（农产品加工及贮藏工程专业论文）柑桔种子中类柠檬苦素提取纯化工艺研究.pdf

西南人学硕十论文中文摘要 柑桔种子中类柠檬苦素提取纯化工艺研究 农产品加工与贮藏专业硕士研究生刘君 指导教师焦必宁研究员 摘要 类柠檬苦素在柑桔属中含量丰富，是柑桔主要的次生代谢产物之一，也是引起柑桔汁苦 味的重要原因。柑桔类柠檬苦素具有抗癌、杀虫、抗病毒、抑菌等生物学活性，有着广泛的 应用前景。 本文以锦橙种子为原料，在研究建立紫外分光光度法快速测定类柠檬苦素的方法基础上， 采用单因素实验和响应曲面法优化了超声辅助法和水溶助剂法提取类柠檬苦素的工艺条件， 并初步开展了大孔树脂纯化分离纯化的研究。其主要研究结果如下： ( 1 ) 以d m a b 作为指示剂，进行比色分析，确定柠檬苦素标准品扫描最大波长为4 7 0 r i m ， 建立吸光度与浓度的线性回归方程为y = o 0 0 2 8 x + 0 0 0 4 7 ，r 2 = o 9 9 4 5 。其平均回收率在9 1 3 0 到9 4 4 8 之间。此法不需要昂贵的设备，操作简单，具有较高的灵敏度，可快速准确的检测 出柑桔种子中类柠檬苦素的总量。 ( 2 ) 用不同的有机溶剂提取类柠檬苦素，氯仿提取效果最好，其次为丙酮和乙腈，综合 考虑安全性以及回收利用、经济成本等问题，本实验选择丙酮作为超声辅助的提取溶剂。 ( 3 ) 通过单因素实验得出的最佳提取工艺参数为：离心脱脂时间为1 0 m i n ，浓度为8 0 的 丙酮溶液，料液比为1 ：4 0 ，提取时间为3 0 m i n ，提取次数为2 次。 ( 4 ) 利用响应面分析法确定了主要影响因素：提取剂浓度、料液比、提取试剂三者之间 的最佳比例关系，按三元二次正交组合设计原理进行设计，得到了回归方程为： y = 4 2 5 3 5 3 4 + 0 2 8 5 5 3 4 * x i + 0 0 8 5 7 9 1 * x 2 + 0 11 4 7 8 3 x 3 - 0 2 3 4 6 8 4 木x i 牛x l - 0 1 3 6 5 7 6 x 2 * x 2 - 0 1 3 3 0 3 2 掌x 3 幸x 1 + 0 0 81 4 4 4 书x 3 事x 2 - 0 1 0 5 5 7 6 搴x 3 幸x 3 并根据响应面值典型分析求得了试剂浓度、料液比、提取时间的最佳组合值分别为：8 5 、 4 7 ：l 、3 2 m i n ，其对应的响应值类柠檬苦素得率为4 3 6 2 m g g ，而根据此组合实际测得值为 4 2 9 7 m g g ，与预测量的r s d 为1 0 6 。 ( 5 ) 在相同条件下，分别用两种水溶助剂n a s a l 和n a - c u s 提取类柠檬苦素，n a - c u s 提 取效果较好，得率为4 0 2 3 m g g ，故选用n a c u s 为提取剂，并通过单因素实验和正交实验确 定最佳的提取类柠檬苦素的工艺参数。 ( 6 ) 通过单因素实验得出用n a - c u s 提取类柠檬苦素的最佳工艺参数为：提取时间为6 h ， i 两南大学硕十学位论文a b s t r a c t ( 7 ) t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u e so fl i m o n o i d sb yn a - c u si no r t h o g o n a l e x p e r i m e n t sw e r e ：t h ec o n c e n t r a t i o no fe x t r a c t i o na g e n tw a s2 5 m o l l ，6h o u r s ，t e m p e r a t u r ew a s 4 0 ，t h ev o l u m eo fe x t r a c t i o na g e n tw a s2 5 m l t h es i g n i f i c a n c eo fi n f l u e n c i n gf a c t o ri st h e c o n c e n t r a t i o no fe x t r a c t i o na g e n t t h ev o l u m eo fe x t r a c t i o na g e n t t e m p e r a t u r e t i m e t h eo b t a i n r a t eo fl i m o n o i d si nt h eb e s tc o n d i t i o n si s4 3 3 2 m g g ( 8 ) a b s o r p t i o ns p e c i a l i t i e so f a b 一8 、h z - 8 4 1 、d m l 3 0 、d 3 5 2 0 、x a d 一1 6m a c r o p o r er e s i nt o l i m o n o i d sw e r es t u d i e d t h ex a d - 16r e s i nw a st h eb e s ti ni n t e g r a t e de s t i m a t e t h ea d s o r p t i o nr a t eo f x _ a d - 16r e s i nw a s9 4 1 2 ，t h ea d s o r p t i o nq u a n t i t yw a s4 3 5 8m g g ，t h ee l u t i o nr a t ew a s8 5 3 6 ( 9 ) t h et e c h n o l o g i c a lp i o c e s st op u r i 匆l i m o n o i d sb yx a d - 16m a c r o p o r er e s i nm e t h o dw e r e 2 31 5 m g m lw a st h ea d s o r p t i v ec o n c e n t r a t i o n ，o 5 m l m i nw a st h es a m p l ev e l o c i t y ；8 0 a l c o h o la s t h ed e s o r p t i o ns o l u t i o n ，t h ev e l o c i t yw a s0 5 m l m i n , t h es a m ea st h ed e s o r p t i o nv e l o c i t y ，t h ev o l u m e o fd e s o r p t i o ns o l u t i o nw a s2 0 0 m l k e yw o r d s ：l i m o n o i d s d e t e c t i o ne x t r a c t i o n p u r i f i c a t i o n i v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 标注。 学位论文作者：别动 签字日期：w 矿盏年 占月；日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：。酶保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：考t 雾 签字日期：枷多年多月弓日 导酶签龟：壁1 9 一，j 签字日期：杪口9 年6 月3 日 夕 西南人学硕士学位论文 第l 章文献综述 第l 章文献综述 1 1 类柠檬苦素简介 类柠檬苦素( 三砌d 刀d 胁) 又称柠檬苦素类似物，是一类具有呋喃环的三萜类 化合物。为柑桔中主要的次生代谢产物之一，主要存在于芸香科和楝科植物中， 迄今为止己发现3 9 0 多种类柠檬苦素i l l 。 类柠檬苦素( 三咖铡d 胁) 在柑桔属中含量丰富，是引起柑桔汁苦味的重要原 因之一。研究人员已从柑桔属中分离出3 7 种类柠檬苦素和2 1 种配糖体【2 3 4 捌。大 量的动物试验表明，类柠檬苦素具有抑制由化学物质导致的肝癌、小肠癌、口腔 癌和皮肤癌等作用，还有杀虫、抗病毒、抑菌等作用。最近研究表明，类柠檬苦 素也以其糖苷( 三拥d 刀d 胁础l c 讽皤) 的形式存在【6j 7 1 。类柠檬苦素的配糖体不但 具有水溶性好和没有苦味等特点，而且和柠檬苦素类似物一样具有抗肿瘤活性， 可以直接做功能性添加剂。 本章对类柠檬苦素的结果、分布、合成，提取分离及纯化研究现状，生物学研 究现状，应用现状及发展前景进行综述。 1 2 类柠檬苦素的结构、分布与合成 1 2 1 类柠檬苦素的结构 类柠檬苦素具有高度氧化的三萜醇类诱导体结构，与c 1 7 位的呋喃结合，形 成c 3 位或者c 6 位的内脂环，具有c 1 4 、c 1 5 位向的环氧化物特征【8 ，9 】，主要以 游离苷元和配糖体两种形式存在【m 】，见图1 1 类柠檬苦素游离苷元不仅水溶性差，而且味苦，是大多数柑橘类水果苦味物质 之一，也是使果汁及其他加工制成品产生“后苦味”的物质。现已从柑桔类中分离得 到3 8 种类柠檬苦素苷元【l l 】，较常见的主要有柠檬苦素( 锄d 力切) 、诺米林( 刀d 所溉) 、 宜昌根辛( 矗历口删咖) 、脱乙酰诺米林( 如口纪p f 响d 聊f 砌) 、诺米林酸( 玎d 掰f 砌口c 耐) 、 脱乙酰诺米林酸( 如口c p 衄珈d 珑砌z 口c 谢) 等，其中柠檬苦素和诺米林具有强烈苦味 【1 0 】 o 类柠檬苦素配糖体犯砌d 加耐础，而d 矽是由类柠檬苦素苷元分子d 环开环后 在c 1 7 的位置上以糖苷键的形式结合一个五碳糖而构成的，是在植物体内经过一 系列非常复杂的生化过程而合成的，大多溶于水溶液，在p h 2 8 范围内比较稳定， 无苦味，且仍保留与其相应的苷元相似的生理活性【1 ，1 1 ，13 1 。一般情况下，有多少种 类柠檬苦素，就该有相应数量的配糖体，但目前从柑桔只分离出了2 2 种类柠檬苦 素配糖体【1 4 】。几种比较常见和重要的类柠檬苦素类配糖体包括：柠檬苦素配糖体 两南人学硕十学位论文 第1 章文献综述 ( l i m o n i n l 7 b g l u c o p y m n o i s i d e 、) 、诺米林配糖体( 、n o m i t 洒1 7 - l b d g l u c o p y r n i s i d e 、) 、 宜昌根配糖体( 尼办c 办口馏伽j 7 毋d 甜c 9 乃嘲聆d 括豇招) 、脱乙酰诺米林酸配糖体 ( 眈口c 叫玎。朋玎配口c 刃j 7 _ 伊脚c d 矽y 阳玎d 括娩) 、诺米林酸配糖体( o 明班拧a c 耐 l7 8 d g l h c o p y r n n o i s i d e 、) 、异柠鼍糕甏溅体( i s o n m o m cn c i dl7 | b d g 胁c 9 p 吵册d 括娩) 、奥巴叩酮配糖体( a 哆卯姗d 以p 7 毋d 甜c 哆 册一d 西砘! ) 等i b j 。 挣熔纷詹 挣撵篙鬻j ：- ，删i 嘲游舒 图1 1 柠檬苦素类似物及其配糖体的结构 f i g1 - 1t h e s t l l 山c 1 c u r eo f l i m o n o i d s 柚dl i m o n o i dg l u c o s i d e 1 2 2 类柠檬苦素的分布 类柠檬苦素主要存在于果实中，而在茎、叶等组织中含量较少。在幼果中，类 柠檬苦素多以苷元等形式存在，随着果实不断发育，苷元逐步转化为配糖体，作 为一种贮存形式存在于成熟果实中【1 4 】。几乎所有的柑桔果实都是以种子含量最高， 其次为果皮，在果汁中含量最低。种子中的类柠檬苦素苷元含量通常要高于其配 糖体，比例大概为2 2 ：1 ，而在果实中其比例为1 ：1 5 0 【1 5 16 1 7 1 。表1 1 详细列出了 在8 种柑桔类水果籽粒中的类柠檬苦素含量，从表中显示，葡萄柚的类柠檬苦素 含量最高。 表1 1 柑桔种子中的类柠檬苦素苷元和配糖体化合物含量【1 8 】 1 a b l el - 1t h ec o n t e n to fl i m o n o i da 9 1 y c o n e 锄dl i m o n o i dg l u c 0 s i d ec o m p o 吼d si nc i t m s s e e d s 2 西南人学硕士学位论文第l 章文献综述 对于多数柑桔品种来说，柠檬苦素是最主要的类柠檬苦素苷元，其次是诺米林 素，脱乙酰诺米林素和黄柏酮，而诺米林糖苷则是主要的配糖体，其次为黄柏酮 糖苷、诺米林酸糖苷以及脱乙酰诺米林糖苷【l9 1 。在果汁中，类柠檬苦素主要以柠 檬苦素1 7 p - d 一吡喃葡萄糖苷存在，以游离苷元形式存在的类柠檬苦素含量较少， f o n g ( 1 9 8 9 ) 测定了美国柑桔汁商品中的类柠檬苦素糖苷含量，其中橙汁最高， 平均为3 2 0 m g i 【g ，其次为葡萄柚果汁，平均为1 9 0m g l 【g ，而柠檬果汁中含量最低， 但也达到了8 3m g l ( g 【2 们。 1 2 3 类柠檬苦素的生物合成 经过多年研究，柑桔类植物中的类柠檬苦素的生物合成途径已基本明确，其首 先在枝的筛管部位由醋酸和甲羟戊酸等合成最初前体物质诺米林，合成的诺米林 向叶、果实、种子等部位移动，经一系列酶的作用合成其他类柠檬苦素化合物1 1 2 1 。 如图1 2 所示 甲基异黄柏酸地奥酚 1 9 羟基脱乙酰诺米林酸 t t t t t 上 上占 上上 上 j 异柠檬苦酸柠檬苦素 图l - 2 柑桔类植物中类柠檬苦素的生物合成途径 f i 9 1 2t h eb i o s y i l m e t i cp a m w a yo fl i m o n o i d si l lc i 仃吣 1 3 类柠檬苦素的提取、分离与纯化 1 3 1 类柠檬苦素的提取 3 西南人学硕十学位论文 第1 章文献综述 1 3 1 1 有机溶剂提取法 这是目前国内外使用最广泛的方法，比较容易实现工业化生产，常用的有机 溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。在提取过程中，原料本身的性质，溶剂的性质及固 液比、提取温度、时间、次数、原料与溶剂接触情况都可能影响提取的效果 2 3 , 2 4 】。 孙崇德等人( 2 0 0 4 ) 从提取液、提取方法、提取时间、温度等方面进行了研究， 优化了提取方法，提取柠檬苦素和诺米林的回收率分别为9 0 4 和9 1 1 ，并采 用薄层层析与高效液相色谱结合的方法有效的定量柠檬苦素和诺米林，得到检测 限均为0 0 3 9 9 g ，r s d 分别为6 4 8 和2 9 0 【2 5 】。罗水忠等( 2 0 0 6 ) 对柑桔籽中 柠檬苦素的脱脂、索氏提取以及结晶等工艺进行了优化，并对所获得的产品进行 了抑菌试验研究。发现采用石油醚在3 2 ，p h 6 5 的条件下脱脂8 h 后，再用丙酮 在8 0 下索氏提取8 h ，所得效果最好【2 6 】。 1 3 1 2 水溶助剂提取 近年来，国外有学者开始利用极易溶于水的有机盐和水溶助剂增加有机成分的 水溶性，优化提取效率【2 7 2 8 1 。v i n a y a g u me 等人用包含十二烷基硫酸钠( s d s ) 的 磷酸一一硼酸缓冲液在短时间内有效的分离出了柠檬苦素糖苷，奥巴叩酮配糖苷 和诺米林糖苷，简化了前处理步骤，在用毛细管胶束电动色谱法( m e c c ) 测得柠 檬苦素糖苷和诺米林糖苷的回收率分别为9 4 1 和9 3 5 。研究证明此法适于柠 檬苦素糖苷的分离测定，是一种快速、高效、节约成本的方法【2 9 1 。d vd e e p a k 等 人通过改变水溶助长剂浓度，提取温度和原料的用量对酸橙种子中生物活性成分 类柠檬苦素进行提取，研究发现可明显减少有机溶剂用量，减少提取生物活性成 分过程中的污染【3 0 】。 1 3 1 3 超临晁流体萃取法 超临界流体萃取法是一种新型的萃取分离技术。该技术是利用流体( 溶剂) 在临界点附近某一区域( 超临界区) 内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平 衡行为和传递性能、且对溶质溶解能力随压力和温度改变而在相当宽的范围内变 动这一特性而达到溶质分离的一项技术。与传统的溶剂浸提法相比，具有提取效 率高、无化学溶剂残留、无污染、无异味、天然植物中活性成分和热不稳定成分 不易被分解破坏等优点。同时还可以通过控制临界温度和压力的变化，来达到选 择性提取和分离纯化的目的。j u ny u 运用超临界二氧化碳( s c c 0 2 ) 流体萃取技 术从葡萄柚种子中的柠檬苦素和柚皮甙，第一步用s c c 0 2 萃取弱极性的柠檬苦 素，第二步用有乙醇的s c c 0 2 萃取强极性的柠檬苦素糖苷和柚皮甙，实验表明， 当压强为4 8 3 m p a ，温度为5 0 。c 时浸提6 0 m i n 时从葡萄柚籽粒中提取柠檬苦素含 量为6 3 m g g 3 。 4 西南人学硕士学位论文 第1 章文献综述 1 3 2 类柠檬苦素的分离、纯化 提取所得到的粗提物，成分复杂，杂质较多，需确定合理高效的分离、纯化 途径。常用的纯化方法有：离子交换法、柱层析法、大孔树脂吸附法、制备型高 效液相法等【3 2 3 3 3 4 1 。s h i b ump o u l o s e ( 2 0 0 7 ) 等人利用q s 印h a r o s e 离子交换树脂， 通过改变氯化钠的浓度调节p h 值，用8 0 乙醇提纯葡萄柚种子中的类柠檬苦素， 经薄层层析后，得到纯度 9 5 的类柠檬苦素【3 5 l 。在我国，田庆国等人( 2 0 0 0 ) 研究了我国主要柑桔品种甜橙种子中的柠檬苦素类化合物配糖体的提取和分离， 利用半制各高效液相色谱结合柱色谱和离子交换色谱技术分离纯化了一种柠檬苦 素类似物的配糖体，并经核磁共振测定为奥巴叩酮配糖体，其质量分数约占甜橙 种子中柠檬苦素类似物配糖体总量的8 0 以上【3 6 1 。施英等人( 2 0 0 6 ) 将桔核脱脂 后经乙醇提取过滤，采用大孔吸附树脂纯化桔核中的柠檬苦素类物质，优化了动态 纯化条件：上样浓度为4 m g m l ，p h 为6 o ，上样流速为l b v l l ；最佳洗脱剂为7 0 乙醇溶液，洗脱液p h 值为8 0 ，洗脱速率为2 b v l l ，洗脱体积为4b v ，纯化得到 的样品柠檬苦素类物质含量为3 7 2 6 p 。 1 4 类柠檬苦素的检测方法 近年来，柠檬苦素类似物的定量分析方法主要有分光光度法( u v ) 【3 8 3 9 】薄层 层析法( t l c ) 【4 0 1 、? l c u v 法【4 1 4 2 j 、h p l c m s 法【4 3 1 、毛细管胶束电色谱方法4 5 j 和放射免疫测定法( r n ) 【4 6 】。放射免疫测定法能检测低浓度的柠檬苦素，但这类 方法可能导致柠檬苦素和其他无苦昧类柠檬苦素发生交叉反应，对结果造成影响 【4 7 4 8 1 。另外，还有学者采用大气压化学电离( a p c i ) 离子化技术和电喷射离子化 ( e s i ) 技术利用反相h p l c 系统可定量纳克级的柠檬苦素，以下介绍几种常用的 分析方法的应用情况。 1 4 1 分光光度法 分光光度法测量柑桔中的类柠檬苦素化合物主要是根据柠檬苦素和艾利希 e 肼i c h 试剂的反应呈红色，可粗略的测量样品中的类柠檬苦素化合物的总量，而 且快速方便，可用于类柠檬苦素的提取研究。田庆国等人( 1 9 9 9 ) 建立了一种以 柠檬苦素为标样快速简便地测定橘核中类柠檬苦素化合物总量的分光光度法。样 品经石油醚脱脂、丙酮提取和二氯甲烷萃取后，萃取物中加人e h 订i c h 试剂反应后， 在2 1 0 i l i i l 波长下测定类柠檬苦素的总量。该方法的检出限为7 1 0 r 6m g l ，回收率在 9 9 4 l o o 1 范围内，相对偏差在l 以内，适用于柑橘类柠檬苦素的常规检测 【3 8 】。近年，加利福利亚一位教授( 2 0 0 7 ) 建立一个测定柑桔果汁中的类柠檬苦素 糖苷配基和糖苷浓度的简单、快速的比色方法。利用4 二甲氨基苯甲醛( d m a b ) 西南人觞了肆褊劬道霪i 秀哥褊器薹 藕荔捌搦磕泪猩墨擒省蹦涔舀曜骝剿勋翻氍狲劂羹呀圃蜊柳羹班鞫：晦罨毯鐾班 入一列募隧弱拐蚝k 瑟啦丽人类蚕。霪琴薅雪：藿主蓁蓁j 妻萋；闲夔鬻滗礤掰薹藕基矍i 薹呱 i ；耋喜霪蓬鍪；垂； i 。蓬，霉嵇稻吖魏硒 薹耄霍璐翟毯曜萋聃酾鹭塑删够辩髋募弼n 瓣葬鳓酗；明髓鹅墓陛岜羹垂了瑶 誉磷魁塑蠢翌嗣剡酗刻引鞘韦制；霞鞠副酗蓉体系中，柠檬苦素和柠檬苦素甙对自由基的清除率分别 为0 5 和0 2 5 。另外，柠檬苦素、柠檬苦素糖甙和香豆素对过氧化物自由基的清 除率为2 5 0 o - 1 0 ，同时柠檬苦素还能够防止低密度脂蛋白的氧化【55 。s u n ，c 等人 的研究表明，柠檬苦素和诺米林的抗氧化活性随柑橘组织和品种的不同而异，柠 檬苦素和诺米林的活性约是v c 的2 9 8 3 倍【5 引。 1 5 2 抑菌活性 类柠檬苦素还具有明显的抑菌活性。g o v i n d a e h a r i 等人( 2 0 0 0 ) 研究三萜类化 合物对真菌的抑制效果时发现，柠檬苦素、柠檬苦素酸和柠檬苦素醇等柠檬苦素 类似物对落花生柄锈菌均具有一定的抑制效果。在这3 种物质中，柠檬苦素的抑菌 效果最强，柠檬苦素醇次之，诺米林酸最弱。柠檬苦素的浓度为7 3 5 “g c m 2 时的抑 制率为6 7 7 ，柠檬苦素醇的浓度为1 4 1 嵋c m 2 的抑制率为3 7 9 ，当诺米林酸 浓度为1 6 2 5 “g c m 2 时，抑制率仅为2 8 5 【5 7 】。 1 5 3 类柠檬苦素的抗癌活性 近年来，研究发现类柠檬苦素具有抗癌、抗肿瘤活性，对致癌因子及肿瘤细 胞有抑制作用。l a m 等人( 1 9 9 4 ) 用小鼠进行试验，发现柠檬苦素、诺米林、奥 巴叩酮、异奥巴叩酸、宜昌银等五种类柠檬苦素物质能明显的激发肝和小肠粘膜 上谷胱苷肽转移酶( g s t ) 的活性，从而抑制化学致癌物的致癌作用【5 引。c k e l l y 等也进行了动物试验，在喂食小鼠时添加柑桔中的柠檬苦素和诺米林两种物质， 观察对肝肠中毒物代谢酶和谷胱甘肽s 转移酶的影响，发现其能有效的引导这两 类酶作用，预防癌症【5 9 】。m i l l e re g ( 2 0 0 4 ) 等研究了类柠檬苦素对d m a b 诱导口 腔癌的抑制实验，在d m a b 诱导仓鼠的口腔癌的形成中，柠檬苦素抑制肿瘤形成 率为6 0 6 0 l 。唐莉莉等人( 2 0 0 1 ) 探讨了柠檬苦素类似物对乳腺癌细胞m c f 7 生长抑制和对细胞周期的影响，应用m t t 法和流式细胞仪检测癌细胞株生长和细 胞周期。结果显示柠檬苦素类似物能明显抑制m c f 7 的生长，抑制率高于7 0 ， 且存在剂量效应关系，随作用时间和剂量增加其效果增强，在用柠檬苦素处理癌 细胞4 8 h 后出现凋亡细胞1 6 1 】。 1 5 4 阵痛、抗炎作用 7 两南人学硕十学位论文 第1 章文献综述 质，在药理、除虫等方面的研究进展，使得这类物质的疗效和保健功能越来越受 到人们的重视，其对食品、农业和人类健康有重要意义。 1 5 1 抗氧化活性 随着人们对天然产物抗氧化性的重视，越来越多的研究发现类柠檬苦素也具 有很强的抗氧化性。j u ny u 等人( 2 0 0 5 ) 对柑桔中的1 1 种活性物质进行抗氧化活 性实验时发现，在d p p h 体系中，柠檬苦素和柠檬苦素甙对自由基的清除率分别 为o 5 和0 2 5 。另外，柠檬苦素、柠檬苦素糖甙和香豆素对过氧化物自由基的清 除率为2 5 1 0 ，同时柠檬苦素还能够防止低密度脂蛋白的氧化【55 。s u n ，c 等人 的研究表明，柠檬苦素和诺米林的抗氧化活性随柑橘组织和品种的不同而异，柠 檬苦素和诺米林的活性约是v c 的2 9 8 3 倍【5 6 j 。 1 5 2 抑菌活性 类柠檬苦素还具有明显的抑菌活性。g b v i n d a c h 撕等人( 2 0 0 0 ) 研究三萜类化 合物对真菌的抑制效果时发现，柠檬苦素、柠檬苦素酸和柠檬苦素醇等柠檬苦素 类似物对落花生柄锈菌均具有一定的抑制效果。在这3 种物质中，柠檬苦素的抑菌 效果最强，柠檬苦素醇次之，诺米林酸最弱。柠檬苦素的浓度为7 3 5 叫c m 2 时的抑 制率为6 7 7 ，柠檬苦素醇的浓度为1 4 1 嵋c m 2 的抑制率为3 7 9 ，当诺米林酸 浓度为1 6 2 5 “g c m 2 时，抑制率仅为2 8 5 【5 7 】。 1 5 3 类柠檬苦素的抗癌活性 近年来，研究发现类柠檬苦素具有抗癌、抗肿瘤活性，对致癌因子及肿瘤细 胞有抑制作用。l 锄等人( 1 9 9 4 ) 用小鼠进行试验，发现柠檬苦素、诺米林、奥 巴叩酮、异奥巴叩酸、宜昌银等五种类柠檬苦素物质能明显的激发肝和小肠粘膜 上谷胱苷肽转移酶( g s t ) 的活性，从而抑制化学致癌物的致癌作用【5 引。c k b l l y 等也进行了动物试验，在喂食小鼠时添加柑桔中的柠檬苦素和诺米林两种物质， 观察对肝肠中毒物代谢酶和谷胱甘肽s 转移酶的影响，发现其能有效的引导这两 类酶作用，预防癌症【5 9 】。m i l l e re g ( 2 0 0 4 ) 等研究了类柠檬苦素对d m a b 诱导口 腔癌的抑制实验，在d m a b 诱导仓鼠的口腔癌的形成中，柠檬苦素抑制肿瘤形成 率为6 0 【删。唐莉莉等人( 2 0 0 1 ) 探讨了柠檬苦素类似物对乳腺癌细胞m c f 7 生长抑制和对细胞周期的影响，应用m t t 法和流式细胞仪检测癌细胞株生长和细 胞周期。结果显示柠檬苦素类似物能明显抑制m c f 7 的生长，抑制率高于7 0 ， 且存在剂量效应关系，随作用时间和剂量增加其效果增强，在用柠檬苦素处理癌 细胞4 8 h 后出现凋亡细胞1 6 1 】。 1 5 4 阵痛、抗炎作用 7 西南人学硕七学位论文第2 章引言 第2 章引言 2 1 研究目的和意义 类柠檬苦素在柑桔属中含量丰富，国外对类柠檬苦素在柑桔叶、果实、种子 内的合成、转化及分布有较深入的研究，柑桔汁脱苦技术也较成熟。近来，大量 试验表明，类柠檬苦素具有多种生理活性，如抑制由化学物质导致的肝癌、小肠 癌、口腔癌和皮肤癌等作用，还有杀虫、抗病毒、抑菌等作用。类柠檬苦素的配 糖体还可以直接做功能性添加剂。 类柠檬苦素的定量方法主要有t l c 法、h p l c 法等，本文根据对类柠檬苦素 共同含有的呋喃环进行定量测定，而建立一套以柠檬苦素为标样定量类柠檬苦素 总量的比色测定方法；拟用锦橙种子为原料，研究以超声和水溶助剂两种方法提 取类柠檬苦素的最佳条件，并采用大孔树脂吸附法对提取得到的类柠檬苦素粗液 进行分离纯化，确定工艺参数，为类柠檬苦素的进一步工业化生产奠定基础。 2 2 主要研究内容 ( 1 ) 分光光度法快速测定类柠檬苦素含量： ( 2 ) 利用超声辅助和水溶助剂提取类柠檬苦素的工艺 ( 3 ) 大孔树脂纯化类柠檬苦素的初步研究 9 西南人学硕七学位论文 第3 章材料与方法 电热鼓风干燥箱c s1 0 1 2 ab n重庆市永生实验仪器厂 电热鼓风干燥箱c s l 0 1 1重庆试验设备厂制造 磁力加热搅拌器 7 9 1精达仪器制造厂 电子恒温不锈钢水浴锅h h s 一4 s上海康路仪器设备有限公司 超声波清洗机 c q 2 5 1 2 d宁波新芝生物科技股份有限公司 离心机tdl5a上海安亭科学仪器厂 氮吹仪 k 1 5 1 2北京康林科技有限责任公司 可见紫外分光光度计 t u 1 8 1 0 s p c北京普析通用仪器有限责任公司 超纯水器h u m a n p o w e r l i +韩国h u m a n 公司 旋转蒸发仪 r 12 4b n c h i ，m a d ei ns w i t z e r l a n d 恒流泵b t 0 0 1 0 0 m保定兰格恒流泵有限公司 恒温振荡器 m i n i 仃o n 北京博劢行仪器有限公司 层析柱上海厦美生化科技发展有限公司 3 2 实验方法 3 2 1 果样预处理 取果样，切分，分离出种子，6 0 c 烘干至恒重，粉碎过4 0 目筛，保存于干燥 器中，备用。 3 2 2 分光光度法测定类柠檬苦素 根据类柠檬苦素的呋喃结构在醋酸和高氯的条件下，与对二甲基苯甲醛发生 反应可产生红色物质，利于光谱的吸收。本实验拟采用柠檬苦素标准品在紫外区 扫描确定最大波长，测定吸光度，制作标准曲线，计算类柠檬苦素的总量【5 0 】。 3 2 2 1 指示剂的制备 取冰醋酸3 0 0 r a l ，再加入2 4 0 m l 高氯酸，按冰醋酸：高氯酸为5 ：4 的比例 制得酸母液备用。取适量酸母液，按3 0 m l 加入1 1 l g 对二甲氨基苯甲醛的比例制 得d m a b 指示剂，因d m a b 指示剂长时间放置会发生变色，影响测定效果，所 以需现用现配。 3 2 2 2 柠檬苦素标样储备液的制备和最大吸收波长的确定 精确称取5 m g 柠檬苦素标准品，用甲醇( 色谱纯) 定容至2 5 m l ，作为工作母 液备用。分别取2 m l 标样和2 m l 甲醇( 色谱纯) 于两只1 0 m l 试管中，并在每个 试管中分别快速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温下放置3 0 m i n 后，在 紫外分光光度计3 0 0 - - 6 0 0 n m 处扫描吸收情况，得到最大吸收峰为4 7 0 n m 。 3 2 2 3 柠檬苦素标准曲线的绘制 西南人学硕士学位论文 第3 章材料与方法 准确吸取o ，o 2 5 ，0 5 ，0 7 5 ，1 ，1 2 5 ，1 5 ，2 o m l 标准溶液于1 0 m l 试管中， 分别加甲醇( 色谱纯) 至2 0 m l ，再分别快速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母 液，室温放置3 0 m i n 后，在所得的最大吸收波长4 7 0 m 处测定吸光度，以吸光度 为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程。 3 2 2 4 提取液中类柠檬苦素含量的测定 取各组不同实验条件下所得的定容样液2 m l ，氮吹浓缩近干，再加入甲醇至 2 m l ，分别依次快速加入3 m u ) m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温下静置3 0 m i i l 使 其充分显色后，以空白甲醇加指示剂作为参比，在4 7 0 眦处比色测定吸光度，按 下述公式计算柑桔种子中的类柠檬苦素含量。 原料中类柠檬苦素含量( m g ) = i v c 1 0 0 0 m c ：测得含量( “咖l ) ：v ：样品定容体积( m l ) ；m ：所测样品质量( g ) 3 2 2 5 精密度的考察 分别准确吸取标准品溶液和定容后的样品溶液各2 m l ，按3 2 2 4 操作，重复进 样6 次，测定吸光度，计算i 塔d 。 3 2 2 6 稳定性的考察 分别准确吸取标准品溶液和定容后的样品溶液各2 m l ，按3 2 2 4 操作，在o 、 1 0 、2 0 、3 0 、6 0 、1 2 0 m i n 测定其吸光度，考察稳定性，计算r s d 。 3 2 2 7 加标回收率实验 取三只l 嘶l 试管各加入1 m l 浓度为1 0 0 6 8 肛咖l 的样品溶液，分别加入1 m l 浓度为5 0 、1 0 0 、1 5 0 i l g m l 的标准溶液，按照3 2 2 4 操作，测定其吸光度并计算 回收率。 回收率( ) = ( 测得类柠檬苦素量一样品类柠檬苦素量) 加入类柠檬苦素量1 0 0 3 2 3 超声辅助法提取种子中类柠檬苦素的研究 超声波可使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，且对原料有水浴作用，能大 大缩短提取时间，提高有效成分的提出率和原料的利用率，超声提取技术已在油 脂、蛋白质、多糖、色素等物质的提取中得到应用【6 7 1 。目前国内外对类柠檬苦素 的提取使用最广泛的方法为有机溶剂浸提法，常采用有机溶剂在热水浴下进行， 花费时间较长，效率低。本实验利用超声在热水浴下进行辅助提取，用紫外光谱 进行测定，探讨各因子对提取工艺的影响，通过响应曲面法优化提取工艺。 3 2 3 1 提取溶剂的选择 称取2 0 9 样品6 份，加入1 0m l 石油醚磁力搅拌2 1 1 1 i n ，于4 0 0 帆m i i l 离心5 m i n ， 弃去石油醚提取物。试管剩余物分别加入正己烷、二氯甲烷、乙醇、氯仿、丙酮、 乙腈、甲醇各2 0 1 1 = l l ，超声提取2 0 m i i l ，离心5 m i n ，过滤于1 0 0 n ：1 l 容量瓶中，以 1 2 西南人学硕+ 学位论文 第3 章材料与方法 相应的提取溶剂定容至刻度，从中吸取2 m l 样液，氮吹近干，甲醇定容至2 m l ， 分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂 做参比，4 7 0 n m 处测定吸光度，并计算得率。 3 2 3 2 超声提取类柠檬苦素单因素实验 ( 1 ) 脱脂时间的影响 称取2 o g 样品5 份，加入1 0 m l 石油醚磁力搅拌2 m i n ，于4 0 0 0 r m i n 分别离 心5 m i n 、1 0 m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n ，弃去石油醚提取物。试管剩余物加入丙酮2 0 m l ， 超声提取2 0 m i n ，离心5 m i n ，过滤于1 0 0 m l 容量瓶中，丙酮定容至刻度，从中吸 取2 m l 样液，氮吹近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和 3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，4 7 0 n m 处测定吸光度，并 计算得率。 ( 2 ) 提取试剂浓度的选择 称取2 o g 样品5 份，加入1 0m l 石油醚磁力搅拌2 m i n ，于4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ， 弃去石油醚提取物。试管剩余物分别加入2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 的丙酮 2 0 m l ，超声提取2 0 m i n ，离心5 m i n ，过滤于1 0 0 m l 容量瓶中，丙酮定容至刻度， 从中吸取2 m l 样液，氮吹近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示 剂和3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，4 7 0 n m 处测定吸光度， 并计算得率。 ( 3 ) 物料比的影响 称取2 0 9 样品5 份，加入1 0m l 石油醚磁力搅拌2 m i n ，于4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ， 弃去石油醚提取物。试管剩余物分别加入浓度为8 0 的丙酮2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 m l ， 超声提取2 0 m i n ，离心5 m i n ，过滤于1 0 0 m l 容量瓶中，丙酮定容至刻度，从中吸 取2 m l 样液，氮吹近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和 3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，在4 7 0 n m 处测定吸光度， 并计算得率，观察样品和提取溶剂不同体积比的效果。 ( 4 ) 超声提取时间的影响 称取2 0 9 样品5 份，加入1 0m l 石油醚磁力搅拌2 m i n ，于4 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ， 弃去石油醚提取物。试管剩余物加入浓度为8 0 的丙酮8 0 m l ，分别超声提取1 0 、 2 0 、3 0 、4 0 、5 0 m i n ，离心5 m i n ，过滤于1 0 0 m l 容量瓶中，丙酮定容至刻度，从 中吸取2 m l 样液，氮吹浓缩近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，在4 7 0 n m 处测定 吸光度，并计算得率。 ( 5 ) 超声次数对得率的影响 称取2 o g 样品3 份，加入1 0m l 石油醚磁力搅拌2 m i n ，于4 0 0 0 r m i n 离, t m 0 m i n ， 1 3 两南人学硕士学位论文 第3 章材料与方法 弃去石油醚提取物。试管剩余物加入丙酮2 0 m l ，超声提取2 0 m i n ，离心5 m i n ，过 滤于1 0 0 m l 容量瓶中，丙酮定容至刻度，从中吸取2 m 啡液，氮吹近干，甲醇定容 至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和3 i n l 酸母液，室温放置3 0 i i l i l l 后，以空 白溶剂做参比，4 7 0 m 处测定吸光度并计算得率。 3 2 3 3 柑桔种子中提取类柠檬苦素的二次回归正交实验【6 8 f 6 9 】 通过单因素实验，确定试剂浓度、物料比、超声提取时间是影响类柠檬苦素 提取的关键因素。采用三元二次回归正交组合设计，绘制相应曲面图，研究影响 较大的因素的主效应和交互效应的影响，以求得最佳提取效果。各因素变化区间 ( ) 由单因素实验确定，查表确定星号臂丫，计算水平取值并进行编码。 z o j = ( z l j + z 2 j ) 2j 2 ( z l j z o j ) 一 + 1 水平= 面+ j 一1 水平= z o j 一j z 1 j 、z 嘶、z 2 j 分别为某因素的上水平、零水平、下水平 其实验结果以弦表示，二次回归方程的一般形式为： 弦= 肋+ 脚+ 触勋+ 触2 巧+ & _ ，= if 可，= l 对平方项进行中心变化，消除平方项与常数项的相关性后，得到预测模型如 下，进行回归分析。 夕。= b 。+ 蜥彤+ 6 洲工矽+ 鼢2 呼 j = ll j 2 i 如为预测响应值，b o 为截距，历为线性系数，幻为交互作用系数，如为平方系数。 3 2 3 4 结果验证 取二次回归分析得到的最佳条件，重复实验3 次，取平均值，计算实验所得值 与预测值之间的相对偏差。 3 2 4 水溶助剂法提取类柠檬苦素的工艺研究 近年来，国外有学者开始利用极易溶于水的有机盐和水溶助长剂增加有机成 分的水溶性，优化提取效率。用水溶助剂提取可明显减少有机溶剂用量，降低提 取生物活性成分过程中的污染【3 0 1 。本章拟用两种水溶助剂提取效果进行比较，并 探讨所选水溶助剂的最佳提取工艺。 3 2 4 1 水溶助剂的选取 称取2 o g 样品粉末2 份，分别用2 0 m l 浓度为2 m o l l 的水杨酸钠( n a s a l ) 和异丙苯磺酸钠( n a c u s ) ，在4 0 下浸提6 h 后，过滤，加提取试剂定容至1 0 0 m l ， 从中吸取2 m l 样液，氮吹近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l i ) m a b 指示 剂和3 m l 酸母液，室温放置3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，4 7 0 n m 处测定并记录 1 4 西南人学硕士学位论文第3 章材料与方法 吸光度，计算类柠檬苦素得率，比较两种水溶助剂的效果。 3 2 4 2 水溶助剂提取种子中类柠檬苦素的单因素实验 ( 1 ) 浸提时间的确定 称取2 o g 样品粉末4 份，用2 0 m l 浓度为2 m o l l 的异丙苯磺酸钠，分别在4 0 下浸提2 、4 、6 、8 、1 0 h 后，过滤，定容至l o o m l ，从中吸取2 m l 样液，氮吹近 干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温放置 3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，4 7 0 1 1 m 处测定吸光度，并计算得率，观察浸提时间 对类柠檬苦素溶出的影响。 ( 2 ) 提取剂浓度的选择 称取2 0 9 样品粉末6 份，用浓度分别为0 5 、1 、1 5 、2 、2 5 、3 m o l l 的异丙 苯磺酸钠2 0 n ：l l ，在4 0 下浸提6 后，过滤，定容至l o o m l ，从中吸取2 m l 样液， 氮吹近干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m l d m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室 温放置3 0 i 】洫后，以空白溶剂做参比，4 7 0 眦处测定吸光度并计算得率。 ( 3 ) 提取温度的确定 称取2 0 9 样品粉末5 份，用2 0 m l 浓度为2 m o 垤，的异丙苯磺酸钠，分别在2 0 、 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 下浸提6 h ，过滤，定容至1 0 0 h 儿，从中吸取2 m l 样液，氮吹近 干，甲醇定容至2 m l ，分别迅速加入3 m u ) m a b 指示剂和3 m l 酸母液，室温放置 3 0 m i n 后，以空白溶剂做参比，4 7 0 1 1 m 处测定吸光度，并计算得率，考察温度对提 取效率的影响。 ( 4 ) 料液比的确定 称取2 0 9 样品粉末5 份，分别加入l o 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 i n l 浓度为2 m o 帆，的 异丙