（发酵工程专业论文）富含酪氨酸新型抗菌肽（trpi）免疫机理的研究.pdf

摘要利用胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白制备一种富含酪氨酸且具有抗菌作用的免疫活性肽( t r p i ) 。纯化后的产物t r p i 经s d s - p a g e ( u r e as d s - p a g e 及t r i c i n es d s - p a g e )及毛细管电泳( c e ) 分析为单一蛋白质组分使用洋菜孔洞扩散法测定了其对大肠杆菌的抑制作用，结果表明酶解液及纯化后的t r p i 均具有较好的抗菌活性。将用t r p i 处理过的大肠杆菌固定后，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染，通过透射电镜观察，发现与对照组相比，t r p i 对大肠杆菌的主要作用是细菌胞膜破裂，内容物外泄而最终导致细胞死亡。m t t 法实验结果表明t r p i 在体外可以极其显著地刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖( p o 0 0 1 ，s i = 2 1 3 ) 。给b a l b c 小鼠灌服t r p i 后，定期测定小鼠摄食量、体重，脾脏和胸腺质量，计算脾脏和胸腺指数。结果表明纯品t r p i 对小鼠体重无明显影响，对摄食量具有下调作用，酶解液、粗品和纯品t r p i 均能显著促进小鼠脾脏指数( p = 0 0 0 4 0 0 1 ) 和胸腺指数( p 尾静脉给药组 口服组。以上事实表说明t r p i 通过粘膜免疫系统对细胞因子网络，尤其是对发炎缅胞因子和抗炎细胞因子平衡作用的影响最大。综上所述，t r p i 可以在体外抗菌，显著刺激小鼠淋巴细胞的增殖，在体内可以上调小鼠免疫器官脏器指数，发炎细胞因子i l 一1b 、i l - 6 以及抗炎细胞因子i l 一1 0及i l 一4 ，进一步揭示了t r p i 通过调节细胞因子的生成束促进机体的免疫功能可能是其免疫调节作用的机制之一。对t r p i 免疫机理的研究是建立在对其抗菌机理的研究基础之上，对它的作用机理的深入阐明，展示了其作为抗菌，免疫调节剂的可能性与应用前景，并为其在功能性食品、医药或其它领域的应用方面奠定理论基础。关键词：牛乳酪蛋白：免疫活性肽；t r p i ；免疫机理：细胞因子a b s t r a c tt y r o s i n e - r i c hp e p t i d eo fi m m u n o s t i m u l a t i n g ( t r p i ) w a ss e p a r a t e df r o mt r y p t i cc a s e i nh y d r o l y s a t e s ( t c h ) t r p iw a sf o u n dt ob eah o v e lc a s e i n - d e d v e da n t i m i c r o b i a lp e p t i d a谢t ho b v i o u si m m t m o s t i m u l a t i n ga n da n t i m i c r o b i a lp r o p e r t i e s t h ep u r i f i c a t i o no ft r p iw a sp r o v e db ys d s p a g e ( u r e as d s p a g e & t r i c i n e s d s - p a g e ) a n dc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ( c e ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep e p t i d ew a so fh i g hp u r i t y a g a rd i f f u s i o nt e s tw a su s e dt or o v e a la n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so ft c ha n dp u r l f l e dt r p i t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tb o t ho ft h e mh a v es t r o n ga n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e st oe j c o i l e c o l i ,t r e a t e dw i t ho rw i t h o u tt r p i ，w a si m m o b i l i z e d 。d o u b l es m i n e db yu r a n i u ma c e t a t ea n dl e a r lc i t r a t ea n df i n a l l yo b s e r v e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e ( t e m l t h er e s u l t ss h o w e dt h ee e l lw a l la n dm e r n b r a n cr u p t u r eo fe c o l ia n dt h ec ) a o p l a s m i cc o n t e n tl e a k g el e n dt ot h ef i n a ld e a t ho fc e i l st r e a t e dw i t ht r p i n 把r e s u l t so fi nv i t r oe x p e r i m e n t ( m t t ) i n d i c a t e dt h a tt r p ic a nv e r ys i g n i f i c a n t l ye n h a n c e p r o l i f e r a t i o n o f m o u s e l y m p h o c y t e s ( p o 0 0 1 ，s i 乏1 3 ) a l s o ，o r a la d m i n i s t r a t i o no ft r p ii nb a l b cm i c ew a sc a r r i e do u tf o raf u r t h e rs t u d yo nt h ei m m u n o s t i m u l a t i n ga e t i v i t yo f t r p i f e e di n t a k e b o d yw e i g h ta n di n d i c e so fi m m u n eo r g a n $ w e r ed e t e r m i n e dp e r i o d l y t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt r p ih a dn oo b v i o u se f f e c to nb o d yw e i g h tw i t hal o wd o w n r e g u l a t i o no nf e e di n t a k e w h i l en om a t t e rt c h p a r t i a l l yp u r i f i e do rf u l l yp u r i f i e dt r p ic a ns i g n i f i c a n t l yp r o m o t ei n d i c e so f m o u s es p l e e n ( 旷o 0 0 4 0 0 1 ) a n dt h y m u s ( a l s op c a u d a lv e i ni n j e c t i o ng r o u p o r a la d m i n i s t r a t i o n a l lo ft h ea b o v ee v i d e n c e ss u g g e s t e dt h a tt r p im a ya f f e c tc y t o k i n en e t w o r kt oi m p r o v ei m m m m i t ya n dt h ee f f e c tw a st h es t r o n g e s tt h r o u g hm u c o s e “m m u n e t os o mu p ，t r p ic a nr e v e a ls t r o n ga n t i m i c r o b i a la c t i v i t y ，s i g n i f i c a n t l ye n h a n c ep r o l i f e r a t i o no fm o u s el y m p h o c y t e si nv i t r oa n du p r e g u l a t ei n d i c e so fm o u s es p l e e na n ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s es o m ec y t o k i n el e v e l si nv i v o t h er e g u l a t i o no fc y t o k i n ep r o d u c t i o nt oi m p r o v et h ei m m u n es y s t e mm a y b eo n eo fi t si m m u n em e c h a n i s m n l es t u d yo nt h ei i n m u n em e c h a n i s mo ft r p iw a sb a s e do nt h a to na n t i m i c r o b i a lm e c h a n i s m t h ef u n h e re l u c i d a t i o no fm e c h a n i s mo fa c t i o no ft r p iw i l lb r i n gf o r t ht h ep r o s p e c to fi t 鲢a n t i m i c r o b i a la n di m m u n o m o d u l a t o ra n da c c e l e r a t et h ea p p l i c a t i o no ft r p i 髂f u n c t i o n a lf o o do ro t h e rm e d i c a la n dp h a r m a c e u t i c a lp r a c t i c e si nt h e o r y k e yw o r d s ：c a s e i n ；i m m u n o p e p t i d e s ；t y r o s i n e r i c hp e p t i d eo fi m m u n o s t i m u l a t i n g( t r p i ) ；i m m u n em e c h a n i s m ；c y t o k i n e s第一章前言第一章前言1 1 引言科学研究表明，乳蛋白不仅仅是一种营养蛋白，同时还具有许多重要的生理功能。乳是婴儿出生后大自然馈赠给婴儿的第一道宿主防御系统，对于新生儿的生存非常重要叫抗感染蛋白就是早期的科学发现之一，并且长期以来人们一直认为乳蛋白对于婴幼儿及成人的健康有益。母乳可以提供能够直接抵抗病菌的物质，包括免疫球蛋白( i g a ，i g m 和i g g ) 、酶、激素、生长因子和神经内分泌肽等多种生物活性物质，对哺乳动物的生长和发育尤其是胃肠道发育方面有着起极其重要的作用“1 。其中，对于免疫球蛋白，乳过氧化物酶，溶菌酶和乳铁蛋白研究较为广泛。乳中的生物活性物质有的直接存在于乳中，有的则隐藏在乳蛋白序列中。其中的乳铁蛋白显示出免疫调节作用，甚至可以独立启动宿主防御的级联放大反应。而乳蛋白经过生物体胃肠遭蛋白酶的水解就可以释放出许多具有多种生物活性的肽类物质。这些信号蛋白簇的作用机制多种多样。因此这种保护性的策略就可以提供给机体一个广泛的应对感染的反应。这些保护功能的相互配合，使婴幼儿能以不成熟的免疫系统抵抗各种外来病菌和毒素而健康地生长发育。在各种食物源蛋白质免疫活性肽中，乳源活性肽是研究的最早，也最为深入的一类免疫活性肽，乳中的生物活性肽，或自然存在于乳中，或以无活性的状态存在于乳蛋白前体物中。1 ，经酶解可释放出具有生物活性的小肽。随着乳源生物活性肽研究的不断深入，人们又渐渐认识到乳蛋白及其水解物的小肽的多种生物学功能的重要性。目前，从现有的乳蛋白的水解物中发现新的肽类物质已成为研究热点。至今，这些底物包括q 一乳白蛋白，b 一乳球蛋白以及所有的酪蛋白组分及乳铁蛋白。这些短肽的免疫调节作用现在被定义的越来越详细了。1 2 乳源生物活性肽生物活性肽( b i o l o g i c a l a ct i v e pe p t i d e s ，b a p ) 是一类具调节机体新陈代谢、参与生命活动调节的肽类物质。乳源活性肽具有人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素、酶抑制剂、抗菌、抗病毒、降血脂等作用，食用安全性及高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展i ；i 景的功能因子。第一章前言乳中自然存在的活性肽包括：e g f 、t g f 、n g f 、i g f - i 、i g f - i i 、t g f - 8 、胰岛素、血管活性肠肽、生长激素释放因子等，这些内源的生物活性肽在生物体内作为载体和运输工具，不仅可以将人们平常所食的营养输送到人体各个部位，充分发挥其功能，而且还可以作为神经递质，传递信息，这些生物活性肽具有极强的活性和多样性，可全面调节人体生理功能，增强人体生理机能“1 。这类生物活性肽能够刺激新生哺乳动物胃肠道的成熟和发育，对婴幼儿正常的生长发育和萨常生理功能的发挥起着非常重要的作用，而且对调节成年人的生理功能、预防疾病和感染也具有重要意义6 。乳中的第二类生物活性肤源于乳蛋自水解后的产物，它们均以无活性的形式存在于乳蛋白前体物中，只有在胃肠道蛋白酶的作用下水解成较小的短肽后，它们的活性才被释放出来，从而才能发挥其生理功能。近年来的研究表明，乳蛋白不仅在胃肠道中，在蛋白酶的作用下能够产生具有重要生理功能的生物活性肽，在体外条件下，调节适当的p h 值、温度、底物浓度和酶解时间，用适当的蛋白酶或蛋白酶的组合水解乳蛋白特别是牛乳酪蛋白，也可获得具有与体内生理功能和活性相同的生物活性肽。1 9 7 9 年b r a n t l 从牛乳一酪蛋白的酶解液中分离得到了两个类吗啡活性肽( o p i o i dp e p t i d e s ) 。据报道，这两种肽可以对豚鼠回肠纵肌神经节起到吗啡样活性作用，并证实与内源性类吗啡活性肽具有相同的活性，这是源于食品蛋白活性肽的最早例子。类吗啡活性肽，具有类吗啡受体配体活性，能与机体内的类吗啡受体结合，可起到镇痛、止泻、抑制胃肠蠕动的功能”3 可调节人体情绪、呼吸、脉搏、体温的作用，增强机体对氨基酸和其它营养物质的吸收功能，与普通镇痛剂不同的是，它经过消化器官进入人体后无任何副作用m ；到目前为止，人们已经发现了多种生物活性肽，如：免疫活性肽( i m m u n o p e p t i d e s ) ，能够增强机体免疫力，刺激机体淋巴细胞的增殖，增强巨嗜细胞的吞噬功能，提高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率，并具有抗肿瘤功能；酪蛋白糖肽( c a s e y n o g y c o p e p t y d e s ) ，它能够抑制胃酸分泌，并影响肠道激素的释放“”；酪蛋白磷酸肽( c a s e i n p h o s p h o p e p t i d e s , 简称c p p ) ，能与多种矿质元素结合形成可溶性的有机磷酸虢，充当许多矿质元素特别是钙离子在体内运输的载体，促进小肠对钙离子和其他矿质元素的吸收”1 ；抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ) 。是近年来发现并开始研究的一类生物活性肽，体外条件下能抑制细菌的生长，在体内具有类似抗生素的活性。能抑制小鼠感染致病的金黄色葡萄球菌1 ；抗血栓转化酶抑制荆( i n h i b i t o r so fa n t i g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m e ，简称c e i ) ，是种多功能肽，具有调节血压、免疫第一章前言防御和调节神经系统功能的活性“”。此外，近几年还有抗高血压肽( a n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d e s ) 、抗遗忘肽( a n t j a 旧n e s t i cp e p t i d e s ) ，抗血栓活性肽( a n t i t h r o m b o t i cp e p t i d e s ) “”，抗氧化肽、抗爱滋病、降脂肽、减肥肽、降糖肽、激素肽等多种生物活性肽的报道旧”1 。1 2 1 乳源免疫活性肽乳源免疫活性肽是在类吗啡活性肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽，免疫活性肽的研究始于1 9 8 1 年。1 9 8 1 年，j o l l e s 等首次报导用胰蛋白酶水解人乳蛋白，从水解物中分离得到一种具有免疫活性的肽段，它的氨基酸序列是v a l - g l u - p r o i l e p r o t y r ，对应于人乳1 3 一酪蛋白5 4 - - 5 9 的氨基酸残基序列。这个短肽，在体外试验中能增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用，静脉注射，则能增强小鼠对肺炎克氏杆( k e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 感染的抵抗能力“。1 2 1 1 乳源免疫活性肽的定义和分类从广义上讲，免疫活性肽不仅包括免疫活性肽( i m m u n o p e p t i d s ) ，还应该包括其他具有免疫活性的生理活性肽，例如类吗啡肽，除了具有类吗啡活性外，它还能够刺激机体淋巴细胞的增殖，增强机体免疫功能”：抗血栓转换酶抑制剂( a c ei ) ，a c e 在催化血管紧张素活化的同时，也使舒缓激肽失活，后者能促进巨噬细胞增强淋巴细胞移动与淋巴激活酶的分泌“；此外，有些抗菌肽等生物活性肽也具有一定的免疫活性噼1 。从来源上可分为如下凡类：乳清蛋白来源免疫活性肽，酪蛋白源来源免疫活性肽，乳铁蛋白来源的免疫活性肽。乳铁蛋白为乳中微量存在的一种带碳水化合物侧链的含铁蛋白质，其碳水化合物包括甘露糖、半乳塘、岩藻糖、n 一乙酰半乳糖胺和唾液酸等1 。与铁离子具有强烈亲和性的乳铁蛋白以铁不饱和态存在，可以与一些需要铁的细菌竞争结合铁，从而抑制细菌的生长研究还发现，乳铁蛋白以及乳铁蛋白的胃蛋白酶水解物能促进人白血病( h l 一6 0 )细胞的凋亡。乳转铁蛋白b ( 相当于1 7 4 l 氨基酸残基序列) 由乳铁蛋白胃蛋白酶水解得到，乳铁蛋白和乳转铁蛋白b 都可刺激人多形核白细胞( p m n ) 产生嗜中性白细胞活化趋化因子一白细胞介素- 8 ( i l - 8 ) 1 ，这个发现表明，乳铁蛋白和乳转铁蛋白b可能具有活化宿主防御系统的免疫介导剂的作用，这种作用可能是食用牛乳蛋白质可抑第一章前言制癌细胞生长的原因之一。乳清蛋白中免疫活性肽及其功能见表1 - 1 表1 - 1 乳清蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e ! li m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o mw h e ya n df u n c t i o n s肽免疫功能t y r - g l yt y r g l y 。g l y增强人外周淋巴细胞增殖增强人外周淋巴细胞增殖乳转铁蛋白b ( 1 7 4 1 )刺激p m n 产生i l 一8此外，一些其它来源的免疫活性肽近年来也有一些研究。1 2 1 2 免疫活性肽的生理功能免疫活性肽具有极其重要的生理功能，对于新生儿尤为重要。刚出生的婴儿和其它哺乳动物的幼崽，其免疫系统尚未发育完全，免疫系统的功能也不健全，t 细胞和b 细胞处于非活性状态，所以，它还不能有效地抵御外界各种病原微生物的入侵，免疫能力低下。而乳蛋白作为新生哺乳动物的主要食物来源，无论从进化意义还是从个体发育的意义上来讲，都责无旁贷地负担起弥补新生儿免疫系统缺陷的责任汹。许多研究表明，吸吮母乳的新生儿的胃肠道能够迅速的发育成熟，丽不吮吸母乳则没有上述变化”1 。乳中除含有免疫球蛋白和各种细胞因子外，动物乳蛋白经胃肠道的蛋白酶水解后释放出的多种生物活性肽，尤其是免疫活性肽也在很大程度弥补了新生儿的免疫功能缺陷，提高了其免疫系统的抵抗力。最近，香港大学医学院微生物学系冠状病毒研究小组和因发明阻止艾滋病毒进攻的“鸡尾酒疗法”而闻名的美藉华裔科学家、美国艾伦戴蒙德艾滋病研究中心主任何大一博士，2 0 0 3 年5 月1 1 日在香港联合举行的记者会上宣布，可借鉴艾滋病治疗经验，利用合成的多个氨基酸链即“多肽”，阻止非典型肺炎病毒入侵人体细胞。多肽防“非典”的主要作用机理是：诱导和促进t 细胞分化、成熟；调节t 细胞亚群比例，使c d 4 c d 8趋于j 下常；增强巨噬细胞的吞噬能力；增强红细胞免疫功能；提高自然杀伤细胞( n k )活力；提高白介素一2 ( i l - 2 ) 的产生水平和受体表达水平：增强外周血单核细胞y 一干扰素的产生：增强血清中s o d 活性：可显著增加淋巴细胞功能；能有效地防止辐射和放化疗及其它污染中毒后白细胞数量的减少：能有效地抑制肿瘤细胞生长；可以防止恶性肿瘤放化疗引起的c d 4 + 降低，起到改善免疫功能的作用。4第一章前言总体来说，免疫活性肽具有以下几个生理功能：促进肠粘膜的免疫反应，维持肠道健康和抑制肠道感染；能够增强机体免疫力。刺激淋巴细胞增殖、提高巨噬细胞吞噬能力：提高机体抵御外界病原物质感染的能力，降低机体发病率，并具有抗病毒，抗肿瘤的功能。另据有关报道，免疫活性肽还具有阻止h i v l 入侵细胞的功能。1 2 1 3 免疫活性肽发挥生理功能的剂量免疫活性肽发挥其生理功能的浓度极低。例如，从人乳酪蛋白的消化物中获得了二种免疫活性肽，位于人b 一酪蛋白的5 4 - 5 9 残基上的六肽( v a l - 6 l u - p r o - i l e - p r o t y r ) ，和位于旷乳清蛋白5 1 - 5 3 残基上的三肽( g l y - l e u - p h e ) ，可以以极低的刹量( 如0 1 “m o l l ) 就可通过注射，激活鼠腹腔臣噬细胞吞噬绵羊红血细胞( s h e e p r e d b l o o d c e l l s ，s r b c ) 的作用；六肽以0 5 m g k g 的剂量、三肽l m g k g 的剂量腹腔或皮下注射可使老鼠免受肺炎克氏杆菌 k e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 的感染1 。从牛酪蛋白中分离出的免疫活性肽：三肽l e u - l e u - t y r ( 位于b 一酪蛋白的1 9 1 - 1 9 3 残基上) 、六肽t h r - t h r - m e t p r o l e u t y r ( qs 卜酪蛋白的c 末端) ，在与人乳酪蛋白的三肷( g l y - l e u - p h e ) 相似的剂量时，即0 1 p m o l l 时，就能激活巨噬缅胞的吞噬作用，而六肽以0 0 5 d m o l l 的剂量即可达显著活性。此外，二肽t y r - g l y ，在1 0 m o l l 的浓度下，就能显著增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞的增殖。提高小鼠抵抗肺炎克氏杆菌( k j e b s i e l l a p n e u m o n i a e ) 感染的能力：t y r g l y - g t y 作用的浓度更低，仅为1 0 2 m o l l ，并且可表现出最大刺激的7 4 “。1 2 1 4 免疫活性肽作用机理到目前为止。免疫活性肽的作用机理还不清楚。有研究认为，富含疏水氨基酸的肽段与免疫活性有关，较强的疏水作用可能使它们能够与细胞膜相互作用而增强其免疫活性。长畦慎一等。1 研究了牛乳蛋白质对细胞增殖的影响，用胰蛋白酶对k 一酪蛋白水解3 小时，用高压液相色谱( h p l c ) 分离肽片段时发现，一部分水解物有促迸免疫细胞增殖的作用，而这种作用随浓度的增加而增强。由此推测其可能的机理是：免疫活性肽与其受体结合后，活化细胞内存在的酪氨酸激酶活性，通过g 蛋白的介导，活化第二信使，进而活化一系列信号传导系统，最终传递至细胞核内，启动d n a 复制。活性肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质，生物体内已发现几百种肽，是机体完成各种复杂的生理活动必不可少的参与者“1 。所有细胞都能合成多肽物质，其功能活动也受多肽的调节。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。肽的生理和药理作用可能是激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，第一章前言或通过控制d n a 转录或翻译而影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。但是，这也只是一种假说，免疫活性肽的作用机理还需要进一步的深入研究。虽然从1 9 8 1 年开始研究到现在，免疫活性肽的研究已经有二十多年的历史了，人们也发现了多种不同序列的免疫活性肢，但免疫活性肽的研究进展与其它种类的生物活性肽相比，发展速度是比较缓慢的。主要的原因是纯品免疫活性肽制备困难，同时活性检测方法比较麻烦，需要傲大量的动物试验才能得出结论。而到目| ； 为止，免疫活性肤的研究仍然处于实验水平还没有一套较为有效的制备方法，所以进行动物实验就有很大的困难。就目前我们所掌握的资料来看，德国以h a n s e e i s e l 为首的联邦乳品研究中心( f e d e r a ld a i r yr e s e a r c hc e n t e r ) 物化研究所( i n s t i t u t ef o rc h e m i s t r ya n dp h y s i c s ) 在这方面做了大量工作，发现了多种免疫活性肽并对其部分生物活性做了一定的检测，目前，正在进行深入研究。1 2 2 酪蛋白源免疫活性肽酪蛋白大约占所有乳蛋白质的8 0 ，酪蛋白包括d ( s 1 ) 和a ( s 2 ) 酪蛋白，b 一酪蛋白以及x 一酪蛋白。酪蛋白是乳中的主要蛋自质，乳源活性肽主要来源于酪蛋白，乳本身又在哺乳动物的进化中起到了重要的作用。这些隐藏在母体蛋白内的活性肽，只有通过体内或体外酶水解释放出来才能发挥其生物学作用。据郑华报道酪蛋白水解物能提高小鼠的体重及体增重，增强免疫功能啪口服酪蛋白的胰蛋白酶水解物可以增强小鼠腹腔巨噬细胞和血液中吞噬细胞的吞噬作用。”1 。1 2 2 1os 一酪蛋白源免疫活性肽as 一酪蛋白在体内或体外水解能释放比多种具有生物活性的多肽，主要包括阿片激动活性肽、免疫调节肽、酩蛋白磷酸肽、抗高血压肽、抗菌肽等。研究表明，从a 一酪蛋白的胰蛋白酶酶解液中分离得到的肽段t h r t h r m e t p r o l e u t y rr 相当于。扩酪蛋白c 末端1 9 41 9 9 序列，该肽具有健进小鼠巨噬细胞的吞噬活性，增强小鼠对k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的抵抗能力“1 。在p h值为6 7 条件下，经凝乳酶处理的。扩酪蛋白水解物中分离纯化得到一个具有免疫增强作用的短肽片断，氨基酸排列顺序与nr 酪蛋白n 术端l 2 3 残基序列相同，并命名为拟杀细胞粒体( i s r a c i d i n ) 。体外条件下能抑制葡萄球菌、枯草杆菌、肺炎克氏杼菌、八叠球菌、肺炎链球菌等。在体内条件下，具有类似抗生素活性，能够保护小鼠免受致死性的会黄葡萄球菌感染“”：该肽既有预防感染的作用，又能通过刺激胞吞作用和免疫反应使动物产生长效的免疫抵抗能力。另外还发现，将改肽注射入牛或羊的乳腺，可保6第一章前言护小鼠免受c a n d i d a a b i c a n s 感染，也可预防乳腺炎 u o ) o a r g t y r l e u - g 1 y t y r l e u - g 1 u( 9 0 9 6 ) 和a r g t y r l e u - - g l y t y r l e u ( 9 0 9 5 ) 是经胃蛋白酶处理分离纯化得到的这两个短肽，具有阿片样活性，且五肽的类吗啡活性较强。研究证明，两短肽也具有免疫调节活性，可增强淋巴细胞增殖，提高自然杀伤细胞( n k ) 活性，促进嗜中性白细胞的移动汹1 自从发现t 淋巴细胞上具有阿片受体以来。阿片受体及其不同亚型已在许多免疫细胞中被分离提取出，研究发现除t 、b 淋巴细胞外，人类外周血n k 细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞和多形核白细胞等细胞表面都具有阿片受体或受点，这些存在于免疫细胞上的阿片受体同阿片样活性物质结合后。具有增强t 、b 淋巴细胞的功能、提高n k 细胞的细胞毒作用等功效。p h e p h e v a l a l a - p r o p h e p r o g l u p h e g l y l y s ( 2 3 3 4 ) 具有增强巨噬细胞吞噬作用，静脉注射具有抵抗k e b s i e l ap n e u m o n i a 感染的能力。该肽也是血管紧张素转换酶抑制剂( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ，简称c e i ) ，c e i 具有抗高血压的生理功能，另外，血管紧张素转换酶一i ( a c e - i ) ，能起到活化血管紧张素转换酶一i i ( a c e i i ) 及钝化舒缓激肽( b r a d y k i n i n ) 的作用，而舒缓激肽是急性炎症反应的调节因子，能够刺激吞噬作用，增强淋巴细胞向炎症部位迁移，诱导淋巴细胞分泌淋巴因子“1 。or 酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表i - 2 。1 2 2 2b 一酪蛋白来源免疫活性肽从胃一凝乳酶的8 一酪蛋白酶解液中分离纯化得到一个短肽，它位于b 一酪蛋白c 末端1 9 3 2 0 9 残基，该肽在分裂原和抗体均不存在的情况下，也可明显得直接刺激鼠淋巴细胞增殖。六肽p r o g l y - p r o i l e - p r o - a s n ( 6 3 6 8 ) 和三肽l e u - l e u t y r ( 1 9 l 1 9 3 ) 都具有明显促进抗体形成。增强鼠巨噬细胞吞噬作用，增强小鼠对k l e b s i e l l ap n e u m o n i a 的抵抗能力。另外，三肽还可增强抗体依赖型t 细胞增殖汹1 。b 一酪啡肽是人或牛1 3 一酪蛋白经胰蛋白酶酶解处理的产物，其氨基酸组成与0 一酪蛋白6 0 7 0 片断的残基序列相同，具有类吗啡活性，也具有调节免疫系统的功能“。这类肽可能直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽。穿过肠粘膜进入外周血液再透过血脑屏障与脑中的阿片肽受体结合，即使是成年人在大量饮用牛奶后，在其小肠中也能检测到显著量的该种阿片肽的免疫反应物。牛b 一酪啡肽在低于1 0 洲剂量情况下，就具有明显抑制人淋巴细胞增殖的作用汹1 。另外还发现，这种肽具有增强鼠抵抗k e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染的能力“。第一章前言b 一酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表卜3 1 2 2 3x 一酪蛋白来源免疫活性肽k 一酪蛋白的胃一胰蛋白酶酶解液具有明显刺激分裂原处理的人淋巴细胞增殖作用的短肽。k 一酪蛋白胰蛋白酶酶解得到p h e p h e s e t a s p l y s ，它相当于k 一酪蛋白1 7 2 1 氨基酸残基，具有促进抗体形成，增强人和鼠巨噬细胞吞噬活性。t y r g l y ( 相当于3 8 3 9 氨基酸残基序列) 是另一个免疫调节肽，可直接通过小肠壁到达淋巴细胞，可刺激人外周血淋巴细胞( p b l ) 增殖，功能类似于c o n a 。k 一酪蛋白中免疫活性肽及其功能见表卜4 。表1 - 2or 酪蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e l 2a s t - c a s e i nd e r i v e di m m u n o p e p t i d e sa n df u n c t i o n s肽免疫功能t h r l t h r 。m e t p r o + l e u 。t y r( 1 9 4 - 1 9 9 )促进巨噬细胞吞噬活性增强鼠抗k e b s i e l an e u m o m a 感染能力a r g t y r 。l e u - g ly 。t y r 。l e u - g l u( 9 0 9 6 )增强淋巴细胞增殖，提高自然杀伤细胞活性，促进嗜中性白细胞移动w g 。t y r 。l e u g l y 。t y r 。l e u( 9 0 - 9 5 )同上p h e p h e v a l a l a p r o p h e p r o -g l u 。p h e 。g ly 。l y s( 2 3 - 3 4 )促进巨噬细胞吞噬活性，增强鼠抗k e b m e l ap n e u m o n i a 感染能力，c e i第一章前言表卜31 3 一酪蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e l - 3i m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o m 3 - c a s e i na n df u n c t i o n s肽免疫功能t y r 。g l n 。g l n p r o 。v a l 。l e u g l y 。p r o 。v a l 。a r g刺激淋巴细胞增殖一g l y p r o p h e p r o i l e 1 1 e - v a l ( 1 9 3 2 0 9 )p r o g i y p r o i l e p r o a s n ( 6 3 - 6 8 )促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性l e u l e u - 1 y r ( 1 9 1 1 9 3 )促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性，刺激抗体依赖型t细胞增殖t y r p r o p h e 。p r o 。g l y 。p r o 。i l e 。p r o - a s r l 。s e r - - l e u( 6 0 - 7 0 )抑制淋巴细胞增殖增强鼠抗朋e b s i e l l ap n e u m o n i a 感染能力t y r 。g l n g l n 。p r o v a l 。l e u 。g l y 。p r o v a l a r g( 1 9 3 2 0 2 )c e ia l a p r o t y r p r o g l n a r g ( 1 7 7 1 8 3 )c e i表卜4k 一酪蛋白源免疫活性肽及其功能t a b l e l - 4l m m u n o p e p t i d e sd e r i v e df r o mg - c a s e i na n df u n c t i o n s肽免疫功能p h e p h e s e r a s p l y s ( 1 7 2 1 )促进抗体形成，促进巨噬细胞吞噬活性t y r g l y ( 3 8 3 9 )刺激淋巴细胞增殖1 3 免疫活性肽与细胞因子网络1 3 1 评价免疫功能常用的实验方法目前，对于免疫调节促进剂的研究方法主要分为两大类：其一是动物活体实验，即9第一章前言体内实验( ，1 7r ，0 ) ，其二是体外实验( ，口r ，t ，口)按照我国保健食品功能评价法规，对于种具有免疫调节活性的功能评价指标是：采用动物喂养实验或人体试食实验，考查受试物对动物细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫的相关检测指标( 图1 - 1 ) 中，有两个( 包括两个) 以上的检测结果显阳性，方可确定该物质具有免疫调节活性。免疫功能细胞免疫淋巴细胞jj 迟发型 ln k 细胞转化实验ii 超教反应ll 活性测定体蘸免瞳抚体 血璃溶血蠢ll 免疫璋蚤白生成细胞1i 含量测罡ij 含量的测定图卜1 免疫刺激评估方法f i g l 1m e t h o d sf o re v a l u a t i o no f i m m u n o s t i m u l a t i n ga c t i v i t y1 3 2 细胞因子网络自7 0 年代未命名自细胞介素( i l ) 以来，众多的细胞因子被发现或重新命名，并且随着分子生物学等相关学科的迅速发展，各种细胞因子的结构也被相继阐明。细胞因子种类繁多，其生物学活性也复杂多样，对与它们在机体正常状态的维持和不同疾病发生中的作用的研究报道也越来越多第一章前言图1 - 2 细胞因子网络信号传导途径模式图f i g l - 2c y t o k i n en e t w o r ks i g n a l i n gt r a n s d u c t i o np a t h w a y s作为免疫系统的一郝份不回的细胞协调他们之同的功能，包括8 细胞t 细胞，h 赡细胞，嗜中性辁细胞嗜碱细胞，噬曙红细胞这些细胞中的每一个在免疫系统中具有不同的作用使用叫傲细胞因子的分泌型的因子与其它免疫细胞进行交流，这些细胞因子包括自介索。t n f 和其它的十扰索h 噬细胞使用细胞因了来激活8 细胞和t细胞的特异性的抗原依赖性的反应和其它类型的非特异性的反应束吞噬外束异物并且是抗原提呈鲰i 脆。t 细胞分泌多种因子协调和澈活对特异性抗原的免疫反应，例如在响应抗原时t 细胞和b 细胞活化t h 细胞的作用嗜曙红细胞嗜中性粒细胞和嗜碱细胞的增殖和活化也对细胞因子作出应答细胞因子的交流通常都是局部的在一个组织内或在紧密接近的细施之闰。每个细胞园子可以被一套细胞分泌并且及兵另一套靶细胞的反应经常包括分泌细胞因子的细胞像i l - l ，干扰索及i n f 这鹃细胞因子激活对痔染或足伤害做i n 响应的广泛的炎症反心射一屿细胞闪了既有更加特异性的功能，如随后这些例子i l - 2 澈活b 细胞和t 细胞的增矾和活化i l 一4t h 2 型细胞分化过程中在炎症反应中以及抗体类型的转换中起作用i l 一5 擞活炎症期问嗜曙红细胞的产生和成熟i l - 8 是一个趋化因子可以将嗜中性牲细隗，嗜碱细胞私t 细胞吸弓l 到炎症位点i l 1 2 和i l _ 1 8 也涉及t h 细胞的分化i l - o 明显地抑制促炎症细胞因子的分泌的作用。不州的细胞嘲了的功能。，免疫细胞之间复杂的相互作用对于适与的免疫功能来说十分重要提供者g l e n nc r o s t o n p h v 摘自中国免疫学信息学州第一章前言1 3 2 1 细胞因子细胞因子( c y t o k i n e ) 是一类由各种免疫细胞和非免疫细胞产生的与炎症、造血和免疫应答密切相关的具有生物活性的多肽或糖蛋白。通常所说的细胞因子包括淋巴细胞因子、单核细胞因子及其他细胞产生的细胞因子。i 3 2 2 细胞因子的共同特性绝大多数细胞因子是低分子量( 1 5 - 3 0 k o ) 的可溶性的蛋白或糖蛋白，多以单体形式存在，少数以双体( 如i l - i o ) 或三聚体( 如t n f ) 形式存在：细胞因子可以自分泌( a u t o c r i n e ) 、旁分泌( p a r a c r i n e ) 或内分泌( e n d o c r i n e ) 分别作用于自身细胞、邻近细胞或远处靶细胞：一种细胞可产生多种细胞因子，不同类的细胞可产生一种或几种相同的细胞因子，一种细胞因子可对不同的靶细胞产生不同的生物效应一多样性，几种不同的细胞因子也可对同一细胞产生相同或相似的生物效应一相似性，多种不同的细胞因子的生物效应可表现为拈抗性或协同性，从而形成了复杂的细胞因子网络( 图1 - 3 ) ，其作用不仅局限于免役系统，还是联系免疫系统与神经内分泌系统的桥梁。1 3 2 3 细胞因子的分类( 1 ) 白细胞介素( i n t e r l e u k i n 。i l ) ，作用于t 细胞、b 细胞、单核细在白细胞等免疫活性细胞群体的增殖和活化过程中发挥重要作用。( 2 ) 干扰素( i n t e r f e r o n ，i f n ) 具有抗胂瘤和免疫调节作用，具有干扰病毒感染和复制的能力，根据来源和理化性质，可将其分为a 、b 和y 。至少五种类型，i f n - d 1 3 连接在i 型受体上，也称为i 型i f n ，主要有白细胞和病毒感染的组织细胞产生：i f n y连接在i i 型受体上，也称为i i 型i f n ，主要由活化t 细胞和n k 细胞产生。( 3 ) 集落刺激因子( c o l o n ys t i m u l a t i n g ，f a c t o r ，c s f ) 能刺激多能干细胞和不同发育阶段的干细胞增殖和分化并在半固相培养基中形成相应集落，包括粒一巨噬细胞集落刺激因子( g 艟一c s f ) 、单核巨噬细胞集落刺激因子( m - c s f ) ，粒细胞集落刺激因子( g - c s f ) ，此外还包括红细胞生成素( e r y t h r o p o i e t i n ，e p o ) 、干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r ，s c f ) 和血小板生成素( t h r o m b o p o i e t i n 。t p o ) 。( 4 ) 肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) t 9 7 5 年由c a r s w e l l 首先发现并报道的一种能使肿瘤组织出血坏死的物质，分为t n f - o 和t n f - 8 两种i j i 者又称为恶质素，主要由单核巨噬细胞产生：后者又称为淋巴毒素( 1 y m p h o t o x i n ，l t ) ，主要由活化t 细胞产生。( 5 ) 生长因子( g r o w t hf a c t o r ，g f ) 具有刺激细胞生长的作用，包括转化细胞生长第一章前言因子( t g f ) 、表皮细胞生长因子( e 6 f ) 、血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 、成纤维细胞生长因子( f g f ) 、神经生长因子(