e n t a t i o n 3t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ，v a r i e df r o m2 6 。ct o3 4o c ，o np r o d u c t i o no fp y r u v a t ew a s i n v e s t i g a t e d am o d i f i e dl o g i s t i ce q u a t i o na n dl u e d e k i n g - p i r e te q u a t i o nw e r es u c c e s s f u l l y a p p l i e dt oe s t i m a t ek i n e t i c so fc e l lg r o w t ha n dp y r u v a t ep r o d u c t i o n t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e o nt h ee s t i m a t e dk i n e t i cp a r a m e t e r sw a sf u r t h e rs t u d i e db yr e g r e s s i o na n a l y s i s b a s e do n 江南大学硕士学位论文 k i n e t i cp a r a m e t e r sa n a l y s i s ，at e m p e r a t u r e s h i f t i n gs t r a t e g yw a sp r o p o s e d ，i nw h i c h ，a t0 - 8h ， c u l t u r ew a sp e r f o r m e da t3 4 。ct oo b t a i nah i 曲s p e c i f i cc e l lg r o w t hr a t e ，a n da t9 - 4 2h ，t h e t e m p e r a t u r ew a sd e c r e a s e ds t e pb ys t e pf r o m3 4o ct o2 7o ct ok e e pah i g hp y r u v a t e p r o d u c t i o nr a t e a f t e r4 2h ，t h et e m p e r a t u r ew a s m a i n t a i n e da t2 7 。ct ow e a k e ni n h i b i t i o no f p y r u v a t ea n do f f e rc o n s t a n tp r o d u c t i o nc a p a c i t yo fp y r u v a t ei nt h ea n a p h a s eo ff e r m e n t a t i o n a h i g l lc o n c e n t r a t i o n ( 8 0 4g l ) ，y i e l d ( o 7 0g g ) a n dp r o d u c t i v i t y ( 1 3 2g h ) ) o fp y r u v a t e w e r ea c h i e v e db ya p p l y i n gt h i ss t r a t e g y ，w h i c hw e r e12 9 、6 9 a n d3 2 8 h i g h e rt h a n b a t c hf e r m e n t a t i o n 谢mc o n s t a n tt e m p e r a t u r e3 0o c ，r e s p e c t i v e l y m e a n w h i l e ，t h ed i s t r i b u t i o n o fm e t a b o l i cf l u xw a sr e d i r e c t e df r o mb y p r o d u c ta c c u m u l a t i o nt op y r u v a t ep r o d u c t i o na n d t h ef i n a lg l y c e r o la n d0 【一k gc o n c e n t r a t i o n sw e r eo n l y2 10g la n d1 5 7g l ，w h i c hw e r e 5 9 2 a n d4 4 7 o f t h ec o r r e s p o n d i n gv a l u e so f3 0o cr e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：p y r u v a t e ，zg l a b r a t a ，p r o c e s sp e r f o r m a n c e ，k i n e t i c sm o d e l ，e n f o r c i n gs t r a t e g y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名： 日 期：细6 ，0 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 驽童查 导师签名：滥 日 期： 劬幺易0 埘6 第一章绪论 第一章绪论弟一早珀下匕 1 1 概述 化石原料( 如石油、煤炭) 等不可再生资源、能源的日渐枯竭以及环境污染的日益加 剧，已经严重地制约了经济的发展。现代经济的发展必须转向以生物可再生资源为原料， 环境友好、过程高效、可持续发展的新一代物质加工模式，走出一条低能源消耗、低污 染物排放、高效益的新型经济发展道路。即将崛起的以工业催化( 包括工业发酵) 为核心 的工业生物技术无疑是解决资源、能源及环境危机的有效手段l l j 。工业生物技术是指以 微生物或酶为催化剂进行物质转化，大规模地生产人类所需的化学品、医药、能源、材 料等产品的生物技术。它是人类由化石( 碳氢化合物) 经济向生物( 碳水化合物) 经济过渡 的必要工具，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段f 2 j 。 如何更好地利用( 微) 生物催化剂，以取之不尽、用之不竭的可再生生物质资源为原 料大规模生产人类所需的能源、化工、医药、食品及农用原材料，从而降低对石油的依 赖性，以源于生物质的己糖或戊糖为原料生产重要发酵产品的工业发酵，是工业生物技 术的核心研究领域之一【3 1 。而制约发酵产品工业化进程最关键的因素是具有重要工业应 用价值的微生物性能的充分开发以及微生物潜能有效发挥【4 l 。 微生物性能包括两个方面，一个是生理性能，一个是过程性能p l 。在微生物将生物 质转化为生物能源( 生物氢、生物乙醇、生物柴油等) 、重要的化工原料( 如乙烯、1 ，3 丙 二醇等) 或高分子聚合物等产品的过程中，基因工程技术的进步，为菌株改良和生理学 特性的认识提供了比传统诱变技术更为合理的手段【6 j 。基因工程所采取的主要手段是： ( 1 ) 阻断目标代谢产物的降解途型7 】；( 2 ) 强化目标代谢产物的生物合成途径【8 ，9 】；( 3 ) 解除 生物合成途径的代谢调节【1 0 1 。这些手段从基因组、蛋白组、转录组、代谢组等不同角度， 在分子、机器、细胞和生态系统等多个尺度上，多水平、多层次地认识和改造微生物的 生理性能，在提高目标代谢产物的产量、产率和生产强度方面已被证实是非常有效的 1 1 - t 3 】。然而，任何一项生物技术的研究成果要从实验室走向产业化，都需要上、中、下 游的密切配合【1 4 1 。国内外普遍存在的问题是：传统的发酵工程技术由于历史上作坊式生 产的影响而具有经验主义的特点，缺乏对发酵过程的微生物生理学本质认识【l5 】；以分子 生物学为主要研究手段的现代生物技术，虽然深入揭示了微生物的遗传机制和生理行 为，但难以顾及微生物生命活动过程所涉及的工程因素( 包括物理、化学和生物因素) 【1 6 1 7 l o 作为中游技术关键的微生物的过程功能的强化手段，不仅关系到能否发挥菌种的最 大生产性能，而且会影响下游处理的难易程度，因而在整个生物产品的研发过程中具有 特别重要的作用。作为利用微生物生产代谢产物的工程技术，研究对象微生物的复杂性 和生产过程的工程技术特点，决定了深入研究发酵工程技术既需要系统的生物学基础理 论知识，又需要很强的工程技术素养。因此，研究获得高产量( 便于下游处理) 、高底物 转化率( 降低原料成本) 和高生产强度( 缩短发酵周期) 的相对统一的发酵过程优化理论， 并成功地应用于工业实践，是国内外发酵工程领域的关键技术问题【l 引。 上述问题的实质在于：除了采用代谢工程手段提高微生物的生理功能外，还应当在 江南大学硕士学位论文 对微生物生理特性进行准确分析的基础上，重视微生物过程功能的强化研究。而根据不 同发酵阶段微生物对环境适应能力的差异而调控适宜的营养和环境条件，是强化微生物 细胞过程功能的关键途径之一。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 基于微生物反应原理的过程功能强化技术 培养环境优化技术的基本思想是基于微生物反应原理( 包括底物的运输、胞内生化 反应和产物的排出过程) ，研究微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过 代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而 优化微生物生长的物理和化学环境，保证微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步 的发酵过程优化奠定基础。包括： 培养基组成的优化技术。微生物培养基是一个非常复杂的体系。针对不同的产品， 筛选出营养要求简单的微生物菌株，尽可能地简化培养基的组成【1 9 】；然后利用单因素试 验方法，确定培养基组分中对发酵水平影响最大的关键因素【2 0 】；再综合运用响应面分析、 正交试验等研究手段，结合化学计量关系，进一步优化这些物质在培养基中的水平【2 1 1 。 根据这一思路，研究一些关键物质，如碳、氮源的种类、维生素在不同产品发酵中的重 要作用。并对这些关键物质的浓度及其供给方式进行优化，或使目标产物产量明显提高； 或减少了副产物的形成，使底物转化率明显提高；或可确定培养基组分的最小用量，避 免底物的过量或不足。 发酵环境条件的优化技术。应用已优化的培养基，研究不同环境条件( 包括温度、 p h 值【2 2 1 、搅拌( 剪切) 速掣2 3 1 和供氧【2 4 1 ) 对不同菌株发酵生产目标代谢产物的影响，包括 对细胞生长和代谢产物分布的影响。结合微生物反应原理，分析了不同环境条件下不同 发酵过程响应情况的生理学本质，在此基础上确定出以高产量、高转化率和高生产强度 为综合目标的优化环境条件组合。 1 2 2 基于微生物代谢特性分阶段培养的过程功能强化技术 对分批发酵过程的研究发现，适合微生物生长的温度、p h 值、剪切和溶解氧浓度往 往并不一定适合目标产物的形成，反之亦然。通过分析不同温度、不同p h 值、不同搅 拌转速( 剪切) 和不同溶解氧浓度下目标代谢产物的动力学参数( 包括比生长速率、比底物 的消耗速率和比产物形成速率) 及流变学参数的变化特性，提出分阶段溶解氧和搅拌转 速控制策略、分阶段温度控制策略及分阶段p h 值控制策略，将环境条件控制在最适合细 胞生长或最适合产物合成的水平瞰】。 研究表明，在保证产品质量( 如透明质酸和生物絮凝剂的分子量) 的前提下，应用这 些控制策略可有效提高目标产物的产量、转化率和生产强度。此外，利用两级连续培养 系统生产聚羟基烷酸酯( 细胞在第一级反应器中生长，在第二级反应器中大量积累产 物) 2 5 l ；或分阶段控制比生长速率以达到面包酵母高产率和高发酵活力的统一，表明利 用分阶段培养技术还可以将细胞长期和产物形成期人为分开【2 6 1 ，从而实现优化发酵过程 的目的。 2 第一章绪论 1 2 3 基于反应动力学模型的发酵过程功能强化技术 研究不同目标代谢产物发酵过程的反应动力学，应用统计热力学理论和功能单元扩 展理论，建立目标代谢产物分批发酵过程的动力学模型，用龙格库特法求取模型方程数 值解，然后用单纯形搜索法或最速下降法寻出动力学模型方程中的最优参数，并对动力 学模型的适用性进行评价【2 7 2 引。基于分批发酵动力学模型，包括： 采用奇异优化理论，对反应过程中的底物供给方式进行优化，例j t e l ：对透明质酸 的流加培养优化过程的优化中，高海军等通过重复操作和优化补料组合发酵模式，显著 提高透明质酸的生产强度【2 9 】； 应用最小值原理，对发酵过程中的营养物质供给方式进行优化，例如：堵国成等 分别建立真氧产碱杆菌细胞生长期和聚羟基丁酸合成期底物流加的准优化控制策略，确 定以指数速率流加和变速流加相结合的流加操作方式，得到以聚羟基丁酸最大生产强度 和最高转化率为目标的准优化控制策略并成功应用【3 0 1 ； 在无反馈控制的情况下，李寅等比较了不同流加培养模式对重组大肠杆菌生产谷 胱甘肽的影响，发现采用简单的指数速率流加方式即可实现重组大肠杆菌的高密度培养 1 3 1 o 1 2 4 基于代谢通量分析( m l r a ) 的发酵过程功能强化技术 参考已知的生化反应计量关系和特定微生物的代谢途径和生理代谢特征，构建生物 合成特定目标代谢产物的代谢网络。利用代谢通量分析方法，对代谢中间产物进行拟稳 态假设，然后通过测定细胞和代谢产物浓度的变化速率，计算得出胞内各条代谢途径的 通量变化。已有研究证实：根据代谢通量分析的计算数据，分析特定目标代谢产物，如 丙酮酸、透明质酸和生物絮凝剂生物合成途径中主要代谢节点的性质( 刚性、弱刚性或 弹性) ，结合发酵过程中胞内a t p 和n a d p h 的供求情况，可以得到一系列发酵优化策略， 如： 高海军等通过增大细胞合成通量并降低n a d h 库浓度，以提高透明质酸的产量 1 2 9 何宁等通过发酵前期适当增加a t p 通量，而发酵中后期降低n a d h 浓度，并控 制较低的a t p 通量以促进生物絮凝剂的合成【3 刁； 卫功元等通过) b ) j l l l 半胱氨酸，通过缓解胞内对l _ 半胱氨酸、促进碳流合成更多 n a d h 和f a d h 、改变发酵体系已有的氧化还原环境，提高谷胱甘肽的产量【2 6 1 。 在不改变菌种遗传特性的基础上，应用以上基于代谢通量分析的发酵优化策略，可 使代谢流量更多( 或更快) 地转向目标代谢产物。 1 2 5 基于系统观点的生物反应过程功能强化技术 生物反应系统优化的基本思想是将生物反应视为一个系统，从优化系统内部各要素 的功能和相互间的关系、系统与环境的关系入手，对所构建的系统采用定性或定量的模 型优化技术，使系统的结构、性能和状态达到最优。主要包括： 从外部系统构建方面，堵国成等曾经成功构建了有机废水( 物) 酸化和聚羟基烷酸 酯( p h a s ) 发酵生产的耦合系统。由于p h a s 工业化所面临的主要问题是原料成本过高， 3 江南大学硕士学位论文 导致其与化工合成的塑料难以竞争。另一方面，真养产碱杆菌能够利用有机酸生产 p h a s ，因此构建该系统的基本思想是利用厌氧微生物将有机废水( 物) 酸化，然后以酸化 产物为原料由真养产碱杆菌发酵生产具有不同结构的p h a s 【3 3 1 。 从内部系统构建方面，李寅等通过构建a t p 再生系统生物合成谷胱甘肽，利用 重组大肠杆菌中的g s h 生物合成活性合成g s h ，而面包酵母则具有再生a t p 的能力以为 大肠杆菌中的g s h 生物合成提供能量【3 4 1 。 1 2 6 基于辅因子工程的生物反应过程功能强化技术 辅因子工程是采用分子生物学的手段，改造细胞内辅因子的再生途径，改变微生物 细胞内辅因子的形式和浓度，定向改变和优化微生物细胞代谢功能，实现细胞代谢流最 大化、快速化地导向目标代谢产物的合成【3 5 1 。辅因子工程所涉及到的辅因子有： a t p 几p 址佃、n a d h n a d + 、n a d p h n a d p + 、乙酰辅酶a 及其衍生物、维生素和微 量元素掣4 】。在乳酸乳球菌中，过量表达n a d h 氧化酶，使活性提高1 5 0 倍，改变乳酸乳 球菌胞内n a d h + n a d 比率，使重组菌迅速转入混合酸发酵，而且这种转换程度直接取 决于n a d h 氧化酶的表达水平。对于n a d p h n a d p 十系统来说，在s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e 中过量表达包含n a d p + 依赖的3 磷酸甘油醛脱氢酶m a d p + 一g a p d h ) 基因的 g d p i 基因，突变株能以很高的速率和产率利用d 木糖合成乙到3 6 1 。美国r i c e 大学s a nk y 研究小组采用过量表达泛酸激酶同时在培养基中添加一定浓度的泛酸，导致突变株内 c o a 水平增加，使得代谢流转向合成乙酸异戊酯，从而促进了乙酸异戊酯产量和产率的 提高 3 7 1 。 综上所述，发酵过程功能强化策略的研究一直受到国内外发酵工程学者和工程师的 重视。国外学术界的研究可分为两类，一类是专门研究模式微生物( 如大肠杆菌、酿酒 酵母、黑曲霉、枯草芽孢杆菌) 的培养和代谢过程模型化，对这些微生物合成什么产物 并不关心；另一类是研究特定代谢产物生产过程的优化问题，但一般使用不具有工业化 价值的微生物，或者不发表具有工业化价值的数据；国外工业界的研究主要取决于特定 公司的目标产物及其相关的微生物，由于商业竞争等原因，虽然个案可以研究非常深入， 但共性技术和规律性方法的研究、总结、提炼和借鉴相当缺乏。国内学术期刊从2 0 世纪 9 0 年代之后也开始出现发酵过程优化的报道，但主要集中在确定适宜的培养基和发酵条 件上，关于发酵过程定量化、模型化和最优化的研究报道很少，特别是没有系统总结过 发酵过程优化的一般原理；国内发酵工业部门由于缺乏系统的生物学基础理论知识和工 程技术力量，难以独立开发适宜的发酵过程功能强化策略的研究。 因此，选择发酵工业中具有代表性的微生物，综合运用微生物反应计量学、生化反 应和传递动力学、生物反应器工程以及代谢工程理论，从整体系统和特定过程的观点出 发，通过对发酵系统内部的动态过程进行数量化分析并且构建数学模型，特别是针对发 酵过程中微生物表现出的特殊生理状态，开发以发现实现细胞代谢流最大化、快速化地 导向目标代谢产物的发酵过程强化策略，最终发展出发酵过程优化的新理论和新技术， 具有一定的科学研究意义和实际应用价值。 4 第一章绪论 1 3 本论文主要研究内容 1 3 1t o r u l o p s i sg l a b r a t a 发酵生产丙酮酸的研究进展 丙酮酸( p y r u v i ca c i d ) ，又称2 一氧代丙酸( 2 一o x o p r o p a n o i ca c i d ) 、酮基丙酸 做k e t o p r o p i o n i ca c i d ) 或乙酰基甲酸( a c e t y l f o r m i ca c i d ) ，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香 气和愉快酸味，是最重要的0 c 氧代羧酸之一【3 8 1 。作为大宗化学品绿色生产生物炼制的重 要组成部分之一，丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用 化合物的前体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途p 引。 随着丙酮酸应用范围的不断扩大，丙酮酸的市场需求也在不断的增长。比较丙酮酸 的各种生产方法可以发现，生物技术法生产丙酮酸无疑是扩大丙酮酸应用领域的根本途 型2 1 。用生物技术法生产丙酮酸的方法包括发酵法和酶法。发酵法是生物技术法生产丙 酮酸中开展得最早的、也是研究得最多最深入的生产方法m 】。但发酵法生产丙酮酸的问 题是转化率比较低，这是因为丙酮酸作为糖酵解途径的最终产物，处于代谢途径中的关 键代谢支点，在细胞中很容易代谢为其它产物，难以积累。只有切断或弱化丙酮酸的进 一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的【4 1 1 。 烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4 种维生素的营养缺陷型zg l a b r a t ac c t c c m 2 0 2 0 1 9 ，是发酵法生产丙酮酸的首选菌株【4 2 】。对于任何一种发酵产品，肯定存在影响 该物质高效生产的重要因素。如果从生理学角度研究这些因素对发酵过程的影响规律， 进而提出相应的控制方法或策略，可望实现产品的高产率、高产量和高生产强度的相对 统一。m i y a t a 等的研究重点在于选育丙酮酸的高产菌株，对如何发挥这些菌株高产丙酮 酸的潜力研究较少【4 3 1 。本研究室等采用发酵过程优化原理，对多重营养缺陷型菌株z g l a b r a t a 生产丙酮酸的发酵过程进行了大量优化研究工作。 1 3 1 1 基于代谢通量分析o v w a ) 优化zg l a b r a t a 生产丙酮酸的营养环境条件 李寅通过构建zg l a b r a t a w s h i p 3 0 3 菌株以葡萄糖为唯一碳源，以氯化铵为唯一氮 源发酵生产丙酮酸的代谢网络，应用代谢通量分析( m f a ) 方法，得到了不同初始维生素 浓度和不同相对溶氧水平下zg l a b r a t aw s h i p 3 0 3 菌株的胞内代谢通量分布。结合发酵 过程中胞内代谢通量分布的变化情况，提出一系列发酵优化策略，如：碳、氮源浓度 及其比例对zg l a b r a t a 生产丙酮酸有重要作用，控制培养基中合适的c n ( 2 5 ：1 ) 可提高 细胞生长、葡萄糖消耗和丙酮酸的积累速度及产量m 】；zg l a b r a t a d ? 负责丙酮酸降解 的酶( 系) 活性是受培养基中维生素的水平控制的，在培养基中吡哆醇、生物素和核黄素 的初始质量浓度分别为0 4m e e t , 、o 0 4m g l 和0 1m g l 的前提下，烟酸和硫胺素的初始 质量浓度分别为8m g c l 和0 0 1 5m g l 时，可以获得丙酮酸高产量、高产率与高生产强度 的相对统一【4 5 】；硫胺素质量浓度为0 0 1 5m g l 时，采取发酵0 , - - , 1 6h 控s u d o t 恒定在 8 5 、1 6h 后将d o t 降低至6 0 的分阶段d o t 控制策略，能够取得高产率( o 6 5m o l 丙酮 酸m o l 葡萄糖) 和高葡萄糖消耗速度( 1 8 0g ( l h ) ) 的相对统一【2 4 1 。 1 3 1 2 基于调控能量代谢提高光滑球拟酵母生产丙酮酸的速度 刘立明认为，微生物细胞对糖质底物( 以葡萄糖为例) 的代谢速度主要受细胞能荷的 控制【4 1 0 在zg l a b r a t a 中添加不同浓度电子传递链抑制剂以研究胞内a t p 水平对酵解途径 5 江南大学硕士学位论文 的影响，发现：降低胞内a t p 含量能显著提高p f k 活性和葡萄糖消耗速度以及丙酮酸生 产速度，葡萄糖消耗速度的增加是糖酵解途径中关键酶p f k 活性矛i i p k 活性增加所导致的 【4 6 1 。基于此在对光滑球拟酵母能量代谢途径进行详细分析的基础上，利用诱变育种的方 法，采用：阻断电子传递链活性，添加外源电子受体乙醛将n a d h 氧化途径从产生大 量a t p 的氧化磷酸化途径转向无a t p 产生的乙醇发酵途径；降低f o f l a t p a s e 活性，将 a t p 产生途径从氧化磷酸化转向底物水平磷酸；提高乙醇脱氢酶活性，在低溶氧条件 下添加外源电子受体乙醛，提高n a d + 再生速度和胞内含量；低f o f l a t p a s e 酶活性和 低a t p 水平下提高己糖激酶的活性等策略加快了葡萄糖代谢速度，提高了丙酮酸生产强 度【4 7 ，4 8 1 。 1 3 1 4 基于辅因子手段实现丙酮酸代谢过程的“开关”控制 黄慧娟和刘立明认为，而微生物细胞内辅因子的形式和浓度是改变和优化微生物过 程功能的关键性因素【4 ，4 9 1 。而且对于依赖辅因子的代谢途径来说，辅因子的形式和浓度 是决定代谢流的流向和通量大小的关键性因素【3 5 5 0 l 。以光滑球拟酵母中丙酮酸和。【酮戊 二酸( a - k g ) 的代谢为研究模型，研究了辅因子( 维生素和金属离子) 浓度对碳代谢流的调 控。结果显示：增加培养基中维生素b ，浓度，选择性地打开丙酮酸脱氢酶系伊d h ) 途径， a - k g 产量为l o 3g l ，c p y r c k g 的值为3 9 ；增加维生素b i o 浓度，选择性地打开丙酮酸 羧化酶( p c ) 途径，a k g 产量为1 4g l ；同时增加培养基中维生素b l 和b i o 浓度，也即同时 打开p d h 和p c 途径，a - k g 产量可达n 2 0 8g , l 。在此基础上，以c a c 0 3 调节培养体系中 p h ，c a 2 坷迸一步提高p c 活性，此时t x - k g 移 累量达至j j 4 3 7g l ，丙酮酸浓度则下降至l j 2 1 8 g l 。 1 3 2zg l a b r a t a 发酵生产丙酮酸存在的问题 在利用微生物细胞过量合成生物基化学品的过程中，需要考虑的问题是：如何优化 或强化微生物细胞代谢和过程功能，以提高目标代谢产物的生产效率。基因工程技术的 进步，为强化微生物代谢功能提供了更为合理、高效的手段。 作者认为，对于任何一种目标代谢产物，要获得高产量、高产率和高生产强度的统 一。除了采用代谢工程手段提高微生物的生理功能外，还应当在对微生物生理特性进行 准确分析的基础上，重视微生物过程功能的强化研究。而根据不同发酵阶段微生物对环 境适应能力的差异而调控适宜的营养和环境条件，是强化微生物细胞过程功能的关键途 径之一。尽管针对zg l a b r a t a 的多重维生素营养缺陷型菌株发酵生产丙酮酸已进行了长 期的研究，但在zg l a b r a t a 过程功能的强化策略上，还存在以下问题： 问题之一： 在过去1 0 年中，作者所在的研究室对一株自行选育的zg l a b r a t a 的四重维生素( 硫 胺素、生物素、吡哆醇和烟酸) 营养缺陷型菌株c c t c cm 2 0 2 0 1 9 ( 保存在中国典型培养 物保藏中心，武汉) 发酵生产丙酮酸进行了系统、深入的研究。由于这四种维生素分别 是细胞中负责丙酮酸降解主要途径的丙酮酸脱氢酶系( 烟酸和硫胺素) 、丙酮酸脱羧酶( 硫 胺素) 、丙酮酸羧化酶( 生物素) 和转氨酶( 吡哆醇) 的辅因子，将培养基中