（发酵工程专业论文）啤酒有害产酸细菌选择性培养基的优化.pdf

摘要 摘要 啤酒是以麦芽、水为主要原料，添加啤酒花，经啤酒酵母发酵而成的一种低 酒精度、含有泡沫和一定量c 0 2 的发酵酒。由于啤酒中存在乙醇( 0 5 0 , - 1 0 ， w v ) ，酒花苦味物质( 大约1 7 5 5 p p m 的异i f , 酸) ，高浓度的c 0 2 ( 大约0 5 ，w v ) ， 较低的p h 值( 3 8 - 4 7 ) ，极低的氧含量( 0 1 p p m ) ，使得啤酒被认为是一种安 全的饮料。但是如果操作不慎或卫生条件不严，仍难免有厌氧菌等有害菌的污染。 乳酸菌是啤酒厂中最容易污染，且对啤酒质量危害最大的有害菌之一。 从济南、青岛、北京三地啤酒厂中分离到有害菌1 8 株，经革兰氏染色、过 氧化氢酶实验、发酵葡萄糖产乳酸实验等证明，1 5 株为乳酸菌。从1 5 株乳酸菌 中选择6 株典型的菌株，进行发酵麦汁产酸实验。结果表明，6 株乳酸菌均能使 麦汁酸度上升1 5 0 t 。 啤酒有害乳酸菌按形态可分为乳酸杆菌和乳酸球菌。采用单因素实验和正交 实验优化乳酸杆菌和乳酸球菌的选择性培养基的成分和培养条件。单因素实验确 定最优碳源、氮源分别为葡萄糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，正交实验优化了其用 量为：葡萄糖4 、胰蛋白胨2 、大豆蛋白胨o 5 ；选择m g s 0 4 7 1 - 1 2 0 、 m n s 0 4 4 1 - 1 2 0 、k ：h p 0 4 作为培养基的无机盐组分，正交实验优化三者的用量为 m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 0 2 m n s 0 4 4 h 2 00 0 0 5 ，k 2 h p 0 4 0 4 ；对供试菌l 1 、l 3 、 p l 、p 2 的生长因子进行筛选，发现v 彤和泛酸钙对4 株菌的生长有不同程度的 促进作用。选择胡萝卜汁、番茄汁、苹果汁作为乳酸杆菌的天然生长因子，选择 酵母粉、豌豆汁作为乳酸球菌的天然生长因子。正交实验优化乳酸杆菌天然生长 因子的添加量为胡萝卜汁3 ，番茄汁2 5 ，苹果汁3 ；乳酸球菌生长因子的 用量为酵母粉0 3 ，豌豆汁5 。确定了培养基的初始p h 值为6 0 6 2 ，培养温 度为2 5 。 啤酒生产中很多工序的取样中都存在啤酒酵母，啤酒酵母的存在干扰有害菌 的检测。采用纳他霉素作为啤酒酵母的抑制剂。纳他霉素是一种新型抗真菌剂。 采用圆滤纸片法测定了纳他霉素对供试酵母2 0 6 弗、3 0 8 撑、3 0 3 撑、3 5 矿的抑制效果。 实验表明，5 p p m 纳他霉素对四株菌产生的抑菌圈直径分别为1 4 m m 、1 6 m m 、 1 6 m m 、1 8 m m ；最低抑制浓度实验表明，纳他霉素对2 0 矿、3 0 3 # 、3 5 矿的m i c 为3 p p m ，对3 0 8 # 的m i c 为4 p p m 。高温、强酸、强碱影响纳他霉素的抑菌活性。 纳他霉素经1 2 1 维持3 0 m i n 后，1 0p p m 纳他霉素无法抑制供试菌株的生长。当 p h 在5 0 7 o 时，纳他霉素抑菌活性最高；当p h 7 0 时，溶解度提高， 但是活性损失增大。 乳酸菌在培养基中生长代谢，产生乳酸，改变培养基的p h 值。单一指示剂 i v 山东轻工业学院硕士学位论文 存在变色p h 范围过宽，或变色不够灵敏等缺点，因此优化了混合指示剂。将氯 酚红与溴钾酚紫、溴钾酚绿、溴酚蓝、溴百里香酚蓝四种指示剂按照不同的比例 混合组成混合指示剂，实验表明，以氯酚红与溴钾酚紫混合的效果最佳。用p h 计测定溶液变色前后的p h 值，结果表明，氯酚红与溴钾酚紫按1 ：3 的比例混 合时，颜色由紫红变为黄色，且变色p h 范围为6 4 5 5 9 3 ，单因素实验确定其在 培养基中的最佳添加量为1 0 ( v ) 。 关键词：啤酒有害菌乳酸菌生长因子纳他霉素混合指示剂 v 摘要 a b s t r a c t b e e ri sak i n do fp r o d u c tw h i c hi sf e r m e n t e db ys a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e i t s m a i nr a wm a t e r i a l s 锄m a l t 、w a t e r 、h o p 、s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e b e e rh a sb e e n r e g a r d e da sas a f eb e v e r a g ed u e t ot h ep r e s e n c eo fe t h a n o l ( o 5 - 1 0 ，w v ) 、h o p b i t t e rc o m p o u n d s ( a p p r o x17 - 5 5 p p mo fi s o - a - a c i d s ) 、t h eh i g hc o n t e n to fc a r b o n d i o x i d e ( a p p r o xo 5 w v ) 、t h el o wp h ( 3 8 - 4 7 ) 、t h ee x t r e m e l yr e d u c e dc o n t e n to f o x y g e n ( 0 1 p p m ) h o w e v e r , af e wm i c r o o r g a n i s m ss t i l ls u r v i v e di nb e e r 邪ar e s u l to f t h ew r o n go p e r a t i o na n dp o o rs a n i t a t i o n t h e s em i c r o o r g a n i s m sa 他c a l l e d 嬲b e e r s p o i l a g eb a c t e r i a l a c t i ca c i db a c t e r i aa r et h em o s tp o l l u t e da n dh a r m f u lb a c t e r i a 18s t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o mb r e w e r i e si nj i n a n , q i n g d a oa n db e i j i n g 15 s t r a i n sw e r ed e t e r m i n e dt ob el a c t i ca c i db a c t e r i ab yt h eg r a ms t a i n i n g ，c a t a l a s et e s t , m o r p h o l o g i c a le x a m i n a t i o na n ds oo n 1 1 圮t e s tf o ra c i d - p r o d u c i n gi nw o r ts h o w e d t h a t6s t r a i n sf r o m l5s t r a i n sc o u l dm a k et h ea c i d i t yo f w o r ti n c r e a s e1 5o r b e e rs p o i l a g el a c t i ca c i db a c t e r i ac a nb ed i v i d e di n t ol a c t o b a c i l l ia n dp e d i o c o c c i a c c o r d i n gt om o r p h o l o g y t h ec o m p o s i t i o no fl a c t o b a c i l l ia n dp e d i o c o c c i s e l e c t i v e m e d i u ma n dt h e i rc o n d i t i o n sf o ri n c u b a t i o nw e r eo p t i m i z e db ys i n g l ef a c t o r e x p e r i m e n ta n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t 1 f 1 地o p t i m a lc a r b o ns o u r o ga n dn i t r o g e ns o u r c e w e r eg l u c o s e ，t y p t o n e ，s o y b e a np e p t o n e t h e i rc o n c e n t r a t i o n sw e r e4 ，2 ，o 5 r e s p e c t i v e l ya c c o r d i n gt oo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ；m g s 0 4 7 h 2 0 、m n s 0 4 4 h 2 0 、 k 2 h p 0 4w e r eu s e d 嬲t h em i n e r a ls a l t so ft h em e d i u n la n dt h e i rc o n c e n t r a t i o n sw e r e 0 0 2 ，0 0 0 5 ，0 4 r e s p e c t i v e l y t h ee x p e r i m e n to fg r o w t hf a c t o r sf o rl 1 ，l 3 ，p 1 ， p 2s h o w e dt h a tv n sa n dc a l c i u mp a n t o t h e n a t ec o u l dh a v ea i li n c e n t i v ee f f e c to n s t r a i n s g r o w t h s o m en a t u r a lm a t e r i a l sc o u l ds u b s t i t u t ef o rt h e s ev i t a m i n e c a r r o t j u i c e ，t o m a t oj u i c e ，a p p l ej u i c ec o u l db el a c t o b a c i l l i n a t u r a lg r o w t hf a c t o r sa n dt h e i r c o n c e n t r a t i o n sw e r e 3 ，2 5 ，3 ；y e a s tp o w d e r , b e a nj u i c e c o u l ds u b s t i t u t ef o r p e d i o c o c c i n a t u r a lg r o w t hf a c t o r sa n dt h e i rc o n c e n t r a t i o n sw e r e0 3 a n d5 t h e o r i g i n a lp ho ft h em e d i u mw a sd e t e r m i n e da t6 0 - 6 2a n dt h et e m p e r a t u r ef o r i n c u b a t i o nw a sa t2 5 。 s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ee x i s t e di nm a n yp r o c e s s e so fb r e w i n g t h ep r e s e n c e o fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ed i s t u r b e dt h ed e t e r m i n a t i o no fb e e rs p o i l a g eb a c t e r i a d u r i n gt h ei n c u b a t i o no np l a t e n a t a m y c i ni sak i n do fn e w a n t i b i o t i c sa n dc a nb eu s e d i n t h ed e t e r m i n a t i o no fb e e rs p o i l a g eb a c t e r i a i te x a m i n e dt h ei n h i b i t i o no f n a t a m y c i no ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e2 0 矿、& c e r e v i s i a e3 0 8 撑、& c e r e v i s i a e v i 山东轻工业学院硕士学位论文 3 0 3 撑、c e r e v i s i a e3 5 4 4b yu s eo fr o u n df i l t e rp a p e r t h er e s d ts h o w e dt h a tt h e d i a m t e r so f a n t i m i c r o b i a l z o n em a d eb y5 p p m n a t a m y e i nw e r e1 4 m m ，1 6 m m ，1 6 m m ， 18 m mr e s p e c t i v e l y t h et e s tf o rm i n i m a li n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o ns h o w e dt h a tt h em i c o n2 0 6 # 、3 0 8 4 、3 0 3 撑、3 5 4 4 w e r e3 p p m 、4 p p m 、3 p p m 、3 p p m t e m p e r a t u r e 、a c i d 、 b a s eh a v ea l ln e g a t i v ee f f e c to nn a t a m y c i n t h er e s u l ts h o w e dt h a tlo p p mn a t a m y c i n l o s ei n h i b i t i o ne f f e c ta f t e rt h et h e r m a lt r e a t m e n ta t121 f o r3 0 m i n t h ei n h i b i t i o n a c t i v i s to fn a t a m y c i nw a st h eh i g h e s tw h e nt h ep ho fs o l u t i o na t5 0 7 0 t h es o l u t i o n o fn a t a m y c i ni nt h ew a t e rw a si m p r o v e dw h e nt h ep hw a sl o w e rt h a n5 0o rh i g h e r t h a n7 0 ，b u tt h ea c t i v i s tw a sl o w e da tt h es a m et i m e l a c t i ca c i db a c t e r i ag r o w e di nt h em e d i a , a sar e s u l t ，t h e yp r o d u c e dl a c t i ca c i d a n dt h ep ho ft h em e d i u mw a sc h a n g e d s i n g l ei n d i c a t o rw a sd e f i c i t e di nc o l o u r c h a n g ea n ds e n s i t i v i t y , s oo p t i m i z e dt h em i x e di n d i c a t o r m i x e dc h l o r o p h e n o lr e d 丽t l l b r o m o c r e s o lp u r p l e ，b r o m o e r e s o l g r e e n , b r o m o p h e n o lb l u e ，b r o m o t h y r n o l b l u e r e s p e c t i v e l ya c c o r d i n gt od i f f e r e n tp r o p o r t i o n t h em i x e di n d i c a t o rw h i c hc h a n g e d c o l o u rs i g n i f i c a n t l yw a sc h l o r o p h e n o lr e d 、 r i t hb r o m o c r e s o lp u r p l e w h e nm i x e d c h l o r o p h e n o lr e dw i t hb r o m o c r e s o lp u r p l ea c c o r d i n gt ot h ep r o p o r t i o no f1 ：3 ( v v ) ，t h e e o l o u rw a sc h a n g e df r o mr e dt o y e l l o wa n dt h ep ho fm i x e di n d i c a t o rw a s d e t e r m i n e df r o m6 4 5t o5 9 3b yp hm e t e r t h eb e s tc o n c e n t r a t i o no ft h i sm i x e d i n d i c a t o ru s e di nt h em e d i u mw a s1 0 ( v v ) a c c o r d i n gt os i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t k e yw o r d s ：b e e rs p o i l a g eb a c t e r i a l a c t i ca c i db a c t e r i a g r o w t hf a c t o r sn a t a m y c i n m i x e di n d i c a t o r v i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：盛垄 导师签名：盈固垂 日期：丑咀月笪日 日期：绌z 年丘月以日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 啤酒及啤酒工业的发展 啤酒有着悠久的历史，它先于其他酒类而最早出现在人类的生活之中，啤酒 起源于两河流域的古巴比伦王国( 今伊拉克境内) ，是当时生活在那里的苏美尔人 最古老、神奇的发明。公元前3 0 0 0 年前后，随着两河流域和尼罗河流域的贸易往 来，位于尼罗河下游的古埃及也学会了啤酒酿造技术。大约公元前4 8 年以后，啤 酒酿造技术从埃及传到了欧洲，并得以迅速发展。公元8 世纪前后，德国人把大 麦和啤酒花固定为啤酒酿造原料，啤酒酿造技术实现了重大突破【l 】。 我国是世界上用粮食原料酿酒历史最悠久的国家之一。1 9 世纪，以工业化方 法生产的现代啤酒酿造技术在中国逐渐发展起来。1 9 0 0 年，俄国人在哈尔滨建立 了中国最早的啤酒厂乌卢布列夫斯基啤酒厂( 今哈尔滨啤酒厂) ；1 9 0 3 年，英 德合资在青岛开办了英德酿酒有限公司( 青岛啤酒厂前身) 。解放前夕，我国啤酒 产量低，品种少，全国啤酒总产量仅有7 0 0 0 千升。新中国成立后，随着经济的逐 步发展和人民生活水平的提高，啤酒工业取得了快速的发展。1 9 9 3 年，我国啤酒 总产量达到1 2 2 5 万千升，首次超过德国，居世界第二位。2 0 0 2 年，我国成为世界 上啤酒产量最大的国家，达到2 3 8 6 8 3 万千升，成为名副其实的啤酒大国。 1 2 啤酒酿造原料 啤酒是以麦芽、水为主要原料，添加啤酒花，经啤酒酵母发酵而成的一种低 酒精度、含有泡沫和一定量c 0 2 的发酵酒【2 】。 1 2 1 水 水是啤酒酿造最重要的原料，水在啤酒酒液中占到9 2 以上，因此又被形象 地比喻为“啤酒的血液刀。世界著名啤酒的特色都是由各自的酿造用水所决定的。 酿造用水的水质不仅决定着产品的质量和风味，而且又直接影响啤酒酿造的全过 程。啤酒的酿造用水应无色、透明、无沉淀、无异昧等，其各项指标的基本要求 见表1 1 l l l 。 第l 章绪论 表1 1 啤酒酿造用水的基本要求 t a b l el t h eb a s i cr e q u i r e m e n to f w a t e rf o rb r e w i n g 指标 要求 色 透明度 味 总硬度 钠离子 铁离子 锰离子 硅酸盐 氯离子 硫酸根离子 硝酸根离子 无色 透明，无沉淀 无异味 6 2 4 m m o l l 一 7 5 m g l o 0 5 m g l 0 0 3 m g l 2 0 m g l 2 0 0 m g l 3 0 0 m g l 2 5 m g l 1 2 2 麦芽 麦芽是啤酒酿造的主要原料，麦芽的成分和质量对啤酒的色、香、昧、泡沫、 以及稳定性都有根本性的影响，高品质的麦芽是生产高质量啤酒的物质保证。麦 芽通常选用二棱白皮大麦芽，外观整齐，具有一定的颜色及光泽，优良麦芽应有 特殊的香味，不应有异味，如霉味、潮湿味、酸味等。 1 2 3 酒花 酒花，学名蛇麻，系多年生攀援草本植物，雌雄异株，啤酒酿造中使用的酒 花是未受精的雌花。雌花花体为绿色或黄绿色，呈松果状，由3 0 5 0 个花片覆盖在 花轴上，花片的基部有许多蛇麻腺，成熟酒花的蛇麻腺分泌的树脂和酒花油是啤 酒酿造所需的重要成分。酒花树脂中的a 酸是蓰草酮及其同族化合物合薇草酮、 加蓰草酮、前蓰草酮和后蓰草酮的总称，在麦汁煮沸过程中易转化成异a 酸，具 有强烈的苦味和很强的防腐能力，在麦汁中的溶解度远远高于a 酸，是啤酒苦味 的主要来源。啤酒酿造中酒花的使用既能赋予啤酒爽口的苦味和愉快的香味，增 加啤酒的泡持性，又能增加麦汁和啤酒的防腐能力。因此，酒花是啤酒酿造中不 可缺少的最重要的添加物质。 1 2 4 啤酒酵母 啤酒是啤酒酵母发酵麦汁的产物，因此，啤酒酵母的发酵性能、生理生化特 性直接影响成品啤酒的质量。啤酒厂中使用的啤酒酵母根据其在发酵终了时的状 态( 悬浮于液面或产生凝集沉淀) 分为上面酵母和下面酵母。酵母在麦汁中生长 繁殖，进行酒精发酵，不同类型的啤酒酵母代谢产物各异，因而不同品牌或厂家 生产的啤酒，口味也各有特点。 1 3 啤酒生产工艺 啤酒生产工艺流程见图1 1 。 2 山东轻工业学院硕士学位论文 一荔碎 上 大米_ 粉碎一糊化 麦汁煮沸+ 一加酒花 上 上 上 土 灌装卜洗瓶卜验瓶 土 杀菌 上 贴标喷码 装箱入库 图1 1 啤酒生产工艺流程简图 f i g u r e1 1 t h ep r o c e s so f b e e rb r e w i n g 1 4 啤酒有害菌 1 4 1 啤酒有害菌定义 啤酒生产工艺的特殊环境，使得啤酒具有一些对微生物生长不利的条件，如 极低的氧含量( 0 1 p p m ) ，高浓度的c 0 2 ( 大约0 5 ，w v ) ，较低的p h 值( 3 8 _ 4 7 ) ， 乙醇( o 5 - 1 0 ，w v ) 、酒花苦味物质( 大约1 7 5 5 p p m 的异q 酸) 的存在，以 及诸如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等碳源在发酵过程中被啤酒酵母利用消耗，使 得啤酒对于许多微生物来说并不是一个良好的培养基【3 l 。尽管存在这些不利因素， 啤酒生产过程中仍可能污染除啤酒酵母以外的其他微生物，这些微生物统称为啤 酒污染菌。啤酒污染菌能否在啤酒生产的环境条件下生存，取决于污染菌的生理 特性。只有那些能够适应啤酒生产特殊环境的污染菌，才能够生存、生长、繁殖 代谢。这部分污染菌有较强的适应能力，它们能够利用酵母的中间副产物和酵母 3 第l 章绪论 自溶物，并在代谢过程中产生大量的酸类物质、醇类物质、醛类物质，从而引起 啤酒酸败，浊度增加，产生不愉快的气味。这部分污染菌就是啤酒生产中的有害 菌【4 】。 1 , 4 2 有害菌的来源 啤酒生产中的有害菌，主要来自空气、水、原料、种酵母、设备和管路，以 及各种用具和操作人员等。 ( 1 ) 空气和水 空气和水应是第一污染源。啤酒生产过程中，原料常与环境空气直接接触， 容易造成染菌；冷却麦汁添加酵母后充氧通气，如果通入的无菌空气不洁，也极 易染菌。因此，啤酒厂搞好环境卫生，以及必要时的空气灭菌操作都是非常重要 的。用不清洁的水洗涤发酵罐、种酵母、啤酒瓶等，就可能造成啤酒严重染菌。 ( 2 ) 原料也带入一部分杂菌，但在麦汁制备过程中，经过麦汁煮沸，杂菌很容易 被杀灭。 ( 3 ) 啤酒厂的种酵母，一般要连续使用多代，回收再用的酵母泥，都有不同程度 的染菌，使用代数越多，污染程度越严重；而且扩大培养后期采用了现场冷麦汁， 故染菌的机会大增。 ( 4 ) 不洁的设备和管路会带来污染，特别是与麦汁、啤酒接触的不暴露部分，如 管道的弯头、阀门、连接等处，设备中的死角和排污口，均易造成积累性污染， 所以应注意彻底清洁灭菌。 1 4 3 啤酒有害菌分类 现代啤酒生产中，污染的有害菌主要是一些细菌和某些野生酵母，前者按革 兰氏染色结果又分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。 ( 1 ) 革兰氏阳性菌 乳杆菌属( l a e t o b a e i l l u s ) 细胞形态多样，从长的和细长状到弯曲形及短杆，也常有棒形球杆状，无芽 孢，过氧化氢酶阴性。营养要求复杂，需要氨基酸、肽、盐、脂肪酸和可发酵的 碳水化合物。通常每个种都有特殊的营养要求，有些营养往往仅是某些菌株所要 求的。耐酸，最适p h 通常为5 5 6 2 ，一般在p h 5 或更低的情况下可生长【5 】o 乳杆 菌属被认为是啤酒工业中危害最大的细菌，据报道，6 0 7 0 的污染事故都是由这 类微生物引起的【3 1 。由于此类菌利用可发酵性糖产生大量乳酸，因此，若啤酒中污 染了此类菌，会导致酒体严重酸败，混浊。l a c t o b a c i l l u sb r e v i s 是乳杆菌属中最容 易污染的菌种。 片球菌属( p e d i o e o e e u s ) 细胞圆球形，在垂直的两个平面交替分裂形成四联状，但不普遍，一般细胞 呈对生，过氧化氢酶阴性，无细胞色素，不运动，不形成芽孢，菌落大小可变， 4 山东轻工业学院硕士学位论文 直径1 0 - 2 5 m m 。所有的种均能在3 0 c 生长，最适生长温度2 5 c ，化能有机营养 型。生长需要含有复杂的生长因子和氨基酸的丰富培养基。所有的种需要烟酸、 泛酸和生物素，而不需要硫胺素、对氨基苯甲酸或钴胺素1 5 。啤酒厂中发现的片 球菌属的菌株有p d a m n o s u s ，p a c i d i l a c t i c i ，p d e x t r i n i c u s ，p h a l o p h i l u s ，p i n o p i n a t u s , p p a r v u l u s 和p p e n t o s a c e u s 等。其中，p d a m n o s u s 是片球菌属中最易污染的菌种。 ( 2 ) 革兰氏阴性菌 果胶杆菌属( p e c t i n a t u s ) 【o j 杆菌，最适生长温度为3 2 ；最适生长p h 为4 5 ，且培养基中需要4 5 ( w v ) 的乙醇。生长过程中产生大量的丙酸、乙酸、丁二酸、乳酸和乙偶姻。属内的若 干菌种不形成孢子，运动性强，细胞处于幼龄时呈x 形，当细胞变老时，变长呈 蛇形。果胶杆菌属菌种引起腐败的最大特点是浑浊和各种代谢产物如脂肪酸、硫 化氢和甲硫醇结合产生的腐蛋味。果胶杆菌属的细菌被认为是最危险的啤酒有害 细菌之一。2 0 3 0 的细菌污染事故是由此菌引起的，而且主要存在于非巴氏灭菌 的啤酒中。 巨球菌属( m e g a s p h a e r a ) 1 6 j 中温球菌，单个或成对，偶尔呈短链。不形成孢子，不运动， m e g a s p h a e m 这一属包括两个种：m e l s d e n i 和m c e r e v i s i a e 。其中，m c e r e v i s i a e 的最适生长温度 为2 8 ，2 8 ( w v ) 的乙醇能够抑制其生长，但也有可能到5 5 ( w v ) 。这是 存在于啤酒厂中的最厌氧的菌种。这一菌种引起的啤酒腐败会产生类似于 p e c t i n a t u s 的极端浑浊，产生大量的丁酸，少量的乙酸、异戊酸、戊酸，己酸，3 羟基丁酮。 醋酸杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 粗壮杆菌，细胞单生、成对或链状生长，适应广泛的p n 值，最适生长温度 3 0 ，在啤酒中生长集中在液面，形成强的纤维状菌膜，不生孢子，能同化葡萄 糖、乙醇等产生乙酸，使啤酒浑浊、变酸。由于此属内的菌种都是好氧菌，因此， 在啤酒发酵后期，很难生长繁殖。 其它的革兰氏阴性菌 除了以上的两大污染菌，在啤酒工业中还发现了其它的g 有害菌。在加有糖 的罐装啤酒和爱尔啤酒中发现了发酵单孢菌属的若干菌种【6 】。发酵单孢菌属 ( z y m o p h i l u s ) 内的种属兼性厌氧菌，选择性的发酵葡萄糖、果糖、蔗糖，但不发 酵麦芽糖、麦芽三糖；能产生高浓度的乙醛、h 2 s 。z y m o p h i l u s 在系统发育树上与 p e c t i n a t u s 的若干菌种相似。在p h 4 3 - 4 6 以上、乙醇浓度在5 ( w v ) 以下的啤 酒中生长。 ( 3 ) 野生酵母 7 1 野生酵母指不为啤酒正常生产所接种，在啤酒酿造过程中，易引起不正常发 5 第l 章绪论 酵或产生病害的异种酵母。有的野生酵母在啤酒生产过程中能引起严重污染，但 不是所有的野生酵母都对啤酒有害。有的野生酵母对一类啤酒可能有害，但对另 一类啤酒则可能是无害的，如酒香酵母属( b r e t t a n o m y c e s ) 能赋予上面发酵兰比 克啤酒特殊的风味，但对下面发酵啤酒来说，却能引起异味。啤酒厂主要病害野 生酵母的特征见表1 2 。 表1 2 主要野生酵母一览表 t a b l e l 2t h em a i nw i l dy e a s t 啤酒 + 酵母 混浊 变种 异常 汉逊 氏酵 母 膜璞 毕赤 氏酵 母 魏氏 酵母 巴氏 酵母 强 壮 酵 母 卵形、 椭圆 形，或 腊肠形 +圆、椭 圆或柱 形 + 圆、椭 圆或圆 柱形 +长卵圆 形 +长卵圆 形或腊 肠形 + 细胞伸 长呈腊 肠形 菌落淡黄 + 色，湿润，1 3 光滑，边 缘锯齿状 菌落乳白 色，平坦， 无光泽， 边缘丝状 菌落白色 或乳白色 菌落软泥 状，有光 泽，稍皱， 边缘弯曲 + +十一 - 白色 干燥 皮膜 + + + + 形成 薄的 菌膜 菌落白+ 色，湿润， 光滑，边 缘弯曲 菌落淡黄+ 色，光滑 湿润，波 纹状，边 缘锯齿状 + - 十+ - 2 3 上面酵 母，不 同化硝 酸盐， 以乙醇 为碳源 同化乙 醇、硝 酸盐 在空气 存在下 能氧化 乙醇 下面发 酵，以 乙醇为 碳源发 育良好 下面发 酵，不 同化硝 酸盐 + + 下面发 酵，以 乙醇为 碳源发 育良好 引起啤酒 顽固混浊 及刺鼻难 闻的气味 形成混浊 生长快，形 成混浊，产 生异味 使啤酒产 生特殊甜 味，并有苦 涩味、烂水 果昧 妨碍酒液 澄清，产生 异常的苦 味及不愉 快的气味 使啤酒产 生浑浊 6 山东轻工业学院硕士学位论文 随着啤酒酿造工业的发展，由于绝大多数啤酒生产企业已实现纯种酵母生产 啤酒，因此，污染野生酵母的几率已大幅减少。 1 4 4 啤酒有害菌的危害 ( 1 ) 有害菌的各种代谢产物，都能造成啤酒的异味，即使经巴氏灭菌或膜过滤除 去有害菌，异味仍然存留在啤酒中。 ( 2 ) 在发酵和储酒过程中，有害菌繁殖，能够破坏啤酒的胶体平衡，使啤酒难以 澄清，以至于过滤困难。 ( 3 ) 一些有害菌代谢时分泌的多糖会使啤酒的黏度提高，饮后舌面发腻，余味不 净，啤酒丧失爽口性。 ( 4 ) 在瓶装和罐装啤酒中，某些产气的有害菌，使瓶和罐的压力升高，增加容器 爆炸的几率，对消费者有潜在的危险。 1 5 检测方法 1 5 1 平板菌落计数法( c oio n y - c o u n tin gm e t h o d ) 平板菌落计数法是目前啤酒工业中进行有害茵检测普遍使用的方法之一。该 方法是将待检样品接种于各种固体培养基表面或液体培养基中，根据固体培养基 上( 内) 是否形成菌落或液体培养基是否变混浊来判断待检样品的污染情况及程 度【8 】。常用的培养基有n b b 培养基、李氏多级培养基、m r s 培养基等。 n b b 培养基是德国慕尼黑工业大学研制的一种啤酒有害菌专用培养基，其主 要产品类型有n b b a ( 固体培养基) 、n b b b ( 液体培养基) 、n b b c ( 浓缩型液 体培养基) 等。该培养基由于加入了酵母膏、牛肉膏、【广苹果酸等多种营养物质， 比例恰当，因此，十分适合啤酒有害菌的生长。n b b 培养基几乎可以检测啤酒厂 中的全部样品，如各类澄清样品、浑浊样品以及各种气体样品等，培养温度一般 为2 5 2 8 c ，只要保证严格的厌氧环境，则在其上生长的都是啤酒有害菌【l 】。 李氏多级培养基( l m d a ) 也是一种较常使用的有害菌分离用培养基。l m d a 培养基因溴钾酚绿和c a c 0 3 的存在而具有与众不同的特性。当有酸产生时，溴钾 酚绿变成黄色，c a c 0 3 溶解。用此培养基分离有害菌时，3 0 培养2 5 d 。不同有 害菌在l m d a 培养基上的菌落颜色、形态各不相同。例如，乳杆菌属的菌种菌落 圆形，中心深绿色，菌落周围有明显的晕区，表面因菌株不同而由光滑到粗糙； 片球菌属的菌种菌落圆形，较乳杆菌属的小，表面光滑，黄绿色，菌落周围有清 晰晕区；发酵单孢菌菌落圆形，光亮，蓝绿色，不延伸，无晕区等【9 】。 m r s 培养基是分离、培养乳酸菌的培养基之一，日本用p e c t i n a t u s 属菌检出 培养基检测果胶杆菌等。没有一种培养基能适合所有的有害菌生长，因此许多科 研工作者不断对已有的培养基进行优化、改良，以期更好的用于啤酒有害菌的检 测。 平板菌落计数法成本低，操作方便，不需要昂贵的仪器、设备；缺点是耗时 7 第l 章绪论 长，一般需要5 7 d ，且准确度不高。 1 5 2p c r 法 p c r 技术是美国科学家k a r ym u l l i s 发明的一种体外扩增d n a 序列的技术。 p c r 技术在成为整个现代分子生物学实验工作基础的同时，也为微生物的鉴定提 供了新的快捷方法，在啤酒有害菌的检测方面被证明是一种很有希望的技术【协1 6 1 。 ( 1 ) 使用一套特异性引物的p c r 技术 使用特异性引物的p c r 技术可用于快速检测和鉴定啤酒中的有害菌。细菌在 长期的进化过程中，由于发生基因突变，致使某些d n a 片段的核苷酸序列发生变 化，但就整个基因组来说，仍然保留着祖先遗留下来的痕迹。细菌细胞中r n a 碱 基的变化比整个基因组的变化要保守的多。1 6 sr r n a 是原核生物核糖体小亚单位 上的一个r n a 分子，其一级结构非常保守，而决定其一级结构的1 6 sr d n a 序列 也十分保守。随着1 6 sr r n a 基因库的建立，发现同属或同种微生物1 6 sr d n a 序 列之间保持很高的同源性，这种同源性与物种间的亲缘关系有着密切的对应关系。 现代微生物学中，已成功运用1 6 sr d n a 序列来鉴定细菌的种类以及分析它们之间 的进化关系隅1 0 1 。m 4 , 群等【l 明以6 3 种啤酒有害细菌1 6 sr d n a 序列所共有的5 条 同源序列为基础，设计出一对通用引物5 g a a c a g g 册g a t a c c c 37 和5 g a c ! t t a a c c c a a c a t c t c a c 3 ，利用该对引物，检测出啤酒厂出现的8 种 有害菌。 ( 2 ) 嵌套多聚酶链式反应技术( n e s t e d p c r ) 在发酵环境中，当啤酒酵母大于3 0 x 1 0 4 个m e 时，用普通的p c r 技术鉴定 啤酒有害菌会受到干扰。因此，在p c r 的基础上又开发了n e s t e d p c r 。n e s t e d p c r 是为了从一个d n a 模板的同一区域扩增出不同片段而设计的特殊方法。 n e s t e d p c r 需要两套引物，第一套引物用于产生扩增的d n a 片段，此片段中含有 第二轮p c r 引物的结合位点，第一轮反应产物被等份转入第二轮p c r 引物，扩增 靶d n a ，扩增的特异性是由第二套引物决定的。由于第一轮反应之后增加了靶 d n a 模板数量，使第二轮p c r 反应效率明显提高【1 1 1 2 1 3 1 。李红等【1 4 1 讨论了 n e s t e d - p c r 技术在啤酒有害乳酸菌检测中的应用。实验中第一轮扩增使用的引物 为n s n l 0 f 和n s n 9 8 6 r ，热循环起始温度9 4 c ，5 m i n ，随后3 0 次循环中均为5 5 ，4 0 s ：7 2 ，l m i n ；9 4 ，4 0 s 。第二轮扩增使用的引物为p l 和l 9 5 4 ，浓度 为第一轮扩增引物浓度的1 0 倍，共热循环3 1 次，反应条件与第一轮反应相同。 实验证明，n e s t e d p c r 能够检测出的啤酒酵母与乳酸菌的浓度比为1 0 8 ：1 ，这大 大提高了检测的灵敏度。 ( 3 ) 随机扩增多态性d n a 分析p c r ( 黜蛆d p c r ) r a p d p c r 技术是由w i l l i a m s 和w e l s h 同时发展起来的一种新型d n a 标记技 术。它的基本原理是利用随机引物( 一般为8 1 0 b p ) 通过p c r 反应非定点扩增 山东轻工业学院硕士学位论文 d n a 片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物d n a 片段的多态性。扩增片段多态性 便反映了基因组和相应区域的d n a 多态性。2 个物种的个体之间亲缘关系越近， 其相应的p c r 扩增产物在凝胶上的带型就越相似，反之则差异越悬殊。加拿大 l a b a t t 公司的研究人员在啤酒有害乳酸菌的检测中使用5 sr r n a 和1 6 sr r n a 基因 进行p c r 扩增，用于菌种的特性鉴定。已经成功地对乳杆菌属、片球菌属、肠膜 明串珠菌属中的菌株做出鉴定【l 。但是由于r a p d p c r 中使用的引物不是针对某 一特定的d n a 序列，因此长期以来重复性一直是该技术值得讨论的问题。 p c r 技术作为一种微生物的快速鉴定分析的新方法，国外研究较早，近年来， 我国的学者也开始关注，并在这方面作了大量的工作。与传统的培养方法相比， p c r 技术检测微生物具有快速、灵敏度高、特异性好等特点，但p c r 技术也存在 一定的缺陷：p c r 技术仅限于那些核酸序列已知的微生物的鉴定，并且在啤酒有 害菌检测中无法确定提取的d n a 是来自死细胞还是活细胞。 1 5 3d n a 杂交法 ( 1 ) 核糖核酸型检测( r i b o t y p i n g ) 例 核糖核酸型检测( r i b o t y p i n g ) 是基于对细菌染色体d n a 用限制性核酸内切 酶消化，然后与e s c h e r i c h i ac o l i5 s 1 6 s 2 3 sr r n a 操纵子编码区的探针进行 s o u t h e r n 杂交。探针用来与所有真细菌中存在的r r n a 操纵子的高度保守区域杂 交，因而可以检测大多数细菌的核糖核酸型。已经开发了一种自助分析系统 r i b o p r i n t e r ，可以用来鉴定重要的啤酒有害菌的种及亚种，包括乳杆菌属，片球菌 属，果胶杆菌属等。r i b o p r i n t e r 的缺点是设备的投资成本和运行成本太高。 ( 2 ) 荧光原位杂交( f i s h ) 【r l 墙】 一 荧光原位杂交( f i s h ) 结合了分子生物学的精确性和显微镜的可视性信息， 可以在自然或人工