（发酵工程专业论文）以中药为基质的黑木耳多糖发酵工艺条件的研究.pdf

以中药为基质的黑木耳多糖发酵工艺条件的研究 摘要 黑木耳是一种营养丰富的药、食两用真菌。黑木耳中含有的黑木耳多糖因具有 降血糖、降血脂、抗肿瘤以及抗凝血等生理活性而成为研究热点。本论文通过添加 适当的贵州特色中药成分，以促进深层发酵黑木耳多糖的产量。研究了黑木耳多糖 的摇瓶发酵工艺和胞外多糖提取工艺，并在15 l 发酵罐上进行发酵工艺试验。 首先考察了六种贵州特色中药的水提取液和乙醇提取液对黑木耳深层发酵 的影响。结果表明所有中药的水提取液均可以在不同程度上促进黑木耳胞外多糖 的产量。但是乙醇提取液对黑木耳胞外多糖产量的促抑效果不一。最终综合生物 量与胞外多糖产量两项指标，选择天麻乙醇提取液作为后续试验的添加成分。 单因素试验研究了各种营养因子对黑木耳深层发酵的影响，结果表明葡萄糖、酵 母膏、天麻乙醇提取液和无机盐，在一定浓度下有利于黑木耳菌体生长和胞外多糖 的形成。进一步用响应面法优化了培养基配方，确定了黑木耳深层发酵培养基为： 葡萄糖3 7 8 l 虮、酵母膏1 0 2 3 e c l 、天麻乙醇提取液3 0 o o e c l 、k h 2 p o a 3 9 4 9 l 、 m 萨0 4 1 9 7 9 l 。采用此培养基后，黑木耳胞外多糖产量达到了2 6 5 9 l 。 通过试验确定了黑木耳深层发酵的适宜工艺条件为：初始p h 5 6 6 ( 自然) 、 接种量1 0 、种龄4 5 d ，培养温度2 8 、2 5 0 m l 摇瓶装液量8 0m l 。 通过试验得出，黑木耳发酵液胞外多糖最佳提取工艺为：第一步沉淀时采用 3 0 的乙醇浓度，第二步沉淀时采用7 5 的乙醇浓度；静置温度为4 ；静置时 间为2 4 h 。此工艺条件提取黑木耳胞外多糖较为合适。 在1 5 l 发酵罐上进行发酵工艺条件小试研究。通气量试验结果表明较高通气 量有利于黑木耳深层发酵的发酵结果，综合考虑生产实际选择6 v v m 为宜。两 段温度控制试验结果表明2 8 适合菌丝体生长，2 5 适宜胞外多糖的生成。所 以0 - 8 4 h 宜采用2 8 。c 培养，8 4 1 4 4 h 宜采用2 5 。c 培养。两段p h 控制试验结果表 明，p h 5 1 适合黑木耳菌丝体生长，p h 5 7 有利于胞外多糖的生成。所以，0 - 8 4 h 宜采用p h 5 1 培养，8 4 1 4 4 h 宜采用p h 5 7 培养。最后综合以上优化结果进行的 验证实验表明，采用优化后的工艺条件，胞外多糖产量最高达到了3 4 2 l 。 关键词：黑木耳；药用真菌；中药；多糖：深层发酵；提取；1 5 l 发酵罐；小试。 s t u die s o nt h es u b m e r g e df e r m e n t a tio no f a u ri c u l a ri aa u ri c u l ab ya d din gac er t ainkin do f c hin e s etra ditio n aih erbm e dicir e a b s t r a c t a u r i c u l a r i aa u r i c u l ai sak i n do ff u n g iw h i c hi sb o t he d i b l ea n dm e d i c i n a l t h e e x t r o - p o l y s a c c h a r i d eo f a u r i c u l a r i aa u r i c u l ah a sv a r i o u sb i o l o g i c a la c t i v i t i e s ，s u c ha s a n t i c o g u l a t i o n ，a n t i l i p i d e m i c ，a n t i p l a t e l e t ，a n t i t u m o r , e t c i nt h i sp a p e r , t h ep r i m a r y p u r p o s eo ft h er e s e a r c hw a st op r o d u c eb e t t e ra n dm o r ee x t r o - p o l y s a c c h a r i d e sb y s u b m e r g e df e r m e n t a t i o nf r o ma u r i c u l a r i aa u r i c u l a a t i e re x a m i n e ds i xk i n d so f c h i n e s et r a d i t i o n a lh e r bm e d i c i n e sf r o mg u i z h o up r o v i n c e , s h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o n ， e x t r a c t i o n a n dt h et e c h n i q u e si n15 lf e r m e n t o rw e r ew e l ls t u d i e di nt h i sp a p e r t h ee f f e c t so fw a t e ra n de t h a n o le x t r a c t so fs i xk i n d so fc h i n e s et r a d i t i o n a lh e r b m e d i c i n e s , w h i c hw e r ef r o mg u i z h o up r o v i n c e , o nt h es u b m e r g e dc u l t u r eo fa u r i c u l a r i a a u r i c u l aw e r ef i r s t l ys t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ey i e l d so fe x t r o - p o l y s a c c h a r i d e w e r ei n c r e a s e di nd i f f e r e n tl e v e l sw h e na d d e da n yw a t e re x t r a c t so ft h es i xm e d i c i n e s b u tt h er e s u l t sv a r i e dw h e na d d e de t h a n o le x t r a c t s t 钛eb o t hb i o m a s sa n d e x t r o - p o l y s a c c h a r i d ei n t oc o n s i d e r a t i o n , w ec h o s et h ee t h a n o le x t r a c to fg a s t r o d i a e a t a t h ee f f e c t so fs o m en u t r i t i o n a lf a c t o r so nt h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o no f a u r i c u l a r i aa u r i c u l aw e r es t u d i e d a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tg l u c o s e ，y e a s te x t r a c t ， s a l ta n de t h a n o le x t r a c to fg a s t r o d i ae l a t ai ns u i t a b l el e v e l sc o u l dp r o m o t et h ey i e l d e x t r o - p o l y s a c c h a r i d e a no p t i m u mm e d i u mw a so b t a i n e db yr e s p o n d i n gs u r f a c em e t h o d e x p e r i m e n t t h em e d i u mc o m p o s i t i o nw a sa sf o l l o w s ：舀u c o s e 3 7 8 1g l ，y e a s te x t r a c t 1 0 2 3 9 ke t h a n o le x t r a c to fg a s t r o d i ad a t a3 0 0 0 9 l , k h 2 p 0 4 3 。9 4 9 & m g s 0 4 1 9 7 l t h e m a x i m u me x t r o p o l y s a c c h a r i d ey i e l dr e a c h e d2 6 5 9 lw h e nu s e dt h em e d i u ma b o v e t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：i n i t i a lp h 5 6 6 ( n a t u r a l ) c u l t u r et e m p e r a t u r e 2 8 ，i n o c u l a t i o na g e4 5 d ，i n o c u l a t i o nq u a n t i t y1o ，8 0m l m e d i u mi n2 5 0 m l s h a k i n gf l a s k t h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u e so f a u r i c u l a r i aa u r i c u l ae x t r o p o l y s a c c h a d eh a db e e n s t u d i e da sw e l l t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta f t e rt h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lr e a c h e d 3 0 i nt h ef i r s ts t e p ，t h ec o n c e n t r a t i o no fe t h a n o ls h o u l dr e a c h7 5 i nt h es e c o n ds t e p a n dt h e n , d e p o s i ta tt e m p e r a t u r e4 f o r2 4 h t h et e s t si n15 lf e r m e n t o rs h o w e dt h a th i g h e rv e n t i l a t o r yv o l u m ew a sg o o df o r t h es u b m e r g e df e r m e n t a t i o no fa u r i c u l a r i aa u r i c u l a a n dc o n s i d e r i n gt h ep r a c t i c e ， 6 v v i mw a sb e t t e r t h er e s u l to ft e m p e r a t u r ec o n t r o l l e ds t r a t e g ys t u d ys h o w e dt h a t f o r m0t o8 4 h ，i ts h o u l db ec u l t u r e du n d e r2 8 ，a n df o r m8 4t o14 4 hi ts h o u l db e c u l t u r e du n d e r2 5 t h er e s u l to fp hc o n t r o l l e ds t r a t e g ys h o w e dt h a tf o r m0t o8 4 h i ts h o u l db ec u l t u r e du n d e rp h 5 1 a n df o r m8 4t o14 4 hi ts h o u l db ec u l t u r e du n d e rp h 5 7 u n d e l - t h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ey i e l do f e x t r o p o l y s a c c h a r i d er e a c h e d3 4 2 9 l k e yw o r d s ：a u r i c u l a r i aa u r i c u l a ；f u n 季；c h i n e s eh e r bm e d i c i n e ；e x t r o - p o l y s a c c h a r i d e ； s u b m e r g e dc u l t u r e ；f e r m e n t a t i o nt e c h n i q u e ；e x t r a c t ；l5 lf e n n e n t o r 贵州大学硕：仁学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意- i 7 , 至l j 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：丞丕堑 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：；童茎签 导师签名：日期：2q q l 生丝旦 贵州大学硕十学位论文 第一章绪论 1 1 立题背景 黑木耳( a u r i c u l a r i aa u r i c u l a ，简写为彳a ) ，主要因其侧生于树木上，形似 人耳而得名木耳；又似蛾蝶玉立，名木蛾；因它的味道有如鸡肉鲜美，亦名树鸡； 重瓣的木耳在树上互相镶嵌，宛如片片浮云，又有云耳之称。黑木耳的其他商品 名还有细木耳、光木耳、川耳、黑菜、木菌、耳子、榆耳、桑耳等。 黑木耳在分类学上隶属木耳目、木耳科、木耳属。它的子实体一般较小，两 面光滑、黑褐色、半透明、浅圆盘形、耳形或不规则形，胶质，新鲜时软，干后 收缩。是生长在朽木上的一种腐生菌，由菌丝体和子实体两部分组成。菌丝体为 无色透明，生长在朽木的内部，子实体则生长在朽木的表面，为可食用部分【柏1 。 随着近几年我国经济的高速发展，人民的物质生活水平有了很大的提高，人 们开始大量接触高糖、高脂的食品。加之当今社会快节奏的生活方式，人们往往 忽视体育锻炼，造成高血压、高血脂等“富贵病”。这些疾病已经成为威胁我国人 民身体健康的重要因素。黑木耳因具有药、食两用特性，特别是其含有的多糖成 分具有改善上述病症之效果，因而成为药品与保健食品开发的新来源。 1 1 1 黑木耳的营养价值 黑木耳香嫩可口，糖类、蛋白质、铁等物质的含量较高，是倍受人们欢迎的 食品。现代科学研究和大量动物实验已经证实，黑木耳含有丰富的蛋白质，其含 量相当于同等重量的肉类，而且这种蛋白质人体容易吸收。文献资丰 4 1 4 3 1 表明，黑 木耳中含有十七种氨基酸，总含量为5 6 4 1 0 3 8 9 ( 每l o o g 干木耳) ，其中赖氨酸 o 1 8 0 7 2 9 、组氨酸0 5 7 9 、苏氨酸0 3 2 - 0 7 2 9 、精氨酸0 1 6 0 7 6 9 、天门冬氨酸 0 4 8 1 1 9 、丝氨酸0 3 9 - 0 6 6 9 、谷氨酸o 6 6 一1 1 6 9 、脯氨酸0 1 9 - 0 6 2 9 、甘氨酸 o 2 7 0 5 9 9 、丙氨酸o 4 1 0 8 1 9 、胱氨酸微量、缬氨酸o 3 0 6 9 9 、蛋氨酸o 0 8 9 、 异亮氨酸o 2 6 - 0 4 5 9 、亮氨酸o 4 3 - 0 7 5 9 、酪氨酸o 1 3 - 0 3 7 9 、苯丙氨酸o 2 - 1 1 3 9 。 黑木耳不仅蛋白质、氨基酸含量高，还是一种含铁和钙元素较高的食品，所 含铁元素在食用菌家族中名列前茅，比银耳高6 倍，比动物食品中含铁量最高的 猪肝高近7 倍，比蔬菜中含铁最高的芹菜高2 0 倍，比肉类高1 0 0 倍，为各类食 品含铁之冠。钙的含量也非常高，是肉类的3 0 7 0 倍，黑木耳的矿物质含量比一 贵州人学硕士学位论文 般米、面、蔬菜高4 1 0 倍，详细营养检测结果数据见表1 1 t 3 4 1 。 表1 1 黑木耳与一些食物营养成分的比较( 每l o o g 含量) t a b l e1 1c o m p a r i s o no fn u t r i t i o nc o n t e n t si na a a n do t h e rf o o d s ( inlo o g ) 1 1 2 黑木耳的药用价值 食用菌是我国传统的药、食同源食品。作为我国中医中药文化中的一个重要 部分，一直为历代医家所推崇，我国医务工作者很早就开始将食用菌应用于药膳 来治疗或辅助治疗多种疾病。 在周礼尔雅等古籍中记载了应用食用菌食疗食补的内容；礼记中 也记载了关于食用菌的栽培技术；千金要方、御药院方等古代医学典籍中 已记载过食用菌的护肽美容作用；我国第一部药典，汉代的神农本草经记载 有将灵芝、茯苓、银耳、冬虫夏草等作为药物使用，其将黑木耳描述为：“桑耳 黑者，主女子漏下赤汁，血病症、瘕积聚、阴痛、阴阳寒热，无子”；明代李时 珍的本草纲目【l7 】中记载黑木耳“益气不饥，轻身强志，断谷治痔”、“性平、 昧干”、“益血不饥、强身健体”，具有补氧益智、润肺补脑、凉血、活血、益气 强身等功效。主治“崩中漏下，血痢下血、痔疮、贫血、肠风下痢”。对痔瘘便血、 产后淤血、女子经血过量、尿血及外伤出血等病症均有较好辅助疗效；刘波的中 国药用真菌等书中也曾记载木耳能治疗寒湿性腰腿疼痛、产后虚弱，外伤引起 2 贵州人学硕j j 学位论文 的疼痛、血脉不通、麻木、手足抽搐，以及痔疮、肠风、白带过多、便血、子宫 出血、反胃多痰、误食中毒、高血压、血管硬化、眼底出血、诸疮溃烂、不能结 痂者等病症。 1 2 国内外黑木耳多糖研究进展 1 2 1 黑木耳深层发酵研究进展 真菌多糖获得方法一般有两种：一是从固体培养的子实体中提取，二是通过 深层发酵获得。相对于从子实体提取多糖，深层发酵具有以下几方面的优势【3 6 】： 1 生产迅速，生产周期大大缩短；2 能有目的地获取高含量的次级代谢产物； 3 液体种子替代固体种子，具备菌龄一致、接种方便等优点；4 劳动强度小， 且不受季节及地域限制。 自1 9 4 8 年美国h u m f e l dh 等人成功地对蘑菇进行深层发酵和1 9 5 7 年s z u e e s j 等用发酵罐对羊肚菌的深层培养以来，液体深层发酵技术在食药用菌制种、综 合利用等方面的应用日趋广泛【4 8 1 。目前，世界上已有5 0 多种食药用菌进行了液 体发酵实验。至今国内已进行深层发酵并工业化生产应用的食药用菌有冬虫夏 草、云芝、灵芝、银耳、猴头、竹荪、猪苓、蜜环菌、香菇、麦角菌、小杯珊瑚 菌、d , , i i 猴头等【3 9 1 。 唐青涛等曾对黑木耳深层发酵生产多糖进行了初步的探索性研究。从7 种 黑木耳菌株中筛选出生长较快并且产胞外多糖量较大的菌株作为出发菌，转接液 体种，摇瓶培养后作为菌种，以正交试验优化深层发酵条件。结果表明：葡萄糖 2 ，酵母膏o 3 ，起始p h 6 0 为黑木耳产多糖较合适条件，产量最高达o 7 4 5g l 。 肖彩霞等3 刀对黑木耳胞外多糖深层发酵培养基进行了优化。以其实验室保藏 的黑木耳菌种作为出发菌，转接制备液体种后，通过单因素实验以及正交优化， 得出黑木耳最佳深层发酵培养基为：葡萄糖4 0g l ，豆饼粉9g l ，k h 2 p 0 44g t , ， 无机盐x 2 2 l 。 w u 等【1 2 1 研究了p h 对黑木耳深层发酵的影响，采用摇瓶发酵研究了单因素 最佳培养条件，之后用补料发酵法研究了p h 对胞外多糖产量的影响。结果表明， p h 5 0 有利于菌丝体生长，p h 5 5 有利于胞外多糖的积累。通过参数分析，在发 酵过程前期采用p h 5 0 ，后期采用p h 5 5 ，多糖产量进一步提高。因此得出结论： 在不同的发酵阶段采用不同的发酵条件来适应细胞代谢需求，可以促进菌丝深层 3 贵州大学硕t 学位论文 发酵代谢产物的积累。 可见，目前对黑木耳多糖深层发酵的研究仍处于初始阶段，对于深层发酵工 艺需进一步深入研究。 1 2 2 黑木耳多糖分子结构研究进展 a k i r am 等【l 】从黑木耳中分离出4 种多糖组分：f i a ，f i b ，f i i 和f i i i 。其中， f i a ，f i i 为酸性杂多糖，由d 一木糖、d 甘露糖、d 葡萄糖、d 葡萄糖醛酸组成。 另外2 种多糖成分f i b 和f i i i 主链为p 一( 1 3 ) d 一葡聚糖，此两种葡聚糖成分的侧 链与主链以3 - ( 1 6 ) 键连接。区别在于，f i b 的主链有部分葡萄糖残基被单个葡萄 糖基取代，这种多羟基基团的存在使其为水溶性；而f i l l 在主链上有部分葡萄糖 残基被短链的葡聚糖残基取代，其分支程度比f i b 要高，为水不溶性。 l i n a 等【1 6 1 从黑木耳子实体中提取得到了3 种d 葡聚糖( a ，c ，e ) 和2 种 酸性杂多糖( b ，d ) ，它们具有不同的相对分子质量和分子结构。通过纸层析和 气相色谱等研究后发现，3 种葡聚糖的主链主要由p ( 1 3 ) 一d 一葡萄糖构成，而侧 链有多种变化。2 种酸性多糖含有d 木糖、d 甘露糖、d 半乳糖、d 葡萄糖和 葡萄糖醛酸残基。经过检测，这5 种多糖( a ，c ，e ，b ，d ) 的平均相对分子 质量分别为1 1 7 x 1 0 4 ，1 4 4 x 1 0 4 ，2 0 0 x 1 0 4 ，5 0 x 1 0 4 和3 0 x 1 0 4 。通过黏性分析发现， 在水溶液中，a ，e 两种成分含有刚性链结构，而b ，c ，e 3 种成分具有柔性链 结构。 两项研究所得结果大致相同，均从黑木耳多糖中分离得到了b d 一葡聚糖组分 和酸性多糖组分，酸性多糖成分由d 木糖、d 甘露糖、d 半乳糖、d 葡萄糖和 葡萄糖醛酸构成。还有一些差异，可能是分离方法和操作条件不同的结果。 1 2 3 黑木耳多糖的生物学活性研究进展 黑木耳的现代药用活性研究始于2 0 世纪8 0 年代，首先h a m m e r s c h m i d t 发现 其有抑制人血小板聚集的作用3 1 ，从而引起关注。1 9 8 2 年，吴梧桐等从中分离出 重要功能性成分黑木耳多糖【3 3 1 。随后的大量研究发现，黑木耳多糖还对免疫有良 好的促进作用，且有降血糖、降血脂、降胆固醇、抗血栓、抗肿瘤、抗辐射、清 除氧自由基等多种功效。 1 2 3 1 降血糖活性 4 贵州大学硕士学位论文 韩春然等【2 4 】用纤维素酶和蛋白酶从黑木耳当中提取出了相对分子质量分别 为3 1 7 x 1 0 5 和1 8 3 x 1 0 5 的2 种多糖组分。以糖尿病小鼠为对象，与空白正常小鼠 对照，研究了黑木耳多糖的降血糖功能。使用剂量分别为1 0 0 、2 0 0 、4 0 0m g k g 。 结果表明，当剂量在2 0 0m g k g 以上时，黑木耳多糖能够显著降低糖尿病小鼠的 血糖值，但对正常小鼠的血糖值没有影响，表明黑木耳多糖能够增加糖尿病小鼠 的糖耐量。 1 2 3 2 降血脂活性 血液中过高的胆固醇、甘油三脂以及血管壁上过多的脂类容易被氧化，形成 脂质过氧化物质。因此积极治疗高血脂症，对防治心脑血管疾病有重要意义。周 国华等】研究了黑木耳多糖的降血脂作用，建立高血脂症小鼠模型，用低中高3 种不同浓度的黑木耳多糖给高脂模型小鼠灌胃。结果表明，黑木耳多糖组小鼠的 血清甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白均不同程度低于对照组，而高密度脂蛋 白却显著高于对照组，表明黑木耳多糖确有降血脂作用。 蔡小玲等【l9 】每天对高脂血症小白鼠注射黑木耳多糖，研究黑木耳多糖的降胆 固醇效果。l 周后小白鼠血清中的胆固醇量显著降低，表明此多糖有明显的降低 胆固醇的作用，而降血脂主要就表现在降胆固醇上。 1 2 3 3 抗肿瘤活性 黑木耳多糖具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制可能与影响红细胞膜流动 性、减少肿瘤免疫抑制、增强红细胞膜的活性有关。肿瘤细胞可通过旁路途径激 活并粘附补体，与红细胞c r l 结合。红细胞通过c r l 等机制识别肿瘤抗原与肿 瘤细胞粘附，同时红细胞中的氧化酶与补体可共同杀伤肿瘤细胞，攻击癌细胞【l l 】。 a k i r am 等【i 】研究从子实体黑木耳提取的多糖的化学结构与其抗肿瘤活性的 相互关系，认为黑木耳中提取的水溶性葡聚糖成分具有明显的抗肿瘤作用。张秀 娟等5 钉研究了黑木耳多糖对红细胞膜流动性和免疫粘附作用的影响，结果表明， 肿瘤的发生与黑木耳多糖的治疗对小鼠红细胞膜组分均有一定的影响。s 1 8 0 荷 瘤小鼠红细胞膜的流动性较正常小鼠高，经精制黑木耳多糖治疗后，可使其流动 性降低；而h 2 2 荷瘤小鼠红细胞膜流动性降低，经药物治疗可使其流动性增加。 同时，其在试验中还发现，h 2 2 荷瘤小鼠的红细胞免疫粘附肿瘤细胞的能力较正 常小鼠显著下降，经黑木耳多糖治疗后，该指标得到了显著提高。 5 贵州大学硕十学位论文 1 2 3 4 抗凝血活性 s o o n 掣9 1 研究了黑木耳多糖的抗凝血作用，用水提法、碱提法、酸提法分别 从黑木耳中分离得到了具有抗凝血作用的酸性多糖，其中碱提法得到的多糖抗凝 血活性最高。用凝胶过滤法进行纯化，具有抗凝血活性的纯多糖成分相对分子质 量大约为1 6 x 1 0 5 。给小鼠饲喂多糖，观察到黑木耳多糖有抑制血小板凝集的作 用，其抗凝血作用主要是抑制凝血酶的活性，由此认为黑木耳多糖可作为新的治 疗血栓的药物。 1 2 3 5 抗辐射活性 具有高度增殖和分化潜能的细胞群体容易受到电离辐射影响，使细胞损伤， d n a 突变，造成细胞异常分化、癌变或引起后代畸形等。樊黎生等2 2 1 研究了黑 木耳多糖对受辐射后小鼠存活的影响，用6 0 c o y 射线作为辐射源，皮源距1 0 0 c m 照射小鼠。多糖组小鼠用低、中、高3 种水平多糖灌胃，空白组小鼠用蒸馏水灌 胃。结果表明，黑木耳多糖灌胃后可明显提高辐射小鼠的存活率和存活时间。黑 木耳多糖可以促进辐射小鼠白细胞数目的恢复，保护造血组织，降低辐射后小鼠 的骨髓微核率和精子畸变率，从而降低细胞及染色体的损伤。但更适宜的剂量有 待进一步研究。 1 2 3 6 对动物运动机能的影响 史亚丽等【2 明将雄性昆明种小鼠4 0 只，随机分为对照组和多糖组，每组2 0 只。 多糖组小鼠灌胃黑木耳粗多糖2 5m g k g d ，对照组灌胃生理盐水0 2m l d ，连续 灌胃2 0d 。考察黑木耳粗多糖对小鼠耐缺氧时间、力竭游泳时间等多项生理指标 的影响。结果显示，多糖组的耐缺氧时间显著长于对照组，但两组力竭游泳时问 差异不显著。多糖组小鼠的血红蛋白，肝糖原水平显著高于对照组。而血乳酸及 血尿氮水平显著低于对照组。表明黑木耳粗多糖能明显提高小鼠耐缺氧时间，血 红蛋白水平，降低定量负荷后血乳酸及血尿氮水平，有明显的提高运动能力的作 用。 1 2 3 7 抗衰老活性 范亚明等人【2 3 】把小鼠随机分成正常组、高胆固醇组和黑木耳加等量胆固醇三 组，三个月后测得黑木耳加等量胆固醇组小鼠血清中的丙二醛含量显著下降，而 6 贵州人学硕上学位论文 前两组则变化不明显。这表明黑木耳具有抑制脂质过氧化的作用。而脂质过氧化 与衰老有密切的关系，因而黑木耳能延缓衰老。 肖瑛等人4 1 1 对实验性动脉粥样硬化家兔进行了实验，发现黑木耳有降低氧自 由基、肝、心、脑组织褐变质、血浆过氧化血质、血浆胆固醇含量及减轻a s 病 变的作用，从而推测其有抗老的作用。陈依军等人【2 0 1 在果蝇身上进行实验，发现 黑木耳多糖能明显延长果蝇的平均寿命。夏尔宁等人【3 8 1 研究得出结论，黑木耳多 糖对可提高小鼠肝脏药物氧化代谢，加强肝脏解毒功能，这是黑木耳多糖延缓衰 老的另一重要指标。 1 3 本课题的研究意义 随着人们生活水平的提高，高血压、高脂血症已成为危害人们身体健康的常 见病，特别是在中老年人群中，其引起的多种并发症更是加大了危害性。据资料 报导【4 9 】，1 9 9 0 年美国低脂食品的销售为1 8 0 0 0 0 亿美元，1 9 9 5 年达到4 1 0 0 0 0 亿 美元。在我国，仅北京市每2 0 分钟就有1 人死于心血管疾病，在我国死亡总数 中的比例由5 0 年代的2 0 一跃升至目前的5 0 以上。我国每年约有1 0 0 万人死 于心血管疾病。 根据美国临床冠心病预防和血脂关系研究的结果，年龄3 5 3 9 岁血总胆固醇 水平 2 6 5m g d l ，甘油三酯水平 f o o l ( 9 ，5 ) = 1 0 1 6 ，且该方程的决定系数r 2 为0 9 5 9 8 ，修正决定系数a d j r 2 为 0 8 8 7 5 ，说明该模型能对试验数据结果进行较好的拟和，因此该模型可用于预测 黑木耳发酵生产多糖的实际情况。 表3 7 模型方差分析表 t a b l e 3 7a n o v aa n a l y s e so fm o d e l 图3 4 列出了单因素预测图。在保持1 个因素为最优条件下，其余2 个因素 与响应值之间的关系如图3 5 和3 6 所示。图3 5 为等高线图，图3 6 为三维曲面 图，两图直观地反应了各因素对响应值的影响关系。 2 8 贵州人学硕i 学位论文 拍j 千i 晕膏水平 图3 4 单因素预测图 烈兰永平 响应值与无机盐束平，葡萄糖水平的等值线囤 葡萄蕾水平 多茁含量 雁巫 斗* 翊车悄 出州人学坷j ：学位论立 睁 * 趣0 时 鼬 睁 * 描 导 m 响应值与酵母膏水平，葡萄糖水平的等值线图 酵母罾水平 回 圈3 5 响麻面法等高线圈 f ig i l r e 35 c o n t o u r p l o t s o f r 器p o n d l n g s u 如m a m o d 自应值 考察了六种贵州特色中药的水提取液和乙醇提取液对黑木耳深层发酵菌 丝体和胞外多糖产量的影响。综合考虑下，天麻乙醇提取液为适宜添加的多糖增 产促进因素。 3 营养源试验及响应面试验得出添加天麻乙醇提取液的黑木耳深层发酵优 化培养基组成为：葡萄糖3 7 8 1 9 l 、酵母膏1 0 2 3 9 l 、天麻乙醇提取液3 0 9 l 、 k h z p 0 4 3 9 4 9 l 、m g s 0 4 1 9 7 9 l ，再此基础上测得的最大黑木耳胞外多糖浓度可 达2 6 5 9 l 。 4 通过单因素试验确定了黑木耳深层发酵的适宜工艺条件为：初始p h 自然 ( 5 6 6 ) 、接种量1 0 、种龄4 d 、培养温度2 8 、2 5 0m l 三角瓶装液8 0 m l 。 5 黑木耳发酵液胞外多糖最佳提取工艺为：第一步加入乙醇至浓度达到 3 0 ，第二步追加乙醇达到7 5 。静置温度为4 ，沉淀时间为2 4 h 。 6 采用优化后的发酵培养基在1 5 l 发酵罐上进行了小试研究。确定了添加 天麻乙醇提取液的黑木耳深层发酵适宜的发酵周期为9 6 h 1 0 8 h 。 7 通过对比通气量大小对发酵过程的影响，确定了6 v v m 为较合适的发酵 罐通气量，发酵液最高黑木耳胞外多糖浓度可达3 1 6 9 l 。 8 在o h 一8 4 h 控制2 8 。c 培养，8 4 h 一1 4 4 h 控制2 5 培养，为最佳两段温度控 制策略。此条件下，发酵液最高黑木耳胞外多糖浓度可达3 2 8 9 l 。 9 在o h 8 4 h 控制发酵液p h 5 1 ，8 4 h 一1 4 4 h 控制p h 5 7 ，为最佳两段p h 控制 策略。此条件下，发酵液最高黑木耳胞外多糖浓度可达3 2 0 l 。 1 0 综合验证试验设定通气量为6 v v m ，在o h 8 4 h 内控制发酵罐培养温度 为2 8 。c 、p h 5 1 ，在8 4 h 一1 4 4 h 时间段内控制发酵罐温度为2 5 * ( 2 、p h 5 7 ，发酵液 最高黑木耳胞外多糖浓度可达3 4 2 9 l 。 2 ，展望 1 天麻乙醇提取液对黑木耳深层发酵胞外多糖的促进效果是整体上的，但 天麻乙醇提取液成分复杂，所以值得进一步研究探讨具体是天麻乙醇提取液中的 ，o ，-一 哪种( 些) 物质起到了促进作用。 。2 本研究仅从试验现象上得出天麻乙醇提取液可以促进黑木耳深层发酵胞 ，外多糖的产生这一结论，但其深层次的作用机理仍有待进_ 步展开研究。 5 5 贵州人学硕i - 学位论文 致谢 本论文是在尊敬的导师吴天祥教授的精心指导和悉心帮助下完成的，从本论 文的选题、研究方案的设计再到论文的最后审阅和定稿都凝聚了吴教授的智慧和 大量的心血。吴教授渊博的学识、敏捷的思维，以及严谨治学的作风和实事求是 的科学态度，对我产生的影响将使我在今后的工作和研究中受益。在此，谨向关 心我学习和生活的恩师致以最崇高的敬意和真挚的感谢! 同样非常感谢我的第二导师温州大学的杨海龙教授，在本研究进行期间，杨 教授在研究路线的制定和试验条件上给予我极大地指导和帮助。同时，杨教授在 科研中勤勤恳恳、一丝不苟的精神也深深地感染着我。 o 感谢西南大学的邹祥博士在真菌菌种培养以及发酵技术方面对我的详细指导。 - 在本课题的研究过程中，得到了本实验室赵亮、张徐兰、郑岩、田永峰等同 学的大量帮助，在此表示衷心感谢! 还要感谢西南大学郭霞同学和齐齐哈尔大学 刘同军同学在学业上和生活中对作者的大量帮助! 再次感谢我的导师和同学们，感谢他们在这三年中给予我的关心和帮助。谢 谢大家! 贵州大学硕士学位论丈 主要参考文献 【1 】a k i r am ，m a r i k ok ，t a k u m as ，e ta 1 s t u d i e so ni n t e r r e l a t i o no fs t r u c t u r ea n d a n t i t u m o re f f e c t so fp o l y s a c c h a r i d e s ：a n t i t u m o ra c t i o no f p e r i o d a t e - m o d i f i e d ， b r a n c h e d ( 1 3 ) - p d g l u c a no fa u r i c u l a r i aa u r i c u l a - j u d a e ，a n do t h e rp o l y s a c c h a r i d e s c o n t a i n i n g ( 1 3 ) 一g l y c o s i d i cl i n k a g e s j c a r b o h y d rr e s ，1 9 8 1 ，9 2 ( 1 ) ：11 5 1 2 9 【2 】d u b o i sm ，g i l l e sk a ，h a m i l t o nj k c o l o r i m e t r i cm e t h o df o rd e t e r m i n a t i o no f s u g a r sa n dr e l a t e ds u b s t a n c e s j a n a l yc h e m ，19 5 6 ，2 8 ：3 5 0 3 5 6 【3 】h a m m e r s c h m i d td e s z e c h w a np r u p u r a m n e n g l jm e d ，19 8 0 【4 】h a o 飙a n e w d i - ( p h y d r o x y b e n z y l ) h y d r o x y l a m i n ef r o mg a s t r o d i a e l a t ab i j c h i n e s ec h e m i c a ll e t t e r s ，19 9 9 ，10 ( 6 ) ：4 6 7 【5 】k i ms w , h w a n gh j ，x uc p o p t i m i z a t i o no fs u b m e r g e dc u l t u r ep r o c e s sf o r t h ep r o d u c t i o no fm y c e l i a lb i o m a s sa n de x o - p o l y s a c c h a r i d e sb yc o r d y c e p sm i l i t a r i s c 7 3 8 j ja p p lm i c r o b i o l ，2 0 0 3 ，9 4 ( 1 ) ：1 2 0 - 1 2 6 【6 】l i nj h p a r i s h i n sb a n dcf r o mr h i z o m e so fg a s t r o d i a e l a t j p h y t o c h e m i s t r y , 19 9 6 ，4 2 ( 2 ) ：5 4 9 【7 】l ip z ，z h a n gk c s t u d i e so np hc o n t r o l l e df e r m e n t a t i o no fb i o a c t i v e e x o - p o l y s a c c h a r i d e sb yg a n o d e r m al u c i d u m j b u l lm i c r o b i o l ，2 0 0 2 ，2 7 ( 1 ) ：5 - 8 8 】n o d a n 2 , 4 - b i s ( 4 一h y d r o x y b e n z y l ) p h e n o l f r o m g a s t r o d i a e l a t a j p h y t o c h e m i s t r y , 1 9 9 5 ，3 9 ( 5 ) ：1 2 4 7 【9 】s e o nj y , m y e o n ga y y ur et h en o n t o x i cm u s h r o o ma u r i c u l a r i aa u r i c u l a c o n t a i n sap o l y s a c c h a r i d ew i t ha n t i c o a g u l a n ta c t i v i t ym e d i a t e db ya n t i t h r o m b i n j t h r o m b o s i sr e s ，2 0 0 3 ，1 1 2 ：1 5 1 1 5 8 【10 t a g u c h ih s t u d i e so nt h ec o n s t i t u e n t so fg a s t r o d i ae l a t ab l u m e j c h e m p h a r mb u l l 1 9 8 1 ，2 9 ( 1 ) ：5 5 - 6 2 ， 【11 】w a n gh b ，z h a n gj p , w a n gh t h em e a s u r i n go fr e dc e l lm e m b r a n c ec r1 m o l e c u l ea n di t sc l i n i cm e a n i n g j 】c h i njm i c r o b i o li r n m u n o l ，2 0 0 0 ，2 0 ：3 8 1 【12 】w uj ，d i n gz y , z h a n gk c i m p r o v e m e n to fe x o p o l y s a c c h a r i d ep r o d u c t i o n b ym a e r o - f u n g u sa u r i