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发酵豆粕深度酶解生产低分子大豆多肽 摘要 大豆肽是大豆蛋白水解后形成的分子量小于1 0 0 0 0d a 的多肽混合物。与大豆 蛋白质相比，大豆肽具有更良好的理化性质，在食品、医药、化妆品等领域有着广 泛的应用前景。本研究首先以d h 和t c a s n i 为指标研究了温度，料水比和时间对 发酵豆粕初步水解的影响，得到最佳水解条件。而后对酶解法和微生物发酵法相结 合生产小分子量大豆多肽的方法进行探索研究，筛选出最佳的外加蛋白酶，并确定 了蛋白酶深度水解豆粕发酵液的最佳条件，最后对最终酶解产物进行了分析，根据 本研究结果，得出以下主要结论：发酵豆粕的最佳水解条件：温度5 0 ，料水比1 ： 6 ( w w ) ，水解时间6h 。以豆粕发酵液为底物，从胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，p r o t a m e x ， a l c a l a s e 2 4 l 和n e u t r a s e 五种蛋白酶中筛选发现胰蛋白酶有较强的进一步水解发酵 豆粕的能力，通过单因素和正交试验确定胰蛋白酶水解的最佳工艺条件为：酶解 温度6 0 ，p h8 5 ，酶底比例：6 0 0u g 发酵豆粕，底物浓度：1 3 ( w w ) ，酶解时 间为l 小时。在此条件下产物的水解度达到3 2 3 ，较酶解前提高了6 1 ，t c a s n i 达到6 7 2 ，较酶解前提高了9 9 。其中7 7 8 的产物分子量分布在5 3 8 2 6 5 9d a 范围内。 关键词：酶解；豆粕；发酵；蛋白酶；多肽 华中农业人学2 0 0 9 届毕业生硕十论文 a b s t r a c t t h es o y b c a np o l y p e p t i d e sa r eac o m p o u n dw i t hm o l e c u l a ru n d e r10 0 0 0d aw h i c h a r eo b t a i n e df r o mh y d r o l y s i so fs o y b e a np r o t e i n c o m p a r e dw i t hs o y b e a np r o t e i n ， s o y b c a np o l y p e p t i d e sh a v em o r es u p e r i o r p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s ，a l s o b i o a c t i v i t i e s t h e r ea r eg o o dp r o s p e c t i v eo fe x p l o i t a t i o na n da p p l i c a t i o ni nf o o di n d u s t r y a n dm e d i c a lw o r k s w es t u d y e dt h ee f f e c to ft e m p e r a t u r e ， m a t e r i a l - w a t e rr a t i oa n dt i m eo n h y d r o l y s i so ff e r m e n t e ds o y b c a nm e a la c c o r d i n gt od ha n dt c a s n i ，a n do b t a i nt h e b e s th y d r o l y s i sc o n d i t i o n s t h e nw ee x p l o r e st h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so fs m a l ls o y b c a n m e a lp e p t i d e sw h i c hc o m b i n et h eh y d r o l y s i sa n dm i c r o b i a lf e r m e n t a t i o n w es e l e c tt h e b e s tp r o t e a s e ，a n dg e tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rh y d r o l y s i so fs o y b e a r lm e a lb r o t hb y p r o t e a s e f i n a l l yw ea n a l y s et h eh y d r o l y s a t ea n dc o m et ot h ec o n c l u s i o n ：t h es t u d y s h o w st h eb e s th y d r o l y s i sc o n d i t i o n si st e m p e r a t u r e ：5 0 c m a t e r i a l w a t e rr a t i o ：1 ： 6 ( w w ) ，r e a c t i o nt i m e ：6h t r y p s i ni sm o r ee f f i c i e n tt h a np a p a i n ，p r o t a m e x ，n e u t r a s e a n da l c a l a s e 2 4 l t r y p s i nc a nm a k eai n c r e a s eo fd ha f t e rh y d r o l y z i n gf e r m e n t e dl i q u i d o fs o y b c a nm e a l a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fs i n g l e f a c t o ra n do r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s ，t h e o p t i m u mc o n d i t i o n sf o rh y d r o l y z i n gf e r m e n t e dl i q u i do fs o y e i e a nm e a lb yt r y p s i ni s t e m p e r a t u r e ：6 0 ，p h8 5 ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ：13 ( w w ) ，r a t i oo fe n z y m et o s u b s t r a t e ：6 0 0u g ( s o y b e a r ld r e g s ) t h er e a c t i o nt i m ei s1ha c c o r d i n gt ot h em o l e c u l a r w e i g h td i s t r i b u t i o no fh y d r o l y s a t ea n a l y z e db ym e a n so fg f c u n d e rt h i sc o n d i t i o nt h e d ho ft h eh y d r o l y s a t e sr e a c h3 2 3 w h i c hh a sa ni n c r e a s eo f6 1 t h a nt h ed ho ft h e h y d r o l y s a t e sb e f o r et h eh y d r o l y s i s t h et c a s n io ft h eh y d r o l y s a t e sr e a c h6 7 2 w h i c h h a sa ni n c r e a s eo f9 9 t h a nt h et c a s n io ft h eh y d r o l y s a t e sb e f o r et h eh y d r o l y s i s a n d 7 7 8 o f t h e mh a v et h em o l e c u l a rw e i g h tr a n g ef r o m5 3 8d at o2 6 5 9d a k e yw o r d ：s o y b e a r lm e a l ；f e r m e n t a t i o n ；p r o t e i ne n z y m e ；p e p t i d e i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 毡 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同- r 作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：p f 穰时间：加罗年6 月f ) 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 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要生物活性的短肽通过对动植物源蛋白进行适度蛋白酶水解释放并鉴别出来，如乳 蛋白肽( m e c a n nkb ，2 0 0 6 ) ，蛋类蛋白肽( m a r t am ，e ta 1 ，2 0 0 6 ) ，小麦蛋白水解物 ( w a n gjs ，e ta 1 ，2 0 0 7 ) 。h o k i 鱼骨架蛋白肽( y o u n gj j ，2 0 0 5 ) ，大豆蛋白肽( d e e s l i ew d ，c h e r y a n ，m ，1 9 9 8 ) 由于这些蛋白资源十分丰富和廉价，而且容易进行工业化生 产，所以这类研究越来越受到科学家和各国政府的关注。现代营养学研究发现：人 类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是以小肽形式消化吸收的，以游离氨基酸 形式吸收的比例很小。进一步的试验又揭示了肽比游离氨基酸消化更快、吸收更多， 表明肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。 1 1 。2 大豆多肽的概念 以大豆，豆粕或大豆蛋白为主要原料，用酶解法或微生物发酵法生产的，且分 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕士论文 子量分布在1 0 0 0 0d a 以下的肽称为大豆多肽( q b t 2 6 5 3 2 0 0 4 ) 。大豆多肽的氨基酸 组成与大豆蛋白质完全一样，必需氨基酸平衡且含量丰富。大豆多肽与传统大豆食 品蛋白相比，具有易消化吸收、能迅速供给机体能量、低豆腥味等特性，特别是具 有降低血清胆固醇、降血压和促进脂肪代谢等独特的生理功能( 黄骊虹，1 9 9 9 ) ，因 此大豆多肽是比大豆蛋白更为优质的、新型的大豆深加工产品及营养品，已在食品、 医药、日用化工等领域中显示出了诱人的开发应用前景。 1 2 大豆多肽的理化特性 大豆多肽的水溶性很高，即使在5 0 的高浓度下仍具流动性；约1 0 浓度的大 豆蛋白质水溶液一经加热就会凝固，但对于大豆多肽的水溶液来说，不产生凝固现 象；从p h 与溶解性看，大豆蛋白质在等电点p h 4 3 附近会形成沉淀( 刑小鹏，2 0 0 0 ) ， 但大豆多肽在等电点范围内，仍然保持溶解状态；另外大豆多肽还具有抑制蛋白质 形成凝胶、较强的吸湿性和保湿性、调整蛋白质食品的硬度、改善口感和易消化吸 收等特性。由此可见，大豆多肽很适合于生产速溶饮品和高蛋白质食品( 焦迎春等， 2 0 0 2 ) 。 大豆多肽的理化特性是影响其加工、贮存稳定性、口感质量及最终产品的营养 和生物效价的重要因素。在水解过程中肽键的降解，导致了三个主要变化：1 、可离 解基团( n h 4 + ，c o o 。) 数目的增多，导致了亲水性及净电荷数的增加；2 、分子结 构的改变，导致了包埋于内部的疏水性残基暴露于水相中；3 、多肽链长与分子量的 降低，导致了肽的许多关键性参数，如溶解性、粘度、乳化作用、起泡性、胶凝性 及风味等较之完整蛋白完全不同。 1 3 大豆多肽的生物活性 1 3 1 大豆多肽的低抗原性 大豆蛋白的7 s 和儿s 亚基有很强的抗原性。同时由于一些蛋白质酶抑制剂的存 在，使大豆蛋白消化率和生物学效价大大降低。有研究表明酶联免疫测定法( e l i s a ) 测得大豆多肽的抗原性比s p i 的大豆蛋白降低了0 1 1 ，因此大豆多肽可满足对 大豆蛋白易发生过敏反应的人群对氨基酸的需要，尤其适用于生产低抗原性的婴儿 食品( 蒋文强等，2 0 0 4 ；b o n v i s u ts ，1 9 7 6 ) 。 2 发酵豆粕深度酶解生产低分了大豆多肽 1 3 2 大豆多肽降胆固醇、降血压和促进脂肪代谢 研究表明，大豆多肽能阻碍肠道内胆固醇的再吸收，并能促使其排出体外。可 能是由于大豆多肽刺激甲状腺分泌量的增加，从而促进了胆固醇胆汁酸化而无法再 吸收。大豆蛋白经酶水解后得到大豆多肽可抑制阻碍a c e 酶催化水解血管紧张素i 转化成为血管紧张素i i ，从而防止血管强烈收缩，达到降低血压的功效。另外，日 本专家( 李里特等，2 0 0 2 ) 以小白鼠为试验对象研究得出，大豆多肽能促进脂肪代 谢，具有减肥作用。因此，大豆多肽可作为保健食品的功能性成分，对老年人高血 压、高胆固醇、心脑血管疾病有很好防治作用( 丁建华，2 0 0 3 ) 。 1 3 3 大豆多肽促进蛋白质的合成和抗疲劳作用 运动员在剧烈运动初期，首先消耗体内的三磷酸腺苷磷酸肌酸，然后分解糖原， 经苯丙酸至乳酸，在这期间还产生三磷酸腺苷又可作为能源，当氧供给充分时乳酸 经三羧酸循环水解成二氧化碳，同时释放能量，这一过程需要有充分的蛋白质来补 充，大豆多肽的有效摄取，恰恰可以作为肌肉蛋白质的来源。通常在运动1 5 3 0m i n 之间以及睡眠后6 0m i n 时刺激蛋白质合成的激素分泌达到顶峰( 盛国华，1 9 9 3 ) ，若 能在这段时间内适时提供消化、吸收性良好的大豆多肽对运动员肌肉力量的增加是 非常有效的。有研究观察了大豆多肽饮料对耐力项目运动员促进恢复的作用( 王启 荣等，2 0 0 4 ) ，研究表明，补肽组运动后的体重、瘦体重比实验前明显提高，血清睾 酮水平比对照组显著提高，而无补肽组等级则显著下降，同时血清肌酸激酶亦下降。 1 3 4 大豆多肽促进微生物发酵 大豆多肽有促进微生物生长发育和活跃代谢的作用，相同组成的氨基酸和大豆 蛋白都无此作用。研究发现大豆多肽对保加利亚乳杆菌有显著的促生长作用( 张蓉 真，1 9 9 7 ；赵毅，2 0 0 0 ) ，并且能促进酸奶产酸，对酸奶的流变特性有一定的影响( 潘 思轶等，2 0 0 3 ；刘瑶等，2 0 0 6 ) 。 1 3 5 大豆多肽的抗氧化性 环境污染、摄取氧化变质的食品以及身体代谢过程产生的自由基会对生活细胞 和组织造成严重的氧化损伤，导致动脉硬化、心血管疾病、癌症和身体的衰老等 ( c o l l i n s a ，2 0 0 5 ；h o e l z lc ，e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。许多研究表明，蛋白酶解肽具有抗氧化 作用且无毒副作用，可以添加到日常膳食中清除自由基的危害。2 0 世纪9 0 年代， 3 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕上论文 国内学者通过大量实验研究，进一步证实了大豆多肽的抗氧化能力最强的分子量范 围应在2 0 0 0d a 以下，水解度范围为1 7 - 1 9 。但到目前为止，抗氧化肽的结构 和活性的关系以及抗氧化的机理都还没有完全被弄清楚，有待进一步的研究( s a t i o k ，e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 1 4 大豆多肽的生产制备 大豆多肽的生产，主要是将大豆蛋白质用化学或酶解的方法水解成小分子的肽 链，其水解过程是蛋白质首先被水解成大分子肽，再得n d , 分子肽。如果进一步水 解，将最终得到游离氨基酸。作为大豆多肽的产品主要是以小分子肽为主，因此， 无论是化学法还是酶水解法，其工艺关键是对大豆蛋白水解过程的控制，应尽量减 少游离氨基酸的生成( 孙呖，2 0 0 4 ；张玲华，2 0 0 1 ) 。 一般水解方法有化学水解和酶水解。化学方法是用酸或碱水解，酸碱水解虽然 简单，成本低，但不易控制生产。同时因生产条件较苛刻，氨基酸会受到损害而降 低其营养价值，因此目前很少采用此方法( 李书国，1 9 9 7 ) 。与酸水解和碱水解比较， 酶法水解蛋白质具有多种优点，目前是大豆蛋白制备大豆多肽工业化生产的主要方 法。另外生物活性肽还可以通过基因工程，化学合成的方法生产，这不仅需要相当 大的投入，且其安全性还需要进行研究。 1 4 1 酶水解法制备大豆多肽 采用酶法生产活性肽是当前研究的热点。酶法水解具有许多物理、化学改性无 可比拟的优点。首先它可以在不降低营养价值的前提下改善蛋白质的功能特性，扩 展其在食品加工中的应用范围。而且酶解法生产活性肽安全性极高、易于推广。与 酸碱水解方法比较，酶水解有以下优点：首先它是一种不完全、不彻底的水解，其 产物主要是肽而不是氨基酸；其次是反应的条件温和，反应时间短，效率高，不产 生消旋作用，也不破坏氨基酸；最后是产品纯度高，产物易分离等( b e m a r d ils ，e t a 1 ，1 9 9 1 ；d epm ，e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在酶水解工艺中，正确选择使用蛋白酶是生产 上的关键。当酶系确定之后，下一步就要对水解过程的各种参数进行优化控制。控 制的主要参数有水解温度、p h 值、酶与底物比。水解结束时，必须及时终止水解过 程。终止的方法有改变水解体系p h 或温度而使酶失活，也可以采用微滤法除去酶分 子而终止反应。改变p h 一般会发生中和反应生成盐，增加了后续工艺脱盐的一步， 微滤超滤所用设备费用较高，升高温度则是比较理想的终止酶解的方法。 蛋白酶的选择是生产大豆多肽的关键。目前商业化蛋白酶主要来源于植物、动 物性和微生物。动物来源的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等，该类 蛋白酶的专一性较强，如胰蛋白酶能专一性地酶切赖氨酸和精氨酸结合的肽键，胰 4 发酵豆粕深度酶解生产低分子大豆多肽 凝乳蛋白酶能水解酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的肽键。有许多报道用动物来源 的蛋白酶制备活性肽( t e s c h e m a c h e rh ，2 0 0 3 ；g o b b e t t im ， e t a 1 ，2 0 0 4 ； v e r m e i r s s e nv ，e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，但由于来源有限和提取技术要求较高，从而导致价 格较昂贵。植物来源的蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶等。该类 蛋白酶普遍存在专一性不强、作用位点较多，酶解效率低等问题，但其来源丰富且 价格便宜，所以在生产中被广泛使用。如杨萍等( 杨萍等，2 0 0 2 ) 、龙彪等( 龙彪等， 2 0 0 6 ) 用木瓜蛋白酶分别水解青鳞鱼蛋白、乌鸡蛋白，取得了较好的效果。微生物来 源的蛋白酶有细菌性蛋白酶( 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶等) 和霉菌性蛋 白酶( 毛霉蛋白酶、栖土曲霉、黑曲霉等) 等。其中细菌性来源的蛋白酶很多都已经 商品化生产和销售了，如丹麦n o v o 公司生产的碱性蛋白酶a l c a l a s e 、复合蛋白酶 p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 等。随产酶技术日趋成熟，微生物蛋白酶价格逐渐 降低，而且来源广泛，是比较理想的酶源( 汪建斌等，2 0 0 2 ) 。 1 4 2 发酵法生产大豆多肽 发酵法就是在生产中用特殊菌种代替复合酶系，利用其在生长代谢过程中大量 分泌胞外蛋白酶对大豆蛋白进行酶解，微生物菌体直接参与生化代谢，作用于大分 子蛋白原料，可以合成、分泌小肽物质。微生物发酵法不同于酶法，酶法只是简单 的切割肽键，发酵法通过微生物自身的复合酶系可以酶解释放出高浓度特定的活性 肽；通过微生物的代谢、发酵可以合成许多复杂的初级代谢产物和次级代谢产物， 但酶法不能。许多豆制品、乳制品的发酵就是基于这个原理。但发酵乳制品中的蛋 白水解度小，生物活性肽含量少。因此用发酵法生产大豆多肽应在菌种及生产工艺 上进行改进和优化，提高其水解蛋白的能力。与利用纯酶制剂水解大豆蛋白制备大 豆多肽的工艺相比，发酵法生产大豆多肽具有明显优势，可以很好的解决目前大豆 多肽生产中成本居高不下，所得产品苦味难除等问题。 1 5 课题研究的目的和意义 豆粕是大豆经浸提脱油后的副产品，是目前使用最多、最广泛、最优质的植物 性蛋白质饲料原料。其蛋白含量较高、氨基酸组成较合理、消化吸收率较高等等， 是大部分饲料配方中不可缺少的原料( 陈路，2 0 0 4 ) 。 发酵豆粕是豆粕在特定的环境条件下经过多种益生菌发酵处理的产物。上世纪 九十年代，国外开始将发酵豆粕应用于饲料行业中( 吴建平，1 9 9 8 ) ，而国内的饲料 行业也在2 0 0 2 年开始出现新的发酵豆粕产品面世。发酵豆粕应用于饲料行业中具有 极大的优势，豆粕发酵技术能最大限度地消除大豆蛋白中的脲酶、胰蛋白酶抑制因 5 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕士论文 子、凝血素、大豆球蛋白、0 一伴球蛋白、植酸等抗营养因子，有效地降低蛋白质的 分子量，提供小分子蛋白和小肽的无抗原优质蛋白源，并可产生大量益生菌，具有 提高适口性、消化吸收率，促生长减少拉稀等功效。 本试验室拥有一套成熟的豆粕发酵工艺，且生产出的发酵豆粕产品的市场定位 是饲料。本课题的研究目的在于升级产品的市场定位，将大豆多肽定位于更高层次 的食品行业和保健品行业。这无疑要求我们生产出的大豆多肽具有更高的品质，从 直观上讲，就是使大豆多肽的分子量更低，甚至得到分子量在1 0 0 0d a 以下的寡肽。 为了达到这一研究目的，本课题主要工作在于生产工艺的改良。目前大豆多肽 的生产方法主要有两种，酶水解法和微生物发酵法。两种方法各有利弊。酶水解法 是利用外源添加的蛋白酶水解大豆蛋白，其优点是生产条件温和，生产过程易于控 制，但缺点是蛋白酶的添加量大，生产成本高。微生物发酵法不添加外加的蛋白酶， 而是添加微生物进行发酵，利用微生物代谢所产生蛋白酶将大豆蛋白水解成小分子 的多肽，其优点是生产成本相对较低，有利于工业化生产，缺点是微生物产生的蛋 白酶的酶活和水解能力有限，只能将大豆蛋白水解成大分子的多肽，而不能够进一 步的水解成为小肽。因此单纯的酶水解法，或微生物发酵法都不能够满足工业化生 产中高效，低成本的要求。 为克服目前我国在大豆活性肽研究和产业化中的不足，本研究将两种方法结合 起来，先利用微生物发酵将大豆蛋白水解成大分子的多肽，再添加蛋白酶进行深度 水解，旨在获得由2 - 4 个氨基酸残基组成的寡肽，同时控制生产成本。主要研究内 容分为以下几部分：发酵豆粕水解工艺的研究；外加蛋白酶的筛选；发酵豆粕深度 酶解条件的优化。 本论文在新的思路上研究大豆多肽的制备工艺，期望在低成本的前提下获得小 分子量大豆多肽，为进一步研究寡肽的生理功能和产业化生产打下重要基础。使大 豆多肽作为新一代质优价廉的高级蛋白营养素和多功能的生理活性物质，广泛的应 用于保健品和食品领域，为人们的健康和经济的发展贡献力量。 2 材料和方法 2 1 试验材料 2 1 1 材料与主要试剂 微生物菌株 高温豆粕 胰蛋白酶和木瓜蛋白酶 实验室保藏 北京金泰得生物科技有限公司出产 武汉华顺生物技术有限公司分装 6 发酵豆粕深度酶解生产低分了大豆多肽 溴甲酚绿 甲基红 考马斯亮蓝g 2 5 0 牛肉膏 蛋白胨 3 7 9 6 甲醛溶液， 西德s e r v a 公司 西德s e r v a 公司 f l u k a 进口分装 北京新锐生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 福临试剂及其他化学试剂均为分析纯。 2 1 2 主要仪器设备 7 2 2 s 可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司制造 p h s 一3c 精密p h 计 上海日岛科学仪器有限公司 h h 数显恒温水浴锅江苏省金坛市佳美仪器厂 c r 一2 1 g 型高速冷冻离心机h i t a c h l 日本日立公司 h y p _ n 型消化炉上海纤检仪器有限公司 凯氏定氮仪上海沛欧分析仪器有限公司 h q l l 5 0 c 恒温摇床 武汉中科科仪技术发展有限责任公司 恒温磁力搅拌器金坛富华仪器有限公司 电子分析天平上海垒固仪器有限公司 a k t ap u r i f i e r1 0 0 蛋白质纯化仪 瑞典安玛西亚 微量移液器，滴定装置 e p p e n d o r f 公司 各种常用玻璃器皿如三角瓶、培养皿、烧杯、容量瓶、试管、玻璃棒等为生物 化学实验耗材。 2 2 检测方法 2 2 1 微生物产蛋白酶酶活测定 酶活力定义为在4 0 。c 、p h7 5 时，1m i n 水解酪蛋白产生lu g 酪氨酸所需酶量 为1 个蛋白活力单位( u ) ( 张龙翔，1 9 9 9 ) 。 标准曲线的制作以1 0 0u g n m 酪氨酸标准液配制成浓度梯度差为1 0 的7 种浓 度溶液，将配制的各种酪氨酸溶液各取1m l ( 做平行实验) ，分别加入o 4mn a 2 c 0 3 溶液5m l ，福林试剂1m l ，置4 0 恒温水浴中显色2 0m i n ，在6 8 0h i l l 处比色， 作空白对照。 活力的测定以酪蛋白作为底物。反应体系为：取预处理的粗酶液1m l ，在4 0 恒温水浴中预热5m i n 后，加入2 酪蛋白溶液1m l ，准确反应1 0m i n ，加入0 4 m 三氯醋酸2m l ，立即摇匀，静置1 0m i n 后过滤，取l m l 滤液，加入0 4mn a 2 c 0 3 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕十论文 溶液5m l 后，加入福林试剂1m l ，摇匀后置4 0 恒温水浴中显色2 0m i n ，在 6 8 0n n l 处比色，空白对照为粗酶液中先加入三氯醋酸，再加入酪蛋白溶液，其余操 作同前述。 蛋白酶活力测定：在相应p h 条件下，按上述方法测定。 计算公式：u = 吾笔竽 公式( 1 ) u 一酶活力单位，u g w 一用回归方程中计算出的相当的酪氨酸的质量，u g n 一酶液稀释总倍数 4 一反应溶液的总体积，m l 1 0 一酶解反应时间，m i n m 一样品质量，g 2 2 2 蛋白质含量测定 蛋白质是含氮的有机化合物。样品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以 硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。( 何照 范，1 9 9 8 ) 参照( g b t5 0 0 9 5 1 9 8 5 食品中蛋白质的测定方法) 取酶解液样品进行测 定。 2 2 3 水解度( d h ) 的测定 蛋白质水解度( d h ) 的定义为水解过程中打开的肽键占蛋白质肽键总数的百分 比，本文采用甲醛法测定( 赵新淮，1 9 9 5 ；余勃，2 0 0 5 ) 。 豆粕完全水解液的制备：称取相当于1 5g 粗蛋白含量为4 0 的豆粕放入烧杯中， 加入1 5 0m l6m h c i ( 即底物中粗蛋白浓度为4 ) ，密封后放入1 1 0 。c 1 2 0 的烘箱 中水解2 4h 。取出过滤，吸取1 0m l ( 臣p 蛋白含量为o 4g ) 再加入2 0m l 水，用4 0 的n a o h 调p h 到7 5 8 0 ，然后测定。 酶解酶解样品水解液的制备：取酶解液5m l 于小烧杯中加入6 0m l 蒸馏水， 测定水解度。 酶解样品水解度( d h ) 的测定：用精密p h 计指示其p h 值，并用o 1m o l f l 的 n a o h 溶液滴定水解液到p h 8 2 ，加入1 0m l3 7 的甲醛溶液( 用n a o h 滴定到 p h 8 2 ) ，再用o 1m o l f l 的n a o h 滴定到p h 8 2 。记录加入甲醛后把溶液滴定到p h 8 2 所耗碱量。p h 值测量使用精密p h 计。然后按照下式计算蛋白质的水解度： 发酵豆粕深度酶解生产低分子大豆多肽 蛋白质水解度( ) = v 1 ，v o ， m l n 1 v l l lm o n o v o 0 0 v o ， m n v v n m o n o v o v o o v o ：滴定原料滤液所耗碱量，m l ； m o ：称取的原料的质量，g ； n o ：原料的粗蛋白含量，； v o ：所取原料滤液的体积，i i 止； v o o ：溶解原料所用水量，m l v 1 ，- 滴定酶解样品滤液所耗碱量，m l ； m l ：称取的酶解样品的质量，g ； n l ：酶解样品的粗蛋白含量，； v i ：所取酶解样品滤液的体积，m l ； v 溶解酶解样品所用水量，m l v ：滴定完全水解液所耗碱量，m l ； m ：制完全水解液时称取原料的质量，g ； n ：制完全水解液时原料的粗蛋白含量，； v ：所取完全水解液的体积，m l ； v n ：制完全水解液时所用盐酸量，m l 2 2 4 三氯乙酸一可溶性氮指数( t c a - s ni ) 的测定 将酶解液与浓度为1 0 的三氯乙酸以1 ：1 比例混合， 后取上清液用凯氏定氮法测定( 肖凯军，1 9 9 5 ) 。 t c a - n s i = ( n1 n o ) 10 0 式中：t c a n s 卜三氯乙酸可溶性氮得率，； n l 一在1 0 t c a 中可溶性氮，m g ； n 0 一原料中总氮，m g 2 2 5 分子量分布的测定 1 0 0 公式( 2 ) 4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n 公式( 3 ) 用高效凝胶过滤色谱进行分子量的测定( 王梅，1 9 9 8 ；赵新淮，1 9 9 6 ；马永强， 2 0 0 1 ) 。将s u p e r d e x7 51 0 3 0 0g l 凝胶过滤柱用0 2m o l l 的磷酸盐缓冲液平衡l h ， 9 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕士论文 样液于1 2 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，取上清液5 0 0ul 上样测定，洗脱液为o 2m o l l 的磷酸盐缓冲液。分子量标准品为牛血清白蛋白( m r6 7 0 0 0 ) ，卵清蛋白( m r4 3 0 0 0 ) ， 核糖核酸酶a ( m r1 3 7 0 0 ) ，蛋白酶抑制剂( m r6 5 1 2 ) ，维生素b 1 2 ( m r1 3 5 5 ) ，胞嘧 啶核苷( m r 2 4 3 ) 。 2 3 试验方法 2 3 1 豆粕的固态发酵 取一定量的豆粕按1 ：1( w w ) 的料水比加水混合，并按1 o 的质量比接种菌 株a ，将其分装到2 5 0m l 的广口瓶中，放置于3 0 的培养箱中培养2d ，备用。 2 3 2 发酵豆粕水解条件的确定 豆粕经固态发酵后菌株a 分泌了大量蛋白酶，设计了单因素实验来确定这些蛋 白酶水解豆粕中大豆蛋白的条件。单因素试验的基本条件为温度5 0 。c ；料水比1 ：5 ( w w ) ；水解时间6h ，改变其中一个条件，固定其他条件分别考察温度，料水比和 水解时间对d h 和t c a s n i 的影响。 2 3 2 1 温度对水解反应的影响 取5 个2 5 0m l 广口瓶，每个广口瓶中精确称取2 0g 大豆酶解豆粕( 以原始干重 计) ，加入1 0 0m l 水，分别在4 0 、4 5 、5 0 、5 5 、6 0 恒温水解6h ， 灭活酶，离心取上清，以d h 和t c a s n i 为指标，研究温度对水解反应的影响，确 定最适水解温度。 2 3 2 2 料水比对水解反应的影响 发酵豆粕( 以原始干重计) 和加水量按l ：3 、1 ：4 、l ：5 、1 ：6 、1 ：7 、1 ：8 、 1 ：9 、1 ：1 0 混合，分别在最适温度下恒温水解6h ，以d h 和t c a s n i 为指标， 确定最适料水比。 2 3 2 3 作用时间对水解反应的影响 发酵豆粕( 以原始干重计) 和水按最佳料水比混合，在最适温度下恒温水解， 分别在1h 、2 h 、4h 、6h 、8h 、1 0h 、1 2h 取样4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n ，以d h 和 t c a - s n i 为指标，确定最适作用时间。 1 0 发酵豆粕深度酶解生产低分子大豆多肽 2 3 3 发酵豆粕水解液的制备 发酵豆粕按料水比l ：6 加水，5 0 。c 水浴6h ，1 2 1 灭菌3 0m i n 。备用。 2 3 4 豆粕发酵液的检测 取适量发酵液，4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n 后取上清液测定d h ，t c a s n i 和分子 量分布。 2 3 5 蛋白酶的筛选 本实验选用了五种蛋白酶，分别是动物来源的胰蛋白酶，植物来源的木瓜蛋白 酶，和微生物来源的p r o t a m e x ，a l c a l a s e 2 4 l ，n e u t r a s e ，首先测定了五种酶的酶活， 然后根据各种酶的说明书在表l 所述的条件下，将蛋白酶添加到豆粕发酵液中深度 酶解，不同时间分别取样，1 0 0 灭酶活1 0m i n ，然后4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n 后取 上清液测定d h 和t c a s n i 。 表1 蛋白酶的作用条件 t a b l e1o p e r a t i o nc o n d i t i o n so f p r o t e i ne n z y m e s 2 3 6 胰蛋白酶的单因素酶解试验 选择胰蛋白酶作为外加蛋白酶优化酶解条件，单因素试验的基本条件为温度5 0 ；p h8 o ；酶底比1 0 0 0u g 豆粕；底物浓度1 0 ，改变其中一个条件，固定其他 条件分别考察温度，p h ，酶底比和底物浓度对加酶前后d h 和t c a s n i 提高值的影 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕士论文 响。酶用量：1 0 0 、1 7 5 、2 5 0 、5 0 0 、7 5 0 、1 0 0 0 u g 底物；底物浓度：6 、8 、1 0 、 1 2 、9 、1 4 ；p h ：6 0 、7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 ；反应温度：3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、 8 0 ：反应时间：1 8 0 m i n 。 2 3 7 胰蛋白酶正交试验 在单因素试验的基础上，以温度，p h ，酶底比和底物浓度为考察对象，以加酶 前后d h 的提高值为考察指标，采用l 9 ( 3 4 ) 正交试验确定最优的水解条件，因素及 水平安排见表2 。 表2 正交试验因素水平设计 t a b l e2d e s i g no ff a c t o r sa n dl e v e r so fo r t h o g o n a ld e s i g n 2 3 8 胰蛋白酶酶解产物分子量分布的测定 在最佳水解条件下进行酶解试验，分别在0 ，1 ，2 ，3h 取样灭酶活，酶解液于 1 2 0 0 0r m i n 离心1 0m i n ，取上清液5 0 0ul 测定分子量分布。 2 3 9 胰蛋白酶水解1h 后，酶解产物d h 和t c a - s nl 的测定 胰蛋白酶在最佳水解条件下深度酶解豆粕发酵液1h ，取样灭酶活，4 5 0 0r m i n 离心1 0m i n 后取上清液分别测定d h 和t c a s n i 。 3 结果和分析 3 1 发酵豆粕水解条件的确定 3 1 1 水解温度的确定 由图1 1 看出d h 和t c a s n i 随着温度的变化而变化，较高或较低的温度都不 利于酶解的进行，温度在4 0 5 0 范围时，体系内分子运动的激烈程度加剧，再加 1 2 发酵豆粕深度酶解生产低分子大豆多肽 上底物溶解性增高，酶与底物之间的接触机会增多，因此酶解反应的速度加快， t c a s n i 和d h 都迅速提高；当温度升高到5 0 。c 时，t c a s n i 和d h 均达到最大， 分别为5 5 9 和2 4 8 ，当温度高于5 0 。c 这一最适温度时，随着温度的升高，t c a s n i 和d h 又开始逐渐下降。由此得出本实验设计条件下，发酵豆粕水解的最适温度为 5 0 。 3 0 0 2 5 o 2 0 0 零 工1 5 0 o 1 0 0 5 0 4 04 55 05 56 0 温度( ) 图1 - 1 温度对d h 和t c a s n i 的影响 f i g 1 - 1e f f e c to ft e m p e r a t u r eo nd h a n dt c a - s n i 3 1 2 料水比的确定 6 0 o 5 5 0 5 0 4 5 4 0 磊 2 3 5 0 3 0 0 图1 2 是料水比例对发酵豆粕水解的影响。发酵豆粕按照一定的比例与水混合 后，微生物产生的蛋白酶在水中与大豆蛋白结合进行酶解，因此，料水比直接影响 酶的浓度从而影响蛋白酶与底物的结合机率。从图中可以看到随着加水比例的提高， d h 和t c a s n i 也随之增大，加水比从1 ：6 到1 ：1 0 产物d h 和t c a s n i 的变化 趋于平缓。在工业化生产中，料水比过高会降低蛋白浓度，为了达到一定的得率而 不得不反复生产，导致生产成本增加，因此综合各个因素考虑，选择料水比为1 ：6 较为合适。 华中农业大学2 0 0 9 届毕业生硕十论文 2 9 o 2 8 0 2 7 0 2 6 0 ，、2 5 o 登2 4 o w 广、- 2 3 0 u 2 2 o 2 1 0 2 0 o 1 9 o 心心心冬心 6 2 o 6 0 0 5 2 0 5 0 0 料水比 图1 2 料水比对d h 和t c a s n i 的影响 f i g 1 - 2e f f e c to ft h er a t i of o rs o y b e a nm e a lt ow a t e ro nd ha n dt c a - s n i 3 1 3 水解时间的确定 d h 和t a c s n i 随水解时间的变化规律如图1 3 所示。在水解反应的初期，水 解速率高，d h 和t a c s n i 迅速提高，在6h 分别达到2 6 4 和5 7 3 。6h 到1 2h 的过程中d h 和t a c s n i 随水解时间延长而提高，涨幅小且速率缓慢。延长水解时 间虽能得到较高的d h 和t a c s n i ，但生产周期长，耗能高。因此综合考虑，选择 水解时间为6h 。 2 8 0 2 7 0 2 6 0 萼2 5 o 工 o 2 4 0 2 3 o 2 2 0 124681 01 2 时间( h ) 图l - 3 水解时间对d h 和t c a s n i 的影响 f i g 1 - 3e f f e c to fh y d r o l y s i st i m eo nd