（发酵工程专业论文）净水贫营养细菌的筛选及其低营养特性的研究.pdf

摘要 本课题主要进行了贫营养细菌的分离、净水能力筛选和低营养特性研究三方面 的工作，主要结果如下： 1 利用低营养浓度的培养基，从不同环境中分离得到了3 8 株贫营养细菌，均为兼 性营养类型。经1 6 sr d n a 序列分析，主要为不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 、产卟 啉杆菌属( p o r p h y r o b a c t e r ) 、短杆菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 和芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 等1 8 个属。其中，不动杆菌属( a c i n e t o b a c t e r ) 在自然水体来源的样品中几乎都有 分布，而在土壤来源样品中产卟啉杆菌属( p o r p h y r o b a c t e r ) 的数量较多，两者 分别占总数的2 3 6 8 和1 8 4 2 。 2 采用化学需氧量( c o d m ) 和总有机碳( t o c ) 两种检测指标，从3 8 株贫营养 细菌中筛选到一株对微污染水源有较好净化效果的菌株y l l ，其对水中c o d m 。 和t o c 的降解率分别达到4 8 0 1 和4 6 8 3 ，水质与处理前相比，透明度有明 显提高。该菌株经生理生化反应迸一步鉴定为短小芽孢杆菌( b a c i l l u s p u m i l u s ) 。 其次净水效果较好的是一株短杆菌3 1 。与非芽孢杆菌3 1 相比，芽孢杆菌y l l 更 具有大规模应用的优势。 3 对针对微污染水源有较好净化效果的贫营养细菌y i i 和3 1 进行了低营养特性的 研究。结果显示，与富营养细菌相比，贫营养细菌在低营养环境中能长期存活； 能利用多种基质作为营养来源，甚至包括一些难利用的有毒有害污染物；磷酸盐 对贫营养细菌在低浓度有机质中的生长起到了促进作用；长期生活在低营养条件 下，对一些抑制因子的抗性出现了变化。 关键词：贫营养细菌；微污染水体净化；低营养 a b s t r a c t t h r e es e c t i o n sa b o u tt h eo l i g o t r o p h i cb a c t e r i ai n c l u d e di nt h i sr e s e a r c h ：i s o l a t i o n ， s c r e e n i n go nw a t e rp u r i f i c a t i o na n dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fl o w - n u t r i e n tc o n d i t i o n s t h e m a i nr e s u l t sw e r ea sf c i l l o w s ： 1 t h i r t y - e i g h tf a c u l t a t i v eo l i g o t m p h i c b a c t e r i aw e r ei s o l a t e df r o md i f f e r e n t e n v i r o n m e n tw i t hl o w - n u t r i e n tm e d i u m ，a n dt h e i r1 6 sr d n a s e q u e n c e sw e r ea n a l y z e d a l lo ft h es t r a i n sb e l o n g e dt oe i g h t e e ng e n e r a , m o s to fw h i c hw e r ec l o s e l yr e l a t e dt o g e n e r aa c i n e t o b a c t e r ( 2 3 6 8 ) ，p o r p h y r o b a c t e r ( 1 8 4 2 ) ，b r e v i b a c t e r i u m ( 1 0 5 3 ) a n d b a c i l l u s ( 7 8 9 ) a m o n gt h e m ，a c i n e t o b a c t e ra l m o s te x i s t e di nt h ew a t e rs a m p l e sf r o m n a t u r e ，a n dp o r p h y r o b a c t e rw e r ei nt h ea s c e n d a n tq u a n t i t a t i v e l yf r o mt h es o i l 2 a m o n gt h i r t y e i g h to l i g o t r o p h i cb a c t e r i a , as t r a i ny l lw a ss c r e e n e db e c a u s eo f i t se f f i c i e n tp u r i f i c a t i o no i lm i c r o p o l l u t e dw a t e r t r e a t i n gw i t hy l l ，t h ec o d m na n dt o c o ft h et r e a t e dw a t e rr e d u c e d4 8 0 1 a n d4 6 8 3 r e s p e c t i v e l y , a n dt h ew a t e rb e c a m e m u c hd e a r e rc o m p a r e dw i t ht h eb l a n kc o n t r 0 1 y l lw a s d e n t f l e dt ob eb a c i l l u sp u m i l u s a f t e rb i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s e x p e r i m e n m b r e v i b a c t e r i u m3 1w a st h es e c o n d l y e f f i c i e n ts t r a i no nm i c r o - p o l l u t e dw a t e r b e c a u s eo fi t ss p o r e s ，b a c i l l u s p u m i l u sy l lh a d m o r ea d v a n t a g ei na p p l i c a t i o no n a l a r g es c a l e 3 t h e s t u d ya b o u tl o w n u t r i e n tc h a r a c t e r i s t i c so fy l la n d3 1w e r ec a r r i e dt h r o u g h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo l i g o t r o p h i cb a c t e r i ah a dh i g ht o l e r a n c e sf o rs t a r v a t i o n , a n d r e m a i n e dv i a b l ea f t e rl o n gt i m ec o m p a r e dw i t ht h ee u t r o p h i cb a c t e r i a f u r t h e r m o r e ，t h e o l i g o t r o p h i cb a c t e r i au t i l i z e dm o r es u b s t a n c e si n c l u d i n gs e v e r a lp o i s o n o u sa n dh u r t f u l p o l l u t a n t s t h er e s e a r c h e sa l s of o u n dt h a tt h ep h o s p h a t ep l a y e da ni m p o r t a n tr o l ei nt h e g r o w t ho ft h eo l i g o t r o p h i cb a c t e r i ao nl o w - n u t r i e n tm e d i u m b e s i d e s ，t h ec h a r g e so f r e s i s t a n c ea p p e a r e da f t e rl o n g t e r mc u l t i v a t i o na sw e l la so nl o w - n u t r i e n tm e d i u m k e yw o r d s ：o l i g o t r o p h i cb a c t e r i a ；p u r i f i c a t i o no nm i c r o - p o l l u t e dw a t e r ；l o w - n u t r i e n t c o n d i t i o n s 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 歪 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：嗄旅 时间： 删年# 月 ，争日 签名日期：幻以年，月，牛日 签名日期：d 年口口月y 日 注：请将本袁直接装订在学位论支的扉页和目录之闻 华中农业大学硕士学位论文 1 前言 1 1 贫营养细菌概述 1 1 1 概念及营养类型 贫营养细菌( o l i g o t r o p h i cb a c t e r i a ) 又称寡营养细菌。1 9 7 9 年，k u z n e t s o v 提出 了贫营养细菌的概念，并定义为第一次培养时能在含碳1 1 5m g l 培养基中生长的 细菌( k u z n e t s o ve ta 1 ，1 9 7 9 ) ，这个定义已经被大家广泛接受。同时，把不能在富 营养培养基上生长的贫营养细菌称为专性贫营养细菌( o l i g a t e o l i g o t r o p h i cb a c t e f i a ) ， 在贫营养和富营养培养基上都可以生长的细菌称为兼性贫营养细菌( f a c u l t a f i v e o h g o t r o p h i cb a c t e h a ) 。由于还存在一类微生物只能生长在营养丰富的环境中，为了 与贫营养微生物有所区别，p o i n d e x t e r 提出了“富营养细菌”( c o p i o t r o p h i c o r ) 一词， 指的是能发酵碳水化合物的细菌( p o i n d e x t e r ，1 9 8 1 ) 。 贫营养细菌并不是微生物分类学上的专用术语，而是指在贫营养生态环境中生 存的细菌，它们在系统发育上可能归属于不同的细菌进化分支。 根据贫营养细菌的培养性可以将其大致划分为4 种类型：( 1 ) 仅在初次分离时 能在营养贫乏的培养基上培养的细菌；( 2 ) 初次分离时能在营养贫乏的培养基上培 养，然后也能在营养丰富的培养基上培养的细菌；( 3 ) 仅在特殊的营养贫乏培养基 上生长的细菌；( 4 ) 在实验室尚不能培养，但在电子显微镜下能观察到的细菌( k o c h ， 1 9 7 9 ) 。 由于贫营养细菌的分离、培养比较困难，并且其生长缓慢，研究周期较长，所 以上世纪8 0 年代前贫营养细菌的研究进展比较缓慢，直到8 0 年代中期，贫营养细 菌才逐渐引起了各国学者的注意。目前，国外对贫营养细菌从其生理、生态、遗传 以及系统发育等方面进行了广泛的研究( h a t t o r ira n dh a t t o r it ，1 9 8 0 ：m o r i t a ，1 9 9 7 ) ， 而在我国相关的研究报道还比较少。 1 1 2 生态分布 在自然界中，绝大多数自然环境都是以贫营养为特征的，如沙漠中的有机碳含 量不足2 0m g k g ，占地球总面积7 0 以上的海洋中的可溶性有机碳浓度在0 3 5m g l 7 0m g l ，贫营养湖泊不超过0 1m g l ( 王颖群和严共华，1 9 9 5 ) 。同实验室营养丰 富的培养条件相比，大多数土壤也经常处于营养缺乏的状态。土壤中大部分细菌群 落处于休眠状态，只有少部分能获得足够的能量以供生长；即使在适宜的环境条件 下，也只有1 5 3 0 的细菌群落是活跃的。 1 前言 到目前为止，人们已经分别从土壤( o h t aa n dh a t t o r i ，1 9 8 3 ；h a t t o r i ，1 9 8 4 ； w h a n ga n dh a t t o r i ，1 9 8 8 ；王平等，1 9 9 4 ) 、沙表土( j i z h o n gz ，2 0 0 3 ) 、湖泊河水( c o r p e a n dj e n s e n ，1 9 9 2 ) 、地下水( s c h a f f t e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 、海洋( s t a h le ta 1 ，1 9 9 2 ；f e g a t e l l a a n dc a v i c c h i o l i ，2 0 0 0 ) 、缺乏有机质的饮用水( j a e g g in ea n ds c h m i d t l o r e n zw ， 1 9 9 0 ) 、甚至蒸馏水( f a v e r oe ta 1 ，1 9 7 1 ) 等环境中分离出贫营养细菌，这表明贫营 养细菌在自然环境中普遍存在。 在低营养水域中已经分离到鞘细菌、假单胞菌、弧茵、棒状杆菌、生丝微菌等 多种细菌，其中鞘氨醇单胞菌( s p h i n g o p y x i sa l a s k e n s i s ) 作为海洋贫营养细菌的典 型代表，已作为模式菌株对其展开了广泛的研究( o s t r o w s k ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。另外， 在低温条件下也存在贫营养细菌。s l a b o v a 首次发现肾形杆菌( r e n o b a c t e r ) 、甲基杆 菌( m e t h y l o b a c t e r i u m ) ，新月柄杆菌( c a u l o b a c t e r c r e s c e n t u s ) 等5 株贫营养细菌能 长期生存在- - 2 的低温环境中( s l a b o v aa n dn i k i t i n ，2 0 0 4 ) 。 在低营养环境中不仅存在原核生物，也有真核生物的存在。k i m u r a 的研究小组 从土壤中分离到7 株隐球酵母( c r y p t o c o c c a c e a e ) ，它们也能长期耐受低营养的环境 ( k i m u r ae ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 1 3 研究贫营养细菌的生态意义 地球上生命出现的早期，营养条件极其贫乏，只有能够适应贫营养条件的生物 才能生存。w o e s e 根据r 砌啦序列特征比较提出的生物系统发育树，总结出最早出现 在地球上的生命应属于能在极端环境下生存，并可以利用无机营养的真细菌和古细 菌，而能进行光合作用以及以有机物为碳源和能源的生物在地球上出现的时间相对 较晚。因此，贫营养细菌有可能是早期地球环境中的主要微生物。贫营养细菌能否 在此时繁衍，在漫长的进化过程中它们又是如何适应环境条件，通过解答这些问题， 对于人们认识生物的进化生态学以及早期生物在地球环境有机化过程中的作用具有 重要的理论意义( w o e s e ，2 0 0 0 ) 贫营养细菌生态分布很广，构成了生物圈的大部分，在生物地球化学循环中起 关键作用。w h i t e m a n 对世界主要低营养海域中贫营养微生物数量进行了测定，表明 贫营养细菌的生物量远大于自养型生物( w h i t e m a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。因此对贫营养细 菌生态学特性的研究，可以加深人们对整个生物圈的多样性、生态系统结构组成及 其物质循环和能量流动的再认识，进而促进极端环境生态学理论的丰富和发展。 1 1 4 贫营养细菌在环境检测中的应用 1 1 4 1 对重金属的检测 在贫营养细菌的生态学研究过程中，有一个重要的生态学特性已经引起了微生 物生态学家及环境学家们的广泛关注。贫营养细菌对环境中的重金属变化十分敏感。 华中农业大学硕士学位论文 t a d a 用重金属( h g 、h g 、c d 、c r 、p b 、z n 、c u ) 处理来自土壤中的贫营养细菌， 发现贫营养细菌对重金属十分敏感，e d s 0 ( 生态剂量) 可以达到1 0 3 1 0 - 5 m m o l l ， 并于2 0 0 1 年提出了用贫营养细菌监测水环境中重金属污染的方法，指出贫营养细菌 对重金属的污染具有良好的生物监测作用( t a d aa n d i n o u r ，2 0 0 0 ；t a d ae ta 1 2 0 0 1 ) 。 1 1 4 2 对医学微生物的检测 在医学制药车间、手术室等要求无菌的环境中，微生物监测是一项常规工作。 传统的微生物监测是采用标准的实验室培养方法，但近些年来人们发现用稀释培养 法能从用传统培养方法己证明无菌的临床材料中分离出大量的专一性和兼性贫营养 细菌( w a n gy e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。虽然人们暂时还不知道这些细菌的临床意义，但这充分 说明用传统方法进行医学微生物监测存在着很大的局限。p a r a g 建议贫营养细菌是检 测制药车间、手术室等环境无菌状况的有用手段( p a r a g e t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 2 贫营养细菌适应低营养特性的研究概况 1 2 1 生理适应机制 细菌是在与不断变化的环境条件发生相互作用的关系中生长、繁殖的。许多环 境因子，包括物理因子( 温度，氧化还原电位、渗透压、压力、表面张力及辐射等) 、 化学因子( 营养物质、氢离子浓度、氧及化学药物等) 和生物因子都会使细胞产生 生理压力。细菌对变化的环境主要会产生两种反应：一是逃离环境( 包括死亡) ，二 是以自组织行为来适应环境( 龙腾锐等，2 0 0 4 ) 。 贫营养细菌能在低营养环境下长期生存，正是有自己独特的适应低营养环境的 方式。贫营养细菌的种类很多，其生理适应机制因种而异。 1 2 1 1 代谢水平变低，繁殖速度变慢 细菌细胞的代谢大致有三个水平，每一个水平相当于一个热力学上的稳态。其 中，最低水平的代谢是细胞的内源性代谢( e n d o g e n o u sm e t a b o l i s m ) ，即当缺乏外来 可作为能源的物质时，细胞便利用内存的物质；而当细胞内贮存的物质陷入缺乏时， 细胞便开始死亡，因此细胞的内源性代谢是受时间限制的。 第二个水平是维持代谢( m a i n t e n a n c em e t a b o l i s m ) ，当有外源性物质存在时，细 胞不进行生长而只是维持活性，这时的代谢称维持代谢，处在这种状态的细胞叫作 非生长细胞或休息细胞。由于其在生理上表现为代谢低下，有潜在繁殖能力而不出 现明显增殖，也称之为细菌的潜生体。因为没有生长，此时外来的能源和碳源物质 ( 如葡萄糖) 只用来供给细胞能量，而这些能量是消耗在维持细胞生命的各个过程。 例如维持细胞活性、生物大分子( r n a 和蛋白及细胞壁的多糖) 的稳定再合成、细 胞质的p h 值和渗透压的调节、向细胞内的活性运输及其它方面。 1 前言 第三个水平是生长代谢( g r o w t h m e t a b o l i s m ) 。这时细胞处于生长发育中，外来 的能源、碳源、氮源、微量元素和激素等都足必要的，生长的物理条件，如温度、 氧等都必须满足。 细菌在贫营养状态或者说营养受到限制的情况下，就会进入一种降低代谢活性 的生理状态( 休眠状态) ，使它们在不利的环境条件下能存活较长时间，或者诱导特 殊代谢基因的表达以适应环境的变化。 1 2 1 2 对营养基质利用更充分 处于饥饿生存状态的细胞，由于能量缺乏，代谢机制的效率得到提高，因此对 基质的利用效率提高。在营养丰富环境中生活的细菌采用，扣一生长战略，即高生长 率途径，增加最大比生长速率系数，可以充分发展种群。而贫营养细菌采用的是l ，_ 一 生长战略，有较小的最大增值速度，即通过降低半饱和系数，尽可能多地吸收不同 类型的基质。这种低的半饱和系数是微生物逐渐适应低营养环境的结果( 桑军强和 王占生，2 0 0 3 ) 。 有入认为半饱和系数是由细胞膜传质过程控制的，当生物量与污染物比例发生 变化时，细胞膜会调节外界营养物质进入细胞的速率或传输能力。尤其当生物量较 高，而营养物质相对缺乏时，细胞膜不得不强化其主动传输能力，因而增强细胞对 基质的亲和力( o s t r c ) w s l 【ie ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 贫营养细菌细胞膜上不但有各种不同的专一性营养物质吸收系统，而且还具有 同时吸收混合营养物质的转运系统( e g u c h ie ta 1 ，1 9 9 6 ) ，以保证营养物质的有效吸 收。一种贫营养细菌通常能够吸收和利用几种甚至几十种不同类型的有机物，所以 在营养比较贫乏的条件下，能够充分利用环境中的有机物。有的贫营养细菌还具有 从大气中摄取营养物质的能力，以利用大气中微量的碳源和氮源来维持正常生长。 对贫营养细菌营养动力学的研究表明，当环境中的碳浓度较低时，贫营养细菌 的k m ( 米氏常数) 值较富营养细菌低，因而贫营养细菌对碳的亲和力大于富营养 细菌，这说明相对于富营养细菌，在低营养环境中的贫营养细菌具有较大的营养竞 争优势( 张崇邦等，2 0 0 5 ) 。 在贫营养条件下，贫营养细菌的代谢主要与两种基质有关：一是贫营养环境中 的主体基质( 也称初级基质) ，它们足群落生存发展的主要营养和能量来源，其浓度 常在m g l 水平。其次是微污染物，大多是有机污染物，浓度通常在p 彰，l 级的水平。 由于这些物质作为唯一的碳源和能源不能为细菌提供足够的能量，单独存在时是不 容易被生物降解的。当存在其它物质能够满足微生物细胞生长代谢的能量需求时， 这些微污染物也可以被微生物利用，这类低浓度污染物质即被称为二级基质。虽然 二级基质提供的能量很少，但它被利用的过程也包括了有机物的部分生物氧化和完 全的生物氧化过程，形成的代谢中问产物可作为细胞合成的基质。因此，贫营养细 菌正是通过二次基质的利用原理来降解水中痕量有机物的。 4 华中农业大学硕士学位论文 在微污染水体中，天然有机物占大多数，其中所含的腐殖质是贫营养细菌的主 要基质，它们可以提供足够的碳源和能量来源，而其他微量污染物如苯酚、萘、m m ( - - 甲基异茨醇) 、土臭素( - - 甲基萘烷醇) 等可以通过二次基质代谢途径被降解。 由于富里酸是腐殖质中的主要部分，n a m k u n g 在以1 1m g l 富里酸为初级基质研究 了生物膜对引起嗅味的痕量物质的降解效果。结果显示，尽管富里酸只有1 0 被降 解，但它能够支持生物膜的大量生长，而土臭素和m m 的去除率可以达到5 5 和 4 4 ，而苯酚和萘的去除率分别高达9 0 以上( n a m k u n g ，1 9 9 7 ) 。 通过生物化学和酶成分分析，发现贫营养细菌细胞附件( 柄、丝、鞘等) 的成 分不同于其他部分，它不含有核糖蛋白、d n a 、r n a 、n a d h 氧化酶和脱氢酶，但 含有与传质和氧化相关的酶类，包括细胞色素、碱基磷酸酶等，这说明细胞附件包 含与传质和能量生产相关的过程。这种进化有利于贫营养细菌在极低浓度基质环境 中生存和繁殖。 1 2 1 3 缩小体积，增大比表面积 贫营养环境中的细菌具有独特的饥饿生存适应方式，可以在很短时间内急剧减 小其细胞体积和内源呼吸来减少营养需求。同时，由于基质浓度非常低，贫营养细 菌不仅仅通过被动的扩散渗透和主动输运收集有用的基质，为了最大限度地收集基 质，更加有效地捕捉有机物，贫营养细菌细胞的比表面积与体积之比都非常大。 在形态上，它们可以变成不同于繁殖体的纤细状细胞，其长度可达到正常繁殖 体的几倍甚至几十倍。例如，有的贫营养细菌能够借助柄或丝状体，增加细胞面积， 吸收有机物和低浓度的氮和磷。有研究表明，处于海洋环境的细菌在低营养环境条 件下多呈球形，这样可以增加表面面积与体积的比值，提高吸收营养物质的能力。 1 2 1 4 多以生物膜形式存在 贫营养微生物较少以游离状态存在，通常以生物膜的形式存在，贫营养生物膜 是附着在固体表面的层状积聚体。生物膜的形成减少了外界贫营养环境和其他不利 的生存环境对其中细菌的影响，是微生物适应贫营养环境的结果。在自然生态系统 中，尤其在较低营养浓度的环境中，生物膜占生物总量的9 9 - 9 9 9 。在自然界， 河边、地下水层、湖泊岸边、水生植物与动物体表面等，都有生物膜的存在( s c h w a r t z e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 水中的贫营养细菌更“愿意”形成生物膜而不是游离细胞的形式存在，原因可 能有以下4 点： ( 1 ) 固体物质表面有细菌生长所需要的营养物质，比如有机物。附着在大颗粒 上后，细菌占据了一个微环境，在这里可以得到比周围水环境中浓度高得多的营养 物质。 ( 2 ) 细菌可以附着在颗粒载体表面四处扩展，以在更大范围内寻找营养。 5 1 前言 ( 3 ) 以生物膜存在时细菌还可最大限度地相互依赖，共享有限的营养以维持种 群生存。形成生物膜的微生物群落在一定程度上会体现出多细胞生物的特征，如细 胞间的协作、功能上的分化( 于鑫等，2 0 0 4 ) 。 ( 4 ) 对外界不良环境的抗性提高。生物膜为细菌提供了保护，细胞吸附到固型 物( 沙粒、土粒、沉积物等) 表面，其d n a 的抗降解能力比游离细胞d n a 可提高1 0 0 到1 0 0 0 倍，曾经观察到来自水环境中的d n a 比水底沉积物的d n a 稳定性差，易 遭到d n a s e 的降解( 陈向东等，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 5 抗性增强 低营养环境中的细菌对除营养匮乏以外的其他不利环境也有相应的适应机能。 与高营养基质生长的细菌相比，贫营养基质下生长的细菌具有较高的抗性( a r t h u r ， 1 9 9 7 ) 。有关嗜肺军团菌( l e g i o n e l l ap n e u m o n i a e ) 的研究己证明，在龙头水中培养 出生长速度缓慢的细胞较在浓培养基中培养的生长速度快的活细胞对消毒剂更具有 抗药性。生长于贫营养“自然生境”中的肺炎军团菌比营养琼脂中生长的细菌有6 - 9 倍之多的抗性，无荚膜、有荚膜的肺炎克雷伯式菌株在贫营养基质下生长对自由余 氯的抗性分别增加了2 倍、3 倍( l e c h e v a l l i e ra n db a b c o c k ，1 9 8 7 ) 。 细菌的抗性还可能来自环境中的d n a 。最新的研究发现，几乎所有的活细菌都 可向环境主动分泌或因死亡裂解而释放d n a ，这些遗传信息可被感受态细菌( 不利 的生长条件是细菌形成感受态的重要生理基础) 获得。如果细菌一旦获得合适的基 因，它将有可能扩大环境中其所能利用的营养物质范围或获得抵抗生长抑制因子( 如 抗生素) 的能力，从而能继续生存下去( 陈向东等，1 9 9 8 ) 。 此外，很多研究表明细菌的抗性也可能因为细菌附着于物体表面而增强，颗粒 物质、器壁等的表面对附着于其上的细菌有保护作用。 1 2 2 贫营养细菌耐受低营养环境的可能原因 1 2 2 1 专性贫营养细菌不适应富营养环境的可能原因 富营养条件改变了贫营养细菌的渗透压。细胞膜溶质泵对外部物质转运太迅速 以至于细胞来不及消费，导致渗透膨胀；细胞不正确地泵入了无法利用的物质；许 多物质同时进入细胞使渗透压太高；细胞泵入某种对细胞有害的物质导致缺少其它 生长因子使生长受阻；细胞壁生长受阻，营养物质无法引入。 富营养条件下，贫营养细菌生长不平衡：可能由于太多的可转运的非代谢物质 突然可以获得，从而使细胞能量物质a t p 或质子驱动力大量耗竭；细胞壁的扩展与 细胞质的增长不成比例；细胞膜中含有太高的膜蛋白与脂的比率，使细胞质膜的生 长成为不可能。因为太多的膜蛋白可能削弱膜或阻碍其生长。 华中农业大学硕士学位论文 有毒物质的形成。半乳糖苷以未知的方式增多；在氧化剂( 氧) 存在的条件下， 由于营养物质的代谢使自由基的形成速率太高，从而杀伤或杀死细胞。 细胞分裂机制的失调。由于染色体复制启动的失败使d n a 合成过程永久性受 阻；细胞分裂由于膜的形成失败或无法正常收缩而受阻；细胞耗竭了蛋白合成所必 需的辅助因子而使生长不能进行或恢复；细胞代谢调节失衡，并且不容易恢复。 1 2 2 2 富营养细菌不适应低营养环境的可能原因 缺乏适当的调节系统。主要表现为：富营养细菌长期以来已经丧失或无法激活 饥饿机制( 营养不足，细胞代谢降低；营养充足，细胞代谢加快) ，甚至根本没有 或已摒弃了饥饿机制。 缺乏足够的时间适应贫营养环境，如保护蛋白的形成。 由于缺乏足够的核苷酸供应使d n a 损伤修复受阻。 d n a 损伤后，s o s 系统( d n a 损伤修复系统) 不能正常发挥功能或不能阻止染 色体的复制和细胞分裂。 在饥饿条件下，细胞内的合成反应向相反的方向进行。如酶和蛋白合成系统被 迫催化可逆的反应过程，这个过程除非被阻止，否则水解和渗漏就会发生。 代谢性或非代谢性物质毒害细胞。如1 磷酸半乳糖苷在细菌和人体中的致死性 就是由于代谢的不平衡所致。 与贫营养细菌的竞争。自然界中，当一定类型的营养物质可能处于十分低的水 平时，由于贫营养细菌的k m 值较富营养细菌低，贫营养细菌耗竭了该种资源并与进 入该环境的富营养菌竞争。 与贫营养细菌需要较少的维持能相比，富营养菌需要较多的能量补偿，以便用 于修复和再合成损伤的细胞组成成分。 1 2 2 3 磷的作用 磷是微生物细胞中必须而且大量的营养元素。磷元素在生物化学过程中起着主 导作用，是重要的调控中心。我国的科学家从化学模型、数学模型和动力学模型三 个方面证明，氨基酸和磷的化合物一磷酰化氨基酸是生命起源的种子( 郑兴灿和李 亚新，1 9 9 8 ) 。 所有微生物都含有相当数量的磷，一般占灰分总量的3 0 - 5 0 。微生物需要磷 来合成核酸，脂多糖和磷脂及其它含磷化合物，壁酸和聚合磷酸盐是其中主要的含 磷化合物。核糖核酸( 心渔) 和脱氧核糖核酸( d n a ) 的含磷量为1 0 1 2 。微生 物细胞内组成d n a 、r n a 和磷脂的磷几乎占到微生物细胞内全部磷的6 0 ，其余 的磷由细胞质磷和聚合磷酸盐组成。聚合磷酸盐广泛存在于细菌、酵母，真菌和藻 类细胞中，是异染粒的主要组分。磷同时也是许多酶或辅酶的重要组成成分，这些 辅酶有辅酶i ( n a d ) 、辅酶i i ( n a d p ) 、辅酶a 、辅羧化酶等。 1 前言 磷酸盐是微生物细胞内能量传递a t p 系统的关键组成部分。三磷酸腺苷( a t p ) 上的磷酸酯键可以贮存高水平的能量，a t p 转换成二磷酸腺苷( a d p ) 的过程中可 以释放7 4k c a l m o l 的能量，高能磷酸酯键在生物体的能量贮存与传递过程中起着 重要作用( 姜登岭，2 0 0 4 ) 。 s t e f f e n s e n 等研究了多基质生物降解过程中无机营养的竞争问题。不添加磷的情 况下，只有非常少量的苯甲胺( b e n z y l a m i n e ) 能够被p s e u d o m o n a s p u t i d a 降解，加 入微量磷后，降解速度明显加快( s t e f f e n s e na n d a l e x a n d e r ，1 9 9 5 ) 。 r o b e r t s o n 等研究了假单胞菌和棒杆菌对苯酚、对硝基苯酚、葡萄糖的降解能力。 加入微量的磷酸盐后，两种细菌对基质的降解能力大大加强，而且细菌数量明显增 多( r o b e r s o na n d a l e x a n d e r ，1 9 9 2 ) 。 r i p p e y 等研究人员以贫营养湖水为对象，研究添加碳源和磷源( 如k h 2 p 0 4 ) 对细菌生长速率的影响。加入有机基质后，细菌生长速率没有显著变化，而加入无 机磷酸盐后，细菌生长速率明显加快( r i p p e ye ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 研究人员在贫营养细菌的能量转化动力学上发现，磷酸盐在贫营养细菌的能量 转换中发挥着重要的作用。可能正是由于这个原因在贫营养细菌的培养中加入一 定量的磷源，可以促进细胞的生长。 1 2 3 针对低营养特性的新研究方法 贫营养细菌的研究方法，主要集中在以下两个方面：贫营养细菌的形态结构和 生理生态学。在形态结构研究方面，一是利用传统的稀释平板法分离易培养的贫营 养细菌；另一个就是将涂有稀营养培养基的载玻片直接放在水体中进行原位培养那 些难以培养的贫营养细菌，或者将湖水放在铜网支持膜上进行培养，然后用扫描或 透射电子显微镜对贫营养细菌进行形态与精细结构分析 b u r o n 等提出了灭绝稀释培养法( e x t i n c t i o nd i l u t i o nc u l t u r i n gm e t h o d ) 用以最大 限度地分离海水中在数量上占优势的贫营养细菌；将海水样本进行一系列的稀释直 到没有微生物细胞存在为止，然后将各稀释管分别培养，观察各管的微生物生长情 况，再做进一步的分析。该方法目前被认为是分离水生贫营养细菌最有效的方法 ( b u t t o ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。 k a e b e f l c i n 等设计了扩散箱培养法，用于分离不可培养的海洋微生物：在扩散箱 子的底部装有用0 0 3 a m 孔隙的聚碳酸酯膜，膜上面放上含有微生物( 作为“合作” 微生物) 的琼脂，箱子顶部装有同样的聚碳酸酯膜，在顶膜与琼脂之间留有一薄层 空间，该空间可充满海水。顶部和底部的膜都能与海水进行化学物质交换，但却限 制细胞的移动( k a e b e f l e i ne ta 1 2 0 0 2 ) 。 s t e p h a n i e 等对贫营养细菌分离后如何获得最大的贫营养细菌生物量进行探讨， 并设计了高产量培养方法( h i g ht h r o ug l l p u tm e t h o d ) ，以供对不可培养的细菌进行 华中农业大学硕士学位论文 培养、鉴定以及生理特性分析。其主要过程为：利用荧光显微镜对接种物直接计数 一将接种物稀释成1 5 个细胞m l ，按每孔1m l 滴加到微量滴定板中一按要求的时 间和条件进行培养一从每个孔中取2 0 0 口l 培养物，分别排列在过滤膜上，染色，再 将滤膜转到载玻片上，用荧光显微镜筛选呈阳性反应的培养物一供进一步分析 ( s t e p h a n i ea n ds t e p h e n ，2 0 0 2 ) 。 尽管上述贫营养细菌研究方法对推动贫营养细菌的研究起到了很大的作用。但 由于环境中的大多数贫营养细菌无法在实验室中培养，因而单凭上述方法是不够的。 近年来分子生物学的研究方法逐渐被用于贫营养细菌的研究过程中，如通过d n a 的基因测序( d n a s e q u e n c i n g ) 来研究贫营养细菌在系统发育上与其它细菌的关系， 利用o f r g ( o l i g o n u c l e o t i d ef i n g e r p r i n t i n go frr n ag e n e s ) 与荧光抗体技术对贫营 养细菌进行鉴定等( s c h u te ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 在贫营养细菌的生理生态研究方面，利用1 4 c - - g l u c o s e 营养液处理含贫营养细 菌的海水，然后通过聚碳酸酯膜过滤，用h a 洗膜，洗脱物放于闪烁瓶中。最后用 闪烁记数器来估计“c - - c 0 2 的释放量以及葡萄糖的利用率( a y oe t a l ，2 0 0 1 ) ，同 时用放射性标记与聚丙烯酰胺凝胶电泳技术相结合也可以研究贫营养细菌对饥饿的 生理反应。利用b i o l o g 微量滴定技术可以研究土壤贫营养细菌对不同碳源的反应 以及功能多样性( k r i s t aa n ds e x s t o n e ，2 0 0 1 ) 。荧光原位杂交( f l u o r e s c e n ti n s i t u h y b d d i z m i o na n a l y s i s ) 与狭缝印迹杂交( s l o tb l o th y b r i d i z a t i o n ) 技术相结合可用于 定量分析贫营养细菌的群落结构组成。利用限制性片段长度多态分析( r e s t r i c t i o n f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s ma n a l y s i s ，r f l p ) 技术研究贫营养细菌的遗传多样性 ( h u g e n h o l t ze ta 1 ，1 9 9 8 ) 。放射性同位素标记与分子生物学方法极大地推动了贫 营养细菌在系统发育、生理遗传特征、种类组成以及群落结构等方面的研究。 1 3 水体微污染及其净化 1 3 1 水资源短缺和水源污染现状 随着经济的发展，世界范围的淡水资源需求的增大，相应的城市污水和工业废 水的排放量也在不断增多。由于污水处理设施建设的滞后和污染控制不够得力，全 球淡水资源正面临两大问题：水资源短缺和水环境污染。这在一些国家和地区，尤 其是包括中国在内的发展中国家，愈益严重并有加剧的趋势( 杨鲁豫等，2 0 0 1 ) 。 我国的水资源危机已经由单纯的水源性缺水转交为水源性缺水和水质性缺水并 存。从某种意义上来说水资源的质量比数量更为重要，因为只有符合一定质量标准 的水对于社会才有意义。大量含有各种有毒、有害物质的工业废水和生活污水未经 适当处理即排入天然水体，直接或间接地污染了城市的饮用水水源，使水中的有机 物、氨氮、铁、锰等的含量升高，严重威胁饮用水的卫生安全性。 9 1 前言 从目前的状况看，水源污染日益严重，受污染的水源范围日益扩大，并且很难 在短期内恢复受污染水源。所以，污水处理行业的任务和压力也相应地越来越大。 在我国淡水资源本来就十分紧缺的前提下，使用完全不受污染水源的可能性越来越 小，也就是说，我国自来水厂不得不面f 缶着使用更多不符合要求的受污染水源作为 生活饮用水( 秦媛，2 0 0 3 ) 。 1 3 2 水体微污染概况 微污染是我国近年来才出现的水处理术语。当水中所含的污染物种类多、性质 复杂，但浓度比较低时，通常被称为微污染水，其特点就是与一般污水相比，污染 物在水中的含量很低，它们的浓度一般在m g l 的水平，但并无一个严格的上限。 其主要污染物有有机物、氨氮、铁、磷、重金属等( 郝爱玲，2 0 0 4 ) 。 微污染水源中的污染物组成与严重污染水体相似，主要来自有机物，大致可以 分为两类： ( 1 ) 天然有机物。主要是动植物在自然循环过程中经腐烂分解所产生的大分子 有机物，包括腐殖质、微生物分泌物、溶解的植物组织和动物的废弃物，其中腐殖 质占总量的6 0 9 0 ，在饮用水处理中是主要的去除对象。 ( 2 ) 人工合成有机物，包括农药、商业用途合成物及一些工业废弃物。1 9 9 7 年，美国环境保护局( u s e p a ) 根据有机污染物的毒性、生物降解的可能性以及在 水体中出现的几率等因素，从7 万种有机化合物中筛选出6 5 类1 2 9 种优先控制的污 染物，其中有机化合物1 1 4 种，占总数的8 8 ，包括2 1 种杀虫剂、2 6 种卤代脂肪 烃、8 种多氯联苯、1 1 种酚、7 种亚硝酸及其它化合物。人工合成的有机物难以降 解，在环境中有一定的残留水平，具有生物富集性、三致作用和毒性，相对于水体 中的天然有机物，它们对公众的健康危害更大( 秦媛，2 0 0 3 ) 。 水体中除了以上常见的污染物超标外，还发现了一些微量污染的有毒有害化合 物也出现了超标现象，如三氯甲烷、四氯化碳和四氯乙烯等。在个别地表水样中发 现三氯甲烷的浓度达到0 1m g l ，而我国在2 0 0 2 年颁布的地表水环境质量标准 ( g b 3 8 3 8 2 0 0 2 ) 中规定三氯甲烷的含量不得高于0 0 6m g l 。美国早在1 9 7 4 年就从 饮用水中发现了三氯甲烷一类的三致物质，引起了对氯化消毒副产物的全面研究。 通过对某些癌症的发病率和病源学关系的调查以及大量的动物实验表明，长期饮用 加氯消毒的饮用水，死于消化和泌尿系统癌症的危险性会增大。 1 3 3 微污染水体的净化方法 微污染水体的处理技术，可以放在常规处理工艺前面，采用物理、化学和生物 方法，对水中的污染物进行初级去除，可以使常规处理更好地发挥作用，减轻常规 处理的负担，改善和提高水质。 1 0 华中农业大学硕士学位论文 以污水处理厂的二级出水为对象的处理技术，其目的是将二级处理出水再进一 步进行物理、化学和生物处理，以便有效地去除污水中各种不同性质的杂质，进一 步提高水质，满足用户的使用要求，回用于农业、工业、地下水回灌等。 由于污水处理厂的二级出水与微污染水源水在水质上有一定的相似性，尤其是 污染物的浓度和组成很相似，所以无论是二级出水的深度处理或是微污染水