（发酵工程专业论文）rhodococcus+spy104产几丁质脱乙酰酶的分离纯化(1).pdf

心 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h e a p p l i c a t i o n o f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc h i t i n d e a c e t y l a s ef r o mr h o d o c o c c u ss p c a n d i d a t e ：y u e h o n g x i a s p e c i a l t y ： f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r l i uj i a n j a n s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 35 6m 4mmmi 71洲y 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 五跫窿 导师签名： 山东轻t 业学院硕j ：学位论文 目 摘 目录 a b s t 】i l a c t i 。 第1 章绪论1 1 1 几丁质、壳聚糖概述1 1 1 1 几丁质2 1 1 2 以几丁质制备壳聚糖2 1 1 3 壳聚糖的性质及应用3 1 2 几丁质脱乙酰酶的研究概况4 1 2 1 产c d a 微生物。4 1 2 2c d a 分子生物学研究现状5 1 2 3c d a 性质6 1 2 4c d a 酶促反应的作用机理8 1 2 5c d a 酶活的测定方法8 1 3c d a 分离纯化的研究现状1 0 1 4c d a 的应用前景10 1 4 1 制备壳聚糖1 0 1 4 2 生产特定的壳聚寡糖1 l 1 5 本课题的立题背景及研究意义1 1 1 6 本课题的主要研究内容1 2 第2 章菌种的分离纯化及发酵条件优化1 3 2 1 引言。1 3 2 2 材料与方法1 3 2 2 1 实验菌种。1 3 2 2 2 实验试剂。13 目录 2 2 3 实验仪器1 4 2 2 4 培养基l5 2 2 5 试剂的配制1 5 2 2 6c d a 酶活的测定方法1 6 2 2 7 菌种分离纯化1 7 2 2 8 发酵条件的优化1 7 2 3 结果与讨论1 7 2 3 1 菌株初筛、复筛结果1 7 2 3 2 碳源对菌株y 1 0 4 产酶的影响1 8 2 3 3 氮源对菌株y 1 0 4 产酶的影响2 0 2 3 4 无机盐对菌株y 1 0 4 产酶的影响2 2 2 3 5 乙酸盐对菌株y 1 0 4 产酶的影响2 3 2 3 6 正交实验确定发酵培养基2 4 2 3 7 菌株y 1 0 4 产酶条件的优化2 6 2 3 8 条件优化后菌株y 10 4 发酵进程3 0 2 4 本章小结3 0 第3 章储存条件对c d a 活力的影响3 1 3 1 引言3l 3 2 材料与方法31 3 2 1 实验菌种3 l 3 2 2 实验试剂3l 3 2 3 实验仪器31 3 2 4 培养基31 3 2 5 培养方法31 3 2 6c d a 酶活分析方法。31 3 2 7 储存方法3l 3 3 结果与分析3 2 3 3 1 发酵培养基对酶储存稳定性的影响3 2 3 3 2 酶底物对酶储存稳定性的影响3 3 3 3 3 金属离子对酶储存稳定性的影响3 3 3 3 4 缓冲液p h 对酶稳定性的影响3 4 2 山东轻工业学院硕士学位论文 3 3 5 储存方式对酶稳定性的影响3 5 3 4 本章小结3 6 第4 章c d a 粗酶液的制备一细胞破碎3 7 4 1 引言3 7 4 2 材料与方法3 7 4 2 1 实验试剂3 7 4 2 2 实验仪器3 7 4 2 3c d a 酶活分析方法3 7 4 2 4 细胞培养方法及菌体制备一3 7 4 2 5 细胞破碎方法3 7 4 3 结果与分析3 9 4 3 1c d a 存在位置的确定一3 9 4 3 2 超声波法处理结果4 0 4 3 3 溶菌酶破壁效果的研究4 1 4 3 4 反复冻融法处理结果4 2 4 3 5 玻璃匀浆器处理细胞对酶活的影响一4 2 4 3 6 反复冻融与匀浆法联合处理4 3 4 3 7 破碎条件对酶活的影响一4 3 4 4 本章小结4 6 第5 章几丁质脱乙酰酶的分离纯化4 7 5 1 引言4 7 5 2 材料与方法4 7 5 2 1 实验试剂及配制4 7 5 2 2 实验仪器4 8 5 2 3c d a 酶液的制备4 9 5 2 4b r a d f o r d 法测定蛋白质的含量4 9 5 2 5c d a 硫酸铵盐析5 0 5 2 6s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤层析5 1 5 2 7s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析5 2 5 2 8 分离纯化结果分析5 2 5 2 9s d s p a g e 法测定c d a 的分子量5 3 3 目录 5 3 结果与分析5 4 5 3 1 硫酸铵盐析5 4 5 3 2s e p h a d e xg 2 5 凝胶过滤层析。5 5 5 3 3s e p h a d e xg 7 5 凝胶过滤层析5 5 5 3 4c d a 纯化结果5 6 5 3 5c d a 分子量的测定及纯度分析5 7 5 4 小结5 9 第6 章结论与展望61 6 1 结论6 1 - 6 2 展望6 l 参考文献6 3 6 7 6 9 山东轻工业学院硕上学位论文 摘要 几丁质脱乙酰酶( c h i t i nd e a c e t y l a s e ，简称c d a ，e c 3 2 1 4 1 ) 是一种可以脱除 几丁质链上的乙酰基生成壳聚糖的酶，用几丁质脱乙酰酶酶解工艺生产壳聚糖与 热碱化学法相比，具有诸多优点，如可以选择性的生产特定壳聚糖，生产过程 环境友好等，几丁质降解酶类的研究与开发已成为人们关注的焦点。本文主 要研究红球菌菌株产c d a 的最优培养基及培养条件，并确定c d a 储存稳定 性影响因素及c d a 分离纯化工艺过程。 以实验室保藏几丁质脱乙酰酶产生菌r h o d o c o c c u ss p 为研究对象，对其产酶 培养基及培养条件进行优化。研究确定了最佳产酶培养基组分( g l ) ：蔗糖1 2 5 、 鱼粉蛋白胨1 2 5 、乙酸钠2 o 、磷酸二氢钾1 5 、氯化铵1 o 、玉米浆0 5 ；最佳发 酵条件为：种子液种龄2 0 h ，初始p h 7 5 ，发酵温度3 0 c ，摇床转速1 8 0 r m i n ， 装液量3 0 m l 2 5 0 m l ，接种量4 m l 3 0 m l 。在最佳发酵培养基及发酵条件下，菌 株最高酶活达5 11 9 1 0 u m l ，比优化前提高了1 3 8 倍。 研究发现菌株y 1 0 4 所产c d a 储存稳定性差，发酵液在4 储存2 4 小时酶 活损失近5 0 。通过考察发酵液的预处理方式、储存方式及稳定性影响因素，最 终确定其最佳预处理过程及储存条件为：发酵液离心，收集菌体，制成干菌体， 储存稳定为2 0 ，预处理后的菌体储存两个月后，酶活损失率仅为0 9 8 ，显著 提高了该酶的储存稳定性。 鉴于菌株y 1 0 4 所产c d a 为胞内酶，本文重点考察几种细胞破碎方法对c d a 酶活的影响，确定合理的细胞破碎方法和预处理方案：发酵液离心，菌体用缓冲 液洗涤三次，用p h 8 0 i r i s h c l 缓冲液悬浮制成菌悬液，菌悬液经反复冻融后用 玻璃匀浆器处理，每次处理6 m i n ，重复5 次，离心收集上清液即得粗酶液，上清 液酶活回收率可达总酶活的4 0 。 获得的粗酶液经硫酸铵盐析、 s 印h a d e xg 2 5 凝胶层析、s e p h a d e xg 7 5 凝 胶层析等分离纯化步骤，得到c d a 组分比酶活为1 9 3 3 8 2 u m g ，酶活回收率为 3 3 9 4 ，纯化倍数为4 4 4 ，经s d s p a g e 检测该酶为单一条带，相对分子量约为 5 8 4 k d a 。 关键词：几丁质脱乙酰酶( c d a ) ；优化；细胞破碎；分离纯化 山东轻工业学院硕十学位论文 a b s t r a c t c h i t i nd e a c e t y l a s e ( c d a ，e c 3 2 1 4 1 ) i sa l le n z y m et h a tc a t a l y z e st h eh y d r o l y s i s o fa c e t a m i n eg r o u p so fn a c e t y l - d g l u c o s a m i n ei nc h i t i n ，c o n v e f i n gi tt oc h i t o s a n c h i t i nd e a c e t y l a s ep r o d u c t i n gc h i t o s a nf r o mc h i t i nd o n tp o l l u t et h ee n v i r o n m e n t ，a n d p r o d u c tt h es p e c i f i cc h i t o s a n ，a n ds oo n t h er e s e a r c ho fc d aa r o u s e dm u c h i n t e r e s t i n g w er e s e a r c h e dt h ec d af r o mr h o d o c o c c u ss p ，o p t i m i z e dt h ef e r m e n t a t i o n m e d i u ma n dp u r i f i e dt h ec d ai nt h ep a p e r t h es t r a i nr h o d o c o c c u ss p w a ss e l e c t e df r o mt h es o i l ，w h i c hw a sp r e s e r v e di n o u rl a b o r a t o r y i no r d e rt oe n h a n c et h el e v e lo fc d a a c t i v i t y ，t h ec u l t u r em e d i u ma n d t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fc d a p r o d u c t i o nb yr h o d o c o c c u ss p w e r eo p t i m i z e d t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u mf o re n z y m ep r o d u c t i o nw a sa sf o l l o w s ( l ) ：c o mp u l p 1 2 5 ，s u c r o s e1 2 5 ，s o d i u ma c e t a t e2 0 ，k h 2 p 0 41 0 ，a m m o n i u mc h l o r i d e1 0 ，p e p t o n e 0 5 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rc d a p r o d u c t i o nw a sa sf o l l o w s ：s e e da g e 2 0 h ，i n i t i a lp h7 5 ，t e m p e r a t u r e3 0 c ，r o t a t i o ns p e e do fr o c k i n gb e d18 0 r m i n ，v o l u m e i ns h a k ef l a s k3 0 m l 2 5 0 m l ，t h eq u a n t i t yo fi n o c u l a t i o n4 m l 3 0 m l t h ee n z y m e a c t i v i t yw a s5 119 10 u m lw i t ht h eo p t i m a lc u l t u r em e d i u ma n do p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，w i t he n z y m ea c t i v i t ye n h a n c e db y1 38t i m e s w ef o u n dt h a tt h ec d a a c t i v i t yi nf e r m e n t a t i o nl o s ts e v e r e l yb yt h ee x p e r i m e n t a l r e s u l t s t h ec d a a c t i v i t yl o s ta b o u th a l fa f t e r2 4 h s oi tw a si m p o r t a n tt of i n dt h eb e s t s t o r a g ec o n d i t i o n b yi n v e s t i g a t i n ge n z y m es t o r a g em e t h o d sa n di t si n f l u e n c ef a c t o r s ， w ed e t e r m i n e dt h eo p t i m a ls t o r a g ec o n d i t i o n s ：c o l l e c t e dt h ec e l la f t e rc e n t r i f u g et h e f e r m e n t a t i o nl i q u i d ，m a d et h ed r yc e l la n ds t o r e di n 一2 0 c a f t e rt w om o u n t h s ，e n z y m e a c t i v i t yl o s sw a so n l y0 9 8 t h ep r o b l e mo fe n z y m ei n a c t i v a t i o nw a ss o l v e db a s i c a l l y w h i c hp r o v i d e dt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e ra n a l y s i so ft h ec h i t i nd e a c e t y l a s e b e c a u s et h ec d af r o ms t r a i ny10 4w a st h ei n t r a c e l l u l a re n z y m e ，t h ee n z y m e s h o u l dr e l e a s et h ec e l lo u t s i d ef i r s t l yb yc e l ld i s r u p t i o n t h e n ，c o m p a r e ds e v e r a l c o m m o n l ym e t h o d so fc e l ld i s r u p t i o n ，t h eo p t i m a lm e t h o dt oe x t r a c tc d aw a sa s f o l l o w s ：f e r m e n t i n gl i q u o rw a sw a s h e dt h r e et i m e s ，a n dt h et h a l l u sw a ss u s p e n d e dw i t h p h 8 0t r i s - h c lb u f f e r t h es o l u t i o nw a sr e p e a t e df r e e z e da n dt h e nt r e a t e d6r a i nb y g l a s sh o m o g e n i z e r f i n a l l yt h es u p e m a t a n tw a so b t a i n e db yc e n t r i f u g e t h er e c o v e r yo f l a c t o p e r o x i d a s ea c t i v i t yw a s4 0 s e p a r a t i o np u r i f i c a t i o no ft h ec h i t i nd e a c e t y l a s ea f t e r c e l ld i s r u p t i o nw a sb y a b s t r a c t a m m o m u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o n ，b a gf i l t e r d e s a l t i n g ，s e p h a d e xg 一2 5g e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ，s e p h a d e xg - 7 5g e lf i l t r a t i o nc h r o m m o g r a p h y ，t h ea c t i v i t yr e c o v e r y a n dp u r i f i c a t i o nf a c t o ro ft h ef i b r i n o l y t i ce n z y m ew e r e3 3 9 4 a n d4 4 4 ；t h ep u r e e n z y m ew a ss i n g l es t r a pv e r i f i c a t i o nb ys d s p a g ei d e n t i f i c a t i o na n dt h er e l a t i v e m o l e c u l a rw e i g h tw a s5 8 4k d a k e y w o r d s ：c h i t i nd e a c e t y l a s e ，o p t i m i z a t i o n ，c e l ld i s r u p t i o n ，s e p a r a t i o np u r i f i c a t i o n i l 龟 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 几丁质、壳聚糖概述 第1 章绪论 n 乙酰葡萄糖胺( g l c n a c ) 通过1 3 1 ，4 糖苷键相互连接成几丁质链，有些 g l c n a c 单体经脱乙酰基反应后成为氨基葡萄糖( g l c n ) 残基，因此总链中既含 有n 乙酰葡萄糖胺单体又含有氨基葡萄糖单体，通常根据总链中氨基葡萄糖 的含量定义几丁质与壳聚糖，一般将n 乙酰葡萄糖胺含量大于5 5 的称为几 丁质，反之称为壳聚糖【1 1 ，其分子结构【2 1 见图1 1 。 图1 1 几丁质、壳聚糖的分子结构 在几丁质酶、几丁质脱乙酰酶等几种酶的作用下，几丁质可以转化成壳 聚糖、壳寡糖、葡萄糖胺等小分子物质【3 1 ，以便应用于各种领域，几种物质 的转化如图1 2 所示。 几丁质脱乙酰酶 几丁质 壳聚糖 ii l几丁质酶壳聚糖酶i 几丁质脱乙酰酶 l n：乙酰葡萄糖胺寡聚体一葡萄糖胺嘉体 li i n 乙酰胺书一葡萄糖胺酶 壳聚糖酶 l 丫 i 几丁质二糖 l 葡萄糖胺 l 几丁二糖酶 上 n ：乙酰葡萄糖胺 图1 2 几种物质的转化 第1 章绪论 1 1 1 几丁质 几丁质是在1 8 1 1 年由法国学者布拉克诺( b r a c o n n o ) 发现的，1 8 2 3 年欧吉尔 ( o d i e r ) 从甲壳动物外壳中提取，并命名为c h i t i n ，译为几丁质、甲壳质、甲壳 素。自然界中，几丁质主要存在于低等植物菌类、藻类的细胞、甲壳动物、 昆虫的外壳以及高等植物的细胞壁中，是自然界中最丰富的天然有机化合物 之一，是除纤维素以外的又一大类重要多糖【l 】。据估计，自然界中几丁质每 年生物合成的量多达1 0 0 0 亿吨。 几丁质的化学结构和植物纤维素非常相似，都是葡萄糖的多聚体，是纤 维素第二位上的羟基被酰胺基置换的产物【4 】。几丁质的基本单位是n 乙酰葡 萄糖胺，几丁质分子量可达1o o 万以上，大约由3 0 0 - 2 5 0 0 个单体通过d 1 ，4 糖苷键相互连接而成。 几丁质可以应用于工业、农业等领域中，例如在工业上可以用来做布料、 染料、纸材料及处理水等；在农业上可做杀虫剂、植物抗病毒剂等：渔业上 做养鱼饲料；医疗用品上可做隐形眼镜、人工皮肤、缝合线、人工透析膜和 人工血管等；还可以作为化妆品美容剂、毛发保护及保湿剂【5 】等。 几丁质是白色或灰白色、半透明、片状固体，不易分解，不易熔化，也 不溶于水、乙醇、乙醚、稀酸( 但能溶于醋酸) 、稀碱，可溶于无机酸，但同时 主链发生降解【6 】。其不溶性限制了应用范围，所以大多加工成壳聚糖使用。 1 1 2 以几丁质制备壳聚糖 几丁质脱乙酰基后生成的产物称为壳聚糖( c h i t o s a n ) ，又称脱乙酰甲壳质、 可溶性甲壳素、聚氨基葡萄糖，化学名称是聚( 1 ，4 苷) 2 胺基2 脱氧p d 葡 萄糖，是唯一的天然碱性多糖。以几丁质为原料制备壳聚糖，常见的方法有 热碱化学法和几丁质脱乙酰酶法。目前工业上主要用热碱化学法脱除几丁质 的乙酰基生产壳聚糖，该法需要大量的浓酸、浓碱处理几丁质，造成严重的 环境污染，关键是此法反应过程不易控制，由此产生的壳聚糖质量不稳定， 产品均一性不好【_ 7 1 ，无法应用于生物、医药等对壳聚糖质量有严格要求的领 域。 酶法制各壳聚糖是利用专一性酶对几丁质进行脱乙酰基反应，该法具有 条件温和、环境友好、质量稳定等特点。有一种酶可以将真菌细胞壁中新生 成的几丁质直接脱除乙酰基而生成壳聚糖，即为几丁质脱乙酰酶( c h i t i n d e a c e t y l a s e ，简称c d a ，e c 3 2 1 4 1 ) ，到目前为止，已发现许多微生物、真 菌中均存在几丁质脱乙酰酶。 用几丁质脱乙酰酶制备壳聚糖，可以有效地脱除几丁质分子中的乙酰基， 且不会把几丁质长链降解为小分子，也不会因排放废碱液造成严重的环境污 2 山东轻工业学院硕仁学位论文 染，且制备的壳聚糖物理化学性质能达到均一化，满足生物、医药等领域对 壳聚糖的要求。所以，利用几丁质脱乙酰酶制备壳聚糖具有相当的吸引力， 但c d a 的研究起步较晚，相关报道不多，工作难度较大，因此研究c d a 具有 非常重要的研究开发价值。 研究发现，几丁质脱乙酰酶可以与几丁质合成酶共同作用通过生物途径 合成壳聚糖。在一些真菌的细胞壁中发现含有壳聚糖，且其脱乙酰度及含量 均很高，所以可以通过微生物培养收集细胞壁中富含壳聚糖的菌体，然后通 过一定方法提取这些壳聚糖。如彳c o e r u l a e 中壳聚糖含量占细胞干重的1 0 4 ， 脱乙酰度高达9 5 咏引，可以直接发酵生产壳聚糖。 1 1 3 壳聚糖的性质及应用 壳聚糖是1 9 世纪初发现的，自发现后1 0 0 多年间其研究时断时续，直到2 0 世纪7 0 年代，在提倡资源再利用的形式下，才逐渐被人们所重视【9 】。2 0 世纪 8 0 年代以来，国内外对壳聚糖的研究日趋活跃，发现在医药、化工、环保、 食品等方面均有广阔的应用前景【l0 1 ，壳聚糖已被现代科学家称为继糖、蛋白 质、脂肪、维生素、矿物质等五大生命要素之后的第六生命要素】。 壳聚糖是白色或灰白色、略有珍珠光泽、半透明片状固体，不溶于水和 碱溶液，可溶于稀有机酸及部分无机酸，如盐酸等，但不溶于冷的稀硫酸、 稀硝酸、稀磷酸、草酸【1 2 】。 壳聚糖是线性高分子，具有成纤性，具有生物相溶性且无抗原性、生物 可降解性以及广谱抗菌性、防腐性、止血和促进伤口愈合等特殊功能【”】，因 而壳聚糖纤维在可吸收外科手术缝合线、人造皮肤( 无纺布) 、止血材料、伤口 包扎材料及抗菌织物等方面有广泛应用 1 4 , 1 5 , 1 6 】。 壳聚糖可制作超滤膜、反渗透膜、渗透蒸发和渗透汽化膜、渗析膜、气 体分离膜、固定化酶膜、离子交换膜、医学用膜等【1 7 】，这些膜已广泛应用于 工业用水、食品卫生、医药工业、石油化工以及环境保护等很多工业领域【1 8 】。 壳聚糖作为一种特殊的天然高分子化合物，对一些金属有螯合能力【”】， 形成的壳聚糖金属配合物可以作为催化剂，具有很好的稳定性、催化活性、 选择性和易从反应体系中分离等特点。 壳聚糖的氨基有较高的结合水中卤代物的能力，具有很好的吸附作用， 无毒且有抑菌、杀菌作用，是食品饮料工业和饮用水净化的理想吸附剂。由 于壳聚糖能溶于一些稀酸，所以常用交联剂把壳聚糖交联，得到对酸、碱、 有机溶剂都比较稳定的、可以再生的交联壳聚糖吸附剂。 近年来，研究还发现壳聚糖在处理工业废水中有很重要的作用。壳聚 糖大分子中有大量游离的n h 2 ，且n h 2 邻位是o h ，所以可通过氢键、离子 3 第l 章绪论 键等形成网状结构，从而金属离子具有稳定的配位作用。因此，壳聚糖可以 作为重金属离子的富集剂，可有效地除去工业废水中的有毒重金属离子。而 且壳聚糖可以完全被生物降解，不会造成环境污染。 壳聚糖的氨基对一些酶有较强的吸附结合能力，可将酶液中的酶吸附， 过滤、洗涤后，得到固定化酶，此法不易破坏酶的活性中心和高级结构。若 用交联剂使酶与壳聚糖之间形成共价键结合，还可以提高酶的稳定性，改善 酶的易变性、易失活等缺点。 壳聚糖在医药领域的应用也较为广泛：降低血胆固醇、用作抗凝血剂、 提高多肽药物的生物利用度。壳聚糖还可用于降脂、降压类保健品，还可以 减少成纤维细胞的生长，减少瘢痕形成，促进内皮细胞、毛细血管、心肌细 胞及神经轴突的再生等多个方面【i4 1 。 1 2 几丁质脱乙酰酶的研究概况 1 2 1 产c d a 微生物 c d a 产生菌可以以几丁质为唯一碳源、氮源生长，其共同特征是能分泌 c d a 并在这种酶的作用下将几丁质分子中的乙酰基脱除产生壳聚糖。最早发 现产c d a 微生物是在2 0 世纪7 0 年代初期，之后陆续在许多生物体中发现了该 酶，包括真菌、细菌、多种昆虫等。 a r a k i t 2 0 】等于1 9 7 3 年从m u c o rr o u x i i ( 接合菌纲的双相型真菌) 中发现了 c d a ，这是关于微生物产c d a 的最早报道，主要研究了几丁质脱乙酰酶的相 关性质。 1 9 7 4 年，y a r a k i 2 1 】等在mr o u x i i 发酵液上清组分中测出c d a 酶活，通过 d e a e 纤维素柱分离纯化c d a ，纯化倍数为1 4 0 倍，并研究了c 0 2 + 、m n 2 + 、z n 2 + 等金属离子对该酶活力的影响。 1 9 9 5 年，i t s i g o s 等【2 2 1 叭c o l l e t o t r i c h u ml i n d e m u t h i a n u m ( 植物病原菌) 中分 离纯化得到c d a ，发现该酶为糖蛋白，测得分子量约为1 5 0 k d a 。并发现该酶 在几丁质及几丁质衍生物存在时保持较高活性，酶反应的最适温度为5 0 ， 最佳p h 为8 0 ，且其活力不受乙酸抑制，这使c d a 在工业应用方面更具优势。 1 9 9 5 年，x i a o d o n gg a o 等 2 3 】发现蓝色犁头霉a b s i d i ac o e r u l e a 也产c d a ， 经硫酸铵沉淀、层析等分离纯化最终得到电泳纯，其分子量约为7 5 k d a ，通过 免疫电镜发现，几丁质脱乙酰酶可能存在于菌丝体细胞壁的内表面即周质空 间内。 除从以上微生物中发现c d a 夕f ，a l f o n s oc 等【2 4 1 于1 9 9 5 年在构巢曲霉 a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 中得到一种具有热稳定性的c d a ，该酶为胞外酶，其最佳 4 山东轻t 业学院硕士学位论文 反应温度为5 0 。该酶参与菌体的自溶，也可以水解乙二醇几丁质、胶体几 丁质等物质上的乙酰基。 19 9 8 年，v a d a k er s r i n i v a s a n 等【2 5 1 从城市污水中分离出一株产c d a 的产 碱杆菌，这是关于细菌产c d a 的最早报道，该酶与真菌所产c d a 的特性很多 不同，专利中未进行详细阐述。 2 0 0 5 年，a m o r i mrvs 等 26 】筛选出6 株产c d a 的毛霉，所产c d a 大多为 胞内酶，并发现产酶与细胞生长速率之间有很大关系。 国内关于c d a 的研究起步较晚，相关报道比较少，而且多是参考国外研 究方法验证试验室保藏菌种是否产c d a ，产c d a 菌种的筛选尤其是细菌的报 道还很少。 2 0 0 5 年，蔡俊等【2 7 】采用固体平板培养和液体发酵从4 2 株供试菌中筛选出 2 6 株有c d a 酶活性，最终确定构巢曲霉和蓝色犁头霉两株产酶活性较高，并 对两株菌产酶条件进行了比较。 2 0 0 6 年，蒋霞云等【2 8 】比较了几种霉菌( 毛霉、根霉、曲霉、青霉) 在对数 生长末期和稳定末期的胞内和胞夕f c d a 的酶活力，得出各霉菌胞内和胞外均 具有c d a 酶活，而且胞外酶活普遍大于胞内酶的活力。c d a 酶学特性研究表 明低温保存稳定性较差，每2 4 h 下降3 0 以上。 2 0 0 8 年，刘丽萍等【2 9 】从土壤中筛选出一株产几丁质脱乙酰酶的 r h o d o c o c c u ss p ( 红球菌) ，对其发酵培养基及产酶条件进行了优化，并初步 研究了c d a 的酶学性质。 1 2 2c d a 分子生物学研究现状 1 9 9 3 年，k a f e t z o p o u l o sd 等【3 0 】发现m r o u x i i 产生的c d a 中一段氨基酸序列 与根瘤菌的n o d b 蛋白序列具有高度相似性，c d a 分子中部( 约2 0 4 个氨基酸) 与n o d b 蛋白( 约2 1 5 个氨基酸) 有着同源性，这些同源域与c d a 的脱乙酰基活性 有密切关系。 1 9 9 5 年，g a ox i a o d o n g 等【3 1 】得到蓝色犁头霉a b s i d i ac o e r u l e a 的c d a 氨基 酸序列为g l y g l u t y r t r p g i n s e r p h e ，其中后五个氨基酸残基与m r o u x i i c d a 相同，认为该区域是c d a 的催化区域，还推断此氮末端序列在识别 g l c n a c 时有着重要的作用。 2 0 0 2 年，a g g e l i k im a r t i n o u 等【3 2 】确定啤酒酵母s c e r e v i s i a e 中有两种c d a 蛋白，c d a l 和c d a 2 ，其中c d a 2 比c d a l 的脱乙酰基活性高，得到啤酒酵 母c d a 2 的氨基酸序列为a l a a l a t h r l y s t h r p r o p h e p r o a s p t r p l e u 。 2 0 0 3 年，a g g e l i k im a r t i n o u 等【3 3 】又研究t c d a 2 在大肠杆菌e c o l ir 辛的表达 情况。c d a 2 基因包括两部分：编码未成熟酶( 4 4 个氨基酸残基) 的基因前序列 5 第i 章绪论 和编码成熟酶( 2 6 9 个氨基酸残基) 的基因序列。克隆前者无法获得有活性的酶， 因此编码成熟酶的基因片段成为克隆表达的主要对象。去除n 末端的1 2 个或者 更多的氨基酸残基可导致表达的c d a 完全失去活性，认为这是因为氮末端的 氨基酸残基参与蛋白的折叠，影响蛋白的结构形成。 2 0 0 4 年，b i n e s hs h r e s t h a 等【3 4 】从c 1 i n d e m u t h i a n u m 扩增出几丁质脱乙酰 酶基因，在p i c h i ap a s t o r i s 中得到表达，并用6 个组氨酸残基标记此蛋白。从发 酵液上清中提取并纯化该重组酶至均质，测得分子量为2 5 k d a ，发现c 0 2 + 是该 酶的激活剂，最后分析了该几丁质脱乙酰重组酶可以大规模应用于几丁质生 产壳聚糖的可行性。 2 0 0 5 年，y a s u h i r om a t s u o 等1 3 副用p c r 从粟酒裂殖酵母中扩增出几丁质脱 乙酰酶基因c d a l + ，与质粒连接转化至菌株酿酒酵母中，并用双杂交系统分 析了c d a l 蛋白相互之间的作用。 2 0 0 6 年，n a t a s aj e r a j 等【3 6 】从根霉菌分离纯化出几丁质脱乙酰酶，构建了 c d n a 文库，对此c d a 基因进行了测序，完整的c d a 基因包括1 3 4 1 个核苷酸， 共编码4 4 7 个氨基酸，分子量为4 7 k d a ，而该酶经s d s p a g e 测定分子量为 1 0 0 k d a ，这表明c d a 中还有碳水化合物5 3 。编码的脱乙酰酶保守序列在基 因片段的中间位置，覆盖整个序列核苷酸的3 4 ，且约有8 个n 连接的糖基化 位点。 2 0 0 7 年，j i a n gx i a y u n 等【37 】用逆转录p c r ( r t p c r ) 技术克隆了 m r a c e m o s u s 中的c d a ，并使用特别保守引物通过快速扩增c d n a 末端( r a c e ) 对其完整的c d n a 序列进行了分析，该序列长1 5 0 6 b p ，共编码4 4 8 个氨基酸， 其中该基因编码的脱乙酰酶保守序列占整个序列的3 2 。并推测了该蛋白质 的三维结构，包括一个完整的c d a 功能域和一个多糖脱乙酰域。 1 2 3c d a 性质 近年来，随着对不同来源c d a 性质的研究，人们发现不同来源的c d a 在 很多地方存在着差异，如其存在位置、分子量、最适p h 、最适酶促反应温度、 碳水化合物在酶中的含量等。现将几种不同来源c d a 的性质归纳于表1 1 ，从 表中可以看出，这些酶之间既有共同特性，同时也存在着较大差异。 6 山东轻丁业学院硕l 二学位论文 表1 1 几种不同来源c d a 的性质 从表中可以看出，几丁质脱乙酰酶大部分都是糖蛋白，热稳定性高，这 是其共同特性，另外还存着差异性。如其产酶模式不完全相同，分子量、最 适p h 、激活剂、抑制剂等均不完全一样，酶的存在位置也不同，有胞外酶， 也有胞内酶，这些差异导致不同来源c d a 的生理功能不同。其中，前两种 菌株所产c d a 功能相同，均参与细胞壁的合成，从表中也可以看出，两种 c d a 的性质最相近。 研究还发现，不同来源的c d a 对底物的要求还不同。多数c d a 底物特 异性很强，如m r o u x i i 、a c o e r u l e a 、c 1 i n d e m u t h i a n u m 等【4 0 , 2 3 , 4 1 】所产c d a 只能以几丁质、壳聚糖及其衍生物为底物，对其他物质作用微弱；但有少数 c d a 如a n i d u l a t l s 所产c