（作物遗传育种专业论文）甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆与几个重要农艺性状的初步QTL定位.pdf

摘要 油菜是一种重要的油料作物，在世界各地除非洲少数地区以外，几乎都有栽 培。油菜经济价值的提高首先需要改良油菜栽培品种，而油菜新品种的改良主要 体现在油菜品质和产量的改良两个方面。在油菜品质改良方面，利用基因工程手 段来改变油菜种子的化学组成成分及其含量是改良油菜品质的一个有效措施，其 中，基因工程手段的一个关键技术就是调节控制优良基因的表达，而高等植物基 因调控主要是在转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互 协调作用。植物基因启动子是重要的顺式作用元件，是r n a 聚合酶识别并与之 结合，从而起始基因转录的一段d n a 序列。因此，油菜组织特异性启动子的克 隆和表达验证是一项重要工作。 在油菜产量改良方面，由于油菜产量及与产量有关的其它许多农艺性状均表 现为微效多基因控制的数量遗传，研究这些数量性状位点( q t l ) 在油菜基因组 染色体上的位置和对性状表现影响的程度，具有积极现实的意义。近年来，随着 数量遗传学和现代生物技术的发展，借助d n a 分子标记和q t l 作图，复杂的 数量性状可剖分为若干离散的盂德尔因子所决定的组分，进而确定其在染色体上 的位置及其效应大小。同时，应用分子标记辅助选择( m a s ) 和转基因等技术，使 油菜产量的进一步提高成为可能。 1 甘蓝型油菜n a p i n 基因启动子的克隆 n a p i n 是一类由多基因编码的种子贮藏蛋白，广泛存在于芸苔属植物的种子 里，占种子蛋白总量的2 0 3 0 。n a p i n 基因是在a b a 的影响下，以组织特 异型方式表达。 本实验根据g e n b a n k 中已经公布的n a p a 全序列57 端非编码区设计引物， 以甘蓝型油菜中双4 号基因组d n a 为模板，通过p c r 扩增，获得的扩增产物克 隆到p m d l 8 t 载体并测序。结果表明，所克隆的扩增序列长度为1 1 5 9 b p ，经比 较分析，该序列与n a p a 相比，只是有几个核苷酸差异，与其它已公布的n a p i n 基因启动子同源性也很高。 该序列富含a t 碱基，具有1 ：a t a - b o x 、c a a t - b o x 、g - b o x 、g 御f a - b o x 等高等植物启动子的序列特征。为了进一步验证其组织特异性表达功能，把它插 入到p c a m b i a 1 3 0 1 载体，替代p c a m b i a 1 3 0 1 中g u s 基因前的c a m v 3 5 s 启 动子，构建成g u s 基因表达载体p c l 3 0 1 n 。把重组载体转化到农杆菌l b a 4 4 0 4 中，感染a b a 诱导的油菜种子，经g u s 染色证明，该n a p i n 基因启动子具有种 子特异性表达功能。 2 甘蓝型油菜几个重要农艺性状的初步q t l 定位 利用杂交组合中双4 号h 2 2 8 f l ，经8 代自交，构建成r i l 群体，在第8 代时 调查亲本和随机选择的1 4 2 个r i l 群体株系株高、一次有效分枝数、单株产量等1 1 个农艺性状。r i l 群体中1 1 个农艺性状之间相关分析表明：单株产量与株高、一 次有效分枝数、主花序长度、主花序有效角数、主花序角密度、角果长度、每角 粒数、千粒重、单株有效角果总数呈极显著正相关。 选用s s r 弓i 物对中双4 号和h 2 2 8 间进行多态性检测，有1 5 2 对引物在双亲间表 现多态性，用这些引物分别对1 4 2 个株系进行检测，构建了含有1 2 3 个s s r 分子标 记、1 8 个连锁群的连锁遗传图，总图距为3 4 8 3 i e m ，标记间平均距离为2 8 3 2 c m ， 各标记在1 8 个连锁群上的分布很不均匀，其中，第l 、1 2 、1 3 、1 7 连锁群上分布 标记较多，其它连锁群上分布标记较少。 根据r i l 群体性状方差和s s r 差异位点分析，该群体可以进行初步的遗传图 谱构建和q t l 定位，但各个性状的平均纯合度不太纯，还需进一步自交纯合，本 次所获得遗传图谱和q t l 位点将有一定误差。与l o w e 等( 2 0 0 4 ) 的遗传图谱比较， 发现2 6 个相同的标记位点，只占本实验标记位点的2 1 1 。 1 1 个农艺性状共检测到8 1 个数量性状位点( q t l s ) 。其中，株高检测到4 个q t l s ，解释性状表型变异的1 0 3 2 8 9 ；一次有效分枝数检测到2 个q t l s ， 解释性状表型变异的2 2 1 和4 7 ；有效分枝部位检测到1 6 个q t l s ，解释性状 表型变异的1 2 2 5 1 8 ；主花序长度检测到1 5 个q t l s ，解释性状表型变异 的7 4 2 6 6 ；主花序有效角数检测到5 个q t l s ，解释性状表型变异的 1 1 2 2 5 ；主花序角密度检测到1 个q t l s ，解释性状表型变异的1 7 3 ；角 果长度检测到1 2 个q t l s ，解释性状表型变异的2 4 3 6 7 ；每角粒数检测到 2 个q t l s ，解释性状表型变异的9 6 和1 6 9 ；千粒重检测到2 个q t l s ，解释 性状表型变异的2 6 * 0 和1 3 7 ；单株有效角果总数检测到1 1 个q t l s ，解释性状 表型变异的1 4 8 4 7 2 ；单株产量检测到1 1 个q t l s ，解释性状表型变异的 1 4 3 3 2 8 。 此外，还对g u s 表达，启动子效率、遗传图距及影响因素、q t l 定位的精确 度等进行了讨论。 关键词：甘蓝型油菜；启动子；克隆；q t l ；农艺性状 c l o n i n go f t h en a p i ng e n ep r o m o t e ra n dp r e l i m i n a r yq t l o f s o m ea g r o n o m i c a l i m p o r tt r a i t si nb r a s s i c an a p u s g a ob i j u n ( g e n e t i c sa n db r e e d i n go fc r o p ) d i r e c t e db yl ip i n g a b s t r a c t r a p e s e e di so n eo ft h em o s ti m p o r t a n to i lc r o p s i ti sp l a n t e da l lo v e rt h ew o r l d e x c e p ti naf e wa r e a $ o fa f r i c a i n c r e a s i n gr a p e s e e de c o n o m i c a lv a l u en e e d st h e i m p r o v e m e n to fp l a n tv a r i e t yo fr a p e s e e da tf i r s t ，w h i l et h ei m p r o v e m e n ti se m b o d i e d i nt h et w oa s p e c t so fq u a l i t ya n dy i e l do fr a p e s e e d s i nt h ea s p e c to fq u a l i t y i m p r o v e m e n to fr a p e s e e d s ，o n eo ft h ee f f e c t i v ew a y si st h ea p p l i c a t i o no fg e n e t i c e n g i n e e r i n gi nt h ec h a n g eo fc h e m i c a lc o m p o s i t i o na n di t sc o n t e n t a n do n eo fk e y t e c h n o l o g yi st or e g u l a t et h ee x p r e s s i o no ft h ee x c e l l e n tg e n e t h eg e n er e g u l a t i o no f t h eh i g h e rp l a n tm a i n l yh a p p e n si nt h et r a _ n s c d p t i o nl e v e la n di sa f f e c t e db yt h e i n t e r a c t i o no fv a r i o u sc i s a c t i n ga n dt r a n s a c t i n gf a c t o r s t h eg e n ep r o m o t e ri s a l l i m p o r t a n tc i s - a c t i n g f a c t o ri np l a n t ad n as e q u e n c ew h i c hi si d e n t i f i e da n d c o m b i n e db yr n ap o l y m a r a s ea n dt h u si n i t i a t i n gt h eg e n et r a n s c r i p t i o n t h e r e f o r e ， t h ec l o n i n ga n dv a l i d a t i n go fo r g a n i cs p e c i f i cp r o m o t e ri nr a p e s e e di sa ni m p o r t a n t t a s k i nt h ei m p r o v e m e n to ft h er a p e s e e dy i e l d ，i ti so fp o s i t i v ea n dp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c et om a k er e s e a r c ho nt h e s eq u a n t i t a t i v et r a i tl o c i ( q t l ) i nt h ep o s i t i o no f t h er a p e s e e dg e n o m ea n di t se x t e n to fi n f l u e n c eo nt h ep h e n o t y p e ，b e c a u s et h e r a p e s e e dy i e l da n dt h em a n yo t h e ry i e l d - r e l a t e da g r o n o m i ct r a i t sa r em a n i f e s t e da s m i n o rg e n e sc o n t r o l l e dq u a n t i t a t i v ei n h e r i t a n c e 。i nr e c e n ty e a r a l o n gw i t ht h e d e v e l o p m e n to fq u a n t i t a t i v eg e n e t i c s a n dm o d e r nb i o t e c h n o l o g y , t h ec o m p l e x q u a n t i t a t i v et r a i t sc o u l db es e p a r a t e dt om a n yi n d e p e n d e n tm e n d e l i a nf a c t o r sb yd n a m o l e c u l a rm a r k e ra n dq t lm a p p i n ga n dd e t e r m i n ei t sp o s i t i o ni ng e n o m ea n di t s e f f e c t m e a n w h i l e ，t h ea p p l i c a t i o no ft e c h n i q u e ss u c ha sm a s ，仃a n s g e n e ，e t c m a k e s i tp o s s i b l et of u r t h e ri m p r o v et h er a p e s e e d s 1 c l o n i n go f t h ep r o m o t e ro f g e n en a p i ni nb r a s s i c an a p u s n a p i n ，av a r i e t yo fs e e ds t o r a g e p r o t e i ne n c o d e db ym u l t i g e n e ，e x i s t sw i d e l yi n s e e do fb r a s s i c as p e c i e s ，o c c u p y i n g2 0 3 0 o ft o t a lp r o t e i ni ns e e d i nt h ea f f e c t o f a b a ，n a p i ng e n ei st i s s u e s p e c i f i c a l l ye x p r e s s e d a p a i ro fp r i m e r sw a sd e s i g n e da c c o r d i n gt o5 n o n e n c o d i n gr e g i o no ft h en a p a s e q u e n c er e p o r t e di ng c n b a n k w i t ha st h eg e n o m i cd n ao fb r a s s i c an a p u s “z h o n g s h u a n g4h a o ”a st h et e m p l a t e ，t h ea m p l i f i e dp r o d u c t sb yp c r w a sc l o n e di n t o p m d l 8 一tv e c t o ra n ds e q u e n c e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h ec l o n e df r a g m e n tc o n t a i n e d 11 5 9 b p t h r o u g ha n a l y s i s t h ef r a g m e n th a do n l yaf e wn u c l e o t i d e sd i f f e r e n c e s 诵t h t h er e p o r t e dn a p a a n dh a dh i g hh o m o l o g yw i mt h eo t h e rr e p o r t e dn a p i ng e n e p r o m o t e r ，t o o t h ef r a g m e n ti sr i c hi na tn u c l e o t i d e s ，州t ht h es e q u e n c ef e a t u r e so f h i g h e rp l a n t ， s u c ha st a t a - b o x ，c a a t - b o x ，g b o x ，a n dg a t a b o x f u r t h e r m o r e ，t 0i n v e s t i g a t e t h et i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o nf u n c t i o no ft h en a p i ng e n ep r o m o t e r , t h ef r a g m e n tw a s i n s e r t e di n t op c a m b i a 1 3 0 1v e c t o r , mp l a c eo f t h ep r o m o t e rc a m v 3 3 si nt h eu p p e r s t r e a mo fg u si np c a m b i a - 13 0 1v e c t o r , a n dt h eg u sg e n ee x p r e s s i n gv e c t o ro f p c 13 0 1 nw a sc o n s t r u c t e d t h er e c o m b i n e dv e c t o rw a st r a n s f o r m e di n t o a g r o b a c t e r i u ml b a 4 4 0 4 t h eb r a s s i c an a p u ss e e d sv i aa b ai n d u c e m e n tw e r e i n f e c t e db yp c l 3 0 1 n l b 4 4 0 4 ，a n dt h e nw e r ed y e db yg u s t h er e s u l tp r o v e dt h a t t h en a p i ng e n ep r o m o t e rw a ss e e ds p e c i f i c a l l ye x p e s s e d 2 p r e l i m i n e r yq t l o f s o m ea g r o n o m i c a l l yi m p o r tt r a i t si nb r a s s i c an a p u s r i lp o p u l a t i o nw a sc o n s t r u c t e du s i n gt h ef ld e s c e n d a n t so f c o m b i n a t i o n z h o n g s h u a n gn o 4 x h 2 2 9c o n s t r u c t e dv i as e v e n t hi n b r e d t h e11a g r o n o m i ct r a i t s ， s u c ha sp l a n th e i g h t ，n o o f e f f e c t i v e1 s tb r a n c h e s ，y i e l dp e rp l a n t ，e t c w e r e i n v e s t i g a t e df r o mp a r e n ta n dr a n d o m1 4 2f sr i lp o p u l a t i o np l a n ts e r i e s t h e c o r r e l a t i o na n a l y s i so f t h e1 1t r a i t si nr i lp o p u l a t i o ns h o w e dt h a tp l a n th e i g h t ，n o o f e f f e c t i v e1 s tb r a n c h e s ，l e n g t ho f m a i ni n f l o r e n s c e n c e ，e f f e c t i v es i l i q u e so f m a i n i n f l o r e n s c e n c e ，d e n s i t yo f m a i ni n f l o r e n s c e n c e ，l e n g t ho f s i l i q u e ，s e e dp e rs i l l i q u c ， 1 0 0 0s e e dw e i g h t ，t o t a le f f e c t i v es i l i q u e sp e rp l a n th a ds i g n i f i c a n tp o s i t i v ec o r r e l a t i o n w i my i e l dp e rp l a n t p o l y m o r p h i s m sb e t w e e nz h o n g s h u a n g n o 4a n dh 2 2 5w a se x a m i n e db ys s r p r i m e r s 1 5 2p r i m e r ss h o w e dp o l y m o r p h i s m s ，a n dal i n k a g em a pc o n t a i n i n g1 2 3 m a r k e r s ，i n c l u d i n g18l i n k a g eg r o u p sw a sc o n s t r u c t e d t h et o t a lg e n e t i cd i s t a n c eo f t h em a pw a s3 4 8 3 1 c m ，a n dt h ea v e r a g ed i s t a n c eo f t w oa d j a c e n tm a r k e r sw a s 2 8 3 2 c m t h ed i s t r i b u t i o no f m a r k e ri n1 8l i n k a g eg r o u p sw a sn o te v e n m e a n w h i l e ， t h ef i r s t ，t w e l f t h ，t h i r t e e n t h ，s e v e n t e e n t hl i n k a g eg r o u p sc o n t a i n e dm o r em a r k s ，w h i l e t h er e s th a df e w e r a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so f t r a i t sm e a nv a r i a n c ea n ds s rd i s c r e p a n c ys i t ui n r i l ，t h ec o n s t r u c t i n go f g e n e t i cm a pa n dq t l c o u l db ep r o c e s s e dp r e l i m i n a r y b u t , t h ea v e r a g eo f t r a i t sw e r en o th o m o g e n e o u si ns o m es o r t ，t h er i ln e e dw a sp u r i f i e d u n c e a s i n g l y t h eg e n e t i cm a pa n dq t l i nt h i sp a p e rh a de r r o ri ns o m es o r t t h e c o m p a r eo f g e n e t i cm a pb e t w e e nl o w e sa n do l l r ss h o w e d2 6h o m o l o g ym a r k e rs i t u , w h i c ho c c u p i e d2 1 1 o f t h em a r k e rs i t ui nt h ee x p e r i m e n t 8 1q t l sw e r ed e t e c t e df o r11a g r o n o m i ct r a i t s 4q t l sw e r ed e t e c t e df o rp l a n t h e i g h t w h i c he x p l a i n e d1 0 3 2 8 9 o ft r a i tv a r i a n c e ；2q t l sw e r ed e t e c t e df o r n o o fe f f e c t i v e1 - s tb r a n c h e s w h i c he x p l a i n e d2 2 1 4 7 o ft r a i tv a r i a n c e ；1 6 q t l sw e r ed e t e c t e df o re f f e c t i v eb r a n c h e sh e i g h t w h i c he x p l a i n e d1 2 2 5 1 8 o f t r a i tv a r i a n c e ；15q t l sw e r ed e t e c t e df o rl e n g t ho fm a i ni n f l o r e n s c e n c e ，w h i c h e x p l a i n e d7 4 2 6 6 o ft r a i tv a r i a n c e ；5q t l sw e r ed e t e c t e df o re f f e c t i v es i l i q u e s o f m a i ni n f l o r e n s c e n c e w h i c he x p l a i n e d1 1 2 2 5 o f t r a i tv a r i a n c e ；1q t l sw e r e d e t e c t e df o rd e n s i t yo f m a i ni n f l o r e n s c e n c e w h i c he x p l a i n e d1 7 3 o f t r a i tv a r i a n c e ； 1 2q t l sw e r ed e t e c t e df o rl e n g t ho fs i l i q u e w h i c he x p l a i n e d2 4 3 6 7 o ft r a i t v a r i a n c e ；2q t l sw e r ed e t e c t e df o rs e e dp e rs i l l i q u e w h i c he x p l a i n e d9 6 a n d 1 6 9 o f t r a i tv a r i a n c e ；2q t l sw e r ed e t e c t e df o r1 0 0 0s e e dw e i g h t w h i c he x p l a i n e d 2 6 1 3 7 o f t r a i tv a r i a n c e ；1 1q t l sw e r ed e t e c t e df o rt o t a le f f e c t i v es i l i q u e sp e r p l a n t , w h i c he x p l a i n e d1 4 8 4 7 2 o f t r a i tv a r i a n c e ；11q t l sw e r ed e t e c t e df o r p l a n th e i g h t , w h i c he x p l a i n e d1 4 3 3 2 8 o f t r a i tv a r i a n c e o nt h eo t h e rh a n d ，i nt h i sp a p e rw ea l s od i s c u s s e do nt h ee x p r e s s i o no fg u s ，t h e e f f i c i e n c yo fp r o m o t e r , t h eg e n e t i cd i s t a n c ea n de f f e c t i v ef a c t o r , p r e c i s i o no fq t l ， e t e k e yw o r d s b r a s s i c an a p u s ；p r o m o t e r ；c l o n i n g ；q t l ；a g r o n o m i ct r a i t 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 慎矽寻 2 雨年6 月誓b 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 导师签名： 荡缈扩7 四年善月砰b 矽矽年月彳日 第一部分甘蓝型油菜n a p i n 基因启动子的克隆 l 文献综述 油菜是一种适应性强、用途广、经济价值高的油料作物，在世界各地除非洲 少数地区以外，几乎都有栽培。我国是世界上油菜生产历史最悠久，种植面积最 广，总产量最多的国家。油菜的经济价值主要体现在菜籽油和菜籽油饼上。菜籽 油营养价值高，含有大量脂肪酸和多种维生素，在人体内易于消化吸收，是广大 人民重要的食用植物油，又是重要的工业原料。菜籽油饼含有3 5 - 4 7 的蛋白质， 以及各种氨基酸、粗脂肪、纤维素、矿物质和多种维生素，除去硫代葡萄糖甙后， 是家畜的优质饲料。同时，菜籽油饼含氮4 6 ，磷2 4 8 ，钾1 4 ，以及其他多 种营养元素，是很好的肥料( 徐润芳，1 9 9 0 ) 。因此，油菜籽化学成分的改良直接 关系到油菜经济价值的进一步提高，而利用基因工程手段来改变油菜种子的各个 化学组成成分及其含量是改良油菜品质的一个重要措施。 其中，基因工程手段的一个重要技术就是调节控制优良基因的表达。生物体 基因调控可以发生在基因转录和翻译的不同阶段，而高等植物基因调控主要是在 转录水平上进行的，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用。植物 基因启动子是重要的顺式作用元件，是r n a 聚合酶识别并与之结合，从而起始 基因转录的一段d n a 序列。植物基因启动子( p r o m o t e r ) 通常仅位于基因上游，能 指导全酶与模板的正确结合，活化r n a 聚合酶，使之具有起始特异性转录的形 式，并决定转录的方向和效率以及所使用的r n a 聚合酶类型，是植物基因转录 调控的中心，是优良基因转录调控和表达的关键( 李杰等，2 0 0 6 ) 。 1 1 高等植物基因启动子的结构特征 启动子作为基因表达调控的一种重要的顺式元件，它具有如下特征：序列 特异性，在启动子的d n a 序列中，通常含有几个保守的序列框，序列框中碱基 的变化会导致转录启动的滞后和转录速度的减慢。方向性，启动子是一种有方 向性的顺式调控元件，在正反两种方向中只有一种具有启动功能。位置特性， 启动子只能位于所启动转录基因的上游或基因内的前端。种属特异性，原核生 物的不同种、属，真核生物的不同组织都具有不同类型的启动予。但一般来说， 亲缘关系越近的两种生物，其启动子通用的可能性也越大( 夏江东等，2 0 0 6 ) 。 高等植物启动子属于i i 型启动子，即m r n a 基因启动子。其所属的基因绝大 多数为编码蛋白质。它一般包括启动子基本区和辅助区两部分。前者包括转录起 始点及邻近的t a t a 框等结构。后者由多个保守序列组成，这些保守序列在不同 的启动子的位置、种类及拷贝数存在较大差异。在转录起始位点上游7 5 b p 处附 近存在一个9 b p 的保守序列，g g t ( c ) c a a t c t ，称为c a a t 框，其功能与r n a 聚 合酶的结合有关。在离起始位点更远的上游1 0 0 b p 3 0 0 b p 位置还存在另一个保 守序列g g g c g g ，又称为g c 框，它与转录因子的结合有关。 1 1 1 转录起始位点 高等植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子( a t g ) 上游4 0 7 0 b p 处。j o s h i 通过对7 9 个高等植物基因启动子区d n a 顺序的比较研究推衍出，植 物a t g 密码旁侧的序列较为保守，常为t 从a c a a t g 0 c t ，基因转录起始的保守 顺序为c t c a t c a ，中间的a 为转录的起始点，编号+ l ( j o s h i ，1 9 8 7 ) 。从基因转录 起始点到翻译起始密码子之间的序列被称为5 端非翻译区，该区的5 端是 m r n a 前体加帽的位点。5 端非翻译区对翻译效率具有调控作用，此外在一些 植物基因的5 端非翻译区中有内含予存在，这些内含子有增强基因表达的作用。 再者，转录起始位点发生变化或缺失都会影响转录。 1 1 2t a t a 框 t a t a 框是第一个被确定的r n a 聚合酶i i 的启动子元件，也是一些反式作用 因子与d n a 相互作用的位点之一。植物启动子t a t a 框是位于转录起始位点上游 3 2 _ 7 b p 处的一段富含a t 碱基对的序列，与动物启动子略有不同，其共通保守序 列为5 7 t 3 7 c 4 2 a 3 8 c 4 7 t 9 6 a 9 7 t g o a 9 4 t 5 3 a 9 5 t 6 3 a 7 1 g 4 33 ( 表1 1 ) ( j o s h i ，1 9 8 7 ) 。t a t a 框依靠与转录因子t fi id 的识别结合而发挥功能，介导决定r n a 聚合酶起始转录 的位点，以及介导前转录复合物的形成并启始转录：同时在一些启动子中该元件 还决定转录的方向，或者介导上下游元件对转录的调控作用。t a t a 框是绝大多 数植物启动子正确启动转录所必需的，不含t a t a 框的基因的精确转录受起始因 子( i n i t i a t o r i n r ) 介导。i n r 元件并无一个十分严格的同源顺序，其中最为关键的核 苷酸是处于+ l 的a 和+ 3 的t 。如果5 a n t 3 ( n 为任意核苷酸) 的两侧+ 4 到+ 5 和- 1 到5 为嘧啶，则成为强的i n r 。i n r 在功能上与t a t a 框类似，常常通过与t f i i 2 d 的结合决定转录起始点的位置起始转录，并能介导上游至少一部分激活因子的 调控作用，与t a t a 框不同，i n r 元件与转录起点重叠。 表1 _ l 几类植物基因中的t a t a 框共通序列( j o s h i ，1 9 8 7 ) t a b l ei - 1c o r l s e n s o ss e q u e n c e so f af e wr e p r e s e n t a t i v eg r o u p so f p l a n tg e n e s 注：下标数字表带该碱基出现的百分翠。 n o t e ：f i g u r ef o l l o w i n gab a s ei sm a x i m u mf r e q u e n c yo f o c c u n n c e 1 1 3 一般上游启动子元件 在真核基因启动子中普遍存在c a a t 框和g c 框两种元件，它们或者同时存 在，或者只存在其中之一，有时还是多拷贝的。但并非所有真核基因的启动子都 存在着一般上游启动子元件，例如在有些植物细胞中几乎不存在c a a t 框。 1 1 3 1c a a t 框 即在t a t a 框上游约5 0 b p 处的一段5 o c ( t c ) c a a t c t 3 顺序，其转录激 活因子是n i l 和c t f 等多种蛋白。c a a t 框具有增强基因转录的作用，对两个方 向都可激活，而且作用距离不定。从转录起始位点到c a a t 框附近这一区域通常 被称为基础启动子。 i , i 3 2g c 框 g c 框通常位于转录起始位点上游约9 0 b p 处，最近位置的g c 框是在起始点 上游4 0 - 7 0 b p 处，它可以处于t a t a 框与c a a t 框之间，也可位于c a a t 框上游， 位置因基因而异。其保守序列为5 g g c _ r c g g3 ，可有多个拷贝，并能以任何方 向存在而不影响其功能。g c 框须与另一种特异的转录因子s p l 结合才能促进基因 转录( 李杰，2 0 0 6 ) 。 1 1 3 3 特有的上游元件 植物启动子的顺式元件除了上述共有的保守碱基序列外，不同来源的启动子 还通常具有种属特异的或者仅局限于某种基因家族特有的调节基序。 g 框：其共通序列为5 c a c g t g3 ，是高度保守而且也是研究最清楚的植物 型转录元件之一。它需要与另一个顺式作用元件( i i i ) 结合，在细胞接受外界信 号时对转录起始的频度起调节作用( m a r y 等，1 9 9 2 ) 。这种机制可能是通过g 盒 及其结合蛋白相互作用产生一个内部环境，使另外的调节蛋白与启动子区域有效 结合，允许细胞准确而有选择地起始转录( 王颖等，2 0 0 3 ) 。 醇溶谷蛋白框：保守序列为 5 。a c a t g t g t a a a g g t g a a t g n a g a t g t g c a t t a t3 ( 小写字母表示出现概率占 优的碱基，n 为任意碱基) ，位于3 0 0 b p 区，但醇溶谷蛋白基因只在内胚乳表达( w u 等，2 0 0 0 ) 。 豆球蛋白框：保守序列为5 t c c a l 隗g c c a t g c a t g c t g a a g a 觚a t c3 ， 该序列指导成熟种子的特异表达，具一种数量调节的特性。 根瘤框：5 。a t c c a a a c aa ：r c aa t t t t a c c a a t c3 。 热激蛋白框：5 c t n g a a n n t t c n a g3 。、 厌氧反应框：5 c g g t t r - t g g t t t3 。 愈伤反应框：5 t t g g t t g a a a t a g t a t a g t a t a a t a g a t t a t g a 3 ( 刘良式， 1 9 9 8 ) 。 1 2 植物启动子的类型 按其作用方式及功能，可将植物基因工程中常用的启动子分为3 类，即组成 型启动子、组织特异型启动子和诱导型启动子。这种分类大体上反映了它们各自 的特点，但在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。 1 2 1 组成型启动子 组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达具有持续性，不表现时空 特异性；r n a 和蛋白质表达量也相对恒定。目前使用最广泛的组成型启动子是 花椰菜花叶病毒的国m 船启动子、来自根癌农杆菌t i 质粒t - d n a 区域的胭脂碱 合成酶基因n o s 启动子和章鱼碱合成酶基因o c s 启动子；后者虽然来自细菌，但 4 具有植物启动子的特性。 此外，人们也从植物自身克隆组成型启动子以进行应用，并初见成效，例如 从水稻和玉米中分别克隆了肌动蛋1 1 1 ( m c e l r o y 等，1 9 9 0 ) 和泛素( c h r i s t e n s e n 等， 1 9 9 2 ) 基因的启动子，并用这些启动子代替c a m v 3 5 s 启动予，可以更有效地在单 子叶植物中驱动外源基因的表达。n a o m i 等( 2 0 0 2 ) 分别从拟南芥的色氨酸合酶1 3 亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应的启动子，用其代替c a m v 3 船启动 子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果。 但是由于组成型启动子会使驱动的目的基因在植物各组织中恒定而持续的 表达，过度消耗细胞内的物质和能量，不能从时间和空间上有效地调控目的基因 的表达，因此在应用中存在一定的缺陷( g i t t i n s 等，2 0 0 0 ) 。如外源基因在整株植 物中表达，产生的大量异源蛋白质或代谢产物在植物体内积累，打破了植物原有 的代谢平衡，不利于产量和品质的提高；有些产物对植物并非必需甚至有毒，因 而阻碍了植物的正常生长，甚至导致死亡。如利用组成型启动予表达病毒衣壳蛋 白，就可能会引起病毒农壳转移，从而导致植物病毒新株系的产生( r o b i n s o n 等， 1 9 9 6 ) 。另外，重复使用同一种组成型启动子驱动2 个或2 个以上的外源基因表达 可能会引起基因沉默或共抑制现象( k u m p a t l a 等，1 9 9 8 ) 。因此，人们在寻找更为 有效的组织、器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因表达。 1 2 2 组织特异型启动子 组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或 组织中，并往往表现出发育调节的特性。目前对组织特异性启动子的调控机制已 进行了深入的研究，发现这类启动子