（发酵工程专业论文）冬虫夏草菌发酵转化半枝莲的研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 发酵中药旨在以增效、扩用、降毒为目的，有望给中药新药研发注入新的活 力，具有广阔的发展前景。本文以冬虫夏草为菌种，对中草药半枝莲进行生物转 化，并对其化学成分和药理功能进行了初步探讨。主要结论如下： l _ 筛选出适于冬虫夏草发酵转化的中草药一半枝莲，并对其发酵条件及特性 进行了研究：通过监测发酵过程中生物量、多糖、总黄酮含量的动态变化，确定 了发酵周期为5 天；采用正交实验确定了培养基的最佳配方为：蔗糖2 、蛋白胨 0 5 、酵母膏0 1 、半枝莲的添加量8 ，磷酸二氢钾o 1 ，硫酸镁o 0 2 ，维 生素b l5 0 m g i ，p h 6 0 。 2 对半枝莲发酵前后的主要成分进行了提取、纯化和比较分析：多糖采用乙醇 沉淀、s a v a g e 脱蛋白、透析、d e a e 离子交换、冷冻干燥法提取分离纯化，再用激光 光散射检测器( l l s ) 测定了其分子量，发现发酵后多糖分子量变小，说明在发酵 过程中多糖得到降解。用红外色谱对其分子结构进行了对比分析，初步判断多糖 结构在发酵过程中未发生修饰改变。黄酮类成分先用石油醚脱脂，再用乙醇提粗 黄酮，最后用大孔吸附树脂精制，采用薄层层析和红外色谱对其进行分析鉴定， 结果表明在发酵过程中黄酮类成分在结构上得到了修饰转化。结果提示半枝莲中 的活性成分被冬虫夏草中丰富的酶系转化。 3 对发酵前后的多种药理功能进行了试验研究，结果表明：剂量为3 9 9 k g 的 半枝莲发酵液对荷瘤小鼠s 1 8 0 实体瘤抑瘤率为5 4 6 4 ，比半枝莲水提液抑瘤率提 高了1 9 7 倍，比复方环磷酰胺抑瘤率提高了0 7 3 倍；而剂量为0 1 2 9 k g 的半枝莲 多糖发酵后比发酵前对s 1 8 0 实体瘤的抑瘤率降低了4 6 2 ：半枝莲经冬虫夏草发 酵后，其发酵液对肺炎克雷伯氏球菌和金黄色葡萄球菌抑菌作用显著增强，其m c 、 m b c 均为6 o ：发酵能提高半枝莲的抗氧化活性：发酵对半枝莲免疫活性影响较小。 关键词：半枝莲冬虫夏草发酵抗肿瘤抗氧化抑菌 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ea i m so ff e r m e n t i n gc h i n e s eh e r b a lm e d i c i n ea r et oe n h a n c et h e i re f f e c t ，e n l a r g e t h e i ra p p l i c a t i o na n dr e d u c et h e i rt o x i c i t ya n ds os t u d ya n de x p l o i t a t i o no nn e w m e d i c i n ef r o mt h e mw i l lb e t r a n s f u s e dn e wa n db l o o m i n gv i g o r i nt h et h e s i s ， b i o t r a n s f o r m a t i o n ，p h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n sa n dc h e m i c a lc o m p o n e n t so fs c u t e l l a r i a b a r b a t af e r m e n t e db yc o r d y c e p ss i n e n s i sw a ss t u d i e dp r i m i t i v e l y t h em a i nc o n t e n t s a n dc o n c l u s i o n sw a sa sf o l l o w s 1 c h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s c u t e l l a r i ab a r b a t at h a ti ss u i t a b l et ob ef e m a e n t e d b yc o r d y c e p ss i n e n s i sw a ss c r e e n e do u tf r o ms e r v e r a lk i n d so fc h i n e s eh e r b a im e d i c i n e w i t ha n t i c a n c e ra c t i o n ，a n di t sf e r m e n t i n gc o n d i t i o n sa n dc h a r a c t e r i s t i c sw a ss t u d i e d i n t h ee x p e r i m e n t ，f e r m e n t i n gp e r i o dw a sf o r 5d a y sc o n f i r m e db yd e t e c t i n gd y n a m i c v a r i e t yo fb i o m a s s ，p o l y s a c c h a r i d ea n dt o t a l f l a v o n e t h eo p t i m u mp r e s c r i p t i o no f c u l t u r em e d i u mw a ss u g a r2 ，p e p t o n e0 5 ，y e a s tc r e a m0 1 ，a d d i n gq u a n t i t yo f s c u t e l l a r i ab a r b a t a8 ，k h 2 p 0 40 1 ，m g s 0 4o 0 2 ，v m5 0 m g la n dp h6 0 ， w h i c hi sd e t e r m i n e db yo p t i m i z i n gd e s i g n 2 s e v e r a lk i n d so fm a i nc o m p o n e n t sb e f o r ea n da f t e rf e r m e n t a t i o nw e r ee x t r a c t e d ， p u r i f i e dp a r t i a l l ya n da n a l y s e dc o m p a r a t i v e l y p o l y s a c c h a r i d ew a se x t r a c t e d ，s e p a r a t e d a n dp u r i f i e db ye t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ，p r o t e i nr e m o v e db ys a v a g ，d i a l y s i s ，d e a e a n i o n e x c h a n g i n g ，f r e e z e d r ya n d t h e i rm o l e c u l a rw e i g h t sw e r ea n a l y s e db yl l s d e t e c t o ra n ds t r u c t u r e sb yi f r ，a n dt h er e s u l t ss u g g e s tt h a ts t r u c t u r e so ft h e p o l y s a c c h a r i d e sa r e n o ta l t e r e db u tt h e i rm o l e c u l a rw e i g h tr e d u c e df l a v o n e sw e r e o b t a i n e db yr e m o v i n gg r e a s ew i t hp e t r o l e u ma e t h e r , e x t r a c t i n gc r u d ef l a v o n e s w i t h e t h a n o l ，r e f i n e i n gw i t ha b s o r b i n gr e s i n ，a n da n a l y s e da n da p p r a i s e db yt l c a n di f r t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h es t r u c t u r eo ff l a v o n e sw e r ee m b e l l i s h e da n da l t e r e dd u r i n g f e r m e n t a t i o n r e s u l t si m p l yt h a ta c t i v ec o m p o n e n t sf r o ms c u t e l l a r i ab a r b a t aw a s t r a n s f o r m e db ya b u n d a n te n z y m e sf r o mc o r c e p ss i n e n s i s 3 as e r i e so fp h a r m a c o l o g i c a lf u n c t i o n sb e f o r ea n da f t e rf e r m e n t i n gw e r es t u d i e d c o m p a r a t i v e l y , t h ec o n c l u s i o n sw e r ed r a w e dt h a ti n h i b i t i o n r a t eo fw a t e re x t r a c to f s c u t e l l a r i ab a r b a r aa f t e rf e m _ i e n a t i o no nsl8 0w a s5 4 6 4 a n d19 7t i m e sh i g h e rt h a n t h a tb e f o r ef e r m e n t a t i o nw h e ni t sd o s a g ei s3 9 9 k ga n d0 7 3t h a nc y c l o p h o s p h a m i d e 1 n h i b i t o no fp o l y s a c c h a r i d eo fd o s a g e01 2 眺ga f t e rf e r m e n t a t i o no ns 18 0d e c l i n e d 1 1 1 1 1 i b o no fw a r e re x t r a c tf r o ms c u t e l l a r i ab a r b a t aa f t e rf c r m e n a t i o no n ，c b s i e l h t 湖北工业大学硕士学位论文 p n e u m o n i a ea n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u se n h a n c e do b v i o u s l ya n dt h e i rm i ca n dm b c w e r e6 o a n t i o x i d a n to fs c u t e l l a r i ab a r b a r aa f t e rf e r m e n t a t i o ne n h a n c e d w a t e r e x t r a c ta f t e rf e r m e n t a t i o nh a sl i t t l ee f f e c to ni m m u n i t y k e y w o r d s ：s c u t e l l a r i ab a r b a r a , c o r d y c e p ss i n e n s i s , f e r m e n t a t i o n ，a c t i v ec o m p o n e n t ， a n t i t u m o r , a n t i o x i d a n t 佩1 l 亡工繁火鬻 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：日期：2 0 0 6 年5月 2 6 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：t 欧魂坠 日期：加f 年3 - 月z f 日 指导教师签名 日期：年 力之艺 月日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 中草药是中华民族的传统瑰宝，现代生物技术是2 l 世纪最有潜力的高新技术 之一，利用现代生物技术转化中草药，探索其复杂体系生物转化的变化规律，是 一种新的尝试。本文拟以冬虫夏草为菌种对中草药半枝莲发酵转化，以期达到增 效、扩用或降毒的目的。 1 1 半枝莲 半枝莲( s c u t e l l a r i ab a b a r t ad d o n ，s c u t e l l a r i a r i v u l a r isw a l l ) ，别名， 狭叶韩信草，牙刷草等，其名最早见于外科正宗，为唇形科植物半枝莲的全 草，本品味辛、苦，性寒，归肺、肝肾经，有清热解毒、散瘀止血、利尿消肿的 功能，也是一种常见的抗肿瘤中药，在临床上应用多年，对肝癌、肺癌、胃癌、 直肠癌、鼻咽癌等均有一定的疗效。近年来，随着国内外学者对半枝莲研究的不 断深入，已从中分离出多种化学成分，并发现了新的药理活性。 1 1 1 化学成分 半枝莲主要成分为黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) 和二萜类化合物( d i t e r p e n o i d s ) ， 还含有生物碱( a l k a l o i d s ) 、甾体( s t e r o i d e s ) 、多糖( p o l y s a c c h a r i d e s ) 等成分。 1 1 1 1 黄酮类化合物 黄酮类化合物是半枝莲主要成分之一。迄今为止，己从半枝莲全草中分离到印黄 芩素( s c u t e l i a r e i n ) 、印黄芩苷( s c u t e l l a t i n ) 、红花素( c a r t h a m i d i n ) 及异红花 素( i s o c a r t h a m i d i n ) 。叶茎部分含汉黄芩素( w o g o n i n ) 、柚皮素( a r i n g e n i n ) 、 芹菜素( a p i g e n i n ) 、粗毛豚草素( h i s p i d u l i n ) 、圣草素( e r i o d i c t y 0 1 ) 、木犀草素 ( 1 u t e o l i n ) 、7 - 羟基5 ，8 二甲氧基黄酮( 7 - h y d r o x y 一5 ，8 - d i m e t h o x y f l a v o n e ) 4 一羟基汉黄芩素( 4 _ h y d r o x y w o g o n i n ) 、5 ，7 ，4 一三羟基一8 一甲氧基黄烷酮( 5 ，7 ， 4 一t r i h y d r o x y 一8 一m e t h o x y f i a v a n o n e ) 、5 ，7 ，4 一三羟基一6 甲氧基黄烷酮( 5 ， 7 ，4 一t r i h y d r o x y 一6 m e t h o x y f l a v a n o n e ) “1 。根含汉黄芩素、半枝莲素( r i v i i l a r i n ，2 ，5 - d i h y d r o x y 一6 ，7 - d r i m e t h o x y f l a v o n e ) 。、5 ，7 一二羟基8 一甲氧基黄酮( 5 ， 7 - d jh y d r o x y 一8 一m e t h o x y n a v o n e ) “1 、5 一羟基一7 ，8 一二甲氧基黄酮( 5 - h y d r e x v 一7 ， 8 一d i m e t h o r y f l a v o n e ) 、5 ，2 一二羟基一7 ，8 ，67 一三甲氧基黄酮一2 一0 一一d 葡 湖北工业大学硕士学位论文 萄糖苷( 5 ，2 一d i m e t h o x y 一7 ，8 ，6 一t r i m e t h o x y f l a v o n e 一2 一0 一一d - g lu c u f e r o p y r a n o s i d e ) ”1 、7 一羟基一5 ，8 - 二甲氧基黄酮一7 0 一口一d - 葡萄糖苷( 7 - h y d r o x y 一5 ，8 一d i m e t h o x y f l a v o n e 一7 一o - 口一d - g l u c u r o n o p y r a n o s i d e ) ”1 、7 一羟基一5 ，8 - 二甲氧 基黄酮一7 0 一d i m e t h o x y f l a v o n e 一7 0 一一d g l u c u n o p y r a n o s i d e ) 、5 ，7 ，8 ，2 一 四羟基黄酮一70 一一葡萄糖苷( 5 ，7 ，8 2 一t e t r a h y d r o xq a v o n e 一7 0 一d - g l u c u r o n o p y r a n o s i d e ) 和5 ，2 ，6 一三羟基一7 ，8 一二甲氧基黄酮2 一0 一口一d 葡萄 糖苷( 5 ，2 ，6y r i h y d r o x y7 ，8d i m e t h o x y f l a v o n e 一2 一0 8 - d g l u c u r o n o p y r a n o s i d e ) “。 1 1 12 二萜类化合物 二萜类化合物是半枝莲中另一主要成分。现已分离得到半枝莲二萜 ( s c u t e l o n e ) a 、b 、c 、d 、e 、f 、g 、h 4 1 1 i 8 1 4 ，和半枝莲内酯( s o u t e r i v a a c t o n e ) a 、 b 、c 、d 和c 2 “。 11 13 其它成分 d u c k is 从半枝莲中分到抗肿瘤成分反式一卜( 4 一羟基苯基) 一丁一卜烯一3 一酮 ( e l - ( 4 一h y d r o x y p h a n y ) 一b u t 一卜e 1 1 3 一o n e ) “。许益民等从半枝莲中分离得到 半枝莲多糖s b p ，s b p 含鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖( 其 摩尔比为1 1 4 ：1 5 0 ：o 2 0 ：o 7 5 ：1 0 ：2 1 8 ) 。”。而孟延发等从半枝莲中得到 均一性多糖s p s 4 ，并经完全水解后通过纸层析及气相层析分析，确定糖基的组成 及摩尔组成比为鼠李糖：岩藻糖：阿拉伯糖：木糖：甘糖露：葡萄糖：半乳糖= o 2 2 ：0 2 6 ：1 0 ：0 0 9 ：0 5 l ：1 8 2 ：2 0 9 “= 1 。王兆全等从半枝莲中发现新型生物 碱：半枝莲碱a ( s a u t e b a r b a t i n ea ) ”“。另外半枝莲还含有对羟基苯甲醛( p - h y d m x y b e n z a l d e h y d e ) 、对羟基苄酮( p - h y d r o x y b e n z y l a c e t o n e ) 、对香豆酸( p - c o u m a r i ca c i d ) 、原儿茶酸( p r o t o c a t e c h u i ca c i d ) 、熊果酸( u f s o ca c i d ) 、植物 醇 ( p h y t o s t e r 0 1 ) 、植物甾醇一一d - 葡萄糖苷( p h t o s t e r y l 一一d - g t u c o s i d e “3 ；一 谷甾醇、硬脂酸。以及半枝莲酸( s c u t e a r i ca c i d ) ”等。 1 1 2 药理作用 1 1 2 1 抗肿瘤作用 d u c k is 从半技莲中分到反式l ( 4 一羟基苯基) 一t 卜烯3 酮，体外试验该 化合物对k 5 6 2 显示强的细胞毒性，i c 。为( 114 - 2 ) g g m i 。需延发等通过实验证实 半枝莲多糖对s 。肉瘤细胞及腹水型肝癌细胞的生k ：有明显的抑制作用“。半枝 湖北工业大学硕士学位论文 莲通过美蓝试管法证实可轻度抑制急性粒细胞白血病血细胞，细胞呼吸器法表明 其抑制率达7 5 “；半枝莲水提物( 0 5 m g m l ) ，在浓度为5 r a g m l ，2 4 小时内 对人早幼粒白血病( h l 一6 0 ) 细胞可全部杀灭“”。 1 1 2 2 免疫增强作用 半枝莲多糖可促进刀豆素a ( c o n a ) 诱导的小鼠淋巴细胞增殖，半枝莲多糖5 0 、 1 0 0 、2 0 0 m g k g 皮下注射一周，可明显提高小鼠外周淋巴细胞酯酶的染色阳性率。 5 0 、l o o m g k g 腹腔给药时，促进二硝基苯( d n e b ) 小鼠迟发型反应，加重鼠耳肿胀。 表明中、小剂量半枝莲多糖能促进细胞免疫“”。 1 1 2 3 抗病原微生物 体外抗菌实验：半枝莲总黄酮对所试l o 种2 7 株细菌的2 5 个菌株表现了不同程度的 抑菌作用，对1 9 个菌株表现了不同程度的杀菌作用。其中，对金黄色葡萄球菌的 最小抑菌浓度范围( m i c ) 在0 2 0 o 8 0 m g m l ，最小杀菌浓度( m b c ) 可达0 ，4 0 m g m l 。 以m i c 。为指标测算的抑菌作用强度排序为：绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌、甲型 溶血性链球菌、卡它布郎汉姆氏菌、葡萄球菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌、 大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌；以m i c 。和药物稀释度分别测算，半 枝莲总黄酮对所试多数菌株的抑菌作用强度高于双黄连口服液。 动物体内实验性治疗：4 0 0l o o m g k g 半枝莲总黄酮灌胃给药对金黄色葡萄 球菌感染所致的小鼠死亡有明显的保护作用，3 个剂量组2 个时间点的死亡率均低 于感染对照组，有一定剂量相关性，以大、中剂量组作用明显，其中大剂量组作 用强度与双黄连胶囊相近“。 苏州医学报道5 0 乙醇煎剂对金葡球菌、福氏痢疾杆菌、伤寒杆菌、绿脓杆 菌、大肠杆菌等有抑制作用。亦有报道半枝莲水提物通过对i t b vd n a 的试验证实 其对乙型肝炎病毒有中等抑制作用1 ，半枝莲中含有一种芹黄素对m r s a 、m s s a 的 抗菌活性为3 1 3 5 0 盹m l ，但对革兰氏阴性菌无抗菌活性，对葡萄球菌显示选 择性抗菌作用，该成分与甲氧西林合用显著增强甲氧西林对m r s a 的抗菌活性o “。 半枝莲水提物有很强的抗突变作用，可显著抑制黄曲霉素b 2 等诱变的回变菌落素， 使与d n a 生成的复合物减少。”。 体外抗病毒试验：半枝莲总黄酮对副流感病毒( h v j ) 、呼吸道合胞病毒( r s v ) 、 疙疹病毒l 、2 型( h s v i 、i i ) 、腺病毒3 、7 型( a d r 3 、d r 7 ) 等病毒的致细胞病变 作用有明显抑制作用，其i c 。分别为0 3 5 3 3 l ，t i 为1 3 8 1 3 ，1 0 ：对柯萨奇b 族 病毒( c o x b ) 未显示出明显的抑制作用。 动物体内实验性治疗：4 0 0 2 0 0 m g k g 半枝莲叶总黄酮灌胃给药对流感病毒引起 湖北工业大学硕士学位论文 的小鼠肺炎有明显抑制作用，肺指数低于病毒对照组，呈良好的量效相关性。4 0 0 l o o m g k g 半枝莲叶总黄酮灌胃给药对流感病毒所致小鼠死亡均有不同程度的抑 制作用，死亡保护率分别为2 7 7 8 、3 3 3 3 和1 1 ，生命延长率分别为1 8 9 7 和1 7 9 4 和8 2 0 ，表示半枝莲总黄酮在此剂量时对流感病毒感染致小鼠死亡有明 显的保护作用。“。 1 1 2 4 抗炎作用 1 0 0 4 0 0 m g k g 半枝莲总黄酮灌胃给药对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症反应 有不同程度的抑制作用，与溶媒对照组比较差异有显著性或高度显著性( p 0 0 5 ) 外， 另外两组对姊妹染色体( s c e ) 均有抑制作用( p 0 0 5 ) ；而高剂量对州和s c e 频率降低最多( 4 6 7 和5 2 1 ) 。龙盛华等利用h ：0 ：一c t m a b 体系，发现半枝莲有较强的抗氧化能力。 1 2 冬虫夏草 冬虫夏草菌( c o r d y c e p ss i n e n s i ss a c c ) 为麦角菌科( c l a v i c i p i t a c e a e ) ， 虫草属( c o r d y c e p s ( f r ) l i n k ) 。冬虫夏草菌等真菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫上的子 座及幼虫尸体的复合物为我国民间较常用的名贵中药，称为冬虫夏草，别名虫草、 冬虫草。 冬虫夏草菌侵害幼虫，被害的幼虫冬天钻入土内，菌核就在它的体内形成， 外表仍然维持原来的虫形：明年夏季从菌核生出有柄的子座，形似草苗，因而得 名。子座从病虫头部生出，长4 l l 厘米，头部近圆筒形内部初实后空，1 0 4 5 2 5 6 毫米，顶尖瘦削，不孕，长1 5 5 5 毫米；子囊壳基部埋于子座中，卵 形，3 8 0 5 5 0 x1 4 0 2 4 0 微米；子囊细长，2 4 0 4 8 5 1 2 1 6 微米，含孢子2 个； 子囊孢子无色，隔膜多，不断裂，1 6 0 4 7 0x5 6 5 微米。 冬虫夏草的药用始载于本草从新，据载：“冬虫夏草，四川i 嘉定府产者最 佳，云南、贵州所产者次之。冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土 上，连身俱化为草”。本草纲目拾遗中载：“出四川江油县化林坪，夏为草，冬 为虫，长三寸许，下为足。” 冬虫夏草寄生于海拔3 0 0 0 4 2 0 0 m 高山草甸地带鳞翅目的幼虫上。分布于山 西、浙江、湖北、甘肃、青海、四川、贵州、云南、西藏等省或自治区。夏至前 后当积雪未化时采集，以完整、虫体肥壮、色黄、子座短者为佳。采集后在虫体 未干时除去外层的泥土及膜皮、晒干。或再用黄酒喷之使软，整理平直，每7 8 条用红线扎成小把以微火烘干。 四川i 康定是虫草产区，对当地大批的新鲜虫草进行了多次分离，得到菌丝通 过反接长出了实体，经鉴定为新种中华被毛孢h ir s u t e l l as i n e n s i sl i u ，g u o ， 湖北工业大学硕士学位论文 y ue tz e n g ，首次确定冬虫夏草的无性世代即是中华被毛孢。也有报道中国拟青 霉p a e c i o m y c e ss i n e n s i sc h e n ，x i a oe ts h i 及其他多种真菌可能是冬虫夏草 菌的无性阶段，但未见培养出含子囊孢子座，因而未能定论。 1 2 1 冬虫夏草的化学成分 冬虫夏草所含成分较复杂，其有效成分尚不十分明确。主要分为以下几大类 ( 孙东方，2 0 0 4 ：苏诚玉，2 0 0 3 ：h 平宇，1 9 9 8 ) ： ( 1 ) 核苷类：尿嘧啶、腺嘌呤及腺嘌呤核苷。从西藏产的冬虫夏草的子座中， 还分得次黄嘌呤核菅、尿嘧踺、胸腺嘧啶、尿营、尿苷、胸腺嘧啶脱氧核苷、尿 嘧啶脱氧核苷和腺苷等。 ( 2 ) 甾醇类化合物：麦角甾醇过氧化物、胆淄醇棕榈酸脂、麦角甾醇及b 一谷 甾醇等。 ( 3 ) 糖及醇类成分：曾分离出水溶性多糖为半乳甘露聚糖，系由d 一半乳糖与 d 甘露耱各l m o l 所组成。另分出一种相对分子质量为4 3 0 0 0 的多糖，单糖组成为甘 露糖：半乳糖：葡萄糖= 1 0 ，3 ：3 6 ：l 。有报道多糖含量为1 2 8 - - 1 6 4 。又含 虫草酸，及d 一甘露糖。又分得微量水溶性含半乳甘露聚糖的蛋白，其相对分子质 量为2 3 0 0 0 ，主要由d 一甘露糖和d 一半乳糖以3 ：5 5 y 子比组成。 ( 4 ) 氨基酸及蛋白类：冬虫夏草含粗蛋白2 7 5 2 ，含有人体所需的1 8 种氨基 酸，含有游离氨基酸，如赖氨酸、牛黄酸、天门冬氨酸、苏氮酸等。 ( 5 ) 微量元素，以磷含量为高，其次是钠、钾、钙、镁、铝、锰、铁、铜、 锌、硼、镍、以及一些维生索。 1 22 冬虫夏草的药理功能 人工发酵培养菌丝体产物的化学成分与天然虫草的化学成分基本相似。发酵 菌丝体中亦含有腺嘌呤、腺瞟呤核苷、尿l 睡啶、尿嘧啶核苷、甘露醇等：还含有 六种环二肽类化合物，其中，i 一苷氨酰基一i 。一脯氨酰基j 不二肽( c y c l o 一 ( l - 。g ly c y 一lp r o l y l ) ) 的初步药理实验具有抗癌( k b 细胞) 和增强免疫的生理 活性。 研究表明冬虫夏草有多种药理功能( 王蕾，2 0 0 3 ；陈万群，1 9 9 4 ：林吉样， 2 0 0 3 ；宾文，2 0 0 3 ；丁保金，2 0 0 4 ) ： ( l ) 中枢镇静：虫草或虫草煎剂5 9 k g 给小鼠腹腔注射可延长小鼠戊巴比妥 钠睡眠时间。虫草醇提物( 或发酵液) 5 2 0 9 k g 皮下注射可对抗烟碱所致小鼠惊 厥及死亡率和戊四唑惊厥，还可使j f 常体温降低。 ( 2 ) 抗衰老：虫草及虫草菌3 9 k g f i 2 提高小鼠肝s o d 及抑制l p 0 生成：虫草菌能 湖北工业大学硕士学位论文 抑制大鼠脑内m a 0 活性。 ( 3 ) 激素样作用：虫草及虫草菌煎齐l j l o g k g ，6 d 可使去势幼年雄性大鼠精 囊增重。给小鼠灌胃可使胸鼠血浆皮质醇含量增加，使肾上腺胆固醇含量增加， 肾上腺增重，对氢化可的松所致“类阳虚”有防治作用。虫草的这种拟雄激素样 作用和抗雌激素样作用，对性功能紊乱有调节恢复作用。 ( 4 ) 抗心肌缺血及心律失常：虫草0 6 6 m g m l 能明显减慢离体大鼠心肌细胞 波动率、虫草及虫草菌丝体水提液可使离体豚鼠及兔心心律减慢、心输出量和灌 脉流量增加，虫草菌丝体醇提物可增加麻醉犬灌脉流量，降低冠脉、脑、及周血 管阻力和降压。虫草菌发酵液0 1 5 9 k g 静注或虫草菌静注及灌胃对神经垂体素所 致兔心肌缺血、甲状腺素及去甲肾上腺素所致大鼠应急性心肌梗死都有保护作用。 虫草菌、醇提物能明显对抗乌头碱、b a c l ：、诱发的大鼠心律失常及畦巴因中毒的 耐受量。 ( 5 ) 增强免疫：虫草及虫草菌水提液明显提高小鼠血中胶体炭粒轮廓程度， 增加小鼠腹腔吞噬细胞吞噬指数和百分率：使小鼠脾脏增重，对强的松龙和环磷 酰胺引起的脾重减轻有明显的拮抗：其水提物和醇提物均可使小鼠胸腺减小。对 体液免疫有调节作用，可提高氢化可的松所致免疫抑制状态小鼠的血清溶血素及 脾细胞免疫溶血活性。在细胞免疫方面，虫草醇提物可使小鼠脾脏t 淋巴细胞增殖， 对强的松龙和环磷酰胺引起的小鼠脾t 细胞e a c 玫瑰花结形成减少对抗作用，提高t 辅助细胞比例。虫草和虫草菌对移植物抗宿主反应有明显抑制作用，虫草菌制剂 可延长同种异体植皮小鼠皮片存活期和皮片开始排斥倒结痂时问，虫草多糖在体 外对淋巴细胞转化有促进做用，可使脾浆细胞增生。 ( 6 ) 抗菌作用：体外试验证明冬虫夏革素( 虫草酸) 对葡糖球菌、链球菌、 鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌等均有抑制作用。本品煎剂对须疮癣 菌、絮状表皮癣菌、石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌等真菌均有抑制作用； 对结核杆菌的作用，各家报道不一，多数报告认为本品醇浸剂对结核杆菌有一定 抑制作用，抑菌浓度为l ：4 0 0 0 l ：1 0 0 之间，也有报告指出煎剂浓度为l ：1 0 0 l ：1 0 0 0 0 之间却无抑菌作用。冬虫夏草素( 虫草酸) 在浓度为0 1 m g m l 时对鸟结 核杆菌有抑制作用。而在浓度为i m g m l 时对枯草杆菌亦有抑制作用：对感染鼻疽 杆菌的兔，经静脉注冬虫夏草( 虫草酸) 治疗后，可使给药组兔生存时间比对照 组延长5 3 d , 时。 ( 7 ) 促进造血功能：虫草具有显著促进升血l 作用，小鼠骨髓造j f f l 干细胞 ( c f u s ) 脾结节形成试验表明，虫草的醇提结晶制剂( c s c r ，含多种氨基酸， d 一甘露糖及多糖) ，可明显提高c f u s 产率和自杀率，表明c s c r 可改变小鼠骨髓 湖北工业大学硕士学位论文 c f u c s 的周期状态，促使它们从g o 期进入s 期，从而促进c f us 增殖。对于小鼠骨 髓粒一单系祖细胞( c f u g m ) ，c s c r 的影响与计量有关，4 9 ( 生药) k g 时可明显 促进其增殖，6 9 k g 作用最强，8 9 k g 反而降低，但仍有显著促进增殖效果， 1 0 9 k g c f u g m 值与对照已无明显差异，而剂量达1 5 9 k g 时，反而显著抑n c f u g m ， 6 9 k f f 的c s c r 还可以拮抗三尖杉酯碱所致c f u g m 的严重抑制，使其保持于正常水 平。对小鼠骨髓红系祖细胞( c f u e ) 的影响，c s c r 也呈与对c f u o m 相似的剂量一 效应关系，c s c r 于5 0 1 5 0 m g ( k g d ) 时作用反而随剂量而下降，至大于2 5 0 m g ( k g d ) 时作用反而不明显。c s c r 还可以显著增d n c f u e 和b f u e 的自杀率，并能 有效地拮抗三尖杉酯碱所致c f u e 和b f u e 的严重抑制，使之保持于正常水平。 ( 8 ) 对脂类代谢的影响：虫草粉或虫草菌粉连续口服，可明显降低小鼠血清 胆固醇含量，虫草菌醇提液注射一次，即可见胆固醇及血浆1 3 脂蛋白明显降低。 进一步研究发现，天然虫草醇提物c s b n 或发酵虫草菌丝醇提物c s b 不仅均能显著降 低正常小鼠血清胆固醇和甘油三酯，且能显著抑审i j t ri t i o n 所致t c 及t g 升高，但对 肝内之t c 及t g 含量无明显影响。虫草菌发酵液，可使正常大鼠血浆甘油三酯( t g ) ， 总胆固酵( t c ) ，低密度腊蛋白胆固醇( v l d l c ) 显著降低，而高密度脂蛋白胆固 醇( h d l c ) 及h d l c t c l e 值显著升高；对于大剂量甲状腺素和去甲肾上腺素所致 应激时大鼠的血脂升高也有显著的改善效果，能使t c 、t g 、h d lc 、l d lc 及v l d l c 均显著降低，而h d l c 显著升高；对高胆固醇饲料引起的试验性高脂血症大鼠，也 能使其t g 、t c 、l d l c 显著降低，而h d l c 及h d lc t c 显著升高，并使高脂血症大 鼠红m 球膜的胆固醇含量及红血球膜黏度均显著降低。降血脂作用的机理在于虫 草菌液能活化毛细衄管壁及血管外组织( 主要是脂肪组织) 中的脂蛋白脂酶，增 加其活性，使t g 分解加强有关。c s b 还能抑制长期高胆固醇饲利饲养家兔增高的t c 和b 一脂蛋白，降低主动脉胆固醇脂的含量，并减轻动脉壁的粥样变。 ( 9 ) 对内分泌的影响：虫草及虫草菌的水提液口服或外敷，均能使摘除睾丸 的幼年大鼠精囊重量明显增加，注射可使去势雄小鼠贮精囊增重。但不影响幼年 小鼠子宫重量。表明有雄激素样作用。虫草及虫草菌水提液可使肾上腺增重，增 高肾上腺胆围醇含量。雄小鼠连续口服可使血浆皮质醇含量增高，注射虫草水提 液的大鼠肾上腺皮质束状带明显增宽，细胞数量增多，体积增夫，胞浆中线粒体， 光面内质网及脂滴明显增多，表明虫草能增强肾上腺皮质激素的合成与分泌。但 有报告大鼠单次或连续5 d 口服虫草或虫草水提液均对肾上腺内维生素c 含量无明 显影响，又表明虫草对肾上腺皮质无明显影响。虫草多糖注射可增高小鼠血浆皮 质酮含量，并可对抗外源性可的松所致血浆皮质酮的低下。 ( 1 0 ) 对中枢神经系统的影响：曾报告虫草浸液口服或注射对兔及小鼠有明 湖北5 - 业大学硕士学位论文 显的抑制作用，虫草及亚香棒虫草的热水浸液口服均能明显减少小鼠自发活动。 虫草及虫草水煎剂口服也均能明显减少小鼠睡眠时间，戊巴比妥钠所致小鼠睡眠 时间。虫草及虫草菌醇提物c s b n 及c s b 注射也可减少小鼠自发活动，明显延长戊巴 比妥钠睡眠时间。虫草菌醇提物还可以加强氯丙嗪的震惊作用，拮抗苯丙胺的中 枢兴奋作用。虫草及虫草菌醇提物注射可减弱烟碱所致小鼠痉挛，减少死亡率， 虫草菌醇提物还可显著延长士的宁所致惊厥的潜伏期，但对咖啡因、戊四氯性惊 厥及电休克无效。但也有报告虫草热水浸液口服不能对抗士的宁所致小鼠惊厥， 而亚香棒虫草者则有显著抗惊厥作用。 ( 1 1 ) 其他药理作用 对血小板作用：虫草及5 种人工培养菌丝能抑制人血小板积聚，并能促使小鼠 血肿血小板数升高和抑制射线所致小鼠血小板减少和超微结构损伤。 平喘祛痰：虫草及虫草菌水提液对豚鼠支气管有明显扩张作用，并能显著增强 肾上腺素作用，腹腔给药可增加小鼠气管酚红分泌量。 抗肿瘤：虫草水、醇提物可抑制小鼠s 。肉瘤、l e w i s 肺癌、姒，。，乳腺癌等生长： 菌丝对小鼠s 。s 。e c a 及p 。有明显抑制作用：还能增强环磷酰胺的抗癌作用。 抗炎：虫草及虫草菌水提液腹腔注射对大鼠甲醛性、蛋清性足肿胀、对二甲苯、 巴豆油耳肿胀及大鼠棉球肉芽肿均有抑制作用。 抗肾衰：虫草水提液对庆大、卡那霉素所致大数急性肾衰有保护作用。 毒性：虫草水提液小鼠腹腔l d 。2 7 8 9 k g ，虫草水提液腹腔( 1 7 9 1 7 ) g k g ， 菌丝体醇提物腹腔( 3 52 1 8 ) g k g 。临床治疗肾功能衰竭、性功能低下、 冠心病、心律失常、高血脂症、乙肝。 1 3 中草药生物转化”。o 1 3 1 生物转化机理 微生物在生长过程中进行生命活动产生成百上千的胞内酶，如纤维素酶、木 质素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂酶等，并且可以分泌几十种胞外酶到培养基中。这些 丰富繁多的酶系是中草药发生化学反应的物质基础，可以将药物的成分分解转化 形成新的成分，这些新成分有可能会产生新的功能。首先，微生物以中药中的有 效成分为前体，经微生物的代谢形成新的化合物；其次，微生物在生长过程中还 能产生丰富的次生代谢产物，有些次生代谢产物自身就是功效良好的药物；第三， 微生物的次生代谢产物和中药中的某些物质发生化学反应生成新的化合物：第四， 微生物的次生代谢产物可以和中草药中的有效成分组成复方发生协同作用，第五， 9 湖北工业大学硕士学位论文 由于中药的某些物质可能对微生物的生长和代谢有促进或抑制作用，对活性成分 的产生也可能有促进或抑制作用，微生物在中药的特殊环境中也有可能改变自身 的代谢途径，从而形成新的活性成分或改变各活性成分的相互比例；第六，微生 物的分解作用有可能将中药中的有毒物质进行分解，中草药中的有毒物质经微生 物降解后毒性降低或脱去；第七，一些中草药经过微生物的降解作用可以使原本不 易消化吸收的物质变得易于消化吸收，提高中草药的消化吸收率：第八，微生物还 可对中草药的有效成分起浓缩作用。这是由于微生物生长主要消耗的是动植物的 蛋白质、糖类等普通成分；第九，微生物在自身的生命活动过程中会产生各种各样 的生物活性物质。总之，利用微生物发酵对中草药进行生物转化具有坚实的理论 依据和多种优势，利用微生物的生长代谢来炮制中药，可以比一般的物理或化学 的炮制手段更具优越性，可较大幅度地改变药性，提高疗效，降低毒副作用，扩 大适应症。所以利用微生物发酵对中草药现代化及新药开发有不可估量的现实意 义。 13 2 中草药生物转化的特点 1 3 2 1 保护中药活性成分免遭破坏 微生物发酵是在常温、常压等较为温和的条件下进行的生物转化，故能最大 限度地保护中草药活性成分免遭破坏，特别是对热敏感的芳香类挥发油、维生素 等活性成分更能有效地加以保护。部分专家认为，发酵中药在中药加工工艺上是 一个创举，有望解决中药在煎、煮、熬、炼、蒸、浸等传统工艺中，活性成分难 于最大限度提取的难题。 1 32 2 提高中药药效 相对而言，发酵中药的分子量较小，因两具有在人体中吸收较快、较完全、 治疗效果较好等特性“。药物进人人体后不能直接被利用的有效活性组分，通过 微生物将其降解成小分子活性物质而被直接利用，还能除去大分子杂质，大大提 高中药的药效。小分子活性物质由于其更易于通过血脑屏障而与人体细胞蛋白结 合，因而比大分子物质有更高的活性。例如，2m g 芥子裂变物的药效等于未提取 的芥子5 0 9 的药效。 1 3 2 3 节省药源 通常中药提取有效成分后的废渣被弃掉，会对环境造成较大的污染，而发酵 中药能较好地解决废弃