（发酵工程专业论文）啤酒酿造过程中酯类物质影响因素的初步研究.pdf

摘要 摘要 酯类是啤酒风昧的主要构成，在啤酒的风格与质量方面起着重要的作用。酯类的适 量存在，给啤酒带来果香味。随着一些啤酒酿造新工艺的出现，酯类含量降低的问题显 得十分突出，醇酯比偏高，饮后感不适。本论文针对这一问题，在建立检测方法的前提 下，在实验室规模下全面系统地考察了糖化参数和发酵参数对酯类物质生成的影响，旨 在通过调整酿造工艺参数提高酯类生成量，提高淡爽型啤酒的香气，改善酒体的风味和 饮后感。 本文利用顶空固相微萃取气相色谱质谱联用技术，建立了一种准确检测啤酒中高 级醇和酯类的方法，预处理条件为：萃取温度5 5 、萃取时间4 8m i n ，n a c i 添加量为 0 3 9g m l 。确定了乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙 酯、乙酸苯乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇等物质的线性范围，标准偏差( r s d ) 为 2 1 2 1 0 8 1 ，各物质相对峰面积与浓度之间线性相关系数均大于0 9 5 ，回收率达到 9 3 1 2 1 0 2 4 9 ，证明了该方法的可靠性和可行性。对市售的啤酒样品进行检测，样品 的总酯含量均值仅为1 6 1 2m g l ，醇酯比偏高，均值达到5 6 ：1 ，醇酯比过高，饮后感 不适。 麦汁的组成影响酵母的生理活性。通过单因素试验探讨糖化参数的改变对酯类物质 生成的影响，借助于多指标实验设计优化糖化工艺，确定酯牛成量最高时的糖化工艺为： 辅料比4 0 4 5 ，定型麦汁p h5 5 ，麦汁浓度1 2o p ，蛋白质休止时间5 7m i n ，硫酸锌添 加量0 4 1m g l ，葡萄糖占总糖的1 0 2 1 ，最终得到啤酒中酯类的含量达到1 7 6 6m g l ， 比对照提高了3 3 8 9 。 发酵工艺影响酵母体内酶系的作用及酵母的繁殖代谢。借助于单因素试验和多指标 综合分析，确定发酵工艺为接种量为1 7 2 l o7 个m l ，丰酵温度为1 2 5 ，贮酒时间为 2 1d ，啤酒中酯含量达到2 4 1 7m g l ，比对照提高了4 3 4 4 。 为了研究工艺的可行性，进行了优化酿造工艺和普通酿造工艺的e b c 发酵实验。 结果表明：优化工艺酿造的啤酒与普通啤酒相比，麦汁和啤酒的各项指标相差不大，发 酵过程正常，总酯含量达到3 0 1 5m g l ，比对照工艺提高了1 1 2 倍，醇酯比为3 1 1 ：1 ， 比对照工艺下降了1 2 7 。啤酒经品尝，口感纯正爽口，酯香醇厚，饮后感舒适，无不 良气味。 关键词：啤酒，酯类，糖化，发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t a l t h o u g he s t e r sw e r et r a c ec o m p o u n d si nb e e r ，t h e ye x t r e m e l yc o n s t i t u t e da ni m p o r t a n t g r o u po fa r o m a t i cc o m p o u n d sf o rt h ef l a v o rp r o f i l e o p t i m a la m o u n to fe s t e r sc o u l db n n g b e e rh a r m o n i o u sf l a v o r w i t ht h ei n t r o d u c t i o no fm o d e mb r e w i n gp r a c t i c e s t h ec o n t e n to f e s t e r sw a so f t e ns u b o p t i m a l a n dt h ef l a v o ri n t e n s i t yo fe s t e r sw a s 、e a k e r m e a n w h i l e ，t h e r a t i oo fh i g h e ra l c o h o l s - t o - e s t e r sh a du n d e r g o n eas h a r pi n c r e a s e ，r e s u l t i n gi nac l e a rd e c r e a s e i nb e e rq u a l i t y b a s e do nt h i s t h et h e s i sf o c u s e ds y s t e m i c a l l yo nt h ef a c t o r st h a ti n f l u e n c e d t h ec o n t e n to fe s t e r sd u r i n gb r e w i n gi nl a b o r a t o r y s c a l ef e r m e n t a t i o n s m o r e o v e r ，t h em a s h i n g a n df e r m e n t a t i o nd e s i g nw e r ea d ju s t e di no r d e rt oi n c r e a s ee s t e rc o n t e n t a na n a l y t i c a lm e t h o dw a sd e v e l o p e dt od e t e r m i n eh i g h e ra l c o h o l sa n de s t e r si nb e e rb y s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o ni nc o m b i n a t i o nw i t hg a sc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( s p m e g c m s ) t h eh e a d s p a c es o l i dp h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o n d i t i o n sf o rh i g h e ra l c o h o l s a n de s t e r sa n a l y s i si nb e e rw e r eo p t i m i z e db yp l a c k e t t b u r m a nd e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c e a n a l y s i s t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ee x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e5 5 ，e x t r a c t i o nt i m e4 8m i n a n ds a l td o s i n g0 3 9g m l r e s p e c t i v e l y t h ew o r k i n gc h i v el i n e a rs c o p eo fe t h y la c e t a t e ， i s o b u t y la c e t a t e ，i s o a m y la c e t a t e ，e t h y lh e x a n o a t e ，e t h y lc a p r y l a t e ，e t h y lc a p r a t e ，p h e n y le t h y l a c e t a t e ，p r o p a n o l ，i s o b u 够la l c o h o l ，a n di s o a m y la l c o h o lw e r ee s t a b l i s h e d t kr e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) w a s2 1 2 1 0 8 l w i t hc o r r e l a t i o nc o e 伍c i e n tm o r et h a n0 9 5 t h e r e f o r e ，t h em e t h o dd e v e l o p e di nt h i sp a p e rw a s s e n s i t i v ea n da c c u r a t e t h ec o n t e n t so fe s t e r sa n dh i g h e ra l c o h o l si nc o m m e r c i a lb e e r ss a m p l e sw e r ed e t e r m i n e d b ys p m e g c m s i tw a sf o u n dt h a tt h em e a nc o n t e n to f e s t e r si nb e e rw a s16 12m g l a n d ， t h em e a nr a t i oo f h i g h e ra l c o h o l s t o e s t e r sw a s5 6 ：1 ，g i v i n gb e e ru n p l e a s a n ta f t e r t a s t e t h ec o m p o n e n to fw o r tp l a y e dac r u c i a lr o l ei ny e a s tm e t a b o l i s m t h u st h ei n f l u e n c e so f m a s h i n gp a r a m e t e r so ne s t e r sw e r es t u d i e d t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t a n dc e n t r a l c o m p o s i t er o t a r yd e s i g nw e r ee m p l o y e dt oo p t i m i z et h el e v e l so fp a r a m e t e r s b yc a n o n i c a l a n a l y s i s t h eo p t i m a ll e v e l so fp a r a m e t e r sf o rh i g h e s tp r o d u c t i o no f e s t e r sw e r ea sf o l l o w s ，t h e r a t i oo fa d j u n c t4 0 4 5 ；p hv a l u e5 5 ，t h eo r i g i n a lg r a v i t y1 2o p ，t h et i m eo fp r o t e i nr e s t5 7 m i n ，t h ed o s a g eo fz n s 0 40 41m g m ，t h eg l u c o s el e v e l10 21 u n d e rt h i sc o n d i t i o n , t h e c o n t e n to f t o t a le s t e r sc o u l dr e a c h1 7 6 6m g l ，i n c r e a s e db y3 3 8 9 ，c o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 t h ef e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sh a ds i g n i f i c a n ti n f l u e n c e so nt h ee n z y m ea c t i v i t i e s f u r t h e r m o r e t h ei n f l u e n c e so ff e r m e n t a t i o np a r a m e t e r ss u c ha sy e a s ts t r a i n ，p i t c h i n gr a t e ， f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e a n ds t o r a g et i m e o ne s t e r sp r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d t h e o p t i m a lf e r m e n m t i o np a r a m e t e r sf o rh i g h e s tc o n t e n to fe s t e r sw e r eo b t a i n e db yc a n o n i c a l a n a l y s i s 。n a m e l yp i t c h i n gr a t e1 7 2 10 7 c e l l s m l ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e12 5 ，a n d s t o r a g et i m e21d ，r e s p e c t i v e l y i nt h i sw a y , t h e c o n t e n to ft o t a le s t e r sc o u l dr e a c h2 4 17m g l ， i n c r e a s e db y4 3 4 4 c o m p a r e dw i mc o n t r 0 1 e b cf e r m e n t a t i o nt e s tw a sc a r r i e do u tt ov a l i d a t et h ec o n c l u s i o n sa b o v e r e s u l t sf r o m o p t i m a lp r o c e s ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to ft o t a le s t e r sw a s 3 0 15m g l ，i n c r e a s e db y1 12 c o m p a r e dw i t ho r i g i n a lp r o c e s s m e a n w h i l e ，t h e r a t i oo fh i g h e ra l c o h o l s t o e s t e r sw a s 3 1 1 ：1 ，d e c r e a s e db yl2 7 c o m p a r e dw i t ho r i g i n a lp r o c e s s t h eb e e rq u a l i t yw a ss o f t l y i i i a b s t r a c t e l e g a n tw i t hd e l i c i o u sa f t e r t a s t e k e yw o r d s ：b e e r , e s t e r s ，m a s h i n g ，f e r m e n t a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同5 - - 作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：冱垒隆 日 期：型望查：窭：塑 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期：加衍占仞盘 第章绪论 第一章绪论 1 1 啤酒风味 目前，我国市场上十分流行淡爽柔和风格的啤酒：低浓度( 7o p - 1 0o p ) 、浅色泽( 3 e b c 5e b c ) 、低苦味值( 8b u s - 1 2b u s ) 、低总酸( 1 2m l 1 0 0m l 1 。5m l 1 0 0m l ) 。淡爽 而柔和的风格是建立在优良麦芽原料，较多使用辅料( 3 5 q 5 ) ，采用浸出糖化法，低 温发酵，各种代谢产物( 醇、酯、醛) 既少而平衡，醇酯比为3 0 ：l 4 o ：1 左右，而且由 于低浓度，原辅料采用较少，成本比较低，适合中国市场的需求i l j 。 啤酒风味即：啤酒的滋味、口感和气味。这种复杂的风味是由啤酒中挥发性和非挥 发性物质引发的一种整体感觉，而这种挥发性和非挥发性物质被称为啤酒风味物质。目 前已鉴定出约有1 0 0 0 多种物质对啤酒整体风味有贡献，其中4 0 0 种是酵母代谢的副产 物。啤酒中主要挥发性风味成分包括醇类、酯类、酸类、醛类、酮类、硫化物、酚类等 化合物l z j 。其它挥发性风味成分也影响啤酒的品质，如酒花油中多种挥发性成分共同产 生的“酒花香”，以反壬烯醛为代表的“老化味”，以3 一甲基2 丁烯硫醇为代表的“目 光臭 ，以及麦芽香气成分。各种副产物的数量和配伍关系是造成啤酒之间风味差异的 主要因素。啤酒发酵中副产物如果超过某一限量范围，就会成为人们不能接受的异杂味 的主要来源。酿造者需要掌握不同的微量成分，使样品呈现使人们乐于接受的良好风格 【3 】 o 1 2 啤酒中的酯类 1 2 1 啤酒的醇酯比与饮后感 近年来，关于啤酒饮后感不适的投诉较多。中国啤酒9 0 以上在餐桌上饮用，有些 酒多喝几瓶会感到头昏、头痛，再难继续喝下去，这现象通常称“上头”1 4 。以往普遍 认为高级醇含量过高是饮酒“上头”的元凶，当高级醇含量超过8 0m g l 时，容易让入 产生“上头 的感觉【5 1 。随着近年来对啤酒“上头 问题研究的不断深入，发现当酒体 中的酒精、高级醇含量一定时，酯类含量越丰富，高级醇与酯类的比例越协调，越不容 易引起上头【6 】。产牛这种效果的关键是酒中高级醇使脑部神经收缩和痉挛，而酯类与高 级醇相反，能够使脑部神经放松和舒缓，减缓了杂醇油的吸收速度，使这些物质在人体 血液中特别是脑组织中不过多积累，也就是说啤酒中恰当的醇酯比例可以改善啤酒的饮 后感。 高级醇和酯类物质是构成啤酒整体风味特色的主要物质，其感官刺激首先是嗅觉， 其次是味觉，即啤酒的气味和一部分口感。高级醇和挥发酯丰要是在啤酒发酵过程中由 啤酒酵母代谢产生，因此其含量的高低主要依赖于酵母菌株以及酿造工艺。我围啤酒多 为下面发酵的淡色啤酒，在1 2o pl a g e r 啤酒中存在的典型高级醇及酯的阈值及合理范围 的浓度见表1 1 。 江南大学硕士学位论文 一 表1 1下面发酵啤酒中高级醇、酯的阈值及含量2 】 t a b 1 1f l a v o rt h r e s h o l da n df l a v o rc h a r a c t e d s t i co fh i g h e ra l c o h o l sa n de s t e r si nl a g e rb e e r 高级醇与酯类总量之比即为醇酯比，是对啤酒风味特点进行评价的重要依据，也是 衡量啤酒饮后感一个十分重要的指标【7 】。如果醇酯比在3 0 ：l “o ：1 之间，啤酒的风 味是比较协调柔和的，品评时也不会有太明显的杂醇油或酯香味。醇酯比与啤酒风味特 征的关系见表1 2 。 表1 2 啤酒醇酯比与风味特征 t a b 1 2t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er a t i oo fh i g h e ra l c o h o l s t o e s t e r sa n df l a v o rc h a r a c t e r i s t i c s 醇酯比( 高级醇：酯) 风味特征 4 ：l 酯香味突出 风味适中 醇昧突出 在啤酒牛产的传统工艺中，辅料比较低，发酵温度低，周期长，并不需要考虑太多 酯类生成量的问题，但随着新工艺、新技术的飞速发展，高级醇含量不断上升，与此同 时挥发性酯类的含量不断下降，醇酯比大幅度提高，影响了啤酒的风味和饮用舒适感和 安全性。据文献报道1 8 1 ，造成目前啤酒醇酯比较高的原因有： ( 1 ) 麦芽溶解性能差，辅料比太高，而酿造参数没有进行相应的调整，导致麦汁组 成发牛改变。 ( 2 ) 大罐发酵罐内温度分布不均匀，对流强烈，酵母降糖速度过快，生产周期短。 ( 3 ) 近代不少工厂酿造啤酒，贮藏期( o ) 很短，仅2 天3 天，啤酒中乙醇等醇类和 水分子氢键缔合差。 1 2 2 酯类对啤酒风味的影响 酯类是啤酒风味的丰要构成成分，在啤酒的风格与质量方面起着重要的作用，对形 成啤酒的风味典型性起着关键性的作用，也是“香气 的主要载体，通常具有很强的“果 香味”。适量的酯才能使酒体丰满，香味协调。啤酒中各种酯类约1 0 0 种以上，根据其 2 第一蕈绪论 挥发性又可分为挥发性酯和非挥发性酯。挥发性酯主要包括乙酸乙酯，乙酸异丁酯，乙 酸苯乙酯，对啤酒风味贡献较大。非挥发酯包括己酸乙酯，辛酸乙酯，癸酸乙酯，乙酸 苯乙酯，等，不挥发酯除了具有香气外，还具有一定的呈味作用。如己酸乙酯在啤酒中 呈现出甜味和一定的刺激感。酯类啤酒中应该有适量的酯，才能使啤酒风味协调，口感 醇厚。酯类含量过高赋予啤酒不舒适的苦味和果味，过低则使啤酒淡寡，对啤酒风味的 协调性不禾l j 9 , 1 0 j 。 酯类的风味阈值很低，在啤酒的高浓度发酵中尤为显得重要。因为高浓发酵产生过 量酯使啤酒带有一种不需要的溶剂味。而在低醇啤酒生产中，由于形成的酯量低导致啤 酒风味差。因此，合理控制啤酒中酯类含量，将赋予啤酒有利的风味。 啤酒中的酯类有两种，一种为脂肪酸酯类，另一类为乙酸酯【l 。啤酒中的酯类以乙 酯类为主，其中乙酸乙酯和乙酸异戊酯两者之和占啤酒中总酯量的8 0 以上，称为两大 酯。乙酸乙酯浓度低时呈苹果香，浓度高时呈菠萝香，在啤酒中作为背景香味；乙酸异 戊酯呈典型的香蕉味，在啤酒中的含量接近阈值，因此对啤酒风味影响十分显著。两大 酯含量的变化，对酒的风味影响较大。 1 2 3 酯类物质的生成途径 啤酒是在酵母作用下将新鲜麦汁经发酵获得的酒精饮品。发酵过程中，酵母代谢将 麦汁中的糖、有机酸、氨基酸等成分、风味前体物质转化为醇类、酸类、酯类、羰基类、 杂环类等产物，期间产生的风味物质多种多样。啤酒中酯类的含量不仅仅取决于其胞内 的生成量，同样与其分子量有关。直链饱和脂肪酸酯可与酵母细胞膜相联结而滞留在细 胞中，联结的强度随分子量的增加而增加。如己酸乙酯全部进入发酵液中，辛酸乙酯则 是5 4 6 8 进入发酵液中，癸酸乙酯是8 1 7 进入发酵液中，所以啤酒中有意义的 脂肪酸酯仅到癸酸乙酯，乙酸酯则可以全部穿过细胞膜进入到发酵液中【l 2 。 酯类形成过程和调控机理相当复杂。根据文献报道【1 3 】，酵母中高级醇、酯类、酸类 物质基本的合成途径如图1 1 所示。 图1 1发酵过程中酵母形成风味物质的基本途径 f i g 1 - lb i o c h e m i c a lb a c k g r o u n do f y e a s tf l a v o rp r o d u c t i o n 江南大学硕士学位论文 从图1 1 可以看出，酯有两条合成途径。途径之一是生物化学途径，即酵母在醇酰 基转移酶( a l c o h o l a c e t y l t r a n s f e r a s e ，简称为a a t a s e ，e c2 3 1 8 4 ) 的作用下由醇和脂肪酰 基辅酶a 形成，途径之二是酵母在酯酶( e s t e r a s e ) 的作用下由酵母产生的醇和脂肪酸合 成，由于酯酶是一种可逆酶，发酵液中的酯可能被该酶水解成相应的醇和脂肪酸1 1 4 ，l 5 。 啤酒酵母生成乙酸乙酯是以图1 1 的两种途径合成，乙酸异戊酯仪以醇酰基转移酶途径 合成。酯的合成途径随酵母种类、酯的种类不同有明显区别【i6 。 酯类的生成与乙醇或高级醇、脂肪酸、辅酶a 和酰基转移酶( u p 酯合成酶) 等有关 1 7 , 1 8 】。通过数年的研究发现【1 6 , 1 9 】，乙醇乙酰基转移酶的活性是发酵过程中影响酯类生成 最重要的因素。乙醇乙酰转移酶a a t a s e i 和a a t a s e l l 分别a t f l p 和a t f 2 p 基因编码，催 化乙醇和乙酰o a 合成乙酸乙酯。与此同时，高级醇和乙酰c o a 的含量对酯类的生成 量也有一定的影响。目前还不能确定每个活性脂肪酰c o a 分子是否都有自己唯一的酰 基转移酶，或者几个这样的酶能否催化所有酯类的形成。n o r d s t o r m 1 s l 并指出虽然乙酰 , - 4 e o a h 匕通过丙酮酸氧化脱羧作用形成，但其它酰基c o a 化合物大部分来自于由乙酰基 c o a 合成酶催化的酰基化作用。 1 2 4 酯类物质合成的影响因素 关于酯类的来源及调节，国内相关研究很少，国外学者的研究开始于上世纪6 0 年 代7 0 年代，由于含量相对较低，分析测定有一定的难度，因此研究对象也仪局限于含 量较高的乙酸乙酯和乙酸异戊酯，初步确定了乙酸乙酯和乙酸异戊酯的合成途径。自7 0 年代以来，由于色谱理论的不断发展与完善，气相色谱仪在酯类的分离上取得了很大的 进展，在啤酒行业的应用也越来越广泛，分离的酯类越来越多。但与此同时，关于酯类 形成和调节的理论研究几乎停滞，近二十年来，仅有f u k a d a | 15 1 ，m a s o n l 5 1 1 ，k r u g e r 4 2 1 ， 汪力平1 4 6 j 等人进行研究，但研究对象仍然局限在乙酸乙酯，乙酸异戊酯，汪力平初步研 究了乙酸苯乙酯的代谢，确定了乙酸苯乙酯的牛物合成途径。 酯类的合成丰要在酵母菌体内进行，生成的产物穿过细胞膜进入酒体。它们的种类 和浓度受到多种因素的影响，如酶的种类及酵母活性等遗传特征及环境因素。研究啤酒 中酯类合成的影响因素，有利于调节工艺参数，提高啤酒中酯类的形成量。一般来说， 影响啤酒中酯类形成的因素有微生物，糖化工艺及发酵工艺。 ( 1 ) 酵母菌株 啤酒的发酵是由微生物即酵母菌株引起的，酵母菌株对发酵有着至关重要的影响。 不同的酵母菌种有着各自的牛理特性，其代谢副产物的种类及含量有很大差异。品种优 良，发酵能力强的酵母除了可使发酵快，成熟早，缩短发酵周期等，还要保证啤酒的品 质。n y k a n e n t l 2 j 等人认为在同等的发酵条件下，啤酒酵母合成酯的能力差异很大，并且 单酯之间的量比关系也有所差异。因而在酿造淡爽型啤酒时，选择优良酵母菌株是控制 啤酒中酯类含量的有效途径，比调整工艺来得更为有效。一般来讲，上面发酵酵母比下 面发酵酵母的产酯水平高。另外，酯的形成也与酵母的活性有关，营养充分、健康酵母 的代谢，有利于合成更多的酯酰辅酶a ，从而有利于形成更多的酯【2 0 1 。近年来，基因重 组技术日渐成熟，采用基因工程技术改良啤酒生产菌种已经成为国内外研究的热点，并 4 第一章绪论 取得了一些突破性的进展。f o j i i 2 q 等人通过分子生物学手段，对清酒酵母中的醇酰基转 移酶进行多拷贝，获得酵母突变株，再用突变株发酵日本清酒，提高了清酒中乙酸异戊 酯的含量，从而改善清酒质量。 ( 2 ) 糖化参数 麦汁是啤酒牛产的中间产品，是啤酒酵母生长繁殖的天然营养基质。其中包含的营 养物质的优劣直接影响酵母的生长代谢、合成代谢及发酵作用，从而影响啤酒的最终质 量。辅料比，定型麦汁p h 值等糖化参数对麦汁制备过程中酶的作用，物质的转换及最终 制得的麦汁成分具有重要影响。 普遍认为相比全麦芽麦汁，添加辅料的麦汁的c ：n l b 改变，影响酵母的代谢。当辅 料比过大，酵母的生长受到限制，乙酰辅酶a 的合成会减少，进而影响到酯的生成。定 型麦汁p h 值直接影响着酵母细胞膜的通透性、膜电位以及相关酶的分泌和活性，进而影 响着酵母的生长和代谢【2 2 1 ，因此适宜的麦汁p h 值是酵母良好发酵的前提条件。关于麦 汁初始p h 对酯合成的影响，e n g a n 1 6 】认为，麦汁初始p h 对酯的合成影响不大。陈九武【2 3 】 则发现初始p h 对酵母的产酯具有一定的影响。关于麦汁浓度对酯类的影响，更多人侧重 研究高浓麦汁对啤酒风味的影响，对普通浓度的酿造关注很少。a n d e r s o n t j 唯i k i r s o p 2 4 】 报道，与传统的麦汁( 1 2o p ) 相比，高浓麦汁( 1 6o p ) 发酵产生更多的酯类，尤其是乙酸 乙酯和乙酸异戊酯，造成风味匹配不平衡的问题，酒体的果香味过重。因此控制高浓酿 造工艺，尽量降低副产物的量将是保证啤酒品质的重要一环。s t e w a r t 2 5 1 ，y o u n i s 2 6 1 和 e n g a n l 2 7 1 等人认为麦汁中可发酵糖的组成影响酯的合成。一般来讲，高葡萄糖麦汁比高 麦芽糖麦汁发酵合成的酯多，高级醇的生成量则不受影响，这一结论已经应用于高浓酿 造技术，以解决风味不匹配的问题。 在啤酒酿造过程中，常量或微量离子不仪对酵母的生长和繁殖起着重要作用，同时 对调节糖化醪和麦汁p h 值，提高啤酒的稳定性发挥着很大的作用。如钙离子，镁离子 不仪具有增酸作用，适量的钙离子能保持淀粉液化酶的耐热性，提高酶的活性，降低双 乙酰的峰值等作用。镁离子对淀粉酶具有激活作用，并且是酵母代谢过程中许多酶的重 要辅助因子。锌离子也是酵母生长发育必需的金属离子，对酵母菌体的生长繁殖、各种 酶的激活和防御、发酵速度、双乙酰的还原、促进糖的代谢等都有重要的作用 5 6 o h o d g s o n 和m o i r 列j 研究发现与其它常量或微量离子不同的是，锌离子会影响到挥发物的产生。 在发酵过程中，z n 2 + 能够促进挥发性物质如挥发酸，高级醇，和酯的生成，缩短发酵时 间，使啤酒口味协调柔和【2 圳。 ( 3 ) 发酵工艺 酵母的发酵受到环境因素的影响，前人针对发酵参数对酯类的影响做了一些工作， 初步考察了发酵温度及高浓发酵时接种量的影响。单酯的最适生成温度有所差异，乙酸 乙酯和乙酸苯乙酯生成的最适温度是2 0 2 5 ，而乙酸异戊酯和己酸乙酯的最适生成 温度为1 5 ( 2 左右。e n g a n 3 0 】认为温度对酯合成的影响随着酵母菌株和发酵条件而变动。 v e r s t e r p e n 3 l 】则认为高温发酵虽然能够促进酯的合成，但其挥发作用也会更明显。接种 量影响酵母的增殖倍数。酵母繁殖倍数过大，会消耗大量的乙酰辅酶a 来合成细胞膜所 5 江南大学硕士学位论文 需的脂肪酸，酯的合成相应会受到抑制。m a u l e 3 2 发现当接种量增大4 倍时，乙酸乙酯 的合成会受到影响。我国近代不少工厂酿造啤酒，贮藏期( 0 ) 很短短，仪2 天3 天， 关于贮酒时间对酯的影响，大家的观点不一致。单连菊【3 3 】认为在贮酒期间，酯酶的水解 作用占主导，乙酸异戊酯的生成量降低。孙丽萍等人1 3 4 】贝i j 认为，随着贮酒时间的延长， 醇和羧酸会酯化生成相应的酯。需要指出的是此时的贮酒温度都是o c 4 。 笼统地，啤酒中的酯主要来自酵母代谢，这是许多作者研究的共同点。但是对于啤 酒中众多的酯类来讲，各种酯的合成途径是什么，它们的影响因素是什么，如何调节和 控制，迄今都没有系统的研究和明确的结论。关于啤酒中酯的报道也是“仁者见仁，智 者见智”，众说纷纭，这为调节啤酒中的酯含量进而改善啤酒质量带来网难。因此，系 统研究酿造过程中酯类的影响因素，是实施控制措施进而改善啤酒风味和口感的重要前 提。 1 3 固相微萃取在啤酒中风味物质检测中的应用 1 3 1 啤酒中风味物质的常规测定方法 啤酒作为饮料酒，其风味特征主要通过感官品尝进行评价。虽然在生产中有较多的 应用，但是测评周期长，影响因素多，主观性强，重复性差，并且人的鼻子、舌头对气 味具有适应性，容易出现疲劳而影响分析结果，无法实现快速检测等，难以达到控制产 品品质的目的。随着啤酒生产规模化集团化发展，仪靠专业评酒人员进行感官品尝，难 以达到控制产品品质的目的。利用现代仪器分析技术对啤酒进行监控，保持啤酒风味一 致性，是啤酒行业发展的趋势。 气相色谱一质谱联用仪( g a sc h r o m a t o g r a p h yw i t hm a s ss p e c t r o m e t r y ，简写为g c - m s ) 具有强有力的定性、定量能力及强大的数据处理系统，在挥发性物质的检测方面应用十 食广, 泛 3 5 , 3 6 1 ， 1 3 2 固相微萃取( s p m e ) 技术 ( 1 ) 固相微萃取的应用和发展 目前对啤酒中风味物质的检测方法大都需先经过液液萃取或项空分析，再由气相 色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，简写为g c ) 进行分析。液液提取可以较全面的提取香气成分， 但需要挥发溶剂，会导致啤酒原有的香气成分的散失。顶空方法简单快速，但其灵敏度 较低，分析的物质种类非常局限，物质的响应值也低，对风味有重要影响的癸酸乙酯及 乙酸苯乙酯无法得到分离。 固相微萃取技术( s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，简写为s p m e ) 是1 9 8 9 年由加拿大 w a t e r l o o 大学的a r t h u r 和p a w l i s z y n 等开发出来的一种新型无溶剂化的样品前处理技术 p 7 。，它集采样、萃取、浓缩、进样于一体，便于携带，真正实现了样品的现场采集和富 集，能够与气相、气相质谱、液相、液相质谱仪联用，因此在环境污染物、化工、食 品分析等领域有着广泛的应用【3 8 】。目前，由于大多数企业对高沸点风味物质的关注不够， 使得国内在啤酒挥发性风味成分研究中应用s p m e 的还不多。 6 第苹绪论 ( 2 ) s p m e 实验装置 固相微萃取实验装置状似一只气相色谱微量注射器，由手柄和萃取纤维头两部成。 s p m e 的操作方式有浸入式固相微萃取法( d i r e c t i m m e r s i o ns o l i d - p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ， 简写为d i s p m e ) 和项空固相微萃取法( h e a d s p a c es o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o n ，简写为 h s s p m e ) 1 3 9 】两种。 1 4 立题背景和意义 啤酒已经成为人们重要的日常消费饮品，由于它所具有的营养价值、低酒精度、适 宜饮用人群广泛等特点，其消费量与日俱增。自2 0 0 2 年起，我国的啤酒产量连续五年 稳居世界首位，2 0 0 7 年我国啤酒的年产量超过3 9 0 0 万千升。随着人民牛活水平的不断 提高，我国的啤酒工业仍然有很大的发展空间。如此巨大量的消费饮品其原料的安全性、 牛产和消费的绿色化、以及产品的风味一致性及质量稳定性也随之受到前所未有的关 注。 我国目前以生产淡爽型啤酒为主，由于我国啤酒企业的酿造原料、酿造工艺、生产 菌种以及管理水平与国外先进水平存在较大差异，酿造的淡爽型啤酒的风味协调性存在 一定缺陷。特别是由于辅料比的升高，大罐发酵等技术的普及，酯类含量降低的问题就 显得更为突出，呈香呈味物质失去了原有的协调平衡，严重影响了啤酒的风味和口感， 酒质下降。特别是饮用后“上头 的啤酒，给消费者的身体带来了伤害。啤酒风味协调 性差和饮后感不舒适是啤酒厂面临的严重问题，直接关系到啤酒的销售及工厂的效益。 有些啤酒企业因此失去了消费市场，给企业带来巨大的经济损失，制约了啤酒行业的发 展。 国内啤酒和淡爽型啤酒的代表百威啤酒的酯类组成相比较发现，其酯类的组成( 含 量和相对比例) 差别很大，这可能是造成啤酒质量( 包括口感和风味) 差距的重要原因。我 国啤酒企业对啤酒中酯类物质的控制仅限于乙酸乙酯和乙酸异戊酯，这对于精确控制啤 酒的风味协调是远远不够的，不能满足现在啤酒质量的控制要求。因此，对啤酒中酯类 的影响因素进行深入系统的研究，因此，如何通过工艺参数的调控来提高酯类物质的含 量、降低醇酯比以改善啤酒饮后感成为啤酒企业控制产品质量的重要课题之一。 本研究从分析成品啤酒的酯含量出发，运用统计学的思想综合考察啤酒酿造过程中 影响酯类牛成的因素，借助数学模型工具最终获得有利于啤酒香味的酿造工艺参数，提 高酯的生成量，酒体的醇酯比降低至3 0 ：1 4 0 ：l ，改善啤酒饮后感，稳定各种啤酒的 风味一致性，提高产品质量。 1 5 课题主要研究内容 本研究围绕提高成品啤酒中酯类物质含量这一中心，运用固相微萃取- 气相色谱一质 谱联用技术( s p m e o c m s ) 技术，全面考察了对啤酒风味有重要影响的7 种酯( 乙酸乙 酯，乙酸异丁酯，乙酸异戊酯，己酸乙酯，辛酸乙酯，癸酸乙酯，乙酸苯乙酯) 在酿造 过程中的影响因素。以此为基础，通过糖化和发酵工艺的选择和优化，寻找相对适宜的 工艺组合，使得啤酒酯类的含量提高，啤酒的饮后感得到改善。 7 江南大学硕十学位论文 本课题的主要研究内容包括： ( 1 ) 利用现代化检测手段，建立啤酒中高级醇和酯类的准确测定方法。 ( 2 ) 检测市售啤酒的高级醇，酯含量及醇酯比分布。 ( 3 ) 对影响麦汁组成的糖化参数进行较系统的研究，探讨糖化参数对酯牛成量的影 响，利用统计学软件确定酯生成量最高时的工艺参数。 ( 4 ) 在实验室规模下，通过单因素试验考察发酵参数对酯类牛成的影响，结合多指 标实验设计确定发酵参数。 ( 5 ) 通过放大试验考察确定的酿造工艺的可行性，对发酵过程中各项指标进行跟踪 分析，并考察成品酒的理化指标和风味。 8 第三章糖化参数对酯类生成量的影响 第二章啤酒中高级醇和酯类物质分析方法的研究 2 1 前言 啤酒为多组分风味体系，高级醇和酯类是影响啤酒风味的最丰要因素 4 0 , 4 1 】。准确检 测啤酒中的高级醇和酯类物质对于啤酒牛产企业控制产品质量十分关键，而可靠和灵敏 的检测技术则是分析啤酒高级醇和酯类物质的前提。 利用g c m s 分析样品通常要进行预处理，目前多采用液液萃取和项空进样的方式。 液液萃取可以分析更多的物质，但耗时长，同时有可能造成目的物的挥发。顶空进样 是最简便的预处理方法，但受组分挥发性的限制，只可检测到己酸乙酯或辛酸乙酯，而 癸酸乙酯、乙酸苯乙酯等高沸点的物质由于挥发性较低而无法得到分离，因此该方法不 能准确反映样品中物质的组成。 固相微萃取技术是一种应现代仪器的要求而产生的样品预处理新技术，不仅能够分 析更多的物质，而且几乎克服了以往一些传统样品预处理技术的所有缺点，集采样、萃 取、浓缩、进样于一体，便于携带，真正实现样品的现场采集和富集。国内在啤酒挥发 性风味成分研究中应用s p m e 的还不多，s p m e 的快速、简便、不用溶剂等优点，非常 符合食品和发酵工业中质量控制的分析要求，因此希望通过s p m e 在啤酒挥发性风味成 分研究中的应用，建立一个准确的分析啤酒中高级醇和酯的方法。 在利用固相微萃取对目的物进行富集过程中，丰要考虑目的物的萃取效率。影响萃 取效率的因素很多，如涂层的极性、萃取温度、解析时间等。本研究中萃取效率以组分 对内标的相对峰面积来表示【4 6 1 ，通过p l a c k e t t b u r m a n 实验设计和b o x b e h n k e n 实验设计 优化各参数的水平，进而验证方法的可行性。检测样品中的高级醇和酯的含量，确定醇 酯比的范围，为后继研究做准备。 2 2 材料与仪器 2 2 1 实验材料与试剂 1 6 种啤酒从从无锡各个超市购得，牛产日期均为一个月以内；标样乙酸乙酯，乙酸 异丁酯，乙酸异戊酯，己酸乙酯，辛酸乙酯，癸酸乙酯，乙酸苯乙酯，正丙醇，异丁醇， 异戊醇，3 辛醇，购于s i g m a 公司。其它试剂均购自中国医药集团上海化学试剂公司。 2 2 2 仪器设备 固相微萃取手柄 7 5l , t m 固相微萃取头( c a r p d m s ) s p m e 专用样品瓶 气相色谱仪一质谱联用仪 p h s 3 c 型精密p h 计 电子天平 9 s u p l o c o 公司 s u p l o c o 公司 s u p l o c o 公司 美国f i n i g o n 质谱公司 上海雷磁仪器厂 梅特勒托利多上海仪器有限公司 江雨大宁坝十字位论文 7 9 3 型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂 2 2 3 数据处理软件 s a s8 0 ，s p s s1 3 0 软件。 2 3 测定方法 2 3 1 标准溶液的制备 ( 1 ) 内标储备溶液 称取1 7 o o “g3 辛醇，无水乙醇稀释至2 5m l 。 ( 2 ) 标准溶液储备液 准确配置标准溶液，乙酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、 癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、正丙醇、异丁醇、异戊醇等组分的浓度分别为2 5 0m g l 、3 0m g l 、 3 6m g l ，2 5m g l 、2 5m g l ，1 0