（发酵工程专业论文）产木聚糖酶菌株的选育及酶学性质的研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 要 本研究首先对产胞外木聚糖酶的实验室保藏菌株f l 0 1 2 的形态特征，生理生 化特征及1 6 sr d n a 序列构建的系统发育树进行了研究和分析，初步鉴定f l 0 1 2 菌株为坎皮纳斯类芽孢杆菌( p a e n i b a c i l l u sc a m p i n a s e n s i s ) ，坎皮纳斯类芽孢杆菌产 木聚糖酶的研究未见报道。在此基础上，经紫外线照射和硫酸二乙酯诱变处理， 获得一株产木聚糖酶活力较高的突变株d 9 3 8 ，产酶活力由出发菌株的7 9 4 9 i u m l 提高到1 2 0 9 0 i u m l ，提高了5 0 0 9 。且遗传稳定性较高，传接五代，产酶活力 基本不变。 对突变株d 9 3 8 产酶工艺条件进行了优化。研究确定的最适发酵培养基组分 c g l ) 麸皮7 7 ，蛋白胨5 ，酵母粉5 ，磷酸氢二钾0 8 7 ，硫酸镁0 2 ，碳酸钙 1 2 5 ( 单独灭菌) ；最适发酵条件：初始p u8 5 ，发酵温度3 7 ，装液量3 5 m l 2 5 0 m l ， 接种量2 0 ，摇床转速1 5 0 r m i n ，发酵培养时间为5 0 h 。在最适发酵培养基和最 适发酵条件下，突变株d 9 3 8 产酶活力达到2 6 6 5 3 i u m l 。 对突变株d 9 3 8 产木聚糖酶的分离纯化及部分酶学性质进行了研究。先后采用 2 0 - 5 0 硫酸铵分级盐析、透析袋脱盐浓缩、s e p h d e xg 7 5 和s e p h d e xg 1 5 0 凝 胶过滤层析对突变株d 9 3 8 发酵液中的木聚糖酶进行分离纯化。经过s d s - p a g e 电泳，该木聚糖酶呈单一条带，分子量约为2 0 7 k d 。对该酶酶学性质研究表明： 酶的最适作用温度为6 0 ，在5 0 - - 6 0 具有较好的稳定性；酶的最适作用p h 值 为7 5 ，在p i - i 5 5 9 o 具有较好的稳定性；h 9 2 + 对木聚糖酶的活性有很强的抑制作 用，c a 2 + 和m n 2 + 对该酶活性有促进作用。以燕麦木聚糖为底物，该木聚糖酶的米 氏常数为1 3 8 7r a g m e ，最大反应速率为4 7 8 5 肛n o l ( m l m i n ) 。酶解产物通过纸层 析色谱和薄层层析色谱分析，结果表明该酶为内切木聚糖酶。 研究结果表明，产木聚糖酶突变株d 9 3 8 产酶活力较高且性能稳定，所产木聚 糖酶为内切木聚糖酶且不具有纤维素酶活性，是一株具有应用潜力的木聚糖酶生 产菌株。 关键词：菌种选育；突变株；木聚糖酶；内切木聚糖酶 a b s t r a c t a b s t r a c t a p r e s e r v a t i o ns t r a i nf l 0 12w h i c hc o u l ds e c r e t ee x t r a c e l l u l a rx y l a n a s ew a st ob e s t u d i e d t h ex y l a n - d e g r a d i n gb a c t e r i af l 012 ，w a si d e n t i f i e d 鹊p a e n i b a c i l l u s c a m p i n a s e n s i sb a s e do nm o r p h o l o g i c a l ，b i o c h e m i c a l ，p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d 16 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i s t ot h eb e s to fo u rk n o w l e d g e ，t h i si st h ef i r s tr e p o r to ft h e c h a r a c t e r i s t i c so fx y l a n a s ep r o d u c e db yp a e n i b a c i l l u sc a m p i n a s e n s i s a f t e rb e i n g m u t a t e db yt h eu l t r a v i o l e tr a d i a t i o na n dd i e t h y ls u l f a t et r e a t m e n t ，am u t a n ts t r a i nn a m e d d 9 3 8w a so b t a i n e d ，w h i c hh a dag o o dg e n e t i cs t a b i l i t ya n dx y l a n a s ep r o d u c t i o na b i l i t y t h ex y l a n a s ea c t i v i t yo fm u t a n ts t r a i nd 9 - 3 8i n c r e a s e dt o1 2 0 9 0 i u m l ，a n di n c r e a s e d b y5 0 0 9 c o m p a r e d 谢t l lt h eo r i g i n a ls t r a i nf l 0 12 t h eo p t i m a lc o m p o s i t i o n so ft h em e d i u mf o rc is t r a i np r o d u c i n gx y l a n a s ea r e 嬲 f o l l o w s ( g l ) ：w h e a t b r a n 7 7 ，p e p t o n e5 0 ，y e a s t e x t r a c t5 0 ，k 2 h p 0 4o 8 7 ， m g s 0 4 7 h 2 00 2 ，c a c 0 31 2 5 ( s e p a r a t e l ya u t o c l a v e d ) ；t h eo p t i m a l c u l t i v a t i o n c o n d i t i o n sf o rd 9 - 3 8p r o d u c i n gx y l a r ma r et h ei n i t i a lp h 8 5 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e o f3 7 ，w i t hv o l u m eo f3 5 m l 2 5 0 m l ，a m o u n to fi n o c u l a t i o no f2 0 ( v v ) ，a n d s h a k i n gc u l t i v a t i o na t15 0 r r a i nf o r5 0h t h ex y l a n a s ea c t i v i t yo ff e r m e n t e db r o t hc o u l d r e a c h2 6 6 5 3 i i7 m i ，w h e nd 9 - 3 8w a si n c u b a t e di nf l a s ku n d e rt h eo p t i m a lc u l t i v i t i o n c o n d i t i o n s t h ex y l a n a s ew a gp u r i f i e dt oh o m o g e n e i t yb ya m m o n i u ms u l f a t ef r a c t i o n a t i o n , d i a l y s i sa n dc o n c e n t r a t e d , a n ds e p h a d e xg - 7 5c h r o m a t o g r a p h y ，s e p h a d e x g 一15 0 c h r o m a t o g r a p h y t h em o l e c u l a rm a s so f t h i sx y l a n a i s2 1 7k d t h eo p t i m u mp ha n d t e m p e r a t u r ef o rt h ea c t i v i t ya r e7 5a n d6 0 ( 3 ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m ei ss t a b l eo v e ra b r o a dp hr a n g ef r o mp h5 5 - - 9 0a n ds h o w e sag o o dt h e r m a ls t a b i l i t yw h e ni n c u b a t e d a t5 0 c , - - , 6 0 c t h ee r l z y m ea c t i v i t yi ss t r o n g l yi n h i b i t e db yh 9 2 + a n de n h a n c e db y m n 2 + ，c a 十t h ek ma n dv m a xv a l u e sa r e13 8 7m g m la n d4 7 8 5l a n o l ( m l m i n ) r e s p e c t i v e l y , f o ro a ts p e l tx y l a n 嬲t h es u b s t r a t e t h ex y l a n a s eh a s a9 0 0 ds p e c i f i c i t ya n d i th a sn oe f f e c to nt h ec a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e t h ee n z y m a t i ch y d r o l y s i sp r o d u c t sw e r e a n a l y z e db yt h ep a p e rc h r o m a t o g r a p h ya n db yt h et l cc h r o m a t o g r a p h y e x p e r i m e n t a l r e s u l t sd e m o n s t r a t et h a tt h i sx y l a n a s ei sa ne n d o t y p ec l e a v ee n z y m e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h em u t a n td 9 - 3 8w i t hag o o dg e n e t i cs t a b i l i t ya n dx y l a n a s e p r o d u c t i o na b i l i t y ，c a np r o d u c ec e l l u l a s e - f r e ee n d o x y l a n a s ea n di th a ss t r o n gp o t e n t i a l f o ri n d u s t r ya p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：s t r a i nb r e e d i n g ；m u t a n t ；x y l a n a s e ；e n d o - x y l a n a s e i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 、 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：l 堑司监 导师签名： 日期：型塑年月丛日 山东轻工业学院硕士学位论文 章绪论 1 1 木聚糖及木聚糖酶 j 1 1 1 木聚糖的结构及其木聚糖酶的分类 木聚糖是植物半纤维素的主要成份，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多 糖，也是自然界中最为丰富的可再生资源之一。木聚糖的主链由b d 毗喃木糖残 基经 1 ，4 糖苷键连接成，依来源不同，可以有不同的侧链取代基【l 】。自然界存在 的木聚糖形式多样，结构变化非常大，且多为异型多糖( 图1 1 ) ，如木糖残基的 c 2 位，c 3 位上可以发生部分或者完全乙酰化 2 3 1 ，也可通过洳1 ，3 糖苷键与a l 呋喃型阿拉伯糖残基相连 4 1 ，或通过伊1 ，2 糖苷键与4 o 甲基葡萄糖醛酸残基相连 5 1 ，此外，在木聚糖中还含有少量通过l 阿拉伯糖残基的c 5 连接的与阿魏酸 ( f e r u l i ca c i d ) 或香豆酸( p c o u m a r i ca c i d ) 。个别情况下，木糖或聚合的阿拉伯糖也可 作为侧链 2 1 。 ” 木聚糖酶属于水解酶类，是一类可以将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合 酶系。由于不同来源的木聚糖主链的聚合度有所不同，且其支链残基的种类、数 量、长度及其在主链上结合位点的不同，要彻底降解木聚糖需要多种酶的共同参 与和协同 6 1 ，木聚糖降解酶系包括内切p 1 ，4 - d 木聚糖酶( e c3 2 1 8 ) ，p d 木糖 苷酶( e c3 2 1 3 7 ) ，a - l 呋喃阿拉伯糖苷酶( 其分为外切型的仅l 呋喃阿拉伯糖 苷酶( e c 3 2 1 5 5 ) 和内切1 ，5 - a l - 阿拉伯聚糖酶( e c3 2 1 9 9 ) ，a - d 葡萄糖醛酸 苷酶( e c3 2 2 3 9 ) ，乙酰木聚糖酯酶( e c3 2 7 2 ) ，酚酸酯酶【j 7 】( 包括阿魏酸酯酶 ( e c3 2 7 3 ) 和香豆酸酯酶( e c3 2 ) ) 。它们的作用方式见图1 1 。 嵴嘲 a clg t ，+一。二妒，铆聊删肛，p咖赢二赢y，瀛yo删口，4x3kjpl3 3 一 ，- ，- ，- 飞 ，“埘崛x = 硝峪1 。蝴即。4 ：岫堆甬圳p 函x y 啦函x y 聊。攀 。一 m 菇t 队 舢 m 童l “ 图1 1 木聚糖的结构及其木聚糖降解酶系的作用位点i s l f i g 1 1s t r u c t u r eo f t h ex y l a na n dx y l a n o l y t i ce n z y m e si n v o l v e di nt h ed e g r a d a t i o no fx y l a n 第1 章绪论 通常所说的木聚糖酶即内切b 1 ，4 d 木聚糖酶，它主要负责木聚糖主链骨架的 降解，是木聚糖降解酶系中最关键的酶【9 ，1 0 1 ，也是当前木聚糖酶研究的重点。 1 1 2 木聚糖酶的产生及其生化性质 微生物木聚糖酶通常是诱导型的，但也有很少数是组成型的。一般地，木聚 糖酶的诱导是相当复杂的，其诱导水平也因微生物的差异而差别较大：某种微生 物的诱导物可能是另一种微生物的抑制剂。另外，底物衍生物和酶反应的终产物 在木聚糖酶的诱导中也起到正向作用，在浓度较高时，也可能成为微生物产酶的 抑制剂。木聚糖是微生物常见的诱导物，它是一种大分子聚合物，不能穿过细胞 壁，直接进入微生物细胞内。图1 2 是微生物细胞诱导产酶机制。随着微生物细胞 的生长，首先分泌少量的组成型木聚糖酶，把木聚糖酶降解成低聚木糖、木二糖 和木糖，少量的降解产物先结合到细胞表面上，在进入细胞内，启动转录加强酶 的合成。 酶促合成 l j l 。ljl 诱导 阻遏物抑制 b 木糖苷酶 木二糖、木三糖、木寡糖篚尹。气：， 葡萄睹 t 木糖 jl 细胞质 透膜目每原生质膜 1 l 木聚糖酶 c ；木二糖、木三糖、木寡糖 葡萄糖 盈 图1 2 木聚糖酶生物合成的诱导机制i u i f i g 1 2t h ei n d u c t i o ns y n t h e s i so fx y l a n a s e 不同来源木聚糖酶的组成和性质不尽相同，但它们在理化性质方面仍存在较大 的相似性。其分子量范围一般为8 ，- - - 1 4 5 k d ，等电点一般在3 - - - 1 0 之间，在p h 值 3 1 0 内稳定，大多数酶反应的最适p h 范围为4 7 。细菌、真菌产木聚糖酶的最 适温度范围是4 0 6 0 ，真菌木聚糖酶的耐热性通常比细菌木聚糖酶的差一些。 根据酶的理化特性，可分为两大类，即分子量小于3 0 k d 的酶和分子量大于 3 0 k d 的酶，前者通常为碱性蛋白，后者通常为酸性蛋白【6 】。通常细菌可产生两种 木聚糖酶，即低分子量的碱性木聚糖酶和高分子量的酸性木聚糖酶，但真菌中没 有这种现象，通常只产生低分子量的碱性木聚糖酶。 2 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 3 木聚糖酶的分子结构 不同微生物产生的木聚糖酶在结构和性质上有很大的差别。有的木聚糖酶只含 有单一结构域，即催化结构域，也有的同时具备催化结构域和多种非催化结构域。 多结构域木聚糖酶分子结构中含有催化结构域( c a t a l y t i cd o m m n ，c d ) 、纤维素结合 结构域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n , c b d ) 、木聚糖结合结构域区( x y l a n - b i n d i n g d o m a i n , x a d ) 、连接序列( l i n k e rs e q u e n c e ) 、重复序列( r e p e a t e ds e q u e n c e ) 、热稳 定结构域( t h e r m o s t a b i l i s i n gd o m a i n , t o ) 及其它未知功能的非催化结构域等。这些 区域担负着不同的生理功能。不同微生物所包含的区域差别较大。有的仅具有其 中的一种或几种，有的则包含以上所有结构埘1 2 1 。 ( 1 ) 催化结构域 木聚糖酶的c d 决定着酶的水解特性，也是该酶分类的依据之一。1 9 9 1 年，g i l k e s 等人就是根据木聚糖酶的催化结构域氨基酸的同源性和疏水簇分析法将木聚糖酶 分成族f 和族g 。研究揭示，这两个家族木聚糖酶的催化区的氨基酸序列及催化基 团的周围序列没有有意义的同源性，表明它们在进化上来源于不同的祖先基因， 并有不同的折叠方式；此外还揭示木聚糖酶活性催化区与纤维素酶的催化区基本 没有同源性，表明这两种酶在进化上也是源于不同的祖先基因。 ( 2 ) 纤维素结合结构域 c b d 在纤维素酶分子中广泛存在，但由于自然界中纤维素通常是与木聚糖等半 纤维素共存于植物多糖结构中，且多以纤维素为骨架，因此许多木聚糖酶也含有 c b d ，使之既能水解纤维素，也能水解木聚糖，成为双功能酶。c b d 对木聚糖的 催化功能不是必需的，但它可以使木聚糖酶结合在纤维素上，更加靠近底物，调 节酶对可溶性和不溶性纤维素底物的特殊活力。如粪碱纤维单胞菌( c f i m i ) 中的木 聚糖酶d ，它的全长和截短形式对水解纸浆木聚糖是等效的，但含有c b d 的酶能更 有效的降低k a _ p p a 值【1 3 1 。c b d 在功能和氨基酸组成上与纤维素酶分子中的c b d 相似 【1 4 】，缺乏带电氨基酸；在靠近n 末端和c 末端分别有一个半胱氨酸与该结构域紧邻； 甘氨酸、天冬氨酸及4 个色氨酸高度保守【1 5 】。 ( 3 ) 连接序列 木聚糖酶大多数为多结构域蛋白，连接序列负责将各结构域连接起来，形成柔 韧可伸展的铰链区。连接序列富含丝氨酸或脯氨酸和苏氨酸，通常都是被高度糖 基化，长度在6 5 9 个氨基酸之间【1 6 1 。 ( 4 ) 热稳定结构域 族f 中有两个含t d 的木聚糖酶：解糖高温厌氧杆菌的x y l an 末端重复区( d i a 和 d i b ) 1 7 1 ，及热纤梭菌的x y l y 3 区_ ( x y l yd a ) 【1 羽，二者均可增加酶的最适作用温度，d i b 则可提高嗜温酶的耐热性。而且，至今几乎所有的嗜热酶都含有一个与x y l ad i a 或d i b 同源的区段。 ( 5 ) 基因簇 第1 章绪论 木聚糖酶水解酶系中各个酶基因之间的相互作用也是某些研究工作的重点。 m o r i y a m ah 等研究表明，短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 中b 木聚糖酶和p - 木糖 苷酶基因之间距离很近，相隔1 4 4 k b ，但它们为不同的操纵子控制。杂交试验表明 这两个酶基因的转录是分别进行的，在这两个酶基因的上游都有类似于启动区的 一段序y u 1 9 1 。c a l d i c e l l u l o s i r u p t o rs a c c h r o l y t i c u s q 丁- 段6 k b i 拘d n a 片段上有5 个开放 阅读框，根据缺失分析发现3 个基因分别编码d 木聚糖酶，p 木糖苷酶和乙酰酯酶 【2 0 】。这种基因成簇存在的现象也存在于其它微生物中，可能是为了适应环境中不 同结构的多糖便于被微生物有效的分解，其机理还在研究之中。 1 1 4 木聚糖酶的催化机制 多数研究表明，木聚糖酶与葡聚糖酶和溶菌酶的作用方式相同【2 l 】，也是由羧基 参与的酸碱催化。首先由活性位点的谷氨酸的羧基提供1 个质子给p 1 ，4 糖苷键， 致使糖苷键断裂，然后由带负电的天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸稳定住过渡态碳， 再 扫h 2 0 分子提供o h 给木糖的c ，使糖残基还原；提供旷给谷氨酸的羧基，使酶 复原 2 2 1 。也有研究认为，木聚糖酶在催化底物水解的过程中，形成了一个酶糖苷 中间物。c u 2 + 、h 矿+ 等重金属离子可以影响酶分子中的二硫键或者直接攻击酶分子 中的其它一些氨基酸残基，从而改变酶的构象，使酶失活团】。 1 2 木聚糖酶生产与分离纯化的国内外研究现状 1 2 1 木聚糖酶的生产 ( 1 ) 木聚糖酶的生产菌株 t 产木聚糖酶的微生物分布很广，有几十个属、一百多个种，其中包括细菌、放 线菌、丝状真菌以及某些酵母。其中研究较为清楚的细菌有b a c i l l u ss p w - 1 2 4 1 、 b a c i l l u sc i r c u f a n sw l 12 1 2 5 1 、b a c i l l u ss p s w a i nb p 7 1 2 6 1 、b a c i l l u ss p s t r a i nk - 1 2 7 、 b a c i l l u s s p s t r a i na r 0 0 9 t 2 s 、m i c r o c o c c u ss p a r 1 3 5 2 9 、s t a p h y l o c o c c u ss p s g 1 3 3 0 1 ，放线菌有砌印幻 吵栅s p b 1 2 2 1 3 1 1 、s t r e p t o m y c e st 7 1 3 2 1 、s t r e p t o m y c e s v i r i d i s p o r u st 7 a t 3 3 1 、s t r e p t o m y c e ss p q g 1 1 3 1 3 4 1 ，真菌有a s p e r g i l l u sn i g e r l 3 5 1 、 a s p e r g i l l u s 甩胁肠瑚【3 6 1 、g e o t r i c h u m 阳m 铂- “，i 3 r l 、t h e r m o m y c e s 3 s 1 ，酵母菌有 a u r e o b a s i d i u mp u l l u l a n sy 2 3 11 1 3 9 1 、c r y p t o c o c c u sa l b i d u s l 4 0 1 、t r i c h o s p o r o 刀 c u t a n e u ms l 4 0 9 4 1 1 。我国已研究用黑曲霉、海枣曲霉、棒曲霉、里氏木霉来产生木 聚糖酶，但抗热性差。现在，很多木聚糖酶基因已被克隆，并在大肠杆菌上不同 程度表达。基因工程的发展，为得到稳定性高、活力好、适于工业化生产的木聚 糖酶提供了一条有效途径。 ( 2 ) 木聚糖酶生产菌株的筛选方法 木聚糖酶产生菌株的筛选方法多数是基于酶的催化特性和底物分解前后性质 的改变，主要的方法有以下几种： 4 山东轻工业学院硕士学位论文 r b b x y l a n 法 将菌株点种在含有深蓝色r b b - x y l a n 的选择平板上，含有木聚糖酶基因的菌株 可分解深蓝色的底物，从而在菌落的周围形成明显的透明圈。 木聚糖底物法 以木聚糖为底物，若菌株周围出现水解圈，则为木聚糖酶产生菌株，但该方法 灵敏度不是很高。 刚果红法 是基于刚果红能与1 3 1 ，4 糖苷键连接的纤维素底物紧密结合形成红色物质，糖 苷键水解后这种红色可被n a c l 溶液脱去的原理，在木聚糖底物法的基础上，用0 1 刚果红染色3 0 r a i n ，再用l m o l l n a c l 脱色2 0 m i n ，木聚糖酶产生菌株的菌落周围就 会形成透明圈( 背景为红色) ，若再用1 m o l l 的h c i 处理，则背景染成深蓝色，透 明圈更明显【4 2 】。 ( 3 ) 木聚糖酶酶活的测定方法 酶活力测定是进行酶的研究、应用、生产的基础，探寻一个精确、简便的测定 方法十分重要。木聚糖酶的测定方法通常有d n s 法 4 3 , 4 4 ，s o m o g y i - n e l s o n 法1 4 5 删 和r b b x y l 姐法，前两种方法是基于测定酶反应后所释放出的还原糖量，第三种方 法是基于从r b b - x y l a n 中释放出的染色碎片来测定。这三种方法中d n s 法应用广 泛，s o m o g y i - n e l s o n 法测定值较d n s 法测定结果要低，而且试剂有一定的毒性； r b b x y l a n 法可以排除其它相关酶的干扰，测定结果准确性高。r b b x y l a n 还可 应用于产木聚糖酶微生物的筛选中，该方法简单、灵敏度高、不伤害微生物，可 以通过直接观察筛选平板上微生物周围是否出现透明圈来判断，但是r b b x y l a n 的价格昂贵【4 7 钙】。 其中d n s 法是测定木聚糖酶活力的最常见方法，采用木聚糖酶水解底物木聚 糖，产生还原物质，用显色剂作用于这些还原物质，并用分光光度计测定，同时 以试剂木糖溶液绘制标准曲线，由标准曲线查出所测得的光吸收值对应的木糖生 成量，即可计算出木聚糖酶活力。 ( 4 ) 木聚糖酶的生产及其影响因素 目前木聚糖酶的产生主要集中在真菌和细菌等微生物的发酵上。有效产生木聚 糖酶的关键因素是选择合适诱导底物和最佳的培养基组成。丝状真菌由于能分泌 胞外木聚糖酶而且产酶水平高于酵母和细菌而格外引起研究人员的关注，但是丝 状真菌木聚糖酶的产生往往是和纤维素酶的产生相联系的。以木聚糖为碳源从而 有选择性地生产木聚糖酶在木霉属和曲霉属微生物已经获得了成功，而在以纤维 素为碳源时，这些菌株会在产生纤维素酶的同时也产生木聚糖酶。在有些丝状真 菌中，将细胞培养在不含纤维素的木聚糖上，并且控制培养基中较低的氮碳比， 是产生无纤维素酶活性的木聚糖酶的策略之一。一些杆菌和真菌微生物可以产生 5 第1 章绪论 无纤维素酶活性的木聚糖酶【4 9 j 。 真菌木聚糖酶的活性通常要高于细菌木聚糖酶。据报道在真菌中，到目前为止 能够商业化生产木聚糖酶的还只是以木霉和曲霉属微生物为主，但是一些对于极 端温度条件有较高稳定性的木聚糖酶高产菌株已经得到了证实。放线菌和细菌的 最适生长和产酶环境接近于中性，真菌却需要比较酸性的条件，耐碱性杆菌的最 适生长和产酶p h 值在9 1 0 【2 】。影响木聚糖酶产率的因素除去通常的发酵条件外还 有一些关键的因子，各种因子对于木聚糖酶的表达有综合效应，它们包括底物的 可接近性，低聚木糖的释放速率和数量及其化学特性和所能够产生的木糖数量。 木糖在很多场合既起到碳源作用又会对木聚糖酶的形成产生抑制，通常诱导物分 子的缓慢释放被认为可以提高木聚糖酶的活性。木聚糖酶与底物的结合紧密，在 发酵过程产生的一部分木聚糖酶会结合在不溶性底物上而被丢失。此外影响到木 聚糖酶产生菌的代谢酶，包括蛋白酶和糖苷转移酶类，都会影响到木聚糖酶的产 率，这些代谢酶通常在对数生长末期得到最佳的表达，在确立木聚糖酶的培养时 间时必须要结合考虑到这些酶是在培养基中的。影响木聚糖酶活性和产率的其它 生物过程参数还包括p h 、温度和通风。 1 2 2 木聚糖酶的分离纯化 ： 微生物产生的木聚糖降解酶系比较复杂，且大多还同时生产纤维素酶，这些酶 性质相近，使分离纯化木聚糖酶比较困难。大多数木聚糖酶的分离纯化采用多步 非特异性方法。一般步骤是粗酶预处理、粗酶沉淀、色谱分离。木聚糖酶纯化的 早期步骤通常使用低分辨率、非专一性的手段如硫酸铵盐析、超滤、透析等以达 到浓缩、去大部分杂质和色素的目的；随后常用的色谱有离子交换、凝胶过滤、 疏水色谱、亲和色谱和色谱聚焦。使用率最高的是离子交换和凝胶过滤，离子交 换基团大多数是以弱离子交换基团d e a e 、c m 为主，其次是强离子s p 、q 等， 凝胶过滤主要色谱介质是葡聚糖和琼脂糖及其改良物。 国内外学者在木聚糖酶的分离纯化方面做了大量的工作。 王瑞田，曲音波等报道假单胞菌( p s e u d o m o n a s ) g 6 2 2 产生两种胞外木聚糖酶 纯化和性质【5 0 】。经过硫酸铵沉淀、阴离子和阳离子交换层析、s e p h a d e xg 1 0 0 分 子筛色谱，最终得到两种电泳纯酶。x y n a 的分子量及等电点分别为4 1 2 k d 和9 1 ， x y n b 的分子量和等电点分别是2 0 k d 和8 8 。 杨瑞金，许时婴等报道顶青霉( p e n c i l l i u mc o r y l o p h i l u m ) 产木聚糖酶的分离和纯 化【5 l 】。发酵液经硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e x ( 3 - 2 5 凝胶色谱脱盐、d e a e s e p h a d e x a 2 5 和c m s e p h a d e xc 5 0 离子交换色谱等分离纯化技术，分离至u p a r ta 、p a r tb 和p a r tc3 种木聚糖酶组分。经s e p h a c r y ls - 2 0 0 凝胶过滤色谱和c o n a s e p h a r o s e4 b 亲和色谱进一步分离纯化，分别得到2 个纯木聚糖酶组分。其中p a r tb 经s d s p a g e 鉴定为单带，分子量为2 4 2 k d ；p a r tc 经s d s p a g e 鉴定基本为单带，分子量为 6 山东轻工业学院硕士学位论文 4 8 3 l 【d 。 曾艳，刘铁汉等报道嗜碱菌( b a c i l l u ss p ) z b a w 6 产木聚糖酶的分离和纯化【5 2 】。 通过硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，凝胶过滤层析3 步，从嗜碱菌b a c i l l u ss p z b a w 6 纯化了木聚糖酶。经s d s p a g e 鉴定，结果表明该酶分子量为4 5 k d 。 陆登俊，肖凯军等报道使用硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e x ( - 2 5 凝胶色谱脱盐和 s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶色谱等分离纯化技术，从康氏木霉( t r i c h o d e r m ak o n i n g i i ) 发酵 液中分离出木聚糖酶，纯化后的木聚糖酶经s d s p a g e 鉴定为单一组分，其分子量 为5 5 2 k d 5 3 】o 王时良，朱劫等报道了宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u su s a m i i ) 产木聚糖酶的分离和纯 化。采用硫酸铵盐析、p h e n y l s e p h a r o s ec l - 4 b 疏水层析、s e p h a d e xg - 5 0 凝胶层析 和d e a e s e p h a r o s e f a s tf l o w 阴离子交换层析等分离技术，从宇佐美曲霉( a s p e r g i l l u s u s a m i o 司态培养物浸出液中分离出一种s d s p a g e 电泳纯木聚糖酶组分，其最终的 收率为1 9 o ，纯化倍数为2 6 9 1 5 4 。 k h a n d e p a r k e rr d s ，b h o s l en b 报龇n t e r o b a c t e rs p m t c c5 11 2 产木聚糖酶的 分离和纯化【5 5 1 。经8 0 硫酸铵沉淀，s e p h a d e x ( - 2 0 0 凝胶过滤层析，d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析色谱和c m s e p h a r o s e 离子交换层析色谱，获得电泳级纯酶。最终收 率为3 5 5 ，分子量为4 3 0 k d 。 0 j 7 u l i ox a n d r oh e e k ，l u 7 i sh e n r i q u ed eb a r r o ss o a r e s 等人报道了b a c i l l u s c i r c u l a n sb l 5 3 产木聚糖酶的分离和纯化【5 6 】。经硫酸铵分级沉淀，c m s e p h a r o s ef f 离子交换和s e p h a c r y l $ - 2 0 0 凝胶过滤层析得到电泳级的纯酶。纯化倍数达至w j 4 2 7 8 3 ；， 最终得率为5 7 。 s u c h i t an i n a w e ，m u k e s hk a p o o r ，r a m e s hc h a n d e rk u h a d 等人报道_ s t r e p t o m y c e s c y a n e u ss n 3 2 产木聚糖酶的分离纯化【5 7 1 。发酵液经硫酸铵分级沉淀 d e a e s e p h a r o s e 离子交换层析色谱，后经s d s p a g e 鉴定达到电泳级纯酶。最终收 率为4 3 0 ，分子量为2 0 5 k d 。 从上述有关木聚糖酶的分离纯化的报道中，我们不难发现分离过程主要采 用以下步骤：首先将发酵粗酶液离心，上清液中加入硫酸铵盐析，盐析蛋白质沉 淀后离心收集后进行透析除盐，之后进行各种层析，比较常用的层析方法有离子 交换层析和凝胶过滤层析。纯化后的木聚糖酶再通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其 分子量，之后再进行各种生物化学性质的研究。 1 3 木聚糖酶的应用 木聚糖酶作为单一酶制剂在国际市场上排第7 位，约占总销售额的1 0 。木聚 糖酶、纤维素酶和果胶酶共占世界酶制剂市场的2 0 左右。世界上仅有几个国家 工业化生产木聚糖酶，他们是日本、芬兰、德国、爱尔兰、丹麦、加拿大和美国。 木聚糖酶的工业化应用始于上世纪8 0 年代，最初应用于饲料，而后扩展到食品、 7 第1 章绪论 纺织和造纸工业。近年来，木聚糖酶在制浆造纸、饲料、食品等行业都有广泛的 应用。 1 3 1 木聚糖酶在造纸工业中的应用 纸浆漂白过程中应用生物技术，已得到造纸界的广泛认可和关注。目前研究较 多的是木聚糖酶在漂白中的机理和作用。2 0 世纪8 0 年代，v i i k a r i 等人率先提出了在 化学漂白前利用木聚糖酶对硫酸盐浆进行预处理的技术。由于半纤维素和木素之 间存在着某种共价键连接，它们之间形成了“接枝共聚物”，苯醚键和苯酯键连接。 因此，纸浆中半纤维素的水解有利于木素的去除，主要是因为破坏苯醚键，从而 降低化学漂白剂的用量。不仅如此，木聚糖酶还能够有效地降解蒸煮过程中再吸 附和沉积在纤维表面的木聚糖，使漂白剂更好地接近残余木素，使纤维细胞壁润 胀而结构变得疏松，从而使木素容易被抽提出来。另外，木聚糖酶能够有效地除 去在蒸煮过程中产生的衍生物已烯糖醛酸木聚糖，据报道这种物质对卡伯值有一 定贡献【5 8 , 5 9 , 6 0 , 6 1 , 6 2 , 6 3 ，6 4 。 此外，酶法脱墨可以提高回收纸浆的滤水能力，与化学脱墨法相比，酶法脱墨 后的纸浆具有高白度、高自由度和低残留墨等优点。木聚糖酶和纤维素酶是酶法 脱墨中研究最多的酶。木聚糖酶与纤维素酶、淀粉酶协同作用可以在混合办公废 纸脱墨中明显改善脱墨效果，与化学脱墨浆相比尘埃度大大下降【6 5 】。回收的废纸 采用酶法脱墨，可减轻化学方法脱墨带来的环境污染，是一种经济有效的方法， 已经应用于工业生产中。另外，木聚糖酶在去皮、浸渍中也有一定作用删。 1 3 2 木聚糖酶在饲料工业中的应用 动物饲料中半纤维素对于非反当类动物来说几乎没有营养价值，因为这类动 物缺乏合适的降解酶类。然而，这些未消化的半纤维素会在动物肠道中增加食物 的粘度，从而影响消化酶透性，不利于纤维素降解，影响食物的消化和吸收。在 大麦类动物饲料中，阿拉伯木聚糖是构成非淀粉多糖的主要成分，占谷粒中多糖 成分的4 - - 8 ，占胚乳中多糖的2 5 ，占糊粉层中多糖的7 5 ，而这部分物质 只是部分水溶性的，所以会产生高度粘稠的水溶液，从而造成动物饲料中谷物难 以吸收利用。如果在动物饲料加入木聚糖酶，就可以降解这类物质，利于可利用 多糖的降解，从而增加饲料利用率。早在1 9 5 7 年，j e n s e n 6 7 1 报道在饲料中添加木 聚糖酶可降解植物细胞壁中的木聚糖，改善其营养价值。 另外，添加木聚糖酶还可以减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，使畜禽体重 均匀；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物浓度，减少环境污染【6 8 , 6 9 , 7 0 , 7 1 。 1 3 3 木聚糖酶在食品工业中的应用 木聚糖酶在食品工业中主要是应用在小麦面粉的改良方面 7 2 1 。小麦面粉中的非 淀粉多糖( n o n s t a r c hp o l y s a e c h a r i d e s , n s p s ) 主要是戊聚糖( 主要成份是阿拉伯木聚 糖，其中水溶性阿拉伯木聚糖约占2 0 - - , 3 0 ，水不可溶性阿拉伯木聚糖约7 0 山东轻工业学院硕士学位论文 8 0 ) ，它在面粉中的含量虽然很少( 约占面粉干基的2 , - - - 3 ) ，但对面团的流变 性质和面食品质有显著影响【7 3 1 。在面包加工过程中适量添加戊聚糖酶( 主要是木 聚糖酶) 不仅能提高面团的机械加工性能，而且可以消除发酵过度的危害，增大 面包体积，改善面包芯质地以及延缓老化等【7 4 】。这是因为木聚糖酶能够通过降解 面团中的阿拉伯木聚糖以改善产品品质。大多数研究者使用的中温真菌木聚糖酶， 添加了该酶的面包体积最大增加量茭- j 3 0 1 t m 7 5 1 。 果蔬细胞壁是由果胶质、纤维素和半纤维素等组成的网状结构，可阻止细胞内 容物的渗出。将木聚糖酶与纤维素酶、淀粉酶、果胶酶合理搭配就可在极温和的 条件下破坏果蔬原料的细胞结构，提高有效成分的浸出率，增加汁液中营养物质 和风味物质的含量，同时又可极大地降低提取液的粘度，成倍提高汁液的浓缩或 干燥效率，使果蔬汁的澄清度等质量指标得到明显的提高【7 6 7 7 , 7 8 1 。 另外，由于功能性低聚糖具有显著的双歧杆菌增殖能力 7 9 1 ，不被消化特性【8 0 1 ， 无龋齿性【盯1 ，促进人体对钙的吸收【8 2 】等多种良好的生理学特性，目前已成为食品 工业上研究开发的热点。 低聚木糖的生产不仅将促进我国低聚糖工业向一个新的方向发展，而且还可以 处理农林废料，变废为宝，保护环境，具有十分重大的经济效益和社会效益。在 国外，低聚木糖的生理功能已得到人们的认同，其需求量日益增加；在我国，低 聚木糖的功能也越来越受到人们的青睐。 1 3 4 木聚糖酶在酿酒工业中的应用 酒是传统的消费品，出于成本的考虑，至今为止，尚未见到有工业化使用木聚 糖酶在酒类的酿造过程中，但是在葡萄酒和日本大麦烧酒的生产中，已经有了木 聚糖酶的应用研究，并且取得了比较好的结果，原因在于木聚糖酶对谷物细胞壁 中木聚糖的作用有助于加快淀粉酶的作用1 8 3 , 8 4 1 在白酒和葡萄酒的酿制过程中，木聚糖酶的主要作用是与纤维素酶等其他多水 解酶的协同破坏原料细胞的结构，促进淀粉、蛋白质等有效成分的溶出，加速其 他酶( 主要是淀粉酶) 的作用，提高发酵效率，增加酒精的产掣8 5 , 8 6 。 在啤酒行业中，由于啤酒生产原料中由于p 葡聚糖和木聚糖含量较高，造成麦 汁过滤困难，酒液混浊，啤酒滤膜堵塞。随着国内纯生啤酒的快速发展，由b 葡聚 糖和木聚糖造成的啤酒滤膜堵塞提高了啤酒的生产成本【8 7 , 8 8 。木聚糖酶和1 3 葡聚糖 酶的协同作用，解决了滤