（发酵工程专业论文）产紫杉醇菌种的改良及若干种前体物质作用的研究.pdf

摘要 摘要 紫杉醇是一种二萜类衍生化合物，最早从红豆杉属植物中分离出来。由于其抗癌机 制独特，对多种恶性肿瘤疗效突出，一直备受人们的关注。利用植物内生真菌发酵法产 生紫杉醇是近年来研究热点，由于产量性状不能满足生产要求，提高真菌发酵液中紫杉 醇的产量是当今及以后研究工作的重心。而高产菌种选育、优化培养条件将是提高紫杉 醇产量的有效途径。 本论文在实验室保藏的一株紫杉醇产生菌f u s a r i u mm a g ik 1 7 8 基础上，以发酵生 产紫杉醇的产量提高为目标，对其生物合成前体、育种途径、发酵工艺做进一步研究。， 主要研究方法和结果如下： 1 研究同时添加不同前体物对菌体合成紫杉醇的影响，采用响应面法对美丽镰刀菌 ( f u s a r i u mm a i r e ik 1 7 8 ) , 发酵合成紫杉醇途径中一些可能的前体进行优化研究。首先 采用p l a c k e t t b u r m a n 法对8 个因素进行了筛选j 结果表明j 苯丙氨酸，苯甲酸钠和 乙酸钠三个因素对紫杉醇产量影响较大。在此基础上，再通过b o x b e h n k e n 设计， 利用d e s i g n e x p e r t 软件进行二次回归分析，得到各因素的最佳浓度为：苯丙氨酸2 8 m g l ，苯甲酸钠3 1 8m g l ，乙酸钠3 3g l 。在优化条件下紫杉醇的产量达到2 4 2 6 肛g l ，较前体单因素实验最高值提高1 5 6 ，并对前体合成紫杉醇机理进行了研究。 2 采用紫外线与亚硝酸对美丽镰刀菌( f u s a r i u mm a i r e o k l 7 8 的孢子进行复合诱变，于 含4 0p g m l 制霉菌素的平板上进行筛选，获得3 1 株突变株，其中5 株的紫杉醇产 量高于出发菌株，突变株u h 2 3 的紫杉醇产量为2 5 9 8 “g l ，较出发菌株提高了 1 7 8 。 3 研究了突变株f u s a r i u mm a i r e z v h 2 3 发酵产紫杉醇的工艺条件，实验结果表明最佳培 养条件为：温度2 6 ，发酵起始p h7 0 ，接种量5 ，2 5 0m l 三角瓶装液6 0m l ， 发酵周期1 2d 。筛选了最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为硝酸铵j 得到最佳发酵培养 基组成( g l ) ：葡萄糖6 0 ，n h 4 n 0 36 ，无水m g s 0 4o 3 ，k i - 1 2 p 0 4o 5 ，z n s 0 41 1 0 ， c u ( n 0 3 ) 21 1 0 一，f e c l 32 1 0 一，v b i5 1 0 。2 ，苯丙氨酸2 8 1 0 一，苯甲酸钠3 1 8 1 0 一，乙酸钠3 3 ，l 一酪氨酸5 1 0 。紫杉醇含量达到3 0 5 9p g l 。硝态氮和铵态 氮二者对菌体合成紫杉醇具有协同作用。在发酵第6d 补加蔗糖，在蔗糖含量在不高 于1 0g j 时对菌体生长和紫杉醇积累具有促进作用。 关键词：紫杉醇，响应面法，前体，复合诱变，抗性筛选，发酵条件 a b s t r a c t a b s t r a c t t a x o l ，ah i g h l yd e r i v a t i z e dd i t e r p e n o i d ，w a sf i r s t l yf o u n df r o ms o m es p e c i e so ft a x u s d h et oi t su n i q u ea n t i c a n c e rm e c h a n i s ma n dt h er e m a r k a b l ec u r a t i v ee f f e c tf o rv a r i o u s m a l i g n a n tt u m o r s ，i th a sb e e nt h ef o c u st ow h i c hp e o p l ep a ya t t e n t i o na l lt h et i m e t a x o l p r o d u c t i o nb yp l a n te n d o p h y t i cf u n g if e r m e n t a t i o nh a sb e e nt h er e s e a r c hh o t s p o ti nr e c e n t y e a r s i ti si m p o r t a n tt oi m p r o v et h et a x o lp r o d u c t i o nb yf u n g ii no r d 9 rt om e e tt h ep r o d u c t i o n r e q u i r e m e n t b r e e d i n go fh i g hy i e l ds t r a i n sa n do p t i m a lc u l t i v a t i o nc o n d i t i o n sw i l lb et h e e f f e c t i v ew a y st oi n c r e a s et h ey i e l do ft a x 0 1 t h ef u r t h e rr e s e a r c hb a s e dt h ef u s a r i u mm a i r e fk 17 8f r o m 虹1 ep r o t o p l a s tm u t a t i o nw a s i n v e s t i g a t e db yo p t i m i z a t i o no fb i o s y n t h e s i sp r e c u r s o r , b r e e d i n gm e t h o da n df e r m e n t a t i o n t e c h n o l o g yt oi n c r e a s et a x o ly i e l d t h em a i nm e t h o d sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h ec o n c e n t r a t i o no fp r e c u r s o r sf o rt h ep r o d u c t i o n o ft a x o lw i t hf u s a r i u mm a i r e f k 17 8w a so p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y f i r s t l y , p l a c k e t t b u r m a nd e s i g nw a s u n d e r t a k e nt oe v a l u a t et h ee f f e c t so fe i g h tf a c t o r s w i t hs t a t i s t i cr e g r e s s i o na n a l y s i s ，t h e s i g n i f i c a n tf a c t o r sa f f e c t i n gt a x o lp r o d u c t i o nw e r ed e t e r m i n e da sf o l l o w s ：p h e n y l a l a n i n e ， s o d i u ma c e t a t ea n ds o d i u mb e n z o a t e b o x b e h n k e nd e s i g nw a su s e dt oo p t i m i z et h et h r e e c r i t i c a li n t e r n a lf a c t o r sm e n t i o n e da b o v e a n dw ef o u n do u t 也eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o nl e v e l s a n dt h er e l a t i o n s h i p sa m o n gt h e s ef a c t o r s b yq u a d r a t i cr e g r e s s i o nm o d e le q u a t i o n 、析m d e s i g n e x p e r ts t a t i s t i cm e t h o d s ，t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no ft h ev a r i a b l e sw e r ed e t e r m i n e d a s ：p h e n y l a l a n i n e2 8m g l ，s o d i u ma c e t a t e3 3g 几，s o d i u mb e n z o a t e31 8m g m u n d e r s u c h c o n d i t i o n s ，t h et a x o lp r o d u c t i o nw a si n c r e a s e d t o2 4 2 6p g l ，w h i c hw a s15 6 h i g h e rt 1 1 啦 t h em a x i m u mv a l u ei nt h es i n g l e f a c t o rt e s t s t h ee x p e r i m e n tv a l u e su n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n sa g r e e d 谢t 1 1 也ep r e d i c t e dv a l u e s w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h em o d e lw a sp r o p e ra n d e f f e c t i v e a n dt h em e c h a n i s mo ft h ep r e c u r s o r ss y n t h e s i so ft a x o lw e r ea l s os t u d i e d 2 s p o r e so ft a x 0 1 p r o d u c i n gf u n g u s 只裕a r i u mm a i r e ik 17 8w e r et r e a t e dw i t hu va n d m t r i t e t h em u t a n t sw e r es e l e c t e di nt h ep l a t ew i t h4 0p g m ln y s t a t i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a t 5m u t a n t se x h i b i t e da ni n c r e a s ei nt a x o lp r o d u c t i o na m o n gt h eo b t a i n e d3ln y s t a t i nr e s i s t a n t m u t a n t s t h et a x o lp r o d u c t i o no fm u t a n tf 协a r i u mm a i r e iu h 2 3w a s2 5 9 。8 “g l ，w h i c hw a s 17 8 m o r e 也a nt h a to ft h es t a r t i n gs t r a i n 3 飞h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fe n d o p h y t i cf u n g u sf u s a r i u mm a i r e m h 2 3w e r e i n v e s t i g a t e df o rt a x o lp r o d u c t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta ni n o c u l a t i o nv o l u m eo f5 i n t o t h e6 0m l 2 5 0m le r l e n m e y e rf l a s ka tt h ec o n d i t i o no f2 6 a n di n i t i a lp h7 0c o u l dr e a c h t h em a x i m u mt a x o lp r o d u c t i o na f t e ri n c u b a t i o no f12d a y s g l u c o s ea n da m m o n i u l nn i t r a t e w e r es e l e c t e da st h eb e s tc a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ei nt h ef u r t h e rs t u d y t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o n sw e r e ( g l ) ：g l u c o s e6 0 ，n h 4 n 0 36 ，m g s 0 40 3 ，k h a p 0 40 5 ， z n s 0 41x1 0 。j ，c u ( n 0 3 ) 21 1 0 一，f e c l 32 1 0 一，v bx5 1 0 一，p h e n y l a l a n i n e2 8 1 0 一， s o d i u mb e n z o a t e3 1 8x1 0 1 ，s o d i u ma c e t a t e3 3 ，l t y r o s i n e5x1 0 一t h et a x o ly i e l dr e a c h e d 3 0 5 9p g lu n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s t h ee x p r e s s i o no fn i t r a t en i t r o g e na n da m m o n i u m n i t r o g e na r es y n e r g i s t i ce f f e c t so nt h eb i o s y n t h e s i so ft a x 0 1 u n d e rt h ec o n d i t i o no fa d d i n g s u c r o s el e s st h a no re q u a lt o10g lc a r lp r o m o t et h ec e l lg r o w t ha n di m p r o v et h ey i e l do f i i 一 垒堕! ! ! !。 - _ 一一一 t a x o la f t e rc u t u r e df o r6d a y s k e y w o r d s ：t a x o l ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ，p r e c u r s o r ，c o m b i n e dm u t a g e n e s i s ， r e s i s t a n c es e l e c t i o n ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：饯文元 日 期：沙哆夕伊 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 氏炙勃 珏 沙。孑了矿 日 期：妒6 7 ? j 第一章绪论 第一章绪论 1 1 紫杉醇概述 1 9 7 1 年，美国化学家w a j l i 和w a l l 从一种短叶红豆杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离到 ，种天然抗肿瘤物质，命名为紫杉醇【lj 。随后，s c h i 仃等【2 】证实紫杉醇具有独特的抗癌机 制。它作用于细胞微管，通过与微管蛋白n 端第31 位氨基酸和第217 - - - 2 31 位氨基酸结合， 诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心 相互连接，将细胞周期阻断于g 2 m 期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖【3 ，4 】。 它能有效地治疗晚期卵巢癌，乳腺癌和其它癌症，被称为是过去几十年中发现的最好的 抗癌药物。由于其独特的抗癌机制，对多种恶性肿瘤疗效突出，完全不同于以往上市的 任何一种抗癌药，1 9 9 2 年美国食品与药品管理局( f d a ) 正式批准紫杉醇用于临床，、其英 ：文名为p a c l i t a x e l r 商品名为t a x o l 。 卜紫杉醇为白色结晶粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂【5 】分子式为 c 4 7 h 5 l n o l 4 ，相对分子量为8 5 3 9 2 ，溶点为2 1 3 2 1 6 。其基本化学结构如图1 1 所示。 c 1 3 位侧链 o b a c c a t i ni i i h o o ；，、 图i - 1 紫杉醇化学结构 。c 1 3 侧链连接于b a c c a t i ni i i 陔的i3 住碳原予上 f i g 1 1s t u c t u r e 。o fp a c l i t a x e l ( t a x 0 1 ) c 1 3s i d ec h a i na n db a c c a t i ni i i c o r ea r ei n d i c a t e d 抗癌新秀紫杉醇自投放市场后，其市场销售额每年以两位数增长并高居抗肿瘤药之 首，1 9 9 6 年紫杉醇的全球销售额己达8 亿美元( 其中美国本土为5 亿美元) 。1 9 9 8 己超过1 2 亿美元年。合成的紫杉醇销售额大约在90 0 0 万美元。目前已有5 0 多个国家已批准销售 合成紫杉醇。据美国国家癌症研究所( n c i ) 预测，在今后1 0 1 5 年内紫杉醇将成为抗癌首 选药物之一1 6 j 。 1 。2 紫杉醇生物合成路径 迄今为止，对细胞内紫杉烷类化合物生物合成的生理及发育调控的有关研究较少。 然而，近年来在紫杉烷类化合物生物化学领域研究所获得的结果，使人们在红豆杉植物 和细胞培养中可通过遗传修饰大大提高紫杉醇的含量。紫杉醇及其相关的带有c 1 3 位侧 链化合物的生物合成途径大致可分为三个主要的生物合成阶段7 】：紫杉烷骨架系统的 垩塑奎兰婴主兰垡笙茎 生物合成；c 1 3 位侧链的生物合成；紫杉烷骨架系统和侧链的酯化反应，形成完整 的紫杉醇分子。- 4 萜类的生物合成十分复杂，代谢步骤很多。现已知从二萜共同前体栊牛基栊牛醇焦 磷酸( g e r a n y l g e r a n y lp y r o p h o s p h a t e ，g g p p ) 到紫杉醇需要约十九步酶促反应。g g p p 是二 萜化合物合成的共同起点，在生物体内由甲瓦龙酸途径( m e v a l o n i ca c i dp a t h w a y ) 合成l 引， g g p p 环化为紫杉烷三环二萜骨架的反应是在紫杉二烯合成酶t a x a d i e n es y n t h a s e 催化 下进行的，反应产物是t a x a 4 ( 5 ) 、1 1 ( 1 2 ) 。d i e n e 9 , 1 0 1 ，此酶为分子量7 9k b 的蛋白单体，以 m g 十为唯一的金属催化剂。与其它二萜环化酶相比，此合成酶活性低，无诱导效应，无 应激效应。 一紫杉烷骨架合成后需要引入侧基进一步形成b a c c a t i n i i i ，它是紫杉醇合成的直接前 体【l l 】。其侧基包括c 4 ，c l o 位的二个乙酰基，c 2 位的一个苯甲酰基，c 9 位的j 个酮基， c l ，c 7 ，c 1 3 位的三个羟基，以及o x e t a n e 环。 形成侧基的第一步反应是羟基化反应，通过对天然存在的1 0 0 多种紫杉烷化合物进 行结构与相对富含量分析，推测羟基化的顺序为c 5 i 1c l o ，c 2 fc 9 ，一e 1 3 ，o x e t a n e 环形成 以后再进行c 1 ，5c 2 位的羟基化b c 5 位的羟基化反应由细胞色素p 4 5 0 羟化酶催化，它将t a x a d i e n e 转变为5 c 【醇4 ( 2 0 ) ， 11 ( 1 2 ) 紫杉二烯，此羟基化反应需要在有0 2 条件及n a d p h 存在条件下进行。p 4 5 0 羟化酶 活性易受c o 抑制i 最适p h 为中性j 1 、 形成侧基的第二步反应是酰化反应j 但酰化反应进行的次序与功能均不明确。放射 性标记实验表明，。乙酸是c l o ，c 4 位乙酰基的合成前体【7 1 i b a c c a t i n i i i 合成以后，在c 1 3 位发生酰化反应，合成1 ：a x o l 或c e p h a l o m 衄i n e 删，二者 存在竞争性抑制。c 1 3 位的酰化反应分为二步，第一步酰化反应是将b a c c a t i n l i i 酰化为n 去乙酰基紫杉醇，即由a p h e 在氨基转换酶作用下生成p p h e ，再发生c 2 位羟基化反应生 成苯基异丝氨酸，由此产物- 与b a c c a t i n l i i c l 3 位结合形成n ? 去苯甲酰基紫杉醇。第二步酯 化反应是将n 去苯甲酰基紫杉醇转化为t a x o l 或c e p h a l o m n n i n e 。如果在c 1 3 侧链的3 位酯 化为n 甲基巴豆酰基，j 则生成c e p h a l o m r m i n e 如果酯化为苯甲酰基，则生成t a x o l 。紫 杉醇生物合成途径如图1 2 所示。 1 3 紫杉醇生产现状 - - 目前商业用紫杉醇主要由红豆杉的树皮提取法生产，但是紫杉醇在植物体中的含量 相当低，大约从3 6 棵6 0 1 0 0 年生大树的树皮中才能提取到lg 紫杉醇，可治疗一个癌症 患者【1 4 】。有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6 棵树龄6 0 1 0 0 年的红豆杉树【15 1 。目前全 球每年2 0 0k g 紫杉醇的消耗量意味着要砍伐1 0 0 万棵红豆杉大树，随着紫杉醇应用范围的 扩大，其需求量必然会逐年增加，而红豆杉树生长速度相当慢，直径2 0c m 的树需生长 1 0 0 年! 因此，伐树生产紫杉醇的方法不仅会严重破坏该树的长期生存和分布，也根本 无法满足人们对紫杉醇的需求。尖锐的供需矛盾在医学、化学和生物学领域中引起了一 场非同寻常的广泛研究，以期增加这种化合物的来源。 2 第一章绪论 现在的研究主要集中在：化学合成、半合喊、植物细胞培养和真菌发酵、微生物转 化等方面。 c , m n t ；1 0 e m n y ld i p h o s 口h a t 。 牛基牛醇焦磷醴 p 4 ( 2 0 j 1 i f l 2 ，d i e n e ，口o j 5 尊4 ( 2 0 ) 1 l ( 1 2 ) 繁杉= 烯 嚼。嗡 t m 4 ( 2 0 j l ii ( 1 2 ) - d i e n c 4 ( 2 0 ) i i ( 1 2 ) 繁杉：烯 - h o 一 0 h t “a 4c 5 ) 。i lf1 2 ) - d ；e n e 4 ( 5 i “1 2 繁杉二埘 c c p h l l c , m n n i n e ； 三尖杉破碱 p 气- 巴0 0 h 旷p h e n y l a l a n i n e b - p h e n y l a h n i n e 掣苯丙氨酸 凸苯丙氨政 图1 - 2 紫杉醇生物合成途径示意图 f i g 1 2t h eb i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f t a x o l 1 3 1 化学半合成及全合成 所谓半合成，就是从可以再生的植物枝叶中提取本身并无活性的紫杉烷二萜类成 分，并以之为前体合成紫杉醇。d e n i s 等【1 6 】首先报道了紫杉醇的半合成。紫杉醇的半合 成主要是以1 0 去乙酰巴卡亭i i i ( 1 0 d e a c e t y lb a c c a t i n i i i ，1 0 d a b ) 和b a c c a t i n i i i 为前体。 1 0 d a b 在部分红豆杉品种枝叶中的含量是紫杉醇的3 倍以上，通过以1 0 一d a b 作为合成 江南大学坝十学位论文 的起始物，从侧链合成开始只要约l o 个步骤就可合成紫杉醇。， 国际制药公司当前较普遍采用的生产技术是生化半合成法( 1 7 ，1 8 】。b a c c a t i n l i i 矛f j c l 3 位 侧链中间体独立合成，可以稳定存在，而且水溶性较好。依据这一特点，利用生物酶类 将红豆杉原料进行处理，使b a c c a t i n i i i $ 口cj 3 位侧链中间体得到一定程度富集，然后提取 这些较易溶解的前体，最后利用酶法或化学法将这些前体合成成品紫杉醇【l9 1 。 半合成紫杉醇可以大大地改善紫杉醇供应的短缺情况；通过半合成，还可以使紫杉 醇的侧链具有更大的可变性，有可能获得活性更高的紫杉醇衍生物譬刚。 半合成法虽然提高了紫杉醇产量，但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别，仍 然需要消耗大量红豆杉树木和大量有机试剂。 化学法全合成紫杉醇已于1 9 9 4 i l z 宅e 实验室里取得了成功，到目前为止，报道的紫杉 醇的全合成路线有三条：( 1 ) h o l t o n i 珞线 2 1 1 ；( 2 ) n i c o l a o u l g 名, 线田】；( 3 ) d a n i s h e f s k y 路线t 2 3 1 。 但是，紫杉醇手性基团较多，合成路线复杂，合成步骤多达2 0 2 5 步，+ 难度较大，成本 高，产率低，至今无法应用于工业生产。 1 3 2 植物细胞离体培养法 c h r i s t e nj 首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后【2 4 1 ，研究吸引了众多的实验 室跟进。 近年来，国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养的 红豆杉细胞系己超过1 0 个，其中大部分已证实产生紫杉醇。，e s c a g e n e t i c s ，公司在1 9 9 2 年n c i 主持的第二次紫杉醇研讨会上宣布，他们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树 皮的2 5 倍。中国的甘烦远等【2 5 】发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到1 2 叽， 紫杉醇含量为0 1 11 9 ，约为成年树树皮中含量的1 2 倍，为栽培植株的4 0 倍，梅兴国等 研究了两相培养系统中红豆杉细胞的生长与代谢规律，紫杉醇产量为3 0 1 9m g l 。 但是，离体培养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破。例如，植物细胞 培养易感染微生物，培养条件苛刻，- 培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长， 并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定等等 2 7 ，2 8 1 。 1 3 3 微生物转化法 利用生物酶类的高度选择性将与紫杉醇结构类似的一些紫杉烷类化合物转化成紫 杉醇的半合成前体，这样简化了分离过程并大大地提高了资源的利用率，为解决紫杉醇 来源问题提供了一个很好的方法和思路。生物转化的主要反应类型有1 5 j ：( 1 ) 羟基化；( 2 ) 水解；( 3 ) 酰化反应；( 4 ) 重排：( 5 ) 环氧化反应等。生物转化的影响因素有：培养基的p h 、 底物的结构、底物的加入时间、加入底物的浓度以及加入底物的方法等。张君增等1 1 8 】 在该方面都做了相关研究并取得了一定的进展，他们从云南红豆杉树皮中分离出8 0 多株 内生真菌，从中发现3 株具有转化天然紫杉烷类化合物的能力，其中m i c r o s p h a e r o p s i s 口n y c h i u r i 和毛霉( m u c o rs p 。) 都可水解将1 0 d e a c e t y l 一7 一e p i t a x o l 的1 3 位侧链并可使7 位羟基 差象异构化，而链格孢l t e r n a r i aa l t e r n a t a ) 则在lb h y d r o x y b a c c a t i ni 不同位置水解。 该实验为微生物转化生成紫杉醇提供了依据。紫杉醇类似物之间基因修饰以获得更高活 4 第一荦绪论 性的新化合物应是一个更广阔的应用领域。但是目前大部分生物转化工作还停留在初级 的新反应筛选和发现上，离实现工业化生产还有很大距离，还需要加大力度对重要的反 应进行深入研究。 1 3 4 微生物发酵方法 目前商业用紫杉醇主要来自红豆杉的树皮，不仅树皮来源严重不足，而且对天然植 物资源构成严重威胁，因而多种途径解决紫杉醇资源贫乏问题变得十分迫切。由于植物 细胞培养条件苛刻，且生产周期长，所以人们不断寻找新的药源。其中最重要的进展应 当是产紫杉醇内生真菌的发现，为这一重要药物的研究和工业化生产开辟了新的药源途 径2 9 , 3 0 】。寻找可以产生紫杉醇的内生真菌，通过微生物发酵的方法生产紫杉醇，有望改 善目前紫杉醇价格昂贵、供不应求的现状。 1 3 4 1 产紫杉醇的内生真菌 1 9 9 3 年美国学者s t i e r l e 等【2 9 】首次从短叶紫杉( 玩“sb r e v i f o l i a ) 的韧皮部中分离出 一种新的内共生真菌t a x o m y c e sa n d r e a n a e ，可在半合成培养液中产生紫杉醇和紫杉烷类 化合物，表明有的内生真菌具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力。 此后，各国学者纷纷开展产紫杉醇内生真菌的分离工作。、l i 等| 3 1 】从秃柏( 勋d 疣“聊 d i s t i c h u m ) 的树皮卜韧皮部和木质部中都分离到产紫杉醇的内生真菌p e s t a l o t i o p s i s m i c r o s p o r a 。s t r o b e l 等【3 2 】从西藏红豆杉( zw a l l a c h i a n a ) 中分离到一株产生紫杉醇的内 生真菌小孢拟盘多毛孢( p e s t a l o t i o p s i sm i c r o s p o r a ) ，这种真菌的培养液可以产生紫杉醇 的量达到5 0 嵋l ；此后又分离到尼泊尔盘端鹿角菌( s e i m a t o a n t l e r i u mn e p a l e n s e ) ，一其真 菌培养液产生紫杉醇的量为6 2 - - - 8 0 ，n g l 【3 3 】j 这说明产紫杉醇的内生真菌不仅存在于红豆 杉属植物中，在一些非红豆杉属植物中也存在，他们的研究进步扩大了产紫杉醇内生 真菌的范围。 我国的学者在分离产紫杉醇内生真菌的研究中也取得了一定的成果。1 9 9 4 年，我国 邱德有等【3 4 】从云南红豆杉( zy u n n a n e n s i s ) 树皮中分离出一种内生真菌y f i ，形态类似于 s t i e r l e 发现的安德鲁紫杉菌，经过t l c 分析测定亦可产生紫杉醇，但是生物合成量很 低。周东坡等【3 5 ，3 6 】从东北红豆杉( t c u s p i d a s e ) 中发现一种内生真菌一树状多节孢 ( n o d u l i s p o r i u ms p ) ，是我国的新记录属，可以产生紫杉醇，产量为5 1 0 6 1 2 5 7 t g l 。 王伟等 3 7 】从南方红豆杉( t c h i n e n s i s v a rm a i r e i ) 的主干和侧枝树皮及皮下部分分离得到9 l 株菌，其中6 株能分泌紫杉烷类化合物，经鉴定分别属于头孢霉属( c e p h a l o s p o r i u ms p p ) 、 轮柄梳霉属( m a r t e n s i o m y c e ss p p ) 和无孢菌群( m y c e l i as t e r l i a ) 。2 0 0 2 年，本实验室研究人 员也从中国南方红豆杉中分离到一株产紫杉醇内生真菌，经鉴定属镰刀菌属( f u s a r i u m m a i r e i ) ，产量约2 0 “g l 。其后，采用原生质体诱变、发酵条件优化等方法，产量有了很 大幅度提高i j 引。 1 3 4 2 利用内生真菌产紫杉醇的优点 无论是从生态还是经济条件的角度来看，利用植物内生真菌作为药源是一项不会枯 望塑奎堂堕圭兰垡笙壅 竭的资源，微生物发酵的方法具有以下优点：( 1 ) 微生物作为工业生产的源泉，可以在 发酵罐中进行，可以源源不尽地进行生产；( 2 ) 微生物发酵的方法容易扩大化，幂$ - t - 工 业化生产；( 3 ) 微生物的生长仅仅需要一般的培养技术，在收集紫杉醇之前，可以通过 改善培养环境、改进技术来提高产量；( 4 ) 微生物易于通过诱变育种、基因工程等方法 筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；( 5 ) 内生真菌生长迅速，易于培养，应用的培养基 相对较简单；( 6 ) 可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格，而且对于植物来源的天然 药物的新生产途径的开发及濒危药用植物的保护具有十分重要的经济及生态效益。 1 3 4 3 紫杉醇的提取分离方法 真菌培养物首先要进行预处理，然后进行紫杉醇的提取。主要提取方法是用有机溶 剂萃取。马天有【3 9 j 的方法是：将培养物冷冻后用转速为1 00 0 0r r a i n 组织捣碎机匀浆3 r a i n ，用4 层纱布过滤，滤液中加入等体积的氯仿和甲醇混合液( 1 0 ：1 ，功，充分振荡后 静置8 1 2h ，收集有机溶液相，并在4 5 条件下减压蒸发，残留物溶于lm l 甲醇中作 为样品溶液备用：周东坡等【3 6 j 对发酵产物萃取的方法是：收集培养物先经3o o o r m i n 离 心i 5 伍i 1 1 ，i 。并将沉淀物捣碎后重新与上清液混合? 、再经35 0 0 i 1 1 离心1 2m i n ，保留上清 液，用等体积的氯仿与甲醇混合液( 1 0 ：1 ，v 玢萃取，收集有机相后置3 0 c 下鼓风干燥， 将蒸发后的萃取物溶于少量的氯仿中保存。后来又进行了改进，即：发酵液过滤后，滤 渣烘干( 低于5 0 ) ，滤液称量体积。滤渣用适量乙酸乙酯萃取，滤液用l 2 滤液体积的 乙酸乙酯萃i 玟( 3 0 m i n ) ，下层水层再用乙酸乙酯萃取一次，合并乙酸乙酯相，减压蒸馏。 用适量申醇洗涤减压蒸馏得到的固体，。再用正己烷萃取1 5m i n ，收集下层甲醇相，加入 乙酸乙酯和水( 1 ：1 ，v 功进行萃取( 3 0m i n ) ，将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏，用- 定 量的乙腈溶解固体，0 * c 密封保存；陈建华等人【4 0 】的萃取方法比较简单：直接用菌丝进 行，；取菌丝lg 均质5m i n 后用甲醇抽提，将抽提液通过离心，收集上层，用旋转蒸发器 蒸干，加入等体积水和二氯甲烷抽提，弃水相收集有机相，荐次蒸干，所得粉末溶于少 量甲醇。 一、总之i 在分离真菌发酵液中的紫杉醇首先要考虑预处理，然后用相应的萃取方法进 行分离，要考虑萃取液的种类和减压蒸馏的温度： 1 3 4 4 紫杉醇含量的测定方法 ；| _ 真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱( t l c ) 、高效液相色谱( h p l c ) 、u v 免疫 分析、生物学方法和放射性前体标记等。另外还有单抗免疫分析法( c o m p e t i t i v ei n h i b i t i o n e n z y m ei m m u n o a s s a y 。c i e i a ) ，它是利用对紫杉醇有专一特性的单抗进行测定，此方法简 单易行且灵敏度高，但检测费用较昂贵。紫杉醇的高效液相色谱分析始于2 0 世纪8 0 年代 末，随后得到广泛应用 4 l 】。h p l c 的主要特点为高速、高压、高效及高灵敏度，正相、 反相色谱均有应用，分离用到的固定相也有l o 余神。广泛应用的普通填料主要有 o d s ( c 1 8 ) 、氰基柱和苯基柱。在分离过程中，采用的流动相通常为乙腈一水或甲醇一水二 元溶剂系统，或采用乙腈甲醇水三元溶剂系统。另外，梯度洗脱方式也得到广泛采用， 且收到良好效果。h p l c 不仅可以测定紫杉醇含量，而且还能追踪分离紫杉醇。已成为 6 第一章绪论 目前国内外常用的检测方法。h p l c 也可与m s 联用，用氰基柱，流动相为甲醇乙腊 醋酸铵。h p l c m s 联用来分析检测紫杉烷类化合物，检测范围可提高到纳克级，但也存 在检测费用高等问题。 1 3 4 5 提高内生真菌产紫杉醇产量的途径 真菌产紫杉醇含量普遍偏低，目前的研究主要集中在以下几个方面： 第一，菌种改良。包括( 1 ) 利用常规诱变改良菌种：1 9 9 3 年，周东坡等f 3 5 】从东北红豆 杉中分离到3 株紫杉醇产生菌，其中h q d 3 3 经过紫外线、e m s 、6 0 c o 、n t g 等诱变剂顺 序诱变得到高产突变株n c e u 1 ，其紫杉醇产量到达3 1 4 0 7 “g l ，远远高于原始出发菌 株紫杉醇的产量( 5 1 0 6 m 2 5 7p g l ) ；( 2 ) 利用原生质体诱变改良菌种，赵凯【4 2 】、徐峰等人 【4 3 】在这方面进行了研究，并取得了一定成果；( 3 ) 利用基因工程技术构建工程菌株改良菌 种：利用d n a 重组技术，通过基因操作，局部设计、改造和更新固有的代谢途径，以紫 杉醇微生物合成途径的基因转移与表达为切入点，提高紫杉醇最终产量是今后研究的重 要方向。 第二，优化培养基及发酵条件。真菌自生和共生条件的代谢途径有差异，内生真菌 脱离植物体后，次级代谢产物的生产量多停止或延缓，如果发酵液中加入红豆杉针叶萃 取物则可以激活紫杉醇的合成，发酵液添加合成紫杉醇的前体物，如b a c c a t i n i i i 、醋酸 盐( a c e t a t e ) 、苯丙氨酸( p h e n y l a l a n i n e ) 、苯甲酸( b e n z o i ca c i d ) 、亮氨酸( l e u c i n e ) 等，或不 同发酵时期加入不同的糖类，或使用不同培养基及改变生长条件，亦有助于提高紫杉醇 的产量。 。 1 4 本论文的主要研究内容 1 4 1 提高内生真菌产紫杉醇产量需解决的问题 近1 0 年来，国内外利用内生真菌产生紫杉醇的研究报道迅速增多，但利用内生真 菌发酵生产紫杉醇仍未能达到中型或大型工业化生产规模( 要达到工业化生产表达率至 少须为毫克级，而现在普遍产量仅仅为几百微克) 。其中主要存在下列问题： ( 1 ) 缺乏良好的适合于发酵的工业菌株。根据国内外报道，目前的产紫杉醇真菌大多 是红豆杉内生菌，一般菌丝体不发达，影响紫杉醇产量。因此要从两方面入手解决这 问题，是继续从自然界中筛选更好的适合发酵的原始出发菌株；二是对现有高产紫杉 醇产生菌进行遗传改造，使其能够产生大量菌丝体来提高紫杉醇的产量。但是，至今关 于紫杉醇合成的分子生物学机制尚不清楚，因此，目前尚用传统的诱变育种手段来筛选 高产菌株。 ( 2 ) 由于发酵条件的限制，单位培养液中紫杉醇的含量低。真菌发酵液中添加合成紫 杉醇的日订体物质，可以提高产量。寻找一些真菌调节剂，抑制其它的次生代谢途径，可 以提高紫杉醇产量。植物体中的生长调节剂对内生真菌产紫杉醇有一定的调节作用。依 据不同的内生真菌的生长条件，选择合适的培养基，发现最佳发酵条件以期提高紫杉醇 的产量已成为目前重要的研究内容。 7 江南大学颁七学位论文 1 4 2 本论文的主要研究内容 作为国家自然科学基金资助项目( n o ：3 0 3 7 0 0 4 4 ，3 0 4 7 0 0 1 6 、，本论文在课题组前期 研究基础上，着重从下面几个方面进行研究： ( 1 ) 研究同时添加几种不同前体物质对真菌发酵合成紫杉醇的影响，筛选出对紫杉醇 合成具有正效应的前体，确定前体最适添加浓度，同时考察前体物之间对真菌合成紫杉 醇有无协同作用； ( 2 ) 对实验室保藏紫杉醇高产真菌进行诱变处理，进一步改良菌种特性，提高其合成 紫杉醇能力； ( 3 ) 对获得的