（环境科学专业论文）用多种方法提取酸性排水沉积物中微生物dna.pdf

摘要 才能提取到d n a ；z h o u 法只能从z 样品中提取到d n a ；k i t 法的d n a 提取物不能 在凝胶上显现。 研究还发现：提取到的d n a 在经普通凝胶电泳和低熔点凝胶槽回收的纯化 过程后，通常可用于1 6 sr d n a 和i s r 基因的p c r 扩增；虽然k i t 法的提取物不能 在凝胶上显现，但可成功用于如上两个基因( c 样品) 和只有1 6 sr d n a 基因( z 样品) 的扩增。 不同方法所提取到的d n a 片段大小相差不大，均在2 3 1k b 左右；d n a 提取 量为1 8 t g g 至1 4p 眺，但通常小于1 0p g g ：提取量随方法而不同，m 1 法从c 样 品中提取到的d n a 总是多于m 2 法，但这两种方法从z 和y 样品中的提取量的比较 并不显示一致趋势，取决于预洗涤条件；此外，p 和t e n 2 + t x - 1 0 0 预洗涤的提取 量总是高于e 预洗涤。 提取到的d n a 纯度随样品有机碳含量增高而下降。高盐预洗涤液 ( t e n 2 + t x 1 0 0 ) 和高盐提取液( t e n 2 + t x 1 0 0 + 1 c t a b ) 均可使d n a 提取 物的纯度下降，特别是有机碳含量高的y 样品。考虑p c r 扩增的可行性，纯化结 果的稳定性，以及试验操作的简易性，通过普通凝胶电泳及低熔点凝胶槽回收 被确定为本实验样品的最佳纯化方法。 不同提取方法的i s r 电泳图谱显示出不同的扩增带型( 数量，位置和强度) 。 对于c 样品，经t e n 2 + t x 10 0 预洗涤的m 2 法所得到的带数最多。对于z 和y 样品， 差别则主要表现在带的强度上。 以上结果表明，为了从a m d 沉积物样品中得到高质量的d n a 提取物，应比 较多种提取方法。对于本研究的a m d 沉积物来说，预洗涤是必要的，特别是有 机碳含量高的样品；并且，采用t e n 2 + t x - 1 0 0 高盐预洗涤后再用裂解条件相对 温和的低盐提取法( 如m 2 法) 可得到较好的提取结果。 关键词：d n a 提取土壤预洗涤1 6 sr d n ai s r 酸性排水 i i a b s t r a c t a b s t r a c t o b t a i n i n gam e t h o do fd n ae x t r a c t i o ns u i t a b l ef o rp a r t i c u l a rs a m p l e si sa p r e r e q u i s i t ef o rs c r u t i n i z i n gm i c r o o r g a n i s m si n v o l v e di nc a t a l y s i so ff o r m a t i o no f a c i d i cm i n ed r a i n a g e ( a m d ) p o l l u t i o nt h r o u g hd n a s e q u e n c ea n a l y s i s t h ed e x i n g c o p p e rm i n ei nj i a n g x ip r o v i n c eh a sal a r g es c a l ea n dl o n gh i s t o r ya n dc a u s e d s e r i o u sp o l l u t i o no fs u r r o u n d i n gl a r g ea r e a s t h i ss t u d y , u s i n gt h r e ee x e m p l a r y s a m p l e so fd i f f e r e n tp r o p e r t i e sf r o mt h em i n e ( s a m p l e sc za n dy o r g a n i cc a r b o n c o n t e n t so f0 5 9 ，1 4 0 ，a n d3 2 3 ，r e s p e c t i v e l y ；m o r es a n do fzt h a nca n dy ) ， o b s e r v e dt h ee f f e c t so fs e v e r a ld i f f e r e n tm e t h o d so fs a m p l ep r e w a s h i n g ，e x t r a c t i o n a n dp u r i f i c a t i o no nq u a l i t yo fd n ae x t r a c t si no r d e rt oe s t a b l i s hm i c r o b i a ld n a e x t r a c t i o nm e t h o d ss u i t a b l ef o rt h em i l l ea n dt h el i k e s e v a l u a t i o no ft h eq u a l i t y i n c l u d e s y i e l d ，s i z e ，p u r i t y , s u c c e s s f u la m p l i f i c a t i o n o f16 sr d n ag e n e ，a n d p o l y m o r p h i s mo fi s r ( i n t e r g e n i cs p a c e rr e g i o n ) g e n e b a n d s f o u rs o l u t i o n sw e r eu s e dt op r e w a s h i n gs a m p l e s ：p ( n a 2 h p 0 4 和n a h 2 p 0 4 ：0 1 m ) ，e ( n a 2 e d t a ：0 5m ) ，t e n 2 + t x - 10 0 ( n a 2 e d t a ，t r i s h c l & n a 3 p 0 4 ：0 1m ； n a c i ：1 5m ；t x - 1 0 0 ：0 0 5 ) ，a n dt e n 3 _ 。t x 一1 0 0 + p v p ( n a 2 e d t a ， i r i s h c l ，n a c l & n a 4 p 2 0 7 ：o 1m ；t x - 1 0 0 ：0 0 5 ；p v p ：1 ；o n l yf o rs a m p l ey ) p r e w a s h i n gw a s o n l ya p p l i e df o rt h ef i r s tt w oe x t r a c t i o nm e t h o d sd e s c r i b e db e l o w f o u rm e t h o d sw e r ea p p l i e dt oe x t r a c td n a ：h j 【g hs a l t & c y c l e so ff r e e z e - t h a w ( m 1i ns h o r t ，t e n 2 + t x - 1 0 0 + 1 c t a ba st h ee x t r a c t i o ns o l u t i o n ，t w oc y c l e so f 7 8 0 c 6 5 0 c ) ，l o ws a l t & p r o t e i n a s ek ( m 2 ；e x t r a c t i o ns o l u t i o nc o n t a i n i n go 1m n a c l 0 0 1m i r i s - h c ia n d0 0 0 1mn a ：e d t a ；o 1m g m lp r o t e i n a s ek a t5 0 。cf o rl h ) ，l l i g hs a l t & p r o t e i n a s ek ( z h o u ，a p p le n v i r o nm i c r o b i o l6 2 ( 2 ) ：31 6 - 3 2 2 ， e x t r a c t i o ns o l u t i o no fm 1w i t h o u tt x 一10 0 0 0 8m g m lp r o t e i n a s eka t3 7 0 cf o r0 5 h ) ，a n dz rs o i lm i c r o b ed n ak i t t m ( k i t ，z y m or e s e a r c hc o r p ) b o t hm ia n dm 2 m e t h o d sa d o p t e dt h es t e p w i s et r e a t m e n t so ft h eo r d e r ：l y s o z y m e ，s d s ( b e f o r e f r e e z e t h a wc y c l e so rs i m u l t a n e o u sw i t hp r o t e i n a s ek ) ，a n db e a db e a t i n g , w h e r e a s ， o n l ys d st r e a t m e n t ( a f t e rp r o t e i n a s ek ) w a sa p p l i e di nt h ez h o um e t h o d c r u d ed n a ( a f t e rt r e a t m e n t so fo r g a n i cs o l v e n t s ) w a sp u r i f i e dw i t hs i xm e t h o d s o fg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ef i r s tf o u rm e t h o d su s e dt h ec o l n n - l o nm e l t i n g - p o i n ta g a r o s e i l l a b s t r a c t g e lb u td i f f e r e n ta p p r o a c h e so fd n ar e c o v e r yf r o mt h eg e l s ：o r g a n i cs o l v e n t s ，3 0 p e gs o l u t i o nw e l l - t r a p ，l o wm e l t i n g - p o i n ta g a r o s eg e l ( l m pg e l ) w e l l - t r a p ，a n d2 p v pl m pg e lw e l l t r a p ( t h ec o m m o ng e lf o re l e c t r o p h o r e s i sa l s oc o n t a i n e d2 p v p ) t h el a t t e rt w om e t h o d sa p p l i e dl m pg e l sw i t h o u td n a r e c o v e r y ( d i r e c t l yu s e df o r g e n ea m p l i f i c a t i o n ) o rw i t hd n ar e c o v e r yu s i n g ac o m m e r c i a lk i t i tw a sf o u n dt h a t ：a l t h o u g hd n ac o u l db ee x t r a c t e df r o ms a m p l e sca n dz c o n t a i n i n gl o wc o n t e n t so fo r g a n i cc a r b o nu s i n gm 1a n dm 2m e t h o d s ，p r e w a s h i n g w a sn e e d e dw i t ht h el a t t e rm e t h o d ；w h e r e a s ，t h ed n af r o ms a m p l ey o fh i g ho r g a n i c c a r b o nc o n t e n tc o u l do n l yb ee x t r a c t e dw i t l lp r e w a s h i n g ；t h ez h o um e t h o dc o u l d e x t r a c td n a o n l yf r o ms a m p l ez ；a n dt h ed n af r a g m e n t se x t r a c t e dw i t ht h ek i t m e t h o dc o u l dn o tb ed e m o n s t r a t e do nt h eg e l s f u r t h e r m o r e ，i tw a sf o u n dt h a t ：a f t e re l e c t r o p h o r e t i cp u r i f i c a t i o nw i t ht h el m p g e lw e l l - t r a pi n s e r t e d i n t ot h ec o m m o na g a r o s eg e l ，t h ed n a e x t r a c t sc o u l db e g e n e r a l l ya m p l i f i e df o r16 sr d n aa n di s rg e n e s ；t h o u g ht h ed n a e x t r a c t sn o t s h o w no ng e l s ，t h e yc o u l db ea m p l i f i e df o rb o t hg e n e s ( s a m p l ec ) a n do n l y16 s r d n a g e n e ( s a m p l e y ) t h es i z e so fe x t r a c t e dd n a f r a g m e n t sw e r es i m i l a rb e t w e e nd i f f e r e n tm e t h o d s ， a l la b o u t2 3 1k b ；t h ed n a y i e l d sw e r ef r o m1 8l a g gt e l 4p & b u tn o r m a l l yl e s s t h a n10i t g g ；t h ey i e l d sd e p e n d e do nt h ee x t r a c t i o nm e t h o d s ，b e i n ga l w a y sh i g h e r w i t hm 1t h a nm 2f o rs a m p l ec r e g a r d l e s so fp r e w a s h i n gc o n d i t i o n sb u t n oc o n s i s t e n t t r e n d sf o rs a m p l e sza n dya c c o r d i n gt ot h ep r e w a s h i n gc o n d i t i o n sa p p l i e d ；i n a d d i t i o n t h ey i e l d so b t a i n e d 、历t l lp r e w a s h i n gs o l u t i o n so fpa n dt e n 2 + t x 1 0 0w e r e a l w a y sh i g h e rt h a nt h o s ew i ler e g a r d l e s so ft h ee x t r a c t i o nm e t h o d so fe i t h e rm 1o r m 2 t h ep u r i t i e so fd n ae x t r a c t sd e c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n go r g a n i cc a r b o nc o n t e n t s o ft h es a m p l e s b o t hh i g hs a l tp r e w a s h i n gs o l u t i o n ( t e n 2 + t x - 10 0 ) a n dh i g hs a l t e x t r a c t i o ns o l u t i o n ( t e n 2 + t x - 1 0 0 + i c t a b ) c o u l dd e c r e a s et h ep u r i t i e so fd n a e x t r a c t s ，e s p e c i a l l yf o rs a m p l ey o fh i g ho r g a n i cc a r b o nc o n t e n t i nc o n s i d e r a t i o no f f e a s i b i l i t yo fp c ra m p l i f i c a t i o n ，s t a b i l i t yo fp u r i f i c a t i o ne f f e c t s ，a n ds i m p l i c i t yo f e x p e r i m e n t a lo p e r a t i o n ，i tw a sd e t e r m i n e d t h a te l e c t r o p h o r e s i sw i t hac o m m o n a g a r o s eg e li n s e r t e dw i t hl m pg e lw e l l t r a pf o rr e c o v e r yw a st h eb e s tm e t h o dt o i v a b s t r a c t p u r i f yo u re x p e r i m e n t a ls a m p l e s t h ee l e c t r o p h o r e t i cs p e c t r u m so fi s ra m p l i f i c a t i o nb a n d sw e r ec h a r a c t e r i s t i c ( i n t e r m so fn u m b e r , p o s i t i o n ，a n di n t e n s i t y ) f o rd i f f e r e n tm e t h o d s f o rs a m p l ec ，t h e n u m b e ro ft h eb a n d so b t a i n e dw i t hm 2m e t h o df o l l o w i n gt e n 2 + t x 一10 0p r e w a s h i n g w a sg r e a t e s t f o rs a m p l e sza n dyt h ed i f f e r e n c e sw e r es h o w nm a i n l yw i t hb a n d i n t e n s i t i e s t h ea b o v er e s u l t si n d i c a t e dt h a tm u l t i p l em e t h o d so fd n ae x t r a c t i o ns h o u l db e c o m p a r e df o ro b t a i n i n gh i g hq u a l i t yo fd n a e x t r a c t sf r o ma m ds e d i m e n ts a m p l e s f o rt h es a m p l e so ft h i ss t u d y , e s p e c i a l l yt h eo n eo ft h eh i g ho r g a n i cc a r b o nc o n t e n t ， t h ep r e w a s h i n gw a sn e c e s s a r y ；f u r t h e r m o r e , t h eb e t t e rd n ae x t r a c t i o nr e s u l t sc o u l d b ee x p e c t e dw i ma p p l i c a t i o no f p r e w a s h i n gw i t hh i g hs a l ts o l u t i o no ft e n 2 + t x 1 0 0 f o l l o w e db y r e l a t i v e l ym i l da n dl o ws a l te x 仃a c t i o nm e t h o d ( s u c ha sm 2m e t h o d ) k e yw o r d s ：d n ae x t r s c t i o ns o i lp r e w a s h i n g16 sr d n ai s r a m d v 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：磕；螽 卅年6 月z 日 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 莨了氢 卅引月加 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 第一章绪论 第一章绪论 第一节酸性排水概述 1 ，1 。1 酸性排水的概念 酸性排水( a c i dm i n ed r a i n a g e ，a m d ) 是一种低p h ，高金属离子含量的废水， 其酸性是由黄铁矿等含硫矿物的氧化造成的，一般呈红棕色【1 1 。 1 1 2 酸性排水主要的来源 a k c i l 和k o l d a s y l j 出了两类a m d 的来源1 2 】见表1 1 表1 1 酸性排水( a m d ) 的来源 初级来源( p r i m a r ys o u r c e s )次级来源( s e c o n d a r ys o u r c e s ) 1 采矿的废石 2 尾矿库 3 地下或露天矿井开采 4 人工抽取或自然流出未经处理的地下水 5 生态恢复地区滤液的扩散 6 。修建公路、水库等所用的石材 7 污泥处理池 8 岩石碎片 9 渗滤液的汇集 1 0 储存库 1 1 沿路水流的浓缩 1 2 应急池 其中，人们在开采矿山时产生大量的含硫废矿石在空气中氧化形成酸性排 水，这是酸性排水产生的重要来源之一。此外，生物浸矿的过程中产生大量的 酸性排水也是其中的主要来源。 1 1 3 酸性排水污染及危害 酸性排水污染是一个全球性的环境问题，在世界各国都存在。据估计，1 9 8 9 年全世界约有1 9 3 0 0k m 河流和约7 2 ，0 0 0h a 的湖泊或水域受到采矿排水的严重 污染。在美国水体中的酸有7 0 就是来自于矿山酸性废水1 3 】。美国林业局估计， 美国约有2 0 ，o o o n 5 0 ，0 0 0 个的矿区产生酸性排水。这些矿区的酸性排水影响到了 8 , 0 0 0 到1 6 ，0 0 0k m 的河流 4 1 。据一份1 9 8 6 年调查估计，加拿大产生酸性排水的尾 矿覆盖有1 2 ，0 0 0 公顷；因此采矿业把酸性排水看成是最大的环境问题【5 】。我国的 受到酸性排水污染的地区主要集中在南方的一些矿区，如江西的德兴铜矿，广 第一章绪论 东的大宝山铜矿，云浮硫铁矿，湖北大冶的大冶铁矿，安徽马鞍山的矿区等。 图11 受酸性捧水污染的河流和酸性排水库 受到a m d 污染的水域常常含有较高的金属离子，这些会对水生生物造成毒 害，导致该水域丧失绝大部分的生物1 6 1 。f r o m r a 报道对于水生生物而言，对它 们繁殖“没有影响”的p h 值大约在65 左右：对大多数的鱼类而言，p h 在5 5 1 0 5 之间也不受影响【7 】。c o o p e r 和w a g n e r 在研究宾夕法尼亚州的河流时发现，当p h 在4 5 - 55 时就对鱼类产生严重影响【b j ；p h 为4 5 时，9 0 的鱼死亡。而当水体的p h 值在2 5 左右时就会对大多数的水生生物产生毒害时。德兴铜矿是我国最大的 斑岩型露天铜矿，每年产生约1 7 0 0 f i m 3 的酸性废水，州值在2 2 也8 之间【l q ，含 有大量的金属离子”。大量的酸性废水排放到附近的大坞河，使得全长1 4h r l 的 河段没有任何水生生物存在，这也不足为奇了。 受到酸性排水污染的土壤的口h 值较低且含有大量的金属离子，严重影响在 该区域的植物生长，甚至可能导致该区域无法生长任何植物。杨振等研究发现， 大宝山周围受酸性排水污染的地区，水稻中的金属离子有累计的趋势，并且c d 含量超过了粮食卫生标准( g b2 7 1 5 - 2 0 0 5 ) 2 倍【1 w 。邹晓锦等在调查大宝山 矿区重金属污染对人体健康影响时发现，所测定的3 1 口饮用水井中有1 2 口井水 的盈和1 4 1 2 1 井水的c d 古量超过了生活饮用水质标准；p b 、z n 、c d 在蔬菜中的含 量分别超过国家蔬菜卫生标准限值的4 0 ，11 和5 6 倍，在大米中的含量为国家粮 食卫生标准限值的70 ，3 4 和29 倍。居民每天摄于过量的这些重金属是造成该地 区癌症高发的主要原因i l m 。 第二节酸性排水产生的原因及影响因数 1 2 1 产生酸性排水的原因及影响因素 由酸性排水定义可知，酸性产生的主要原因是古硫矿物，主要是黄铜矿 第一章绪论 ( c u f e s 2 ) 和黄铁矿( f e s 2 ) 氧化造成的。随着人们开矿活动的日益频繁，产生 了大量的含硫的废矿石。这些矿石暴露在空气中，在氧气和水分以及微生物的 作用下产生了酸性排水。以黄铁矿为例，其具体生物化学过程如下： 2 f e s 2 ( s ) + 7 0 2 + 2 h 2 0 2 f e 2 + + 4 s o “h +( 1 1 ) 由于矿离子的产生，使得环境的p h 值下降。当水中有足够的溶解氧或暴露 在空气中时，f d + 离子就会被氧化成f e 3 + ： 2 f e ”+ 1 2 0 2 + 2 h + - - 2 f e 3 + + h 2 0( 1 2 ) 当p h 值在2 3 3 5 之间时f e 3 + 会形成f e ( o h ) 3 ，使得水体中只含有少量的f e 弘， 同时进一步降低了周围的p h 值： 2 f e ”+ 6 h 2 0 一2 f e ( o h ) 3 ( s 卜6 h + ( 1 3 ) 未沉淀的f e 3 + 离子，会与黄铁矿( f e s 2 ) 继续反应： 1 4 f e ”+ f e s 2 ( s ) + 8 h 2 0 专2 s o + 1 5 f e 2 + + 1 6 h + ( 1 4 ) 总的反应式为： 1 3 2 f e ”+ f e s 2 ( s ) + 1 7 4 h 2 0 + 1 5 8 0 2 专2 s o z 4 - + 1 5 2 f e 2 + + 1 7 2 h + ( 1 5 ) 由总反应式( 1 5 ) 可以看出，lm o l 的f e s 2 可产生8 5m o l 的h + ，可见其对 环境有很大的危害。 当p h 4 时，形成的f e 3 + 的反应式( 2 ) 是促进矿物氧化反应持续进行的关键 反应，因为此时与f e s 2 反应的主要物质是f e 3 + ：而当p h 4 时，无机f e 3 + 氧化f e s 2 的反应可以忽略不计了【1 5 】，此时中度和极度嗜酸铁氧化菌的活动在酸洗矿水形 成过程中起到关键作用【1 6 1 。 影响酸性排水产生的因素，a k c i l 等【2 】归纳有以下几点： 1 p h 值 6 f e ”的化学活性 2 温度7 含硫矿物暴露在空气中的表面积 3 气相中的氧气含量8 启动酸性排水产生的化学活化能 4 水相中的氧气含量9 微生物活性 5 水饱和度 、 在没有人为干扰的自然过程中，含硫矿物的氧化是一个非常缓慢的过程， 有些需要几个地质年代的时间。由于人们的采矿活动把大量的含硫矿物暴露于 地表，和空气中的水分和氧气接触，这极大的加快了矿物的风化过程。在风化 过程中，铁和硫氧化菌起到了至关重要的作用。虽然当这些微生物没有处于最 3 第一章绪论 适条件时，其对风化作用影响很小【2 】；但是如果它们处于适宜的环境，它们可以 把风化的速率提高几个数量级【1 7 】，极大的加快了酸性排水产生的速率。 1 2 2 催化a m d 产生的主要微生物 催化黄铁矿风化的微生物主要是嗜酸的铁、硫的氧化细菌，如t h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s ( 氧化硫硫杆菌) ，t h i o b a c i l l u sf e r r o o x i d a n t ( 氧化亚铁硫杆菌) 和 l e p t o s p i r i l l u mf e r r o o x i d a n s ( 氧化亚铁钩端螺旋菌) 掣1 s , 1 9 1 。它们一般是嗜酸、 好氧的微生物。这些微生物也可以用来生物浸矿，来处理低品位的或难以用其 他方法来提炼的矿物；此外，其中的一些微生物还被用来生物脱硫【2 0 2 1 1 。硫的氧 化细菌( zf e r r o o x i d a n t ) 是铁和硫的氧化菌；氧化亚铁钩端螺旋菌( 厶 f e r r o o x i d a n s ) 是铁氧化菌；它们可以氧化黄铁矿。而氧化硫硫杆菌( zt h i o o x i d a n s ) 是硫氧化菌，它不能单独氧化黄铁矿。 以上提到的这些微生物都是可以培养富集到的微生物，因此人们认识和应 用得较早。然而，有研究表明【2 2 2 3 1 ，目前土壤中能够在实验室培养的微生物占其 总数的0 3 5 。因此通过培养的方法来研究环境中的微生物存在巨大的局限性。 所以，用微生物培养的方法来研究产生酸性排水的微生物同样会有很多局限性。 近年来，使用不依靠培养手段的分子生物学方法来研究酸性排水中的微生物发 现，还有其他的微生物，女h f e r r o p l a s m aa c i d i p h i l u m ，在酸性排水产生过程中起 到重要作用【2 4 2 6 】。 第三节土壤中d n a 的提取 从土壤样品中提取微生物d n a 的方法很多，大体可以分为两大类，分别是 间接提取法和直接提取法。问接提取法是先需要分散土壤颗粒，使得其中包裹 的微生物充分分散于溶液中，再通过低速离心等手段使得微生物细胞与土壤颗 粒分离。收集到的含有微生物细胞的溶液，经过高速离心收集细胞，最后加入 d n a 提取缓冲液进行细胞裂解。直接提取法则不需要把微生物从所在的基质中 预先分离出来，加入d n a 提取缓冲液后直接在原位裂解细胞。间接提取法和直 接提取法的一般步骤如图1 2 ： 4 第一章绪论 直接提取法间接提取法 图1 2 直接和间接法提取d n a 的流程图【2 7 j 1 3 1 间接提取法 1 3 1 1 土壤颗粒的分散 从土壤中分离提取微生物细胞的方法始- 巴f a e g r i 和t o r s v i k e 2 8 捌。由于土壤中 微生物很多都包裹了土壤颗粒当中或是粘附在土壤颗粒表面，不易分散到溶液 当中，因此很难提取到这部分微生物的d n a 。不同的分散方法和分散作用力对 土壤中微生物的分散作用有着很大差异，所以土壤颗粒分散是间接提取法的关 键步骤之一。这些分散方法中包括物理分散法和化学分散法。物理方法常用的 技术有振荡法f 3 0 】，韦林氏搅拌器( w a r i n gb l e n d e r ) 搅拌澍2 8 3 0 1 ，超声、法【3 2 矧， 旋转杵法【3 4 】等。其中韦林氏搅拌器搅拌法最常用。化学分散法是加入化学试剂 使土壤颗粒分散，常用的分散剂有焦磷酸钠【2 3 翔, 3 5 1 ，t r i s 缓冲液3 6 1 ，生理盐水【3 7 ，3 8 1 ， 六偏磷酸钠【2 3 l ，纯水【3 1 , 3 9 】等，其中以焦磷酸钠最常用。 为了达到更好的分散效果，常把物理分散法和化学分散法联合一起使用。 不同的分散方法对于不同的土壤样品的分散作用不同，因此没有统一的标准分 散方法。h o p k i n s 等对1 0 种分散方法进行了比较，认为采用1 胆酸钠、钠型离子 第一章绪论 交换树脂、玻璃珠与土壤样品一起在4 c 振荡2h ，其分散效果最好【矧。l i n d a h l 对使用两种分散剂( 蒸馏水和焦磷酸钠) 和不同大小的韦林氏搅拌器容器来分 散土壤。其结果表明，使用焦磷酸钠和韦林氏搅拌器的中等大小的容器 ( m i d i c o n t a i n e r ) 能达到较好的分散效剽3 1 1 。j a c o b s e n 等研究表明，阳离子交换 树j l 旨c h e l e x1 0 0 也能有效的分散土壤颗粒；而b a k k e n 研究发现，六偏磷酸钠与 双蒸水对土壤颗粒的分散作用没有显著差异1 2 3 。 土壤分散过程中需要加入一定的化学试剂和施加一定的外力，这可能会造 成部分细胞的损伤，甚至导致细胞破裂而损失d n a 。因此在尽量提高分散细胞 效果和细胞完整性之间寻求一个平衡点。 1 3 1 2 细胞的收集 f a e g r i 等首先运用了不同的沉降速度来分离细菌【2 引。该方法包含有两个连续 的离心过程：首先在5 0 0 g 蛰j l ，0 0 0 g 的离心力下离心2 1 5m i n 。该步骤主要是 去除土壤分散后的悬浊液中的土壤颗粒，真菌菌丝等。最佳低速离心条件可以 在权衡细胞的回收率和杂质的去除率之间找到【4 2 1 。含有细胞的上清液经过高速 离心可以沉淀收集其中的细胞。但是一些链式或成簇的微生物和吸附或包裹在 土壤颗粒上的细胞很容易在第一步的低速离心中损失掉。 低速离心收集到的含有细胞上清液中往往还含有非细胞物质或腐殖酸等。 当用c a c l 2 絮凝这些物质时，会造成细胞回收率的大幅下降【4 1 1 。因此，人们用高 速离心浓缩收集提取到的细胞后，再用了高速的密度梯度离心的方法来纯化【2 3 】。 其步骤如图1 3 6 第一章绪论 图1 3 细胞提取和密度梯度纯化的一般步骤【2 3 】( 有改动) 离心法分离土壤微生物的关键是要选择适宜的离心速度。离心速度愈高， 提取液中土壤残存颗粒含量愈低，但细胞沉降量愈大，提取率愈低；反之，提 取液中细菌提取率愈高，但土壤残存颗粒含量亦愈高。此外选择合适的密度梯 度分离液也很重要，b a k k c n 等选用了几种密度梯度分离液，女【i p e r e o l l 分离液、甲 泛影酰胺( m e t r i z a m i d e ) 和n y c o d e n z 分离液来做比较，分离土壤中的微生物细 胞。其结果显示用n y c o d e l l z 分离液的分离效果最好【4 3 1 。细胞回收率在6 5 0 之 间【3 4 4 3 】。n y c o d e n z 分离液的密度为1 3g m o l ，而大多数的细菌的密度小于1 1 2 g m o l ，因此这些细菌细胞“应该 可以从n y c o d e n z 分离液上部回收。然而，由 于很多细菌牢固地吸附在土壤粘粒表面，高速离心后随土壤颗粒沉淀到离心管 底部而损失掉。尽管密度梯度离心可以有效的分离到土壤中微生物的细胞，但 是由于土壤中的一些腐殖质和土壤颗粒的密度也与微生物细胞的密度相似，无 法有效的分离造成的脚】，所以回收的这些细胞中仍然还有部分杂质。 1 3 1 3 裂解细胞 经过纯化的细胞含有杂质相对较少，不必像直接提取法( 见下文) 那样需 要经过较复杂的前处理步骤才能提取到微生物的d n a 。它只需用现有常用的提 取方法来提取，也可以使用直接提取法的裂解步骤( 下详) 来提取。 7 第一章绪论 1 3 2 直接提取法 相对于间接提取法而言，直接提取法的关键步骤除了细胞分散步骤外，还 有细胞的裂解和d n a 纯化等步骤。这是由于直接法在原位提取细胞的d n a 时， 微生物细胞和各种裂解试剂均处于一个成分复杂的土壤悬浊液当中，土壤中存 在的很多杂质会干扰细胞的裂解。此外，土壤中存在的大量的有机质，特别是 腐殖质，它们与d n a 有类似的性质，容易与d n a 结合而难以分离，这严重妨碍 了后续的分析。为了能够用直接提取法提取到适合研究要求的d n a 模板，一般 把直接提取法分为三个阶段：1 样品前处理阶段；2 细胞裂解和d n a 提取阶段； 3 d n a 纯化阶段。本节先介绍前两个阶段，d n a 纯化阶段将在下一节详细介绍。 1 3 2 1 样品的预洗涤 土壤样品的前处理主要是指样品的预洗涤。细胞裂解前进行预洗涤是去除 d n a 提取和p c r 扩增抑制物的有效方法。由于d n a 分子与环境中很多腐殖质相 似，当d n a 分子从细胞中释放出来后很快就与环境中的这些腐殖质紧密结合， 很多纯化方法都难以把它们分离。因此，在它们结合前，即细胞裂解前就把这 些物质去除，是一个提高d n a 纯度，特别是提高腐殖质含量高的土壤中微生物 d n a 纯度的有效办法。此外，土壤中还存在很多细胞外的d n a ，如动植物残体 中的d n a ，这些也会干扰细胞裂解或影响d n a 的纯度。而预洗涤的作用除了可 以分散土壤颗粒外，还可以去除这些胞夕t , d n a 2 7 1 。 w a t s o n 等通过一系列不同浓度的e d t a 溶液选择性的去除了绝大多数棕色 的抑制物，而未造成细胞的破裂，显著的提高- p c r 的扩增效率【4 5 1 。f o r t i n 等在 提取受到有机物污染的内陆湿地土壤和污染严重的海洋沉积物( t o c 含量在 0 2 0 o - 1 3 之间) 中的d n a 时，通过一系列不同浓度的e d t a 溶液预洗涤后，提 取到的d n a 量略有下降，但是提高- p c r 的扩增效率【蛔。h e 等在提取一个高有 机质高铁氧化物含量的森林土壤时发现，如未经预洗涤处理，提取到的d n a 样 品不能成功的进行p c r 扩增；而经过磷酸缓冲液或e d t a 溶液预洗涤后，d n a 产 量提高了2 4 ，腐殖质含量下降了3 1 。经过预洗涤后，也减轻了后续的纯化步 骤1 47 1 。h a o 等用e d t a 和草酸铵溶液洗涤含铁量高的酸性排水沉积物后，成功的 提取到其中的微生物d n a ，并成功的进行p c r 扩增【4 引。 对于腐殖质含量较高的样品，在预沈涤液中加入一些腐殖酸去除剂可以减 少粗d n a 中的腐殖酸含量，从而提高d n a 纯度。p v p p ( 聚乙烯聚吡咯烷酮) 、 第一章绪论 p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 和c t a b ( 十六烷基三甲基溴化铵) 是最常用的腐殖酸 去除剂，其各自的脱腐效果因样品而异。z h o u 等报道，p v p p 和c t a b 能有效的 去除部分腐殖质，但是c t a b 不会造成d n a 的损失，因此c t a b 的效果优于 p v p p 4 9 1 。 k r s e k 和w e l l i n g t o n 研究结果发现，p v p p 和p v p 对d n a 的纯度没有 正面的影响，相反却常常会造成d n a 的损失娜】。对于海洋沉积物等高腐殖质的 样品，简单的在d n a 洗涤或提取缓冲液中加入p v p p 或c t a b 等脱腐物质还不够。 因为这些脱腐物质的脱腐能力有限，只能去除一小部分的腐殖质。使用这种方 法提取到的d n a 样品往往呈棕色或黑色，有的甚至出现大量的黑色的不溶物， 导致d n a 提取失败。针对这种情况，席峰等通过比较不同脱腐缓冲液以及改变 不同的提取条件总结出一个有效去除大部分腐殖酸的方法，即用脱腐液：1 0 0 m m o l l