（发酵工程专业论文）南方红豆杉中内共生真菌的分离、鉴定及耦合培养初探.pdf

摘要 摘要 为研究内共生真菌( c n d o 舢1 9 l l s ) 和其宿主的关系，自南方红豆杉( 豫 动加p 邶括v a lm a i r e i ) 中分离了1 0 0 0 余株内共生真菌，并做了初步分类鉴定。主要 内共生真菌分布予以下属：围小丛壳菌属g 肠所e 陀妇职、葡萄痕孢属肋乃诎r 搠口 m 、葡萄孢属肋以恤够、头孢霉属砷n 胁s 印r 跏掰职、青霉属n 拧缸川f 蜊苹、 曲霉属4 胖枷踢、轮生菌属跆砒册埘w 踞、桶孢属彳砌劬删堋够、木 霉属乃纠b 棚踞、厚壁孔孢属g i 锄础出够、无色芽枝霉属场训j 如，砌俐跟、 拟茎点霉属朋d m 唧妇m 、粘鞭霉属g f f d m 船嘶够，镰刀菌属凡岱胛f z 册踱、线 壳囊孢属0 和妒d ，讯口够、小白壳囊孢属 f d 印您肋够、疱霉属砌d 州口够、刺 盘孢属c o 胜f o 施 甜脚跟、散囊菌属毋f ，d 玎堋踞、黑曲霉属4 胖枷踞、链 毛孢属勋印细撕髓踢、黑团孢属p e r 话d 缸够、支链孢属彳打聊l 甜幻够、圆砖孢 属阳d c 肠讲“m 踞、树粉孢属d 幼d 如删幻珂踞、向基孢属鼬枷枷i r f 删够等。优 势属为镰刀菌属。 得到了9 株能产紫杉醇的内共生真菌，以菌株y l l l 7 的产量性状最高，针 对y l l l 7 进行了菌种的系统鉴定，包括产物产量鉴定、形态学鉴定和分子生物 学( 1 8 sr d l n a 、h n c m a l 怕n r i b c ds p a c c r 、d - t u b l l l i ng c ) 鉴定，确定其为从南方 红豆杉中分离得到的一株能产紫杉醇的腑f “脚属新种，暂定名为美丽镰刀菌 ( n 瑚r f 柳lm 抛fc h c i l gl - 甜1 幻w y ) 。本菌株已申请专利，申请号： 2 0 0 5 1 0 0 3 8 4 2 4 8 ，本专利已公开，公开号：c n l 6 7 0 1 8 0 a 。 针对菌种筛选和菌种改良，进行了高通量筛选的研究，得到较优的筛选条件 为：玻璃纸平板培养5 天，菌丝体5 0 0 c 真空干燥5 h ，乙醇氯仿( 1 ：1 ) 混合溶剂浸 提2 h ，重复3 次， 玎? l c m s 检测。考虑到实验安全等因素，采用上述条件，以 甲醇二氯甲烷( 1 ：1 ) 混合溶剂代替乙醇氯仿混合溶剂为高通量筛选的方案。 针对内共生真菌培养过程中紫杉醇的检测方法进行了验证和改良，认为，快 速准确地分析菌丝体或发酵液中的紫杉醇，同时又能消除其它结构类似物的影 响，h p l c n v i s 是一个较好的选择。 利用取得自主知识产权的耦合式生物反应器对fm 口抛f 和东北红豆杉( z c 嘲，豇幻细) 细胞进行了耦合培养，发现耦合培养时无论是植物细胞还是微生物细 胞的紫杉醇产量均有不同程度地提高，生长曲线和代谢曲线也有所变化，并对此 现象作了初步分析，为进一步研究内共生真菌的植物宿主之问的具体作用物质和 作用原理打下了基础。 关键词；紫杉醇、内共生真菌、美丽镰刀菌，z 艇耐删m 口抛f 、高通量筛选、 肿l c 舢s 、耪合培养、共生机理、1 8 sr d n a 、i t s 、p - m 附i ng e n e 江南大学博士学位论文 a b s t r a c t mo r d e rt 0s t i l d ym e 佗l a t i o nb e 铆啪印d o f h n g i 雒dm e i rh o 瓯m o r et l l 孤1 ，0 0 0 e n d o a m 西w e p 盯a 锄f b m 了幻f l 盥c 而i b ，坫捃v a r m a i 托ia n dw e r ep 佗l i i 】i 【面l y c 1 私s i f i e di d e n t i f i e df o rs t i l d yo nt l l e 豫l a t i o no f 也ee n d o 丘m g im l dt h e i rh o 咄t h e 辩 e n d o f i l n g iw e r cm o s t l yd i s 伍b 删鹊f o l l o w ：g 如m 订讲肠啊、肋幻胁施，m 4 够、 b o t r y 髓ss p 、c e p h d l o s p o r i ms p 、p e m c m i 姗s p 、a s p e r g i l l t 撂s p 、豫t i c m i 姗s p 、 a m b l y o s p o r i t l ms p 、t r i c h o d e r m ns p 、g i l m 璐f 缸s p 、h y d o d e n d r o ns p 、p h o m o p s i s s p 、g l i o m n s t 讧s p 、f 1 l s 钟t ms p 、q f o s p 钟话ns p c y t o s p 哪e l l as p p 抽m ns p 、 c o l l e 幻t r i c h u ms p 、e u m n 栅ts p 、a s p e r 蛋l l 粥s p s i m p f o t b i xs p p e r i c o m ns p 、 a l 把r 眦r 记s p 、矾o c l n d 锄帆s p 、o m o d e 谢细ns p 、b a s i p e t o s r i l l ms p a n af l l s 倒i t l m 焉pw 勰t h ep r e p o n d e m n t a m o n gw m c k9p a c l i t a x e l - p r o d u c 堍e l l d o 铀西w e r cs c r e e n e da i l ds 昀i ny 1 1 1 7 w 船t l l eh i 曲e s ti l lt h e 诅x o lp r o d u c t i v i 何s y s t e m a t i ci d e i l t i f i c a t i o nf o rs t r a 缸y 1 l1 7 w e r ec a r r i e do u ti i l c i u d i i l gp r o d u c t i v i 劬m o r p h o l o g i c a la n dm o l e c u l 缸b i o l o g y c h a r a c 馏峨鹊18 sr d n a ，h l t 踯i a l 仃觚s c r i b c ds p a c e r ，b - t u b u l i l lg e n e nw 勰 c o n f i 咖e dt t l a tt 1 1 es 硫y 1 1 1 7b e l o n g e dt og e n l l s 砌f 删黯a ws p c c i e s 卸dw e n a m c d “凡岱n 砌册，凇抛，c h 髓gl 甜1 幻w y l ks n 面n h 勰b e e n a p p l i e d 幻p a t e n t ( 印p l i c a t i o nm 埘b e r ：2 0 0 51 0 0 3 8 4 2 4 8 ) a n dt l l ep 觚i n th 雒b c e np u b l i s h e d0 u b l i s h n 啪b e r ：c n l 6 7 0 1 8 0 a 1 h i g hi n p u t r e e i l i i l gw a ss t u d i e do nm a i ni s o i a t i o n 觚di m p f o v e m e n t 锄dm c b 岳t t e r 咖d i t i o nf o fi s o l a t i o ng a 缸e dw a so b t a i n e d ：l i c r o o r g a l l i s mw a si n c u b a t e do n c e l l o p h a n cp l a t ef o r5d t h em y c e l i 砌、嬲c o l l e c t e d 锄d 帆sv a c u u m 嘶e di n5 0 。c 1 o r5h f - o u o w e db ve 】“r a c t i o nw i t l lm i ) ( e ds o l v e n tc o n s i s t e do fe l m i o la i | d c l l l o r o f o m l ( 1 ：1 ) f o r2 h t h ee x 加t i w a sr e 础d3 斑n e s 锄dt l l e 【缸枷o n 啪d u c tw 觞e x 鲫n i i l o dw i mh p l c m s t h ee x 锄i n a t i o nm 矾h o 出 o rt h ep a c l i t a x e lp r o d u c e di nt h e 洲s eo f c n d o 丘m g u sc l l l t i v a t i o nw e r ev a l i d a t e da n di n l p r o v e d i tw a ss h o w nm a th p l c m s w 嬲b e t t e ro n e ，n o to i l l y i tc o u l db e l l s e d t oa s s a y p a c i i t a ) 【e l i l l t h e m ”e l i u mo r 醯d m r a p i d l y 觚dc f c d i b l y b ma l s oi tc o l n de l i m i n a t cm e 砌u e n c ei 1 1 d u c e db yo t l l c r c o n f i g u m t i o n 黝l o g s f 肌口加玎a n dzc l 印姚r 口c e l lw e r ec l l l 矗v a t e di nt h ec o u p l i n gb i o r e a c t o r 、) v i t l l s e l f d e t e 衄m a t i o nk n o w l e d g ep r o p e r t yr i g h t i tw s h o w nt h a tm e r ew 够s o m e i n c r e 硒eo f 血ep a c l i t a x e lo u l p u to f p l a n tc e l ia i l dm i c m o r g a m s mc e l li nt 1 1 e 训t i v a t i o l l ， a n dt 置l e r ew 硒s o m ed l a i 培ei ng r o w t hp r o c e s sa n dm e t a b o l i z a t i o nc h a m c t e 培 f o l l o w 以b yp r e l i n l i i l a r i l ya n a l y s i sf o r 拙l c 曲o v ep h e n o m e n a 觚dm eb a s ew 嬲 e s t a b l i s h e d 向r 血n h e rs t u d yo nt h ed e t e 洲n a t ee 丘b c ts u b s t a _ i l c ea n ds ”n b i o t i c p r i i l c i p l eb e t w e e n t h ee n d o f h n g i 孤dt l l e i rp l a n th o s t k e yw o r d s ： p a c l i t a x e l ， e n d o f u n g u s ，凡盯邪f “m埘日眈| l i g hi n p u ts c r e 幽g ， h p l c m s ，c o u p l i n gc u h i v a t i 咀s m b i o t i cp r i n c i p l c ，l8 sr d n a i t s ，p n l b u l i ng e n e ； 一 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：三整鱼日期：碚月罗日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解扛南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：二醢导师签名：2 盟 ，门 日期：硎年6 月7 日 绪言 第一章绪言 1 。1 紫杉醇 紫杉醇( p a c l i 伽【e i ，商品名t 叙0 1 ) 是从紫杉( y e w ，即红豆杉) 树皮中分离得到 的天然产物( 植物抗癌药) ，自1 9 5 6 年发现至今已有近5 0 年的历史。1 9 6 3 年， w 甜l 、w a i l i 从太平洋红豆杉( ? 狐淞6 陀v 咖妇删哟的树皮和木质部得到粗提物， 1 9 7 1 年w l n i 【1 确定其结构，美国b m s ( b r i s t 0 m y e 培s q l l i b b ) 于1 9 9 2 年开发上市。 紫杉醇复杂新颖的结构一直是化学家们关注的焦点，它的基本骨架是三环 【9 ，3 ，l ，o 】十五烷，含有1 1 个手性中心和四个相隔开的环，其结构与相关化合物 如图1 1 所示。 。 0 1 ，：钕o i r 1 = p k& 缸 1 2 ，：d c 髓佃西 氍* t m u or 2 ；h 弛 【3 t8 眦撕n r = r a t ( 4 z 瑰啦j b 耻c | t i nm 蘧钮 图1 1 紫杉醇及相关化合物结构 f i g 1 1s m k t u o f p a c l i t “e l 柚d 协【i i l e 紫杉醇的作用机理与已上市的其它化学合成抗肿瘤剂或植物抗癌药截然不 同。它并非直接杀死癌细胞，而是主要以抑制肿瘤细胞重要的分裂方式微管 蛋白合成使肿瘤体积逐渐缩小。在上市短短几年内紫杉醇制剂的全球销售额已突 破1 0 亿美元大关，创下单一抗癌药销量之最。 f d a 最初批准的临床用途为治疗晚期卵巢癌与非小细胞肺癌。此后，美国 临床医学界陆续发现了紫杉醇有不少令人感兴趣的新用途，其中包括与抗艾滋病 药物合用可治疗卡波济氏肉瘤( 一种艾滋病人特有的恶性肿瘤) 以及用于结直肠 癌、膀胱癌和乳癌等一系列的棘手肿瘤疾病。 由于紫杉醇适应症的扩大及其副作用相应小于其它抗肿瘤药物( 化疗药) ，故 该产品在国际上声名鹊起并己成为临床上广泛使用的首选抗癌药物。 紫杉醇尽管价格昂贵，但由于疗效确切，在市场上始终畅销不衰。b m s 的 紫杉醇专利药瞰o l 在2 0 0 0 年的全球销售额就达到1 6 亿美元，其专利已于2 0 0 2 年到期。现在国际市场紫杉醇原料药的价格为4 5 0u s d 幢，国内紫杉醇针剂的售 江南大学博士学位论文 价为9 0 0 l l o o 元支( 3 0m 曲，而治疗剂量为1 3 5m g i n 2 - 1 7 0m g m 2 ( 即根据体表 面积的不同，一般每次用8 支l o 支) 。 1 1 1 药理 紫杉醇类似物的抗肿瘤机理与长春花碱正好相反，是通过诱导、促进微管蛋 白的聚合，防止解聚，稳定微管，导致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤 丝，使染色体分离失败，抑制了细胞分裂和增殖而产生抗肿瘤作用。临床应用表 明，紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌等有效，尤其对耐常规药物的肿瘤也取得了较好的 疗效。并有显著的抗人肝癌活性1 2 - 3 】。 紫杉醇可使细胞周期阻滞于g 2 m 期并诱导细胞凋亡。尽管两种效应之间的 关系尚存在一些争论，但一般认为紫杉醇对有丝分裂和细胞凋亡的影响均与其细 胞毒活性相关【删。 紫杉醇可作用于细胞凋亡受体途径的f a s f 鹪l 通路，或激活半胱氨酸一天冬 氨酸蛋白酶家族( c y s t e i n y l 唧a n a t ep r o t e a s e s ，c a s p a s c s ) ，诱导细胞凋亡。紫杉醇诱 导的凋亡也受到b c l 2 家族的调控。并有l p s 样活性。 到目前为止从人们对1 奴o l 结构修饰与其构效关系的了解来看，它的c - 7 、 c 9 、c 1 0 位的基团以及c 1 l 、c 1 2 位的双键对它的生物活性并无太大的影响， 但是c 2 、c - 4 位的基团以及d 环和c 1 3 位的侧链对1 奴o l 生物活性影响重大。 此外1 缸o l 的生物活性与其在水溶液与非水溶液精细的立体构象密切相关。在紫 杉醇结构修饰与构效研究中，人们虽然得到了许多活性减小的紫杉醇类物质，但 也得到了许多活性提高的紫杉醇类似物。特别是1 戕o l 的类似物d o c e t 觚e l 被发 现在临床上具有活性后，1 9 9 6 年正式被美国f d a 批准为抗乳腺癌的新药【刀o 1 1 2 毒理 虽然紫杉醇对许多肿瘤有效，但也有一些肿瘤对紫杉醇易产生耐药，其机制 比较复杂，一般认为与多药耐药( m u i m d r u gr e s i s t 柚c e ，m d r ) 有关。此外，尚涉 及微管蛋白亚型表达的改变和细胞周期机制等。 也有人认为，微管结构的改变导致微管动力学改变是肿瘤细胞对紫杉醇产生 耐药的重要机制嗍。 1 2 红豆杉 紫杉在中国植物志中的学名为红豆杉。按植物分类学位于裸子植物亚门， 一松杉纲，紫杉目，红豆杉科，红豆杉属( 1 酞峭) 。红豆杉科含5 属2 3 种，除澳洲 红豆杉属生长在南半球外，其余均产于北半球。 红豆杉在我国有4 种及1 变种，分别为中国红豆杉( 7 h 螂c 砌 b 凇捃( p i l g 曲 r e m e r ，c l l i n e s ey c w ) 、西藏红豆杉或称喜马拉雅红豆杉( zw w 盯 曲f 瑚n z u c c ) 、 2 一 绪言 云南红豆杉( z 叫 n 日h p 瑚西c h a n g 甜l k f u ) 、南方红豆杉或称美丽红豆杉( z c 加g 珊捃v 缸m a i r e i ( l c m e e 甜i e v l ) c h a l l g 甜l k f u ) 和东北红豆杉( zc 淞讲出幻 s i e b e fz u c c 1 。 红豆杉分布于我国大部分地区，如西藏、云南、贵州、四川、广西、广东、 湖南、湖北、江西、福建、浙江、安徽、河南、山西、陕西、甘肃和吉林山区。 江西庐山、江苏和山东有人工栽培的红豆杉。前不久，在雅鲁藏布江考察中又发 现我国最大的红豆杉林。印度、尼泊尔、不丹、缅甸、阿富汗、朝鲜、日本、俄 罗斯远东地区、加拿大和美国等也有分布。 红豆杉虽然分布广，但是数量少、较星散、极少成林、且生长缓慢【9 】。云南 红豆杉被国际松杉类专家组( c s g ) 确定为3 级渐危种【l o 】，早在8 0 年代就被中国 林业部定为二级保护植物，由于9 0 年代初的破坏，中国林业部1 9 9 2 年又将其列 为一级珍贵保护树种；西藏红豆杉被中国植物红皮书定为濒危种饵n d a i l g e r e d s p e c i e s ) ；东北红豆杉也日渐稀少，渐危程度越来越大，日趋濒危。 1 3 紫杉醇的生产现状 由于紫杉醇分离自红豆杉，而红豆杉中紫杉醇的分布是不同的，以树皮为最 高，其它部位几无生产利用价值( 表l - 1 【l ”) ，同时，不同的采收时间同样对紫杉 醇的含量有较大的影响( 表1 2 、1 3 ) 。 表l l 不同植株、不同部位紫杉醇的含量( ) t a b l e1 1c o 廊n to f p a c l i t a ) 【e li nd i 彘陀mp l a c e so f d i 毹n t 觚淞p l 衄协 3 江南大学博士学位论文 表i - 2 不同采样时间z ) m m 树皮( 干) 中紫杉醇及其类似物的含量( ，的 t a b l e1 2c o m 即to f p a c l i t a x e l 锄d 妇柚a l o g si i lt t 地c o n e ) 【s ( d r i e d ) o f d m m t 锄p l 啦t i o f z ) ，m 妇( ) 注：表中l o - d a b 为l o d e a c e t y ib a c c 撕ni i i ，b 为b c 撕n l ，c 为c e p h a l o m 枷i n e ， 1 0 - d a e t 为1 0 - d e e l y lt 强o i ，p 为p a c l i t a ) ( e l ( 紫杉醇) 表1 3 不同采样时间z y m m 括树叶( 干) 中紫杉酵及其类似物的含量( 哟 t a b l e1 3c o n t e mo f p a c l i t a x e l 锄di 招锄a l o g si i l 他l e 雹v 鹤( d r i e d ) o f d i 仃b r e ms 枷p i i n gt i m eo fzy l 肌玮口邶括( ) 注：表中l o - d a b 为1 0 d e e l y ib a c c a t i l li i i ，b 为b a c c a t i l li i i ，c 为c e p h a l o m 枷i n e l o - d a e t 为l o - d e e t y lt a x o l ，p 为p a c l i t a 】【e l ( 紫杉醇) 红豆杉的自然生境也与紫杉醇的产量有密切关系。生长在凉爽、湿润和蔽荫 环境下要比在于热、直晒条件下的植株产量要高。高紫杉醇含量的植株适宜生长 在海拔2 6 0 0m 3 2 0 0m 或北纬4 1 。以北的极寒、湿润和蔽荫的环境中。土壤为 富含有机质的山地暗棕壤、棕壤或黄棕壤。 目前商业用紫杉醇由红豆杉的树皮提取法生产，此方法缺憾是树皮资源匮乏 ( 每生产l 蚝紫杉醇，需1 6 6 7t 树皮，采剥1 5 0 0 2 0 0 0 棵大树) ，而且威胁植物 生存，如不加以遏制终将导致濒危物种的灭绝。因而广辟生产途径，解决紫杉醇 资源贫乏问题变得十分迫切。 ” 现在主要的研究集中在：合成。半合成和结构改造组织培养和真菌研究、一一 天然资源的利用和发展( 栽培) 等方面。 迄今为止，化学家们对紫杉醇的化学全合成研究取得了可喜的进展，但是， 全合成路线复杂，成本过高，从生产角度无任何实际意义，紫杉醇及其半合成原 料均需从天然物中取得，所以对天然资源( 包括栽培) 和组织培养等仍处于紫杉醇 。 4 ， 绪言 研究的核心地位。 植物细胞培养法可以积累紫杉醇，但从技术角度来说尚存在许多方面的工作 要做，目前仍无法进行工业化，主要问题是培养条件苛刻，且生产周期长，容易 染菌，设备要求高等。 因此，人们试图用微生物方法来生产紫杉醇，这也许是最有应用前景的途径 之一。由于微生物在与植物共生进化过程中可能发生的遗传信息的传递，使微生 物具有了与植物相关的基因而且予以表达形成紫杉醇或其前体化合物。由于微生 物培养过程周期短，易于控制和放大，且微生物基因工程技术已经相对成熟，一 旦具有相关基因就有可能进行扩增及高表达，因此自1 9 9 3 年以来有不少人进行 相关研究。 1 3 1 全合成和结构修饰 紫杉醇结构复杂，母核有9 个手性中心，侧链有2 个手性中心，因此应有 2 0 4 8 个对映异构体，它的合成对有机化学家是一种挑战，直至1 9 9 4 年才被完成。 n i c o l a o u 等 1 2 】运用逆合成分析法的战略全合成了紫杉醇。 尽管紫杉醇结构复杂，但至今世界上已至少有六个研究小组成功地完成了紫 杉醇的全合成【1 2 - 1 8 】。由于全合成需要2 2 2 5 步，还没有实际应用价值。 由于全合成步骤繁多，反应条件苛刻，近年来人们把关注的焦点移向了紫杉 醇的结构修饰与构效研究这一领域，尝试对其侧链和结构骨架进行修饰改造，模 拟其分子结构和模拟合成反应，并对其生物活性进行研究。这样做的意义主要在 于：( 1 ) 药理上有利于解释其在稳定微管蛋白，破坏有丝分裂使癌细胞程序性死 亡过程中的结构结合位点与具体作用机理；( 2 ) 有利于确定与紫杉醇生物活性相 关的有效基团，从而合成比紫杉醇活性更高，水溶性更好，毒副作用更低的新紫 杉醇类似物或者在不降低活性的基础上简化其结构【7 】。 1 3 2 半合成 紫杉醇在树皮中只含0 0 0 7 o 0 6 9 ，而且提取难度颇大；虽然全合成已成 功( 见前述，1 3 1 ) ，但皆因路线长、收率低等原因目前无法实现工业化。比较而 言，化学半合成相对具有实用价值。已报道的一类以l o - 去乙酰巴卡亭 i i i ( 1 0 d e a c e t y lb a c c a t i ni i i ，l o d a b ) 为前体，另一类则以1 0 去乙酰紫杉醇 ( 1 0 d c a c e t y lt a x o l ，l o d a n 为前体l ”j 。 紫杉醇的半合成方法已比较成熟，f d a 于1 9 9 4 年1 2 月批准半合成紫杉醇 在美国应用。现在，半合成前体已由l o d a b 这一单一前体向多种前体发展。半 合成前体来源的扩大和合成技术的发展将缓解紫杉醇供应的紧张局面。 1 3 3 植物细胞培养 细胞悬浮培养不仅可以提供一种潜在、可行的获得紫杉醇的途径，而且也是 5 江南大学搏士学位论文 一个研究紫杉醇生物合成、半合成的方便系统。细胞培养技术生产紫杉醇具有人 工合成、真菌生产和人工栽培等其它方法所不具备的优势，能够确保产物无限、 连续，均匀地生产，不易遭受病虫害，季节等因素的影响，适于进行规模化生产； 所得产物比从植物体内直接提取更为简单，可以大大简化分离和纯化步骤，大幅 度降低生产成本；细胞培养可以在细胞反应器中进行大规模培养，通过控制环境 条件可以提高紫杉醇的含量；除生产紫杉醇外，细胞培养还可以生产出其他具有 抗癌活性而原植物所不含有的化合物。因此，近年来国内外红豆杉细胞培养生产 紫杉醇研究十分活跃。 自从1 9 9 1 年获得红豆杉培养的第一个专利以来，已有9 种红豆杉培养植物 建立了细胞悬浮培养系统，其培养技术研究也取得很大进展近年来，国内外在红 豆杉细胞大量培养紫杉醇研究方面取得了较大发展f e t t - n e 仕。在l 升的摇瓶中 进行了紫杉醇的培养，确定培养条件为2 5o c ，1 1 0r m i l l ，暗培养。甘烦远等【2 0 】 发现，云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到1 2 l ，紫杉醇含量为o 1 1 9 ， 约为成年树树皮中紫杉醇含量的1 2 倍，为栽培植株的4 0 倍。b r i n g i 等通过优化 培养基、加入诱导子、两步培养及延长培养时间( 4 2 d ) 的综合措施，使中国红豆 杉( 胁螂西以p c 妇) 中紫杉醇含量达1 5 3m g l ，并获得专利。 但从技术角度来说，植物细胞培养法尚存在许多方面的工作要做，目前仍无 法进行工业化，主要问题是培养条件苛刻，且生产周期长，容易染菌，设备要求 高等。 1 3 4 微生物方法 目前商业用紫杉醇提取自红豆杉的树皮，不仅树皮来源严重不足，而且对天 然植物资源构成严重威胁，因而多种途径解决紫杉醇资源贫乏问题变得十分迫 切。由于植物细胞培养条件苛刻，且生产周期长，人们试图用微生物方法来生产 紫杉醇。这也许是最有前景的途径之一。 1 4 内共生真菌生产紫杉醇 共生关系是指一个以上的有机体，双方建立互利共存、或一方有利而对另一 方无害地生活在一起的一种关系【2 ”。 共生是生物适应自然环境的一种必然现象，不同种类的生物常以种群方式聚 集在一起生活，不同种类的生物之间以及微生物与其它生物之间也存在十分复杂 的相互关系，通过它们的相互作用促进了整个生物界的进化和发展。 生物之间的共生关系在亲疏程度和作用上差异很大，但相对而言，相互之间 有利的关系较为直接和稳定，有利于共生体对外界自然环境的生存适应。 6 一 。 一 绪言 1 4 1 内共生真菌 内共生真菌( 又称内生真菌，e n d o p h ”i cf i l i l g u s ，e n d o f i l i l g u s ，e n d o p h ”e ) 是 存在于健康植物的组织和器官内部中，形成不明显浸染的各种真菌，是植物微生 态系统的天然组成部分。 自1 8 9 8 年g u e 血等人从黑麦草( 上d 疗硎肥m “如n f “聊) 中分离得到内共生真菌 以来，已有百余年的历史。近2 0 年来，在内共生真菌的多样性、对宿主植物影 响的生理生化机制、次生代谢活性产物的开发利用等方面的研究趋向活跃。 内共生真菌在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物体内，通常 不会对被感染的宿主植物形成明显的伤害，从而不使宿主植物表现出明显感染症 状。某些内共生真菌在宿主植物衰老或受到外界胁迫时又会转变为病原菌。内共 生真菌是一个生态学概念，而非分类学单位。 一 关于植物内共生真菌和内共生关系的定义和用法较为混乱，目前在学术界 仍有很多争论和分歧阎。“e n d o p h y t e ”一词最早主要指内生植物，后来被研究者 借用来特指禾本科牧草中那些属于麦角菌科的不引起病症、系统发生、种子携带 的内共生真菌，以与严格附生的病原真菌种类相区别。因此，内共生真菌定义中 一度强调其不引起宿主出现病症的特点，并界定内共生关系为菌根那样的互惠共 生( m u n l a l i s m ) 。随着研究范围的拓宽，不同的研究者纷纷使用“e n d o p h y t e ”、 “e n d o p h y t i c ”等字眼来描述它们特定的与植物联合的微生物类群。因此，植物 内共生真菌的概念具有了明显的异质性。 在发表的有关内共生真菌的论文中，可以发现两个明显的概念取向：注重 于内共生真菌生物本身特定的生态或生理作用的研究者，如植物病理学家通常强 调宿主专一性及生态适应性方面的特征；而侧重内共生真菌生态学、生物多样性 以及群落分析的研究者通常粗放地把栖息于宿主组织内的全部微生物都称做内 共生真菌，其中包括植物病理学家所熟悉的潜伏的( 1 a t c n d 、静息的( q u i e s c e i l t ) 或 条件致病的一些病原菌。 目前，己从藻类、苔藓、蕨类、裸子植物和被子植物中所有研究过的植物 中分离得到了内共生真菌，表明内共生真菌在植物体内广泛存在。内共生真菌系 统地分布于植物的根、茎、叶、花、果实和种子等器官、组织的细胞或细胞间隙， 其分布情况取决于宿主植物本身以及内共生真菌的种类，在宿主植物不同器官的 分布存在差异，不同的内共生真菌占据不同的生态位。同时，内共生真菌的分布 还受到地理位置、气候条件等诸多环境因子的影响。生物多样性越丰富的地区， 内共生真菌种类也越丰富。 内共生真菌可通过组织学方法观察到或从严格表面消毒的植物组织中分离 获得。植物内共生真菌几乎存在于所有目前己研究过的植物中，分布广、种类多。 7 江南大学博士学位论文 据d 哟r f i l s s 和c h 印e l a 估计，约有一百万至数百万种内共生真菌存活于2 7 0o o o 至4o o o0 0 0 种微管植物细胞内或细胞间隙这样一个特殊环境中。 关于内共生真菌的起源至今仍然有不同的观点，存在两种假说，即内生说 和外生说。内生说认为，内共生真菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景； 外生说认为，内共生真菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口 或诱导植物形成的通道进入体内。邹文欣等1 分析认为，在与宿主的长期共进化 过程中，或者由于病原菌的致病基因的突变，侵入植物后不再对宿主植物产生毒 害而与之共生，成为内共生真菌；或者当侵入的病原菌毒力与宿主的防御能力处 于平衡时，病原菌就以内共生真菌的形式存在于植物体内。 内共生真菌长期生活在植物体细胞内或细胞间隙这样一个特殊环境中，并 与寄主协同进化，在演化过程中与宿主植物形成到利共生关系：一方面内共生真 菌可以从宿主植物中吸取营养，并得到保护；另一方面内共生真菌能够促进宿主 植物生长发育，增强宿主植物对生物胁迫( 食草动物、昆虫、病原菌) 及非生物胁 迫( 高温、干旱、高盐等) 的抗逆性。内共生真菌对宿主植物的生物学作用的物质 基础，在于其自身合成的抗生素、激素、酶抑制剂、诱导物等多种活性物质或通 过诱导物( 葡聚糖、糖蛋白、小肽、脱乙酰几丁质、花生四烯酸等不饱和脂肪酸， 等) 胁迫宿主植物合成的萜类、生物碱、皂苷、黄酮、酚类和多炔类等次生代谢 产物。这些次生代谢产物的多样性是导致内共生真菌生物学作用多样性的根本原 因。 至今，对内共生真菌的研究还处于一个比较早期的水平，所研究的植物类 群不过数百种，相对于数量庞大的内共生真菌种类来说，仅涉及了其中很小一部 分。在内共生真菌的起源、与宿主植物的关系、在植物体内生命活动的分子调控、 次生代谢产物的合成机制等方面尚待更深入的研究。 利用植物内共生真菌发酵生产与植物相同或相似的次生代谢活性产物是可 能的，虽然就目前技术水平而言，每升内共生真菌发酵液中仅能获得纳克级的活 性成分，离工业化生产还有很大的距离，有许多问题尚待解决。 1 4 2 内共生真菌中的活性物质 现有的事实证明：内共生真菌能够参与植物活性成分的合成，或者对植物 次级代谢产物进行转化。这种能力正是作为生物活性物质资源微生物的可靠基 础。一一一一一一 李桂玲等口】报告从药用植物三尖衫、南方红豆衫和香榧中分离到1 7 0 多株 的内共生真菌，其中有近9 0 株的内共生真菌能产生抑制和杀灭一种或多种植物 病原真菌的活性物质，这些内共生真菌主要分布于拟青霉属、镰孢菌属等。 关于内共生真菌独立合成活性物质的遗传因素，以及促进植物合成活性成 8 绪言 分的分子机理，还有待进一步研究。 至今，我们对内共生真菌的认识仍很肤浅，所研究的植物类群大约只有数 百种，而且对自然界中有关真菌存在的数量的估算中，也没有把植物内共生真菌 估算入。现有初步认清了：植物内共生真菌是一个庞大的特殊的真菌类群，几乎 在所有的植物组织中都发现有内共生真菌的存在。因此，它的数量肯定是十分庞 大的。由于它们参与了植物的活性成分的合成，因此它们有可能具备有生物合成 特定植物活性成分的能力，这将为我们提供一个新的生物活性物质的源泉。 1 4 3 内共生真菌的鉴定 内共生真菌的鉴定较为困难，虽然分离到内共生真菌，但是有的菌株在人 工培养基上不产生孢子【2 5 1 。从已有的研究结果来看，不产孢菌株占总菌株数的比 例高达4 1 3 ，这些不产孢菌株是无法用传统的形态学方法来进行鉴定的瞄】。 如y l i m a 仕i l a 等【2 】在对腑f 聊l 属的分类中发现，砌f “坍属的种间形态差 异较小，对于传统的形态学分类法来说不易区分不同和种或变种，分类须辅以分 子生物学的方法，但甚至1 8 sr d l n a 也无法将它们完全区分开。 1 4 4 内共生真菌与宿主的关系 一般认为，植物与内共生真菌呈互利共生的关系：一方面，植物为内共生 真菌提供光合产物、矿物质和其它营养物质；另一方面，内共生真菌产生的代谢 物，或能刺激植物的生长发育，或能提高宿主植物对生物胁迫或非生物胁迫的抵 抗能力。这些代谢物中的一部分，正是应用前景广阔的新型生物活性物质，有很 高的开发利用价值。 植物内共生真菌的分离和培养与其产生次生代谢产物的关系：内共生真菌 与宿主植物的共生关系是在经历了漫长的进化过程后相互适应的结果，这种共生 关系是以互惠互利为纽带的。通过这种共生关系联系在一起的生物个体在相互分 离时很可能会两败俱伤，因此植物的内共生真菌在脱离宿主环境后是否都能存活 就成为菌种分离的关键问题之一，也许从植物中分离并在体外培养的并不是与宿 主形成了紧密共生关系的真菌，而那些在脱离宿主环境后就无法生存的内共生真 菌也许更具有研究价值。因此在内共生真菌的分离过程中，优化和改良培养条件 或者在体外模拟宿主体内的生存环境可能有助于分离得到更多的内共生真菌，这 是值得深入研究的课题。 在真菌植物这个系统中，真菌产生的次级代谢产物是十分复杂和丰富的。 当真菌侵入寄主植物后，在特定的环境和生理条件下，能胁迫寄主产生在正常条 件下不能产生的小分子抗菌物质“植物保卫素0 h y t o a l e x i n ) ”，它们的化学结 构多种多样，目前己知有2 0 0 多种具有抗菌作用、抗肿瘤活性及其它的生物活 性。也有人认为【3 ”，对传统的药用植物而言，真正的疗效成分有可能并不是来自 9 江南大学博士学位论文 植物本身而是其中的内共生真菌。 内共生真菌在体外培养时的次生代谢产物与宿主环境下的次生代谢产物是 否相同? 处于宿主体内的内共生真菌和体外培养的内共生真菌生存环境迥异，这 毫无疑问会对其生命活动造成影响，进而有可能对其次生代谢产物的组成产生影 响，这也是在研究内共生真菌次生代谢成分时需要考虑的问题。 此外，经常发现在同一种植物中分离得到的同一种内共生真菌的不同菌株 所产生的次生代谢成分不同，这似乎意味着同一种内共生真菌在宿主体内存在异 质性( h e t e f o g e n e o l l s ) 。通过分子生物学手段对微孢拟盘多毛孢的研究结果对这种 异质性提出了可能的解释，如果将特定的外源基因两端加上端粒重复序列 5 n ：a g g g 3 。，然后将这段d n a 序列导入内共生真菌微孢拟盘多毛孢中，发现 这段d n a 序列可以不依赖染色体而进行独立的复制。如果这种性质对内共生真 菌而言具有普遍性的话，就意味着内共生真菌可以很容易的与宿主植物进行遗传 物质的交换，可以获得植物的染色体并进行遗传。而获得了不同染色体成分就可 能导致同种内共生真菌的异质性【3 2 】。 在内共生真菌植物宿主生物或非生物胁迫因素的生态系统中，植物内共 生真菌起着重要的生态学作用，8 0 的植物内共生真菌在抗真菌、抗藻类或抗杂 草方面具有活性，而来自土壤中的真菌只有大约4 3 具有活性【3 3 1 。 对于内共生真菌次级代谢产物的产生，目前有两种学说，一种是“基因水 平转移0 1 0 i i z o n _ t a l g e n e 仃a i l s f e r ) 刚”，即认为由于相关基因的直接传递，使得宿主 与内共生真菌具有了相同的次级代谢产物的合成途径；另一种是“内共生理论”， 即生物相互作用及协同进化。但无论哪种理论至今都还不成熟和还不完善。 1 4 5 内共生真菌生产絮杉醇 1 9 9 3 年美国学者s t i e r l e 等【3 5 】首次从短叶紫杉( 7 破郴6 旭v 的肠) 的韧皮部中 分离出一种新的内共生真菌死阳 驴邸硎西叩口删，可在半合成培养液中产生紫杉 醇和紫杉烷类化合物，表明有的内共生真菌具有合成和宿主植物相同或相似的活 性成分的能力。这一发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇药源危机提 供了一条新途径，并成为从药用植物中分离内共生真菌热潮的开端，为人类解决 某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等因素带来的药源紧张和生态破坏问题，利用 植物内共生真菌进行工业化发酵生产某些重要天然药物提供了新的思路。 一一至今，已从喜马拉雅红豆杉( 胁郴 w 肼砌砌忉) 冈、南方红豆杉( z 厅埘讹d 【翊、中国红豆杉( z 砌伽p 脚括) 【3 8 】、东北红豆衫( zc 唧砬l 埘) 【3 9 】，欧洲紫杉( z 6 卯c 咖) h 、云南红豆杉( z 彤册册f 邶捃) h 1j 等红豆杉属植物中分离到能够合成紫 杉醇类化合物的内共生真菌，表明产生紫杉醇的内共生真菌普遍存在于紫杉属植 物中。另外，还从落羽松( 强加讲堋d b f c 蜊) 【4 2 j 、榧树( 砌w 粥嘶蚴【4 3 l 、 l o 一 一 绪言 银杏( g 加局g 口6 f f d 6 4 ) 】、秃柏( d 西蜊如比厅“聊) h 3 】以及一种松树( 肋如”缸 以d 6 f f 括) j 中分离到能产生紫杉醇的内共生真菌，显示了紫衫醇产生菌宿主的多 样性。这些内共生真菌分别属于紫杉霉属、镰刀霉属、交链孢属、盘多拉毛霉属、 髓霉属、黑团孢霉属、无孢类群、瘤座孢属、多节孢属、侧孢座腔菌属、链格孢 属、丝核菌属、茎点霉菌属、膝葡孢属、青霉属、木霉属、毛霉属、毛壳孢属、 头孢霉属、轮柄梳霉属、拟盘孢霉属、结核菌等h 6 j 。 药用植物内共生真菌的研究还表明，有的内共生真菌不但可以自身合成药 物活性成分，还具有促进宿主植物合成活性成分的能力。例如，w 抽g 等【4 7 l 从中 国红豆杉( z 融坶幽加e 珊捃) 中分离到一株内共生真菌，可使红豆杉悬浮培养细胞紫 杉醇的产量提高两倍。 我国学者也对内共生真菌进行了研究，表1 4 给出了部分研究概况： 表1 4 内共生真菌国内外研究概况 t a b i e1 4g e n m ls i 钆砒i o fs t i l d y0 nt i i e d o f l l l l g i 江南大学博士学位论文 1 5 紫杉醇的检测 1 5 1t l c 二维薄层色谱技术早期曾用于紫杉烷类化合物的定性及半定量分析。t l c 结合核磁共振( n m r ) 、质谱0 幢s ) 技术，已成功地分离获得多种新的紫杉烷类化合 物，显示出在定性分析方面的优势。m a t y s i l ( 等【5 6 i 报道了一