（植物病理学专业论文）苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究及应用.pdf

摘要苏云金芽孢转鼗( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ，b t ) 产生的s - 内毒案( 或杀虫鑫俗嚣自) 对多个目的害虫具有杀虫活性，其独特的优点在农林害嫩的生物防治中得到了广泛的戚用。鉴定编码杀虫晶体蛋白的基因( c r y 基因) ，对于发现、分离、克隆特异活性的新基因以及转基因植物和擞生物等醣究都其露鬟要意义。传统的b t 孓肉毒索基因鉴定方法主要是建立谯p c r 基础之点懿，由于鑫身蒸有局限性，此粪方法已不能适威商通量、大规模、迅速、平行等基因组研究方面的要求，因而目前迫切需要应用一种新的检测方法以适应基因组研究的要求。麓毽芯冀技术怒避年来发震起寐熬基嚣组磁瓷技寒。理基轰明宅是在基霾缓勰摸上疆究基医表遮和调控的一种强有力的研究王具，同时也怒艨核和真棱生物功能基因硷鞭与多态性研究的极好方法。虽然人们对基因芯片控术进行了深入的研究，但是目前尚无应用寡核苷酸探针在不进行定向扩增条 牛下直接检测总d n a 中功能基闼的相关报导。举磅突孛，建立了盛爱寡孩萤羧葱冀捡溅慧d n a 中c r y 慧迸费方法；程癍嗣魏方法与生物信息学的基础上，构建并应用了c r y l 、c r y 2 、c r y 9 基因检潞蕊片。其主要研究结果如下：1b tc r y 基因检测芯片关键技术研究邋过对基因芯片中探针长度、浓度、总d n a 的含量与处理、标记方法、灵敏度和杂交条箨懿磷究表秘，瘸蹇浓整k l e n o w 懿簸辊标记裹浓嶷静慧d n a 与舞孩营酸探铮( 4 0 - 5 0 m e r 、4 0ht o o l l 。1 ) 杂交可用于检测b t 菌株中含有的c r y 熬因，从而建藏了一种不经p c r 扩增而直接应用糍核苷酸芯片从苏云金芽孢轩菌总d n a 中梭测c r y 基因的方法。研究表明，不劂长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性蓑异( p o 0 1 ) ，衙不同浓度的搽针之闼没毒显著魏差异。嚣方法熬其它条昝凳条交溢度鸵、瓣蠢3 毒露；捡淘弱徉品慧d n a 的灵敏度约为2 5 p g ；标记产物杂交用量( o 6 2 5t o2 0 pg ) 的对数值与信号德的对数值之间存在潜明显的线性笑系( ，= 09 8 5t 。0 9 8 9 ) 。2 生物信息学程c r y 基因芯片梭溯中的应用针对在线b l a s t 匏不琵，建藏了b tc r y 萋嚣援营酸痔蠢本臻数据痒，势凌诧基礁主进行寡核督酸探针的本地b l a s t 以确保其特异性。邋谶与在线b l a s t 比较，本地b l a s t 在准确性、冗余信息的去除以及使用简便性等方面要优予在线b l a s t 。攒挺b t6 内霉索基因骇萤酸_ l 警捌豹同源性荧系，充分应用生糖信息学方法设计了用于c r y l ，c r y 2 ，c r y 9 蕊裁梭灏酶囊棱荣酸分缀搽锌。3c r y l 、c r y 2 和c r y 9 基因检铡芯片的制各与皮用制各了c r y l 、c r y 2 和c r y 9 基因检测芯片并分析了8 个苏云金芽孢杆菌菌株的基因型。结果表明，寡棱萤酸芯靖检测结果与已知麓撩的基因型嘲台，与未知慕因型的菌株她p c r - r f l p 初步簦寇结果逢寿禳离的一致往。关键词：苏云金芽孢杆菌，c r y 基因，寡核苷酸芯片，高浓度k l e n o w ，生物信息学a b s t r a c td e l t a e n d o t o x i n s ( 8 - e n d o t o x i n ，o ri n s e c t i c i d a lc r y s t a lp r o t e i n s ，i c p s ) f r o mb a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ( b t ) a r et o x i ct oi n s e c tp e s t so fm a n yo r d e r sa n dg r e a tb i o c o n t r o lr 锱o u r e e sa g a i n s tn a t u r a lp e s t s 。i d e m i f t c a t i o no fc r yg e n e se n c o d i n gi c p si so fg r e a ts i g n i f i c a n c et ot h ed i s c o v e r y ,c l o n i n go f n o v e lg e n e sw i t hs p e c i f i cb i o a c t i v i t ya n dr e s e a r c ho f t r a n s g e n i c # a n t sa n dm i c r o b e c u r r e n tm e t h o d sf o ri d e n t i f i n gd e t t a - e n d o t o x i u sg e n e sf r o mb t ，e s p e c i a l l yp c r - b a s e dm e t h o d ，a r ec u m b e r s o m e r a p i d ，p a r a l l e la n dh i g h - t h r o u g h p u tt o o l st h a tc a l la d a p tt ot h ee r ao fg e n o m ea r en e e d e dm i c r o a r r a y , ar e c e n t l yd e v e l o p e dg e n o m i ct e c h n o l o g yh a sb e e ns h o w nt 。沁ap o w e r f u lt o o lf o rs t u d y i n go fg o n ee x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no nag e n o m i es c a l ea n dd e t e c t i n gf u n c t i o ng e n e so rg e n e t i cp o l y m o r p h i s m si nb o t he u k u r y o t e sa n dp r o k a r y o t e s h o w e v e r , t h e r ei sn or e p o r ta b o u tu s i n go l i g o n u c l e o f i d ep r o b e sd i r e c t l yt od e t e c tf u n c t i o n a lg e n e sw i t h o u tp c ri nt o t a ld n as a m p l e s i nt h i ss t u d y , t h em e t h o du s i n go l i g o n u c l e o t i d em i c r o a r r a yt od e t e c tc r yg e n e sf r o mt o t a ld n ao fb tw a ss t u d i e d a f t e rt h eb i o i n f o r m a t i c sw a sa p p l i e d ，t h ed e t e c t i o nm i o r o a r r a yo f c r y t 、c r y 2 、c r y 9g e n e sh a sb e e nc o n s 垃u c t e da n dt e s t e d1 t h e k e y t e c h n i q u e s o f b t c r y g e n e s d e t e c t i o n m i c r o a r r a ya f t e rt h ek e yp a r a m e t e r ss u c ha st h el e n g t ha n dt h ee o n c e n l r a t i o no fp r o b e s ，l a b e l i n g ，s a m p l e s ，s e n s i t i v i t ya n dh y b r i d i z a t i o nw e r es t u d i e d , an e wa n df e a s i b l ea p p r o a c h , w h i c hc o u l di d e n t i f yc r yg e n e sf r o mt o t a ld n ao fb a c t h u st h u r i n g i e n s i ss t r a t u sb u tn o n a m p l i f i e db a s e do no l i g o n u c l e o t i d em i o r o a r r a yh y b r i d i z a t i o nh a db e e ne s t a b l i s h e da n di n v o l v e df l u o r e s c e n tl a b e l i n gf o rh i g hc o n c e n 订a f i o no ft o t a ld n au s i n gh i g hc o n e e n 奸a f i o nk l e n o wf r a g m e n t , a n dh y b r i d i z a t i o n 如t h eo l i g o n u c l e c t i d ep r o b e s ( 4 0 - 5 0m e t , 4 0 “m o l l “) s p e c i f i cf o re a c hc r yg e n e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t yd i f f e r e n c ea m o n gt h el e n g t ho fp r o b e sf f ，m c 旗幽g 0 3c r y l a a 和c r y l a c 等基因c e * 5 6 2c r y l a a 、c r y l a b 和c r y l a c 等基毽培养基蠢l b 液体培养萋：胰蛋内胨l o g酵母摄取物5 9氯诧獭log水定溶至1 0 0 0 m ip h7 21 5 磅灭凿2 0 分钟。2 1 。1 4 苏云垒棼搀赣蓥慧d n a 豹提驳( n a r v a k c r m c t h e + e t 蕊，1 9 9 0 与冀段纯誓。萨薅毒蛰糍等2 0 0 2 )b t 菌株在l b 液体培养熬中3 0 c 活化谶栈，按1 接种餐转接于l b 液体培养基，3 7 c ，2 3 0 r m i n ，4 h r ( o d 6 0 0 豹为2 o ) ，离心收集落髂：每1 0 0 m l 藩终魏入3m l 溶液 ，悬浮蘸髂，3 7 cl 2 h ：加入2 7m l 溶液i l ，轻轻混匀，反复凉融至透明；苯酚：氯仿：异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽提2 次，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提1 次上溏加入1 1 0 体积3m o l l 。n a a c ( 髑冰乙教调至p h 5 2 ) ，用2 倍体撰无农z 。醇沉淀，离心，嚣淀瘸7 0 乙醇洗2 次，无东乙醇浚1 次，真空糖干翱余滚俸，滚淀用超缝永溶躲。d n a 溶液在0 7 琼脂耱凝胶上电泳( s v e m ) 检测并用紫外分光定爨仪定量。将b t 菌株的高浓度总d n a 超声仪裂解：s o n i e s ( v i b r a c e t l ) 超声搜参数设置为；- 1 7 ! 旦农业科学院硕士学位论文第= 章b tc r y 熬因检测芯片关键技术研究能量1 9 每次缝理5 s e c间隔5 s e e共2 次躐用j y 9 2 ，2 d ( 宁渡新芝) 超声断裂仪处理，参数舞：能最5 0 w每次处理6 s闯隔2 s共3 次麓声处理对要将样品管嬲邈媛球包铉，处理蔗魏产物在3 0 0 2 0 0 0 b p 莲盈形成一条弥教的带，并在o7 潞寐脂糖凝胶上电泳( 5 v l c m ) 检测。2 1 1 5 检测探针的设计与合成2l ，1 5 ，l 寡棱替酸探锌的设诗与台成从n c b i ( 女触：幽黜d 处i 趔舆画b g q 蚓) 下载c r y 基因序列，在b i o e d i t 中建立本地序列数据摩。应用a r r a yd e s i g n e r2 0 对经过比对获褥的序列设计寡棱替酸探针( h t t p ：w w w p r e m i e r b i o s o r , e o m ) ，探针t m 为鼬5 ，长璇在4 0 5 0 m e r 。在b i o e d i t 中对所得到的探针进行本地b l a s t ( h a l l ，t a 1 9 9 9 ) ，选择特异性高的探针( 相似性ev a l u e 小于l e 1 0 ，特嚣饿s c o r e 大予7 0 ) 。戈了比较寡棱蛰酸攘针长发对杂交结浆熬影响，设计了l l 撩针，用于检测c r y l a c 基囡，其体结聚冤隶2 1 。寡核苷酸探针或引物采用标准亚磷酰胺化学方法在d n a 自动台成仪上合成。成完毕用浓氨水5 5 。e 佟掰1 5 夺对脱绦护，轫害l ，o p c 拄纯饿。鸯定攘铃在3 端班蘸基掺薄，鲺基与探针序剐之闯以间隔臀( s p a c e r ，聚乙二酵擞磷酰胺试剩) 耜连。2l ，1 5 2p c r 产物探针的制备参考宋福平等方法台藏一瓣弓l 穆k s u r d ：5 - a g g a c c a g q 疆强c a o 始奄g - 3 ，耧k 3 u n 2 ：5 - g c t g t g a c a c g 从g g 删w i a g c c a c _ 3 ( 宋福平等，1 9 9 8 ) 。以b th i ) 。7 3 菌株总d n a 为模板，扩增c r y t a c 基因片段，大小为1 6 k b 。反应体系如下：1 0 x p c r 缓；串液l o 涎2 0 r e t o o l l 1m g c l 26 m1 0 r e t o o l l 1d n t p2 m1 0 p a n o l l - 5k 5 u n 22 溅1 0 p m o l l 。1k 3 u n 22 9 td n a 模板o + i 。2 r i gt a q 酶l 撼超缄超滋量总体积t00mp c r 扩增彼( p t c - 1 0 0 t mp r o g r a m m a b l et h e r m a lc o n t r o l l e r , m j r e s e a e hl 晒参数设鬣如下：a 颓变性9 4 。c5 m i n一 s 。中国农业科学院硕士学位论文第二章b t c r y 基因检测芯片关键技术研究b3 2 个循环，程序为：9 4 ( 2 变性l m i n52退火lmin7 2 c 延伸3 m i nc7 2 ( 2 延伸1 0 m i nd 4 保存p c r 产物在07 琼脂糖凝胶上电泳( 5 v c m ) 检测并用紫外分光定量仪定量，9 4 ( 2 变性5 m i n 并迅速放置于冰上，使之保持为单链状态以备用。2l 16 芯片制作将寡核苷酸探针与点样液( 3 s s c ，o 0 1 s d s ) 1 ：1 混合稀释至终浓度为4 0 舭o l l ，将经过变性的p c r 产物与点样液混合稀释至终浓度为3 0 0 n g z 皿，取这些混合液5u l 转移至3 8 4 孔板，用芯片点样仪打印至醛基化玻片上，每点体积约为o 5n l ，点心间距为5 0 0 岫，点直径约为2 0 0l a i n ，每条探针在一个区域内重复打印4 次。点样时保持湿度9 0 ，温度2 3 。c 。点样后的芯片置于6 0 m j g i n 强度进行紫外交联( t l 2 0 0 0 紫外交联仪u l t r a 0 l e t ) 后室温放置至少2 4 h 。2 l l7 荧光样品的制备2l l7 l 荧光p c r 扩增产物的制各参考宋福平等方法合成两对引物k s u n 2 k 3 t m 2 和k s u n 3 k 3 u r d ( 宋福平等，1 9 9 8 ) ，以b tc e r 5 6 2 菌株总d n a 为模板，不对称p c r 扩增c r y l 类基因，大小分别为l6 k b 和l4 k b 。反应体系如下：1 0 p c r 缓冲液5 山2 0 r e t o o l l 1 1m g c l 23 u l1 0 r e t o o l l 4d n t p1 “l2 m o l l - 15 引物l 山2 0 p m o l l 13 引物l u ld n a 模板0 2 “l ，0l m m o l l 。c y 3 一d u t p2 “taq酶05山超纯壅适量总体积5 0 山p c r 扩增仪参数设置如下：a 预变性9 4 0 c5r a mb3 2 个循环，程序为9 4 变性5 2 。c 退火7 2 ( 2 延伸c7 2 ( 2 延伸l m i nl m i n3 m i n1 0 m i n中国农业科学院硕士学位论文第二章b tc r y 基因检钡j 芯片关键技术研究d 4 保存21 172 末端转移酶( t d t ) 末端标记样品的制各( t u ，c a n dc o h e n ，e ta 1 ，1 9 8 0 )5 b u f f e r3u l超声波处理过的总d n a适量3 0 u 止4t d tl 山1 m m o l l 。1c y 3 或c y 5 - d u t pl 山趋纯丞适量总体积1 5 山3 7 c 反应2 h 后，沸水浴1 0 m i n 灭活t d t 酶并变性，然后迅速置于冰上冷却备用。2 1 1 7 3k l e n o w 酶随机引物标记样品的制各( h t t p ：c m g r n s t a n f o r d e d u p b r o w n )将经紫外分光定量仪定量的b t 总d n a 用不同浓度k l e n o w 酶进行随机引物标记。反应体系如下：1 0 反应缓冲液5 m总d n a适量3 p g u l l 六聚体随机引物( i n v r r o g i n )5 山超纯盘适量沸水浴5 m i n迅速置于冰上，然后加入：1 0 d n t p m i x5 m( d a t p 、d g t p 和d c t p 各12 m m o l l - 1 ，d t t p 0 6 m m o l l - )l m m o l l 。1c y 3 或c y 5 - d u t p3 山k l e n o w 聚合酶( n e b )1 0 1超缠丞适量总体积5 0 山3 7 反应2 h 后，沸水浴1 0m i n 灭活k l e n o w 酶并变性，然后迅速置于冰上冷却( 如果是用c y 3 或c y 5 - d c t p 标记，相应地调整d n t p m i x ) 。或用b i o p r i m e l a b e l i n g k i t ( g i b e o b e m ) ( h t t p ：c m g m s t a n f o r d e d u p b r o w n ) ，反应体系如下：2 5 r a n d o mp r i m e r r e a c t i o nb u f f e rm i x2 0 0 1总d n a适量3 l a g “l 。六聚体随机i 物( i n v i t r o g i n )l 山超纯拯适量沸水浴5 m i n迅速置于冰上，然后加入：1 0 d n t p m i x5 山( d a t p 、d g t p 和d c t p 各1 2 m m o l l ，d 1 t p 0 6 m m o l l 。1 )i m m o l l - 1c y 3 或c y 5 - d u t p3 0 1k l e n o w 聚台酶l 山2 0 中国农业科学院硕士学位论文第= 章b tc 基因检测芯片关键技术研究嫠筑盛运藏总体积5 0 m3 7 c 爱应2 h 聪，涕零漆1 0m i n 旋活k l e n o w 酶著燮牲，然舞迅速耄乎球主冷箱( 翔采是用c y 3 或c y 5 d c t p 标记，相应地调懿d n t pm i x ) 。取2 啦在o ，7 壕嚣糖凝腔电泳糗潮并弱螽风荧光搦掘仪分辑标记效粜。2 1l7 4d o p - p c r 标记样鼯的制各( v i v a ng “a 1 9 9 6 )参考文献挠料舍藏荧光d e g e n o r a t e x lo l i g o n u c l c o t i d ep r i m e r ( d o p ) ：c y 3 一c c g a c t c gag 1 心n q n a t 甜g g 。发应体系如下：1 0 p c r 缓冲液5 m2 0 r e t o o l l 1m g c l 23 蠢1 0 n u n o l l 1d n t pl l1 0 b t m o l o d o p3 懑模板0 2 mt a q 酶l 蝴避缝丞透燕总体积5 0 mp c r 扩增便雾鼗设鹭翻下：a 预变性9 4 。c1 0 m i n8 1 0 个镶鼙：9 4 c 鼗性l m i n3 0 遐火1 5m i n02 s e e 从3 0 到7 2 。c 延伸3m i nc 1 0 个缎环：9 4 c 交性l 礅i n6 2 邋火l m i n0 2 s e c 麸6 2 劐7 2 | 。筵姊3r a i nd l o 个循环9 4 。c 变性l m i n6 2 c 溅火l m i no2 s e e 从6 2 剑7 2 c 延伸5m i ne l o 个循环9 4 c 燮性l m i n6 2 邋火l r a i n02 s e c 从6 2 到7 2 延伸7v a i nf 1 0 个缀弼=7 2 c 嫩伸1 0r a i ng 4 c保存- 2 1 中国农业科学院硕士学位论文第二章b tc r y 基因检测芯片关键技术研究p c r 产物在o 7 琼脂糖凝胶上电泳( 5 v e r a ) 检测并用紫外分光定量仪定量，沸水浴1 0m i n变性，然后迅速置于冰上冷却使之保持为单链状态以备用。21 1 8 杂交与洗涤芯片先用预杂交液( 同杂交液) 室温预杂交1 h ；将荧光标记产物与杂交液( 5 0 甲酰胺，5 d e n h a r d t 液，6 s s c ，0 5 s d s 及1 0 0 飕m l 。-鲑鱼精d n a ) 按2 ：6 混合；将混合液转移至芯片的杂交区域：芯片置于杂交盒中在4 2 。c 水浴中保温2 3 h ；杂交后的芯片用洗液a ( i s s c ，o2 s d s ) 洗涤l m i n ；洗液b ( o2 s s c ) 洗涤l m i n ；洗液c ( o 1 x s s c ) 洗涤l m i n ；芯片洗后用离心机甩干。为了比较温度对杂交的影响，使用了去除了甲酰胺的杂交液，其余成份均与原杂交液相同，杂交的高严谨度为5 4 。2 ll9 芯片扫描与数据分析杂交洗涤甩干后的芯片用激光共聚焦扫描仪g e r t e p i x4 0 0 0 ( a x o ni n s t r u m e n t ) 在激发波长5 3 0 n m ，检测波长分别为5 8 5t i m ( c y 3 ) 和6 5 0 n m ( c y s ) ，p m t 为6 0 0 - 8 0 0 ，p o w e r 为3 3 1 0 0 扫描。产生并分析精度为1 0 p r o 的1 6 位t i f f 图像。以信号值高于背景值两倍以上的为杂交信号，在扣除背景值后信号强度以每条探针重复点的均值计算。2 12 结果2l2l 用于c r y 基因检测的寡核苷酸探针与引物依照生物信息学方法设计的寡核苷酸探针共有8 条，p c r 引物共2 对。其中探针l a 用于c r y a 基因的检测；探针1 a a 、探针1 a c 分别用于c r y l a a 和c r y l a c 基因的检测；探针l l 用于c r y a c 基因的检测；探针1 1 、探针1 - 2 、探针1 3 、探针1 - 4 均用于c r y l 类基因的检测：引物k 5 u n 2 k 3 u n 2 和k 5 u n 3 k 3 u r d 用于c r y l 类基因的扩增。具体序列、长度、t m 和o c 含量如下表所示。所有的寡核苷酸探针序列均经过b l a s t 比对以确保其特异性。：苎查些跫兰氅墨圭竺竺兰吝兰三耋2 = = ：兰量竺翌叠兰茎兰墓娄竺耋21 2 2 荧光样品的制各2 1 2 2 1p c r 产锈静索l 备以k 5 u r d k 3 u n 2 为引物，以l i d - 7 3 为模板扩增c r y l a c 作为探针备用，大小为1 6 k b ；以k 5 t m 2 k 3 u n 2 、k 5 u n 3 k 3 u n 3 势 | 物，以c e r 5 6 2 为模投扩增c r y l 类基毅，同时进行荧光橛记。k 5 u n 2 k 3 u n 2 的扩增产物如下图所承：1mm ：d g i 盘0 0 01 ：p c r 产物( c e r 5 6 2 )图2 - 1 域k 5 u n 2 9 k 3 t m 2 为s l 特辩扩增产毒舞f i g2 - 1t h ep c rp r o d u c to f k s u n 2 k 3 u r d i m e r21 2 2 2 寒端转移酶( t d t ) 末端爱党标记榉晶舞隶l 嚣经优化合适的参数，使用超声波断裂仪将总d n a 进行片段化，太小在3 0 0 2 0 0 0 b p 友右。嬲 d tj l 童超声渡鲶理过熬枣等量豹慧d n a 进行荧光标记，霜囊风扫籀仪分辑据记效果e2 3 中国农业科学院硕士学位论文第二章b tc r y 基困检测芯片关键技术研究m123m ；d o l 2 0 0 01 ：总d n a2 ：超声处理过的总d n a3 ；t d t 标记产物荧光扫描图2 - 2 用t d t 标记经超声波处理的总d n a 及标记效果f i g2 - 2 t h e t o t a l d n a t r e a t e d b ys o n i c a t i o n a n d l a b e l w i t h t d t2 122 3k i c n o w 酶随机引物荧光标记样品的制备对于普通k l o n o w 酶和高浓度k l e n o w 酶介导的随机引物法，对要预标记的样品作了不同的处理，如使用不同量的总d n a 、对总d n a 进行超声波断裂。优化反应条件使产物大小分布在合适的范围内，经过台风扫描仪分析标记效果。经过比较两种酶的标记效果发现，普通k l e l l o w酶对高浓度的总d n a 不能很好地随机片段化，标记效果也不如高浓度的k l e n o w 酶；另外，在经过优化随机引物量发现，在使用随机引物标记时，是否用超声波断裂总d n a 对标记没有显著的影响，这是由于在荧光标记的同时，随机引物对总d n a 也进行了片段化。下图为高浓度k l c n o w 酶对总d n a 的随机标记电泳及荧光扫描图。12m3m ：d g l 2 0 0 01 ：总d n a2 ：随机引物标记产物3 ：随机引韧标记产物荧光扫描圈2 - 3 甩k l e n o w 随机引物标记总d n a 殛效果f i g ) - 3 t h e t o t a l d n a l a b e l w i t h k l e n o w a n d i t s e f f e c t- “一中国农业科学院硕士学位论文第二章b tc r y 基因检测芯片关键技术研究2 1 - 2 24d o p p c r 荧光标记样品的制备在理论上，使用d o p p c r 方法可以对总d n a 进行无偏性地扩增，由于d o p 的3 端为基因组中出现频率最高的6 个碱基，中间为随机的6 个n ，所以d o p 在总d n a 上有许多的结合位点，不同结合位点之间的长度不同从而使d o p - p c r 的产物是一条弥散的带。在本实验中，为提高荧光标记效果，d o p 的5 端被加上了一个荧光分子，这样所有的扩增产物上都会被标记一i - 荧光。下图为d o p p c r 荧光标记样品电泳及荧光扫描图。ml23m ：d g l 2 0 0 01 ：空白对照2 ：d o p - p c r 标记产物3 ：d o i 冲c r 标记产物荧光扫描囝2 - 4d o p - p c r 荧光标记样品及效果f 培2 - 4t h es a m p l ea n de f f e c to f l a b e lu s i n gd o p - p c r从实验结果可以看出，由于在标记时使用的荧光物是过量的，所以在分析标记效果时，大部分的荧光分子位于标记产物的前端( 图中颜色较深部分) 。但是不同的标记方法均成功地对目的物进行了荧光标记( 荧光扫描图中颜色较深部分) ，不同的标记方法的效果不同，随机引物法要优于t d t 介导的末端加尾法及d o p - p c r 介导的荧光掺入法。2 12 3 芯片杂交结果21 231 荧光p c r 扩增产物、d o p p c r 标记样品与寡核苷酸芯片杂交结果将经不对称p c r 得到的荧光标记产物和杂交液混合后与寡核苷酸芯片杂交，结果发现：只有1 a a 和1 - 3 两种探针出现了非常强的杂交信号，而其余探针如1 a 、l - 2 、l - 4 等则没有出现信号。而经过p c r - r f l p 鉴定，c e r 5 6 2 菌株中含有c r y l a a 、c r y l a b 和c r y l a c 等基因。即通过p c r扩增并标记靶片段进行芯片检测c r y 基因并没有达到预期的目的。而将经d o p p c r 得到的荧光标记产物和杂交液混合与寡核苷酸芯片杂交，结果在低严谨度条件下出现许多非特异性杂交信号，而在提高严谨度后，即使对扩增产物进行浓缩后与寡核苷酸芯片杂交也无法检测到杂交信号。中国农业科学院硕士学位论文第二章b t c r y 基因检测芯片关键技术研究2 ，1 2 3 2 萤旺标记样品、k l e n o w 酶标记样品奄硷翱蕊篾杂交缝繁将缀过t d t 、k l e n o w 标记的样品分别与p c r 产物探针和爨核苷酸探针杂交，结果发现，在铙化杂交条孛 麴藏提下，只有震鬻浓度k l e n o w 酶醚辍引物法标记离浓发熬慧d n a 薅，p c r产物探针与寡核苷酸探针才都会出现杂交信号( 图2 5 ) ，而经过t d t 与普通k l e n o w 标记的样黯并没有与寡垓替蹬探针絷交产生出可检测如的荧光信号( 如袭2 - 2 ) 。另外结果是示，对k l e n o w随机标记丽言，燕否用超黟波处理慈d n a 对杂交结巢没有显警性的影响。袅2 - 2 不脚方法标记不同处理的d n a 杂交结果t a b l e2 - 2 h y b r i d i z a t i o n r e s u l t s o f v a r i o u s l a b e l i n g m e t h o d a n d 台删d n a标记方法l a b e l i n gm e t h o d探针p r o b e总d n a ( 超声波处理1t o t a ld n a ( f r a g m e n t a t e d 姆s o n i c a t i o n )少量( 几十i l g大量( 几十i l g竣) a f e w & x级) s s 卜x总d n a ( 采用超声波处理)t o t a l d n a ( n o t f r a g m e n l a t e db ys o n i c a t i o n )少女酞几十n g丈量( 几十缀) 8 f e w p溜缓) m 曩8 s! ! ! 出! ! 隧2兰! ! 堡!生兰! q 般2末端转移酶法t d tm e t h o d酱透k l e n o w 酶随橇l物法c o m r f i o nk l e n o wr a n d o m p r t r n c r m e t h o d高浓度k l e n o w 酶蹦机 l 钧法 鞋醢c o n c e n t r a t i o nk l c n o wr a n d o mp r i m 嚣m e t h o dp c r 产物p c rp r o d u c t彝核苷酸o l g o a u d e o t i d ep c r 产翡p c rp r o d u c t糍援彗酸o l i g o n u d e o t i d ep c r 产物+p c rp r o d 溅群核苷酸o l 璁o n u c l e o t i d e+ ：有信号d e t e c t a b l es i 孕i a i - ：光信号n od e t e c t a b l es i v u a撵针l 1探针l a c探针p c r l a el丽2 - 5 离浓崖k l a n o w 标记高液瘦慈d n a 麓芯冀杂交结集扫描熬爰定量势辑f i g 2 - 5t h ep a t t e ma n dt h eq u m a t i t a t i v ea n a l y s i so f m i e r o a r m yh y b r i d i z a t i o n ( h 塘hc o n c e n t r a t i o no ft o t a l d n a l a b e l e d b y h i g h e x m c n t r a t i o n k l m o w f r a g m e n t )- 2 6 0000o0000oo0o0oo0o00o000o008642o8642糕嘿长糕串簪农鼗辩学靛谨士学毽论文檠二辈b t c r y 萋毽撩渊芯冀关键技术研究2 ，l ，3 讨论娶魏应用基因嚣片检潮功能基因魏方法大部分都是遥避p c r 定肉扩增翻的基因片段与寡核苷酸探针杂交的。这样来，不仅髋在扩增的同时对样品进行放大，而且还可以保证样晶没宥 # 鞍菏毅静千撬，溺对瓣鞋豫涯其寄较高酶荧光梅记效率。在本研究串，逶过不对称p c r 获褥的产物序列基本上覆盖丁靶序列的全长，如果菌株中存在相应的基因，通过p c r 邂向扩增放大并标记后，在杂交时就会与所设计的寡核静酸探钎产生较强的信号，但是在实验中并没有出现预期的结絮。分析原因，一是由于p c r 扩增的片段太长，靶片段的长短、g c 、二级结构都是影响杂交效率秘圭簧因素；二是没有对寡菝荣黢搽钟在嚣片段串豹位藿进行侥纯研究。嚣藏，奁今螽的实骏中应该重点解决这两个问题，但是在本研究中其实际操作性存狂着相当大的难度。这是由于寡核苷酸探针的设计必须符台以下的条件：一是特异性，所有的巍核苷酸探针对非靶序弼嚣言必须是憋异性的；二是保守性，对应较麓分类等级驰寡棱蛰羧特髯探针廖列必须是处于其较低分类等级基因的保守序列：兰是一致性，由于杂交反成是在一个液相中进行的，这就要求所有的探补兵备羲静t m 俊。稀酲蓠在n c b l 主已经公毒静c r y 亭列簿2 6 8 瓣( h t t 0 ：w w w b i o l s s u s x a c u k h o m e n e i lc r i c k m o r e b t t o x i n s 2 h t m l ) ，而且第四级序列的相似性在9 5 以上，即使是第三级序列的相似性也在7 5 以上，部分序列较难找到合适的特骅性探针；蠢对予第一级痔列粒蘩二级枣裂，其糍戗牲分别在4 5 以下帮在4 5 - 7 8 之潮( c r i c k m o r eke ta l 。1 9 9 5 ) ，所以探针的设计存在相当犬的难度，经常是顾此失铍，无法兼顾所有的条件。阎样出于基因序列的复杂性，穰零无法设计条或多条弓l 镪在扩增掰蠢o r y 纂鑫序耐豹同拜寸毵保证扩增的片段长度符合杂交的要求。因此，应用p c r 定向扩增并标记靶片段岛寡棱苷酸探针杂交检测b t c r y 基因还需要幸搴进一步豹磷究。毽将来帮便建立了较稳定静建立袭p c r 基础土熟检测髂系，其也没有棼现基圜芯片高通璧、大规模的特点，而且与p c r - r f l p 相比也不具优势。由于c r y 基西序列非常复杂，无法疲莆定尚扩增褥弱所有酶序捌片袋，为诧应用了d o p - p c r隽法对总d n aj # 定向扩增并逃行荧光标记，但是芯片的检测缕累表明对此方法在糍核苷酸芯片检测中的成用也需作进一步的研究。这是由于虽然d o p p c r 对总d n a 进行了扩增，但是扩增熬终粟其燕增鸯羹了嚣辨冀段鹊绝对爨嚣不是据对燕，况基这季孛绝对鬃的增趣蒡不麓与蠹接提取大爨的总d n a 相比，间时这种扩域并不是完全均匀的，虽名为非定向扩增。但是仍有部分序列被优先大量琏扩增，这可黼会造成所要的舀的片段过少蔼达不弱稔溺的掇限；努井，不论从理论上还燕在实践中，d o p - p c r 的扩增产物都在几百b p 到十几k b 之间，如前所述，如此长片段的杂交效率是非常低的( j 萨姆布鲁克等2 0 0 2 ) ：最后，由予本研究中采用的是荧光d o p ，虽然裁傈涯每个扩增冀段郯寿荧宠势予存在，毽是懿果搽铮豹往萋远褰样品鳃5 端，鞠搜攘钟与目的片段完全匹配，所检测到的荧光强度也非常低。程试验了基予p c r 方法应掰基因芯片梭涌c r y 基国籍，采璃了t d t 介辞的宋端加尾法、k l e n o w 介导的殪期引物法对总d n a 进行荧光标记。由予较长的d n a 片段会因为空问阻碍、二级结构、探针在序列上的位置等因綮导致杂交效率非常低，为此在标记前需要对总d n a 片段纯。在冀段纯辩采矮了嚣种方法，一舞超声波处理慧d n a ，是用d n a s e 酶涟纯总嬲a 。一2 7 -中国农业科学院硕士学位论文第二章b tc r y 基因检测芯片关键技术研究两者各有优势与不足，用超声波处理样品时，参数易于控制，但是需要大量的样品；d na ：q e 消化需要的样品较少但是条件难以控制，而且还需要去除酶的污染。经过综合比较，在片段化总d n a 时使用超声波断裂方法优于d n a s e 消化方法。由于t d t 介导的末端加尾法、k l e i i o w 介导的随机引物法都没有对目的片段进行扩增放大，样品中所含有的目的片段非常少，所以在用t ( 1 t 标记和普通k l e n o w 标记时，由于两种酶本身的标记效率较低，即使大大增加总d n a 的量至几十l a g 级也只能与p c r 产物探针产生信号而无法与寡核苷酸探针产生杂交信号，只有用高浓度的k l 口a o w 标记高浓度的总d n a 与寡核苷酸探针杂交才会产生荧光信号。2 8 主耋銮鎏登：鹜銎圭耋釜篓兰量三薹兰：z 量望鏊鎏至兰茎茎茎塑2 2 黼浓度k l e n o w 酶随机标记法应用研究因共基鄹芯片技术是最近才发展越来的，许多存在的阔题仍然没有搞得报清楚。一个最大的潜在的问蹶是在杂交中探针与目标d n a 接触的问题。目前不清楚在杂交中探针研以多丈程瘦建与嚣标d n a 按魅，嚣为荟冀上戆杂交不蹩蕊攀熬滚耱爱痘，在渡稳中d n a 之麓霹兖分接触，遮一点将依赖于目标d n a 和探针的d n a 序列以及d n a 链内的二级和三级结构。因此，特定巍型的旗因芯片的杂交特健( 特异健、灵敏度和定量耨性) 都有赖予各自实验静确定。奉葛研炎了应用高浓度k l e n o w 掠 a 高浓度的d n a 样品直接从b t 总d n a 中检测c r y 基因的方法，对探针长度、浓度以及灵敏魔等条件进行了研究。221 材料垮方法2 21 1 主要仪器设铀觅第一节2 + 2 1 2 主要试剂觅第一节2 2 1 3 菌株和培养基本研究啦所用的b t 蕊株为h d - 7 3 、g 0 3 等，来自中国农业科学院撼物病虫害生物学国家重点实验室收藏。经p c r - r f l p 浆定，所含基因如下：h d 一7 3 ：c r y l a c 基鞠g 0 3 ：c r y l a a 和c r y l a c 等基因。璃养基见第一节。22 4 苏云金芽毽抒莛蒽d n a 鹃提取与片段恁见第一节2 2 15 寡核苷酸探针和p c r 产物探针的设计与合成觉第一节，其审戳k s u n 2 k 3 u n 2 笼g | 镌扩增h d 7 3 褥劐c r y l a c 的黎分痔到终笼p c r 产物探针，命名为p c r l a c 。2 2 l6 芯片制作凳第一节为了研究寡核营酸探针浓度对杂交信号的影响，制作了探针浓度梯度芯片，方法同上，每点重艇两次。所选糟的探针为t - 3 、1 - 4 、i a a 、1 a e 、t a 簿，搽针终浓度分溺为t o v m o | to 、2 0 $ t m o l - l 、4 0 t a m o 0 1 、6 0 9 m o t l 一、8 0 辫, n o l 。l 。2 21 + 7 高浓度k l e n o w 随机标记荧光样品的制各觅第一节2 2 lg 杂交与洗涤- 2 9 ，串落农韭辩学院磺士学位论文第二章b t 掣萋绷硷测茹片美德投术研究燃竺! ! ! ! 竺苎燃皇竺! ! ! ! ! 烹烂i ii i i i i i i i i i i i 竺竺! ! ! 烹懋! ! ! ! ! ! 寰燃曼! ! ! ! ! 烹燃竺竺!见第一节2 , 2 1 9 芯片扫描与数据分析苍冀据擒燕第一节，鼓掭镁耀s p s s1 1 5 、e x i t2 0 0 0 、s i g m a p l o ts0 等较传递疗统诤分掇。2 2 2 结果2 2 + 2 1 愿予c r y 基嚣检测的寡鞍营鼗撵针的设计觅第一节2 2 2 2 探针长度对杂交信号的影响以含有c r y i a c 基困的h d 一7 3 、g 0 3 菌株作为研究对象，提取总d n a 箭进行荧光标记，以l 1 、i a c 、p c r i a c 探镑遗荦亍疆究。统计绥莱驻