（发酵工程专业论文）啤酒超高浓酿造技术的初步研究.pdf

摘要 摘要 超高浓酿造技术是在高浓酿造技术日趋成熟的基础上发展起来的，它可以更大程度 上的降低能源消耗、节省劳动力、提高设备利用率。该项技术国外推广普遍而国内应用 较少。本文从啤酒酵母性能比较、糖化原料配比、麦汁外加氮源的选择及水平的确定、 发酵工艺控制等方面入手，对啤酒的超高浓酿造( 2 0 叩) 技术进行了研究。 论文比较了实验室保存的十株啤酒酵母的渗透压耐受性、酒精耐受性、极限发酵度、 酵母活性及在相同条件下对麦汁中o t 氨基氮同化率等指标，并通过模糊综合评价法对啤 酒酵母性能进行评定，从而筛选出性能更加优良的较为适合超高浓酿造的酵母菌株，作 为后续实验的出发菌株。 为了研究最佳的原料配比和麦汁指标的评价体系，将原麦汁浓度；麦汁的p h ；糖 浆添加比例为主要因素，采用2 3 全因子分析设计上述三个因素的试验水平对啤酒酿造生 产率( b r e w i n g p r o d u c t i v i t y ) i l l 的影响。结果表明，糖浆添加比例对啤酒酿造生产率没有影 响，而麦汁的p h ，原麦汁浓度对酿造生产率的影响较大。当麦汁p h 和原麦汁浓度分别 控制在5 5 和2 0 叩时，酿造生产率较高。并且试验设计预测的酿造生产率为0 1 5 l h 与验证性试验所达到0 1 4 6 l h 基本接近。说明因子分析能够较好的预测实验结果。 根据啤酒酵母在代谢过程中所需的营养条件，将酵母食物作为麦汁的氮源补充形 式，以麦汁中o t 氨基氮的含量作为衡量指标，分析酵母食物的添加对发酵液中双乙酰、 高级醇、发酵度等指标的影响。选择了一种氨基酸谱较为合理的酵母食物种类，并确定 2 0 0 p 超高浓麦汁中最佳仪一氨基氮含量为2 1 0m g l 。 为了研究超高浓酿造的最佳发酵条件，采用发酵过程监控与实验设计相结合的手 段，确定了最佳的发酵工艺：前酵温度为1 5 ，后酵温度为1 2 ，接种量为2 5 1 0 7 个m l 。最终对超高浓酿造后稀释啤酒和普通啤酒进行了理化指标的测定及口味品尝实 验，结果表明：超高浓酿造的啤酒在主体风味上与普通啤酒相似，醇酯比合理，发酵度 稍低，色度稍浅，口感清爽协调，非生物稳定性和抗氧化能力高。 关键词：超高浓酿造，啤酒，啤酒酵母，糖浆，0 l 氨基氮，啤酒酿造生产率 a b s t r a c t a b s t r a c t w i t ht h em a t u r i n go fh i g hg r a v i t yb r e w i n g ，v e r yh i g hg r a v i t yb r e w i n gw a sd e v e l o p e d ， t h i st e c h n o l o g yc o u l dr e d u c ee n e r g ys o u r c e sw a s t e ，s a v el a b o rf o r c e ，g n h a n c ee q u i p m e n t e f f i c i e n c y , e f f e c t i v e l y i tw a sw i d e l yu s e do v e r s e a sb u tl e s si nc h i n a i nt h i sp a p e r , v e r yh i g h g r a v i t yb r e w i n gw a ss t u d i e df r o mc o m p a r i s o n so fy e a s tc h a r a c t e r i s t i c s ，r a wm a t e r i a lr a t i o ， s e l e c t i o no fn i t r o g e nv a r i e t ya n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n d i f f e r e n c e si nf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c si n c l u d i n ga l c o h o lr e s i s t a n tc a p a c i t y , o s m o t i c p r e s s u r er e s i s t a n tc a p a c i t y , f l o c c u l a t i o nc a p a b i l i t y , r e a la t t e n u a t i o n ，a s s i m i l a t i v er a t i o no ff r e e a m i n on i t r o g e n ( f a n )o ft e n y e a s t s t r a i n sw e r ec o m p a r e da n de x a m i n e d f u z z y c o m p r e h e n s i v ee v a l u a t i o nw a su s e dt oa n a l y z et h ep r o p e r t i e so f10s t r a i n s m a k et h e c h a r a c t e r i s t i c sq u a n t i f i c a t i o n a la n ds e l e c t e dt h ee x c e l l e n ts t r a i nf o rv e r yh i 曲g r a v i t yb r e w i n g a st h es t r a i n sf o re x p e r i m e n ts u c c e d e n t i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eb e s tc o m p o u n do fr a wm a t e r i a la n de v a l u a t es y s t e mo fw o r t f a c t o r s ，t h ei n f l u e n c e so nb r e w i n gp r o d u c t i v i t yo ft h r e ef a c t o r so fv e r yh i g hg r a v i t yw o r tw e r e s t u d i e di n t h i sp a p e r o r i g i n a le x t r a c t ，i n i t i a lp ha n dp e r c e n t a g eo fc o ms y r u pi nt h e c o m p o s i t i o no ft h ew o r tw e r es t u d i e di no r d e rt od e t e r m i n et h e i ri n f l u e n c eo nt h ep r o d u c t i v i t y o ff e r m e n t a t i o n u t i l i z i n g2 3f a c t o r i a ld e s i g no ft h e s ef a c t o r s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e p e r c e n t a g eo fc o r ns y r u ph a dn oi n f l u e n c eo np r o c e s sp r o d u c t i v i t yw h e r e a si n i t i a lp ha n d e s p e c i a l l yi n i t i a lw o r tc o n c e n t r a t i o nd i d w h e np ha n di n i t i a lw o r tc o n c e n t r a t i o nv a l u e sw e r e 5 5a n d2 0 叩，r e s p e c t i v e l y ，w i l lr e s u l ti nah i g h e rp r o d u c t i v i t y u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h e m o d e lp r e d i c t e dap r o d u c t i v i t yo f0 15 l h v e r i f i c a t i o no ft h eo p t i m i z a t i o ns h o w e dt h a ta p r o d u c t i v i t yo f0 14 6g l hw a so b s e r v e du n d e ro p t i m a lc o n d i t i o n s i ts h o w e dt h a tt h e e x p e r i m e n t a ld a t ac a nb er e l i a b l yp r e d i c t e db yt h ep o l y n o m i a lm o d e l s u c c e s s i v e l y , o t h e rf i v e s t r a i n sw e r ef e r m e n t e di nt h i sc o n d i t i o n t os o m ee x t e n t ，p r o d u c t i v i t yw a sh i g h e rt h a nt h a ti n o t h e rc o n d i t i o n s e s p e c i a l l yn o 2a n dn o 3s h o w e dam o t er e m a r k a b l et r e n d ，i n c r e a s i n gt h e p r o d u c t i v i t yo f3 2 7 a n d3 0 ，r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt ot h er e q u i r e m e n t so ft h eb r e w i n gy e a s tm e t a b o l i s m ，a d d e dy e a s tf o o da s s u p p l e m e n to fn i t r o g e ni n t ow o r t ，f a ni nv e r yh i g hg r a v i t yw o r tw a sa si m p o r t a n tf a c t o r , a n a l y z et h ee f f e c to ft h es u p p l e m e n t a t i o no fy e a s tf o o do nd e p r e s s e ds u g a rr a t e ，t h ec o n t e n to f a c e t y l ，t h ec o n t e n to fh i g h e ra l c o h o l sa n dt h ei n d i c e so ft h eb e e r , f i n a l l y ak i n do fy e a s tf o o d w a ss e l e c t e dw h i c hh a sr e a s o n a b l ea m i n oa c i ds p e c t n m aa n dc o n f i r m e dt h a tt h eo p t i m a l c o n t e n t so ff a ni nt h ev e r y h i g hg r a v i t yw o r tw a s210m g l i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h eb e s tf e r m e n t i o nc o n d i t i o no fv e r yh i g hg r a v i t yb r e w i n g , b y f a c t o r i a lm e t h o d o l o g ya n da n a l y s i st h eo p t i m a lf e n n e n t i o nf a c t o r sf o rh i g h e rp r o d u c t i v i t yw a s ： m a i nf e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e15 ，s e c o n df e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e12 ，i n o c u l a t i o nr a t e 2 5 x1 07 c e l l m l s u c c e s s i v e l y , p h y s i c a l c h e m i c a li n d i c e so fb e e ra n dt a s t i n gd e g u s t a t i o n e x p e r i m e n t a t i o nw e r eu s e dt oa n a l y z et h ev e r yh i g hg r a v i t yb r e w i n gb e e ra n dn o r m a lg r a v i t y b e e r , c o m p a r i s o nt h e mb yd e t e c t i o no fp h y s i c a l - c h e m i c a li n d i c e sa sw e l la sd e g u s t a t i o n t e s t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a i nf l a v o ro fb o t hb e e r sw e r es i m i l a r , v e r yh i g hg r a v i t y b r e w e db e e rh a sr e a s o n a b l ep r o p o r t i o no fa l c o h o l st oe s t e r sa n dw a sl o w e ra t t e n u a t i o n ，l o w e r l a b s t r a c t c o l o r , h i g h e rn o n b i o l o g i c a ls t a b i l i t y , s t r o n g e ra n t i o x i d a t i v ea b i l i t y ，a n di t sm o u t hf e e ll i g h t a n dh a r m o n y k e y w o r d s ：v e r yh i g hg r a v i t yb r e w i n g ，b e e r , s a c c h a r o m y c ec a r l s b e r g e n s i s ，y e a s tf o o d ，f a n ， b r e w i n gp r o d u c t i v i t y u 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 垂鲢矗 日 期：翻：星! 冱 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 中国啤酒工业的发展 啤酒是指以麦芽( 包括特种麦芽) 、水为主要原料，加啤酒花( 包括酒花制品) ，经酵 母发酵酿制而成，含有c 0 2 、起泡的、低酒精度的发酵酒，现在除了伊斯兰国家，由于 宗教原因不饮啤酒外，啤酒遍及世界各国，是世界最大的饮料酒【2 】。据史料记载，最初 巴比伦人把几种谷物磨碎后加水和成面团，经烤制后放在容器中自然发酵，这就是啤酒 的雏形。后来在世界各地酿制出各种各样的啤酒，所采用的原料有所不同，口味也各异 1 3 】。所用原料有大麦、小麦、荞麦等。由于大麦麦芽具有优良的酿造特性，所以逐渐取 代了其他谷物而成为啤酒酿造的主要原料，其他谷物只是作为辅料使用。到公元八世纪， 德国人将大麦麦芽作为啤酒酿造的唯一原料固定下来，并于1 5 1 6 年制定了啤酒“纯净酿 造法”。其他国家虽然没有专门为此制定法律，但受德国的影响，基本都以大麦麦芽为 主要原料。 我国的啤酒工业己有1 0 0 多年的历史了，目前啤酒工业处于稳步健康的发展中，2 0 0 2 年已成为世界第一大啤酒生产国，2 0 0 7 年年产量达3 9 3 1 万千升，企业间竞争加剧，技 术和资本成为目前我国啤酒工业竞争的主题。 中国啤酒工业的进步主要表现在：( 1 ) 啤酒产量与生产能力稳定增长；( 2 ) 啤酒行业 向规模化、集团化发展；( 3 ) 多品种、高质量发展；( 4 ) 啤酒理化指标合格问题已解决；( 5 ) 啤酒非生物稳定性有很大提高；( 6 ) 啤酒风味稳定性己成为提高产品质量的新目标；( 7 ) 外包装质量明显改善1 4 j 。 1 2 超高浓酿造技术的研究进展 超高浓酿造( v e r yh i g hg r a v i t yb r e w i n g ) 是用比高浓麦汁浓度更高的麦汁进行发酵，在 生产过程的后期用饱和的c 0 2 脱氧水稀释成正常浓度的啤酒。如正常浓度的原麦汁浓度 为1 0 0 p 1 2 0 p ，高浓为1 3o p 1 7 0 p ，而超高浓度为1 8o p 2 4 0 p 。 超高浓酿造工艺采用超高浓麦汁糖化、发酵，最后加水( 脱氧) 稀释的生产方 式，可有效降低糖化车间用水量，不用增加糖化、发酵设备即可满足产量增加 的需要，几乎可以在任何阶段添加脱氧水，包括在麦汁煮沸结束、麦汁冷却、发酵期间 或结束、啤酒后熟期及过滤前后等。与普通高浓酿造相比，超高浓酿造可以更大幅度的 降低能源消耗，节省劳动力，提高设备利用率，提高生产能力【5 j 。其次，采用超高浓酿 造工艺制备的啤酒风味和口感也被改善，更加协调，柔和。在啤酒稀释到正常浓度后， 酯和醇的水平与正常啤酒接近，因此，不会明显改变啤酒的风味【6 j 。此外，超高浓酿造 赋予啤酒品种生产更大的灵活性。可以通过添加不同比例的稀释水生产多种类型产品。 但是，超高浓酿造技术也有一些不足。总结这些缺点如下：( 1 ) 降低了原料的利用率， 糖化过程中原料浸出率下降；( 2 ) 啤酒泡沫稳定性下降；( 3 ) 对啤酒酵母的不利影响，如 影响酵母的发酵和絮凝性，降低酵母对渗透压、酒精及酸洗的耐受性；( 4 ) 发酵时间较长， 江南大掌坝士掌位论文 酵母压力大；( 5 ) 酿造的原料、糖化及发酵工艺要做相应调整【7 1 7 1 0 1 2 1 国内超高浓酿造技术的应用，研究进展 中国啤酒工业近几年一方面由于市场竞争的加剧，产品销售价格平均较低，另一方 面，自2 0 0 3 年以来，啤酒生产原料、辅料、能源、运输等四个环节成木均不同程度的 大幅上涨，导致啤酒生产成本一再攀升，而终端价格比拼和成本挤压双重压力引发的赢 利空间的大压缩，成为整个啤酒行业的坎i 引。 面临巨大的产业竞争，酿造师们对高浓酿造产生了浓厚的兴趣，国内的一些啤酒企 业也开始着眼于这项技术，华光啤酒于2 0 世纪7 0 年代就对高浓酿造啤酒进行了有益的 探讨，即生产浓度为1 2 0 p 1 3 0 p 的麦汁，发酵后用脱氧水稀释为浓度1 0 0 p 8 0 p 的稀释啤 酒的工艺。青岛啤酒集团公司于1 9 9 5 年2 月至3 月，试制了1 5 0 p 麦汁发酵后稀释为l l o p 的啤酒【4 1 。目前国内只有珠江啤酒和k k 啤酒生产过1 8 0 p 的超高浓啤酒，但其仍存在口 味寡淡、发酵不稳定等很多问题。其原因是由于原麦汁浓度的大幅度上升，造成了酵母 对麦汁的营养组成、发酵条件等方面的要求比普通的高浓酿造更严格，甚至在某些技术 方面需要本质的变革。 国内的超高浓酿造技术还处于研究阶段，应用较少。国内对高浓酿造进行过研究的 主要有两人，一是上海交通大学农学院的孙向军教授，他所研究的高浓酿造完全依赖于 大麦糖浆，但是，大麦糖浆的使用并不是长期的问题，其使用的不可行性表现在：目前 啤酒工业上使用糖浆的主要原因是大麦价格的上升，目的在于降低成本，而大麦糖浆则 是是以大麦为来源，通过酶解制备而得，因此在大麦价格不降低的情况下大麦糖浆在价 格上不占优势。另外，青睥集团樊伟总工程师也研究过高浓酿造，但其原麦汁浓度只限 制在1 5 0 p 1 8 叩。 虽然，国内高浓酿造技术的使用已呈上升趋势，但对于更高浓度的超高浓酿造还有 待开拓。 1 2 2 与国外超高浓酿造的差异 美国和加拿大早在上世纪7 0 年代就率先推出高浓酿造啤酒工艺博j 。现在，北美和北 欧的一些国家，已将高浓酿造稀释法作为通常的生产技术，在美国啤酒工业的应用范围 已达7 0 以上。并且，国外对这项技术的研究仍在向纵深发展：麦汁浓度己提高至 1 8 0 p 一2 4 0 p ，甚至达3 0o p 3 6 0 p ，稀释率己达6 0 3 0 0 9 1 ，采用如此高的麦汁浓度，可 想而知，在糖化工艺、酵母选育、发酵技术以及稀释水的处理等方面，一定具有很高的 特殊的要求和很大的难度，但经济意义更加显著，产品的淡爽度更突出。 虽然一直以来国内啤酒企业对超高浓酿造技术的关注程度很高，但是由于传统观念 的束缚，认为当麦汁浓度高于1 6 0 p 时，麦汁中的糖将不能完全被酵母发酵等，高浓酿 造技术还停留在1 2 0 p 1 3 0 p ，与国外的高浓酿造所能达到的浓度仍相差甚远。 但是超高浓酿造技术本身所具有的优势是突出的，市场前景是巨大的，随着啤酒工 业的发展和大众对市场的需求，更多的酿造师们会着眼于该项技术的纵深研究，并且会 被更多的业内人士所认可，最终它将取代传统酿造工艺成为啤酒发展的新趋势。 2 第一苹绪论 1 3 糖浆在啤酒超高浓酿造中的应用概况 通常制备高浓麦汁的方法有两种：( 1 ) 按常规方法制备高浓麦汁，由于需要提高糊化、 糖化醪液的浓度，造成了麦汁搅拌、过滤困难，滤渣残糖高，酒花利用率下降等问题。 ( 2 ) 通过在麦汁煮沸结束前1 0m i n 2 0m i n 加入部分麦芽糖浆，调整麦f l - n 所需要的浸出 物浓度，来制备高浓麦汁。此方法对克服麦汁过滤困难最有效，且不影响麦汁质量，得 到了广泛的应用l i 。 应用糖浆进行超高浓酿造，在国外己成为酿造淡爽型啤酒的成熟工艺。特别是采用 啤酒过滤后稀释技术【l l 】可用同一麦汁酿造出不同浓度不同风格特色的啤酒，有利于啤酒 的多样化【l2 1 。应用糖浆制各高浓麦汁进行高浓酿造一方面能显著地降低啤酒的生产成 本，另一方面进一步提高了最终产品的淡爽度，适应了啤酒消费日趋清淡的时尚，其产 品质量无论是感官指标还是风味物质都比较稳定，易被人们接受3 1 。 超高浓酿造必须以糖浆作为啤酒辅料，在国际上这一做法比较普遍，一些较大的玉 米深加工企业均生产啤酒用糖浆辅料，在欧洲通常用玉米或小麦生产淀粉质糖浆作为啤 酒辅料，在国内糖浆工业起步较晚，由于多方面的因素，糖浆价格长期居高不下，导致 在啤酒行业应用甚少。近几年，随着糖浆价格的下降，在啤酒酿造中逐步得到了使用【1 4 】。 使用糖浆作为辅料有很多优点：( 1 ) 糖浆可以直接添加到煮沸锅中，调节糖化罐中麦 汁中的含氮物质含量，调整麦汁浓度，工艺简单，使用方便，节能降耗。 ( 2 ) 在不添加糖化设备的情况下，提高设备利用率，提高糖化工序能力，提高糖化、发酵 的生产能力。( 3 ) 生产的啤酒色泽浅，口味清爽，抗氧化能力强。( 4 ) 减轻啤酒生产造成 的污染，尤其是在麦汁制备过程中可以减少污染物的产生。( 5 ) 代替部分麦芽，减少麦芽 的用量从而降低成本，还可以缓解啤酒大麦供应不足的矛盾。( 6 ) 提高原料利用率，增加 玉米深加工的经济效益。( 7 ) 使啤酒淡爽型的风味特定更加突出，同时可以增加啤酒的风 味稳定性，延长成品啤酒的货价期【2 5 】。 1 4 立题背景和意义 高浓酿造已有几十年的发展历史，但一直以来麦汁浓度限制在1 6 0 p 以下，是因为 传统的观点认为高于这一浓度的麦汁将不能完全被酵母发酵，啤酒中含有高浓度残糖。 近几年国外的酿造师们对超高浓酿造啤酒进行了广泛而深入的研究，摆脱了传统观点的 束缚建立了新的理论【1 5 】。传统观点，认为对1 6 0 p 的麦汁进行发酵存在着高渗透压及酒 精毒性引起的酵母存活力低、滞缓或终止发酵问题，经研究表明，这种障碍与营养诱导 的生长问题有关。过去长时间认为主要发酵作用由非生长态细胞完成，而新的理论表明 发酵降糖速率与细胞牛长紧密偶联。生长态细胞利用糖的比速率比非生长态细胞大的 多，在新细胞生长减缓期间发酵降糖速率也明显减慢。在超高浓酿造中新细胞合成的时 间和合成量都应超过传统啤酒酿造，这样才能确保在高浓度糖条件下快速发酵。超高浓 麦汁几乎都是通过添加大量辅料制备的，这些辅料几乎很少或几乎不含可同化的氮源， 因此，辅料的加入实际上降低了非糖营养物质的比例，尤其是降低了细胞增殖所需要的 3 江南大学硕十学位论文 a 氨基氮和不饱和脂肪酸的含量，因而抑制了酵母的生长和发酵【l6 | 。总之，新的理论认 为超高浓酿造存在着酒精毒性和高渗透压以及营养物质含量低等问题，因此酵母生长受 抑制，从而滞缓或终止发酵。只有解除对酵母生长的抑制，才能使发酵正常进行。 本文以新的理论为指导，在前人的研究基础上重点探讨了啤酒酵母的性能差异以及 2 0 0 p 麦汁制备、酿造工艺，并采取外加氮源的方式来缓解酵母生长受抑制的现象，以克 服酒精毒性和高渗透压以及营养物质缺乏对酵母牛长的阻碍，使超高浓酿造顺利进行。 该工艺将会产生显著的经济效益，同时也为啤酒工业的发展开创了一条新途径。 1 5 课题研究思路、主要内容和研究目的 本课题通过系统研究啤酒酵母性能、啤酒酿造过程中原料配比、糖化发酵工艺对超 高浓酿造的影响，运用数学统计法对超高浓麦汁评价体系进行优化，并对最佳麦汁评 价体系进行验证与确定，最终使超高浓酿造的成品啤酒与常浓啤酒品质相近。为超高 浓酿造的工业化应用提供参考依据。本论文主要是从以下几个方面进行研究： ( 1 ) 考察不同啤酒酵母菌株的耐渗性、耐酒精性、极限发酵度和酵母活性等发酵性 能，并将模糊评价的数学方法引入到酵母性能的筛选和评定中，筛选出一株较佳菌株作 为后续试验用菌株。 ( 2 ) 研究超高浓麦汁的制备工艺，并对麦汁的评价指标进行优化，旨在提高啤酒的 酿造生产率。 ( 3 ) 探讨麦汁组成对酵母生长和发酵的影响，以酵母食物为麦汁的外加氮源，添加 量的多少主要以麦汁中仅氨基氮的含量作为衡量指标，分析发酵结果中双乙酰、高级醇、 发酵度等指标。选择较适合的酵母食物，并确定超高浓麦汁中最适a 氨基氮含量。 ( 4 ) 研究2 0 0 p 麦汁超高浓麦汁的酿造工艺，包括接种密度、前酵温度、后酵温度对 啤酒酿造生产率的影响，确定最佳酿造条件，并在此条件下进行e b c 试验。 通过对本课题的系统研究，希望克服超高浓麦汁对酵母正常生长、发酵所带来的压 力，找到切实可行的工艺路线，将超高浓酿造技术的优势发挥最大。缓解啤酒企业所面 临的严重的竞争压力，也将超高浓酿造技术的工业化进程推向一个新的起点。 4 第二章超高浓酿造菌株的筛选及评价 第二章超高浓酿造菌株的筛选及评价 2 1 前言 酵母性能的优劣直接影响啤酒产品的质量和设备利用率，从而影响企业的经济效 益。近年来，啤酒产量不断增加，超高浓酿造有利于在没有增加现有设备的基础上增加 啤酒的产量，虽然超高浓酿造利于扩大产量，但它还有一些缺点：包括对酵母的副作用， 这是由于高浓麦汁发酵后渗透压增高、乙醇浓度增加、营养的缺乏等导致发酵速率和程 度、酵母的活力和活性及酵母的凝集性的降低【1 7 】。因此超高浓酿造对啤酒酵母性能的要 求更为严格，选择一株适合超高浓酿造的优良菌株显得尤为重要。 以往的优良酵母菌株应具备高发酵度、比较强凝聚力、可以有效的去除双乙酰、生 产的成品啤酒具有良好口感和风味。但评定一株酵母是否适合超高浓酿造并没有严格的 界限。酵母的渗透压耐受性、耐酒精性、极限发酵度和酵母活性等指标的评价对超高浓 酿造酵母的筛选均很重要，因此选择一种合适的数学评价方法对酵母的各项性能进行综 合分析是非常必要的。 本章利用以模糊数学为基础的模糊综合评价法，将上述不易定量的因素定量化，对 十株酵母进行筛选及性能比较，通过得分对它们进行综合评价，从而选出性能更加适合 超高浓酿造的酵母菌株，用于实际生产中。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要原料 编号n o 1 n o 1 0 ( 本实验室保存下面发酵啤酒酵母菌株) ： 麦芽汁液体( 固体) 培养基，国产麦芽甘啤3 号由甘肃国翔麦芽厂提供。 2 2 2 主要试剂 葡萄糖、无水乙醇、次甲基蓝、无水茚三酮、碘酸钾等均为国产分析纯试剂，购于 国药集团。 2 2 3 仪器设备 e b c 标准磨( 德国b v u h l e r - - m i a g 公司) ，恒温培养箱( 上海科学医疗设备修理厂) ， s w - c j 1 f 超净工作台( 苏州净化设备有限公司) ，天平( 上海天平仪器厂) 、显微镜、 u v - 2 1 0 0 紫外可见分光光度计( 上海尤尼柯仪器有限公司) 及实验室常规分析化验仪器。 2 2 4 试验方法 ( 1 ) 酵母酒精耐受性测定 用杜氏发酵管注满培养基后倒置于盛满液体培养基的试管中，灭菌后加入不同量的 酒精，放置两天，使酒精扩散均匀，接种待测菌株于2 5 恒温一周，隔天检查小导管中 产生的气泡。无气泡产生则表明酵母受酒精抑制，比此管低一级的酒精度即为此酵母的 耐酒精度【4 1 1 。 江南大学硕上学位论文 ( 2 ) 酵母渗透压耐受性测定 含有1 酵母浸膏的溶液，加3 的琼脂后分别添加不同量的葡萄糖，制备出六个 葡萄糖浓度从1 5 - - 4 0 不等梯度的平板培养基，分别将十株酵母点种于平板上， 2 5 2 8 培养一周，观察并记录其是否生长。 ( 3 ) 酵母凝聚性测定 称取发酵结束后的酵母泥0 2 5g ，用0 0 1 m o l l 的e d t a n a 洗涤，离心，并用去离 子水洗涤、离心两次，弃去上清液，沉淀酵母泥转入5 0m l 具塞比色管中，加入5 0m l p h 4 5 的h a c - n a a c 缓冲液，振荡5 r a i n ，迅速吸取2m l 于6 7 0n l i l 处测定光密度值为 o d l ；比色管于2 0 c 水浴中保温3 0m i n 后，在距液面下lc m 处，吸取2m l 于6 7 01 1 l n 处测定光密度o d z 。测定中以p h 4 5 的h a l e n a a e 缓冲液为空白。f = ( o d l i o d 2 ) o d l 】x 1 0 0 ，f 值越大，反映出酵母凝聚的倾向越大3 0 1 。 ( 4 ) 酵母最终发酵度的测定 酵母接种于5 0 0m l 麦汁培养基，装液量为3 0 0m l ，2 5 。c 培养和发酵，每天摇动一 次，发酵3 4 天，至不产生泡沫为止。发酵完毕，发酵液过滤，测定上清夜的剩余浓度， 计算发酵度。 ( 5 ) 酵母其他常规指标测定 酵母死亡率的测定；酵母发酵过程的c 0 2 失重的测定；酵母对0 【氨基氮同化率的测 定；酵母产酒精能力的测定3 9 1 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 不同酵母发酵性能的比较 ( 1 ) 酵母耐受酒精能力比较 超高浓酿造对酵母的酒精耐受性要求很严格。原麦汁浓度为1 0 0 p 的啤酒，其酒精 度大约在3 8 7 左右，而2 0 。p 超高浓酿造啤酒的酒精度能达到7 以上【1 8 】。从表2 1 可 以得出，酒精度在1 0 以下时，十株酵母均有生长现象，当酒精浓度达到1 2 或以上时， 酒精对酵母的抑制作用表现较为明显，其中n o 3 、n o 6 、n o 7 、n o 8 菌种的耐酒精性 能更好。 6 第二章超高浓酿造菌株的筛选及评价 ( 注+ 表示生长，- 表示不生长) 有研究报道了在超高浓酿造环境下，高浓度的糖和酒精都会产生较强的渗透压，通 常在超高浓酿造中采用外加海藻糖的手段提高酵母的耐渗性 1 9 2 0 1 ，但这样不仅会提高酿 造成本，而且可能诱发酵母对于海藻糖的依赖性，因此耐渗性的优劣对超高浓酿造菌种 的筛选甚为关键。表2 2 是十株酵母渗透压耐受性的比较结果，从表中可以看出1 - 6 号 酵母和1 0 号酵母的耐渗性较好，最高可以耐受4 0 的糖浓度，而n o 7 、n o 9 酵母的耐 渗性较差，在本实验设计的最低糖浓度( 1 5 的葡萄糖含量) 的培养基中均不生长，因此 这n o 7 、n o 9 两株酵母在模糊评价时不考虑在内。 ( 3 ) 酵母凝聚性比较 凝聚性是啤酒酵母的重要特性之一，对啤酒生产起到多方面的影响，例如：影响发 酵速度；影响发酵度；影响啤酒的澄清以及啤酒的风味【2 1 1 ，因此本论文比较了十株啤酒 酵母的凝聚性，比较结果见图2 一l 。 7 江南大学硕十学位论文 1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0 型5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 o 覆 霾藿雾垂匿藿匡 jzj4bb d，l u 菌种编号 图2 - 1十株菌株凝聚性能比较 f i g 2 - 1c o m p a r i s o no ff l o c c u l a t ec a p a b i l i t yo ft e ns t r a i n s f 值越大表明酵母絮凝的倾向越大，从图2 1 可以看出n o 8 、n o 4 、n o 1 三株酵母 的凝聚性明显优于其他菌种，超高浓酿造时为了缩短发酵周期往往会增加酵母的接种 量，如果发酵结束后发酵罐中大量的酵母处于悬浮状态，可能会降低啤酒的生物稳定性 并且影响成品啤酒的风味。总之啤酒酵母的絮凝性对啤酒发酵、过滤分离及啤酒酵母的 回收利用，啤酒的感观、理化及微生物学指标都有一定程度的影响，在超高浓酿造过程 中也视为生产性能的一项重要指标。 ( 4 ) 酵母死亡率的比较 c a s e y _ 【2 2 1 等指出，在发酵最初1 2h 酵母活力随麦汁原浓的提高而降低，实验中的十 株酵母菌株在2 0 0 p 高浓麦汁中发酵五天后的死亡率见图2 2 。 l234567891 0 菌种编号 图2 2 不同酵母死亡率的比较 f i g 2 2c o m p a r i s o no fd e a t hr a t eo ft e ns t r a i n s 酵母死亡率过高，易造成酵母自溶，从而影响成品啤酒的风味稳定性及生物稳定性 口3 。由图2 2 可以看出n o 7 ，n o 1 0 这两株酵母的死亡率均超过5 0 ，而其他酵母的死 亡率较低，酵母死亡率的不同从侧面也反映了酵母对高酒精浓度和高渗透压的耐受能力 的差异。由于n o 7 和n o 1 0 酵母的死亡率过高，因此在模糊分析时可不予考虑。 ( 5 ) 酵母极限发酵度的比较 酵母的发酵度和啤酒的质量有密切的关系，它不但影响啤酒口味和风味，也影响啤 r 7 6 5 4 3 2 0 0 o 0 0 o o 0 9 6 静u 礞 第二章超高浓酿造菌株的筛选及评价 酒的生物稳定性。酵母的发酵度反映了酵母对糖类的发酵情况，高发酵度啤酒具有淡爽、 无甜味，饮用后给人以透彻、舒适的感觉，且啤酒苦味值小，双乙酰含量低，c 0 2 含量 高，热量低【2 4 】。不同酵母菌种由于其基因差异而有不同发酵特性。发酵度反映了酵母对 糖类发酵情况，麦汁中麦芽四糖以上多糖不被酵母发酵。因酵母麦芽三糖酶分泌较晚， 麦芽三糖的发酵顺序也被滞后，所以麦芽三糖发酵也是不完全的。对于超高浓酿造来说， 提高酵母的发酵度也是目前研究的热点问题。论文对十株酵母的极限发酵度进行的比 较，从图2 3 可以看出十株酵母极限发酵度方面存在的差异。其中n o 1 、n o 8 菌株的发 酵度较高，优于其它菌株。 l o 8 皇0 6 eo 4 o 2 o l234567891 0 酵母编号 图2 3 不同酵母极限发酵度的比较 f i g 2 - 3c o m p a r i s o no f r e a la t t e n u a t i o no ft e ns 打a m s 注：p 发酵前麦芽汁浓度，n 发酵后除去酒精的原麦汁浓度 ( 6 ) 酵母发酵过程的c 0 2 失重情况的比较 高浓度糖发酵会改变糖的形式【2 5 1 ，例如葡萄糖和麦芽糖的形式转换，从而影响酵母 对糖的利用，比较发酵过程中的c 0 2 失重情况可以反映出酵母的降糖能力，图2 4 是比 较酵母在2 0 0 p 高浓麦汁中发酵2 - 6 天的c 0 2 失重情况。从图中可以看出实验中的各株 酵母的降糖能力和趋势基本一致，在发酵前两天的降糖均较慢，到第三天、第四天达到 最大值，从第四天以后，c 0 2 失重越来越小，直至零。 6 纂5 莒4 ， izj4)o 发酵天最 图2 _ 4 不同酵母发酵c 0 2 失重的比较 f i g 2 _ 4c o m p a r i s o no f r e d u c t i o no fc 0 2o ft e ns t r a m s ( 7 ) 酵母对a 氨基氮同化率的比较 仅氨基氮是麦汁中能被酵母直接利用的氮源，仅氨基氮同化快，同化多，生成酵母 9 囫翰豳醐功翻目豳功园阴朔团历豳诩叼功功朔日阴饧阴功豳阴国防翰助翰豳日园功沥囫翰豳日囫切翻豳朔日囫沥豳饧沥翮功目囫功朔翰囫阴豳组历园功嘲翰囫冒 江雨大学硕一卜字位论文 就多，酵母健壮，发酵力强 2 6 j 。氮源的缺乏也是目前超高浓酿造比较关注的问题。酵母 在2 0 0 p 麦汁中发酵6 天后，酵母利用的a 氨基氮的量与原麦汁总0 t 氨基氮含量的比值 即为酵母对a 氨基氮的同化率。试验发现不同酵母菌株对于0 t 氨基氮同化率存在着显著 的差别，n o 6 菌株对0 t 氨基氮的同化率最高。 234 567891 0 菌种编号 图2 - 52 0 0 p 发酵液中的a 氨基氮含量 f i g 2 - 5c o m p a r i s o no f a s s i m i l a t i v er a t i o no ff a no ft e ns t r a i n s ( 8 ) 酵母产酒精能力的比较 在筛选高浓酿造菌种时考虑酵母的产酒精能力是至关重要的。从图2 - 6 可以看出不 同菌株的产酒精能力有明显的差别，其中n o 9 菌株的产酒精能力均低于其他菌株，发 酵液中乙醇含量仅为3 6 2 ，这会给后稀释带来很大的困难，因此不适合超高浓酿造。 lzjbo， o ，i u 菌种编号 图2 - 6 十株酵母产酒精能力的比较 f i g 2 6c o m p a r i s o no fa l c o h o lp r o d u c t i v i t yo ft e ns t r a i n s 2 3 2 模糊评价体系在评价酵母性能方面的应用 ( 1 ) 确定评价对象的指标论域 本试验评价的论域为1 0 株酵母菌种，这1 0 株酵母构成一个普通论域：f = f h f 2 ， f i o ) 。评价内容为是否符合高浓酿造。评价指标为：x 1 凝聚性；x 2 酵母最终发酵度； x 3 - c 0 2 失重；) ( 4 耐酒精力：x 5 死亡率；x 6 耐渗性；x 7 a 氨基氮利用率：x 8 发酵液最 终酒精度，这八个指标构成一个指标论域：x = x l ，x 2 ，x 8 ) 。 1 0 o 5 o 5 o i i 5 o r1茜叫一扣囊醐麒 8 7 6 5 4 3 2 0 _-乎镳fz 第二章超商浓酿造菌株的筛选及评价 ( 2 ) 确定评语等级论域： v = v l ，v 2 ，即等级集合，每个等级可对应一个模糊子集，其中，v 1 较适合超高 浓酿造，v 2 不适合超高浓酿造。 ( 3 ) 进行单指标评价，建立模糊关系矩阵r 设x 的模糊子集m = 各指标对评价菌种的重要性) ，从而确定某株酵母对等级论域 v 的隶属度。通过实验结果考察每株菌种的各项指标是否符合超高浓酿造，将单指标评 价结果放在一起就得到一个模糊关系矩阵。f l f 1 0 的单指标评价结果分别为r l r l o 矩 阵形式表示见附录。 ( 4 ) 确定评价指标的模糊权向量 自定义权向量a = a l ，a 2 ，a 3 ，a 4 ，a 5 ，a 6 ，a 7 ，a 8 ) ，其中a 的分量大小反应了8 个指标对超高 浓酿造菌种筛选的相对重要性。舻 o 1 、0 3 、0 2 、0 0 5 、0 0 5 、0 1 、o 1 、o 1 ) ( 5 ) f f , j 用适合的合成操作数将a 与各被评价事物的r 合成得到各被评价事物的模糊综合评 价结果向量b 以a 为模糊权向量，r 为模糊关系矩阵，则a x r = (