（发酵工程专业论文）异α酸反顺比（tc）与啤酒风味稳定性关系研究.pdf

摘要 摘要 本论文使用添加有甲酸缓冲液的挥发性流动相，建立了反相高效液相色谱分离检测 啤酒、麦汁中异a 酸顺反异构体的方法。样品通过固相萃取预处理后使用z o r b a x e d i p s ex d b c 1 8 ( 4 6 x 2 5 0n l n l ，5 岬) 色谱柱，在乙腈甲酸缓冲溶液作为流动相条件下 等梯度分离，分离在2 0m i n 内完成，在此基础上结合l c m s 技术所获的信息和文献参 考完成对各目的峰的初步定性；此分离方法准确可靠、重现性好，异a 酸的回收率为 9 3 5 20 o - - , 9 7 4 0 之间，相对偏差 3 3 4 ，认为啤酒处于新鲜状态，当t c 在2 6 1 3 3 4 范围，认为啤酒处于中 度老化状态，当t c 在 3 3 4 ， e p r e s e n t i n gaf r e s hs t a t e ；w i t l lt c2 6 1 - 3 3 4 ，r e p r e s e n t i n gam e d i u ms t a l e ；谢n 1t c 2 6 1 ， e p r e s e n t i n ga s e v e r es t a t e 1 1 l em a i nf a c t o r se f f e c t i n go nt ，cr a t i ow e r ei n v e s t i g a t e df r o mt w oa n g l e so fr e l a t i v e i n d e xi nh o pa n dt h ef a c t o r so fw o r tb o i l i n gc r a f t t h e nr e l a t i o n s h i po fh o pi n d e xa n dt c r a t i ow a se s t a b l i s h e d e q u a t i o n sm o d e lw a sp r o o f e dc o r r e c te l e m e n t a r i l yb yp a i rt t e s t k e yw o r d s ：c i s t r a n ss t e r e o i s o m e r so fi s o - 0 【一a c i d ；h p l c ；t cr a t i o ；s t a l i n g ；h o p i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注争致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名： 壕睹r 经 日 期： 力矗。驴笸 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件扣磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：一趔：墨：么 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 啤酒的风味稳定性研究概况 啤酒在包装后，随着时间的延长，会形成一些物质影响其原有的新鲜风味，使啤酒 风味发生缓慢而明显的恶化：原有的新鲜香味和口味逐渐丧失，产生如焦糖味、面包味 和纸板昧等。由于这是由啤酒风味物质氧化产生，因此称为“老化味”( s t a l i n gf l a v o r ) 或“氧 化味”( o x i d i z e df l a v o r ) ，这个过程称为啤酒的老化【l 捌。啤酒的风味稳定性也就是指啤酒 的风味保鲜期，风味稳定性越好，保鲜越就越长，啤酒的抗老化能力也就相应地越强。 目前对老化风味形成机理认识还不深入，为了改善啤酒的风味稳定性，长期以来一 直通过感官品评来估计啤酒的老化强度，但该方法对品评人员的专业性要求高，品评结 果的主观差异大，要得到评价一致的老化程度十分困难。为了摆脱口感品评的缺陷，研 究员们不断致力于与感官评价相关的客观指标研究。风味衰退是由于生成反应和降解反 应两方面的作用结果：生成物浓度超过其风味阈值就会出现显著影响，而物质降解至浓 度低于风味阈值可能就会失去初始的新鲜啤酒风味。目前研究者们已从多个角度提出如 反- 2 壬烯醛【3 4 】、5 - h m f t 5 1 、丙酮酸乙酯1 6 、t b a 7 1 、d p p h 清除率8 一、s i 系划1 0 1 等【l l - 1 3 】 老化代表性物质或指标进行啤酒风味稳定性方面的研究。 1 1 2 酒花及其对啤酒的贡献 a 酒花 酒花学名“蛇麻”，又名“忽布 ，有雌花和雄花之分，雌花常用于啤酒酿造【1 4 】。 在酒花化学组成中，对啤酒酿造有特殊意义的三大成分为苦味物质、酒花精油和多酚。 其它成分对酿造意义不大。 酒花在酿造过程中作用突出，能赋予啤酒柔和优美的芳香和爽口的微苦味，加速麦 汁中高分子蛋白质的絮凝，提高啤酒泡沫起泡性【l5 1 。另外酒花具有重要的防腐作用，能 抑制许多革兰氏阳性菌和病原菌生长1 1 6 j 。 r ：。c 心c h ( c h 也正- 酸 r ：c o - c h ( c h 3 ) - c 心吼加t - 醴 r ：- - c h ( c h 3 ) ，舍酸 r ：c o c 心- c h 3 后n 酸 r ：。- c 心c h 2 c h ( 1 3 ) 2 前e 。酸 r ：- c h - ( c 卜u c h 2 c 卜b 后前- 酸 图1 - 1o 【酸的结构式 f i g 1 - 1t h es t r ，u c m r eo fa - a c i d a 仅酸 r ：c 0 c 心c h ( c h 3 】2 争酸 r ：- c o o h ( c h 3 ) - c 心c h 3 加p 酸 r ：c 0 - o h ( c h a 台b - 酸 尺：- c o c h 2 - c h 3 后p i i r ：c o - c h 2 c h 2 c h ( c h 3 ) 2h i 3 。酸 r ：c 0 - c h - ( c h 3 ) c h 2 c h 3 后前b _ 酸 图1 - 23 - 酸的结构式 f i g 1 - 2t h es t r u c t u r eo f1 3 一a c i d 仅一酸又称薇草酮( h u m u l o n e ) ，主要包括合蓰草酮、蓰草酮和加蓰草酮三种同系物， 新鲜酒花中仪酸的质量分数约为5 1 1 。0 c 一酸含量的高低是衡量酒花质量的重要指标。 啤酒中苦味和防腐力主要来自0 c 酸的异构物。仅酸呈另菱形结晶，浅黄色，在o 相对 稳定，熔点为6 5 6 6 5 【17 1 。在紫外线下呈柠檬黄色的荧光。0 【一酸是酒花树脂中唯一有 江南大学硕士学位论文 显著光学活性的物质i l 硼( 正己烷中嘲哿为2 3 7 0 ) 。它易溶于乙醚、石油醚、乙烷、甲醇等 有机溶剂。0 c 酸是多种结构类似物的混合物。常见结构通式见图1 1 【1 9 】。 b p 一酸 b 酸又称蛇麻酮( l u p u l o n e ) 。主要包括合蛇麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮三种同系物， 新鲜酒花中p 酸的质量分数为5 11 。它的苦味不及0 【酸大( 约为1 9 ) ，防腐力也比仅 酸低( 约为1 3 ) 。p 酸的熔点为9 0 5 9 2 0 ，在热水中溶解度比仅酸小。它更易氧化形 成b 软树脂。d 一软树脂能赋于啤酒宝贵的柔和苦味。p 酸也是一个混合物，r - 基团和0 c 酸相同。常见结构通式见图1 2 t 1 9 j 。 b 酒花的苦味贡献 酒花中的0 【酸不是直接转移到啤酒中，而是在麦汁煮沸阶段通过异构化过程转变成 异a 酸，它是酒花化学中最重要的反应【2 0 1 。异a 酸具有苦味且比母体化合物更易溶解， 包括与a 酸相对应的六种顺反同分异构体，这六种异a 酸同分异构体结构非常相似，仅 在酰基侧链和手性中心不同( 见图1 3 ) ，它们提供啤酒中8 0 的苦味【2 i j 。前人研究各同分 异构体的苦味强度不同【2 2 ，2 3 1 。 r = c h ( c h 3 ) 2( 异丙基) 合异薇草酮 = c h 2 c h ( c h 3 ) 2 ( 异丁基) 异薇草酮 = c h ( c h 3 ) c h 2 c h 3 ( 2 - 甲基- 丁基) 加异律草酮 图1 3 异旺酸六种顺反同分异构体的化学结构式 f i g 1 3c h e m i s t r yo fs i xc i s t r a n si s o - a a c i d s 1 2 国内外研究进展 1 2 1 啤酒异n 酸测定方法进展 自r i g b y 和b e t h u n e 发现组成0 【一酸三种主要混合物( 合萑草酮、荏草酮及加薇草酮) 中的每一种物质会转变成相应的顺、反异1 1 , 酸同分异构体以来，研究者在异q 酸分离方 面做了不少努力，早期v e r z e l em 使用g c 2 4 1 分离，也有人尝试使用毛细管电泳【2 5 】方法 分离。 从上世纪7 0 年代，h p l c 就在实验室开始普及，因此国外很早就致力于异a 酸六 种主要同分异构体方面的研究，但受分离技术、无商业异a 酸顺、反同分异构体标样纯 品出售以及异a 一酸各顺、反同分异构体结构相似的限制，早期v e r z e l em 使用h p l c 技 术使六种主要异仅酸分离成两个峰，1 9 9 9 年和2 0 0 1 年w i l l i a m s 2 7 】和h a n n s 【2 8 】等人先 后采取添加磷酸或柠檬酸等不具挥发性缓冲溶液作流动相才最初实现异0 【酸各顺、反同 分异构体的分离，p u s e c k e rk 在此基础上实现了l c n m r 2 9 】的定性。由于流动相不具挥 2 第一章绪论 发性，这些分离峰不适于m s 鉴定；近期也有人以碱性挥发缓冲液为流动相分离异* 酸顺反异构体【3 0 , 3 1 1 ，并实现各目的峰的m s 定性，其中使用两根色谱柱分离效果较好。 目前国际上l c i v i s 联用技术也只能实现各物质峰的初步定性，不能充分说明各顺、反 同分异构体的结构不同，顺、反异构体峰的定性要结合相关文献数据完成。但由于操作 简单，仪器更普遍，使l c m s 成为异a 酸各顺、反异构体峰初步定性的趋势手段。国 内也有对异0 【酸的分离检测的报道【3 2 ，3 3 1 ，但限分离与酒花a 一酸相对应的三种异a 一酸化合 物，未见分离异q 一酸六种顺、反异构体相关检测方法的报道。 1 2 2 啤酒异n 酸的相关发展 受分离条件限制，早期对啤酒苦味及啤酒老化过程中苦味变化的研究仅停留在总异 a 一酸或与母体a 酸相对应的三种异a 酸同系物含量的考察，研究发现在啤酒老化过程中 苦味物质不断减少3 4 3 5 1 ，且其降解产物与啤酒老化风味有关【3 6 】。近年随着异0 【酸六种主 要顺、反异构体的完全分离，国外已着手比尔森啤酒储存过程中异仅酸各异构体的研究 l l 叭，考察了异仅酸各顺、反异构体随老化程度加深的降解行为，并发现反式、顺式异仅 酸含量比值( t cr a t i o ) 随啤酒老化时间延长呈现减小趋势。由于国内以淡色啤酒为主， 酿造中酒花添加量及添加方式与国外有较大差异，致使成品啤酒酒基以及其中异a 酸含 量也与国外啤酒不同，加之目前异a 一酸各异构体检测手段的限制，国内在此方面以及相 关方面研究尚属空白。 1 2 3 与异捧草酮有关的啤酒老化机理的研究 酒花酸( 异仅酸、0 【一酸、p 酸) 的降解不仅仅是口感苦味减弱，而且伴随着其它产物 的形成。意味着酒花酸的变化与老化风味的产生有关。k a n e d ah 研究表明异a 一酸在有 活性氧( r o s ) 存在下降解迅速【3 7 1 ，而后h u v a e r ek 研究3 8 1 表明若有合适的电子受体，异 a 一酸不需要活性氧也可以释放电子。由此，氧碳为中心的自由基形成。这些自由基非常 活泼，会引发许多不同性质的产物。 h a s h i m o t on 等人研究【3 9 j 发现不添加酒花酿造的啤酒即使经过很长时间贮藏也基本 不会产生典型的老化风味；同时发现在啤酒模型系统中，异伐酸降解产物是不同长度的 羰基化合物，如c 3 到c l l 的2 一酮类、c 2 至u c l o 的烷醛类、c 4 到c 7 的2 烯醛。除此之外，早 期研究【4 0 j 认为，丙酮、2 甲基丙醛、3 甲基2 一丁酮、4 甲基戊一2 酮和2 甲基3 丁烯2 醇也被认为是相应的氧化产物。w i l l i a m srs 等人1 4 l j 证明0 酸和p 酸羰基侧链降解会释放 出2 甲基丙酸，2 甲基丁酸和3 一甲基丁酸，这些酸是形成老化脂类的前驱物质。 1 3 立题依据及意义 异a 酸是啤酒苦味的主要来源，早期受分离方法的制约，传统上通过测定啤酒中总 异a 酸的含量来评价啤酒苦味。但是异a 酸的六种顺、反异构体具有不同的苦味强度， 因此这些苦味成分的完全分离具有一定的实践意义：首先可以以分离为基础给予酒花评 价更加细致的补充，同时它也提供进行啤酒酿造与啤酒贮藏研究的基础，可以为酿造者 提供啤酒酿造和贮藏过程中具体异构体在量上的变化信息，用于指导实践。 江南大学帧士字位论又 另外，异a 酸六种顺、反异构体的完全分离，不仅为测定具体苦味酸含量控制预测 最终啤酒感知苦味奠定基础，同时根据近年来德国人对比尔森啤酒的研究，发现在啤酒 贮存中反顺异构体的比率与啤酒稳定性存在一定关系。而我国在此方面还未着手。因此 在前人研究基础上，对风味特征迥异的国内啤酒进行研究，考察国内啤酒贮藏过程中 t c 与啤酒稳定性的关系，将可能会建立衡量啤酒稳定性的新指标，不仅可以从一个新 的途径上丰富啤酒的老化机理，也将为考察影响啤酒稳定性的因素提供新的研究手段， 从而为通过探究影响t c 的因素深入了解原料、工艺的选择标准，为提高啤酒风味稳定 性奠定基础。 1 4 本论文的主要研究内容 本研究从异仅酸各顺、反异构体的分离方法建立出发，研究异0 【一酸各顺、反异构体 在啤酒风味劣化过程中的具体变化，通过口感品评及各标志性老化指标的辅助说明，提 出一个有效评价啤酒风味稳定性的t c 客观指标；并在以上基础上，从t c 来源及形成 两方面入手探讨酒花原料和煮沸工艺对麦汁、啤酒中t c 值的影响因素，最终建立酒花 指标与啤酒t c 的关系，为寻找提高啤酒风味稳定性开辟了新途径。 本论文主要包括以下几个方面的探索： l 、异0 【酸顺、反同分异构体测定方法的建立； 2 、啤酒老化过程中t c 与啤酒风味稳定性的关系； 3 、影响t c 因素的探讨及t c 酒花指标关系的初步建立 4 第二章异a 酸顺、反同分异构体测定方法的建立 2 1 引言 第二章异仅酸顺、反同分异构体测定方法的建立 啤酒是一种包含很多不同成分的复杂胶体溶液，据鉴定含有超过8 0 0 多种特色风味 成分1 4 2 1 。啤酒的主要风味包括源于酒花的苦味、源于乙醇的醇特征和源于c 0 2 的碳酸感 等。苦味是啤酒口味的重要特征之一，主要源于在麦汁煮沸过程中添加的酒花或酒花浸 膏【2 0 1 ，在麦汁煮沸过程中，酒花中没有苦味的a 酸【4 3 1 ( 合蓰草酮、薇草酮和加萑草酮) 受 热异构化为6 种相应在c 5 位置差相异构化的顺、反异a ，酸【删( 化学结构式见图l 一3 ) 。这些 异c 酸赋予啤酒8 0 的苦味1 2 1 1 ；同时它们还对抗菌特性、加强泡沫稳定性等方面有重要 作用，同时与如“日光臭 等不良气味的形成也有一定关系【1 6 4 5 4 6 】。 研究证实异( i t 酸每种顺、反同分异构体贡献的苦味有差别【2 2 1 ，且它们在啤酒贮藏过 程中有不同的降解行为1 4 。因而，它们的分离、鉴定和定量检测对啤酒酿造意义深远。 但异a 酸6 种顺反异构体结构非常相似、稳定性差，且目前e b c ( 欧洲酿造协会) 和 a s b c ( 美国酿造化学家协会) 官方方法使用的标准化合物d c h a i s o 只含有3 种反式一异伍 酸，给样品前处理和色谱分离等带来很大困难。国外在此方面做了不少努力1 1 9 , 2 7 2 9 1 ，但 均限于添加不挥发的酸性缓冲液作流动相，不适于m s 鉴定；直到2 0 0 4 年v a n h o e n a c k e r g 等人在碱性条件下使用两根色谱柱使各物质较好分离【3 l 】，近年p a t r i c kl 等人【3 0 1 使用 l c m s 技术以挥发碱性缓冲液为流动相单根色谱柱分离各物质，但未能实现顺式异蓓 草酮与反式一异加蓰草酮的完全分离。国内也有对异c 【一酸的分离检测的报道 3 2 , 3 3 j ，但限 分离与酒花a 一酸相对应的三种异q 酸化合物，目前还未见分离异0 【酸六种顺、反异构 体相关检测方法的报道。 本章主要探讨异a 酸顺、反异构体的分离条件，研究不同缓冲液作流动相的分离情 况，建立反相高效液相色谱分离检测异a 酸各顺、反异构体的方法，使异a 酸各顺、反 异构体均达到基线分离，并通过m s 技术实现各物质的初步定性。在此基础上通过样品 前处理方法的比较，确定与之适合的固相萃取样品预处理方法。经过检验证明此分离方 法重现性好，精密度和检测限均符合要求，可用于准确有效地测定啤酒中主要顺反异i x 酸含量，为后续研究奠定了坚实的基础。 2 2 材料与方法 2 2 i 主要试剂 异0 【酸( 6 4 3 ) 二环己基胺盐( d c h a ) 标样，购自a s b c ( 美国酿造化学家协会) ，乙腈 和甲醇为色谱纯，异辛烷为分析纯，水为超纯水。啤酒样品为市售。 酸化甲醇的配制：加0 5m l 磷酸( 8 5 ) 于1 0 0 0m l 甲醇中。 标准储备液的配制：称取标准样品2 0m g ，用酸化甲醇溶解于1 0 0m l 棕色容量瓶中， 并于2 4 保存。 缓冲溶液i 的配制：配制甲醇：水：磷酸( v ：v ：v ) 为6 0 ：4 0 ：0 1 的溶液。 5 龃南大字坝士字但论又 缓冲溶液i i 的配制：配制乙腈：甲醇：水：磷酸( v ：v ：v ：v ) 为5 0 ：4 0 ：1 0 ：0 1 的溶液。标准样 品的配制：称取标准样品2 0m g ，用缓冲溶液i i 定容于l o o m l 棕色容量瓶中， 并于2 4 c 下保存。 2 2 2 主要仪器 高效液相色谱仪：美国w a t e r s 公司，1 5 2 5 泵，7 1 7 自动进样器，2 4 8 7 双波长紫外检测 器：b r e e z e 3 3 色谱工作站。 2 6 9 0 高效液相色谱一质谱联用仪( h p l c e s i m s ) ：美国w a t e r s 公司，w a t e r sp l a t f o r m z m d4 0 0 0 型，9 9 6 二极管阵列检测器。 2 2 3 主要分析方法 a 样品前处理方法 a 液液萃取： 1 0 0m l 脱气啤酒经盐酸酸化后用2 5 0m l 异辛烷于5 0 0m l 分液漏斗中萃取，用力 振荡2 0m i n 后，静置分层，收集异辛烷层( 约12 5m e ) ，并用旋转蒸发仪在减压状态蒸 发溶剂。残渣被重新溶解于2m l 酸化甲醇中。在进行h p l c 色谱分析之前，样品溶解 液通过0 4 5l a n 的微孑l 滤膜过滤，以供分析。 b 固相萃取： 用5m e w 醇活化s e p p a k 固相萃取小柱，然后5m l 缓冲溶液i 经过，加入1 0m l 除气 啤酒通过柱子，再用2m l 超纯水水洗涤，1 0s 干燥，使用缓冲溶液i i 将目的物洗脱下来， 最后用缓冲溶液i i 定容为2m l ，在进样前用0 4 5 岬微孔滤膜过滤，低温避光保存以备 分析。 b h p l c 分析方法： a 甲醇乙酸铵缓冲液分析方法： 色谱柱为p u r o s p h e rs t a rr p l s ( 4 6m m x 2 5 0i t f f n ，5u m ) 。检测波长为2 5 6a m ；柱温 3 5 ；进样量为1 0 此。流动相条件为甲醇：1 0m m o l 乙酸铵缓冲液( v v ) = 6 0 ：4 0 ，流速1 0 m l m i n ，等梯度洗脱。 b 乙腈甲酸缓冲液分析方法： 使用z o r b a xe d i p s ex d b c 1 8 ( 4 6 x 2 5 0i t i i t i ，5r t m ) 色谱柱，流动相组成：a 相甲酸缓 冲液( p h 砣3 ) ，b 相乙腈，a ：b = 4 1 ：5 9 ；柱温2 0 ；检测波长2 5 6n l t l ；流速2m l m i n ；进 样量4 “l ；检测在等梯度梯度洗脱条件下完成。 c 质谱条件 负离子扫描( e s i ，m z2 0 0 1 0 0 0 ) ，毛细管电压：4 0 5k v ，锥孔电压：3 0v ；离子源 温度：1 0 0 ；脱溶剂气温度：2 5 0 。质谱数据使用m a s s l y n x4 0 软件进行处理。 d 条件优化 采用d r y l a b2 0 0 0p l u s 软件对色谱条件进行优化。 6 第二章异q 酸顺、反同分异构体测定方法的建立 2 3 结果与讨论 2 3 1 甲醇乙酸铵缓冲液分离异a 酸六种同分异构体的摸索 a 检测波长的选择 为确定合适的检测波长，利用h p l c d a d 对标样及待测样品于2 0 0 - - - 5 0 0 n m 范围作光 谱扫描，通过相互确认得到各物质峰的紫外吸收图谱( 图2 1 ) 。 肇j 人峰4 m 1 乏 1 5 l 峰5 、 m 多 峰3 q i峰6 m 图2 1 各峰的紫外吸收光谱图( 峰号见图2 3 b ) f i g 2 - 1u v - v i ss p e c t r ac o r r e s p o n d i n gt oe a c hp e a l ( ( p e a kn u m b e r sr e f e rt oh p l cc l l r o m a t o 伊锄si n f i g 2 - 3 b ) 由图显示各顺、反异0 【酸的特征u v 吸收存在微小差异【4 8 】。考虑各物质的检测波长 均在2 5 3 6 2 5 7 6m n 范围内，其中大半物质在近2 5 6n n 波长处有最大吸收，因此确定 同时分离各物质的检测波长为2 5 6n l n 。 b 色谱条件的优化 图2 2 不同流动相组成的h p l c i 蛩谱 f i g 2 - 2h p l cc h r o m a t o g r a p h ye m p l o y i n gv a v i o u sm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o n 先后对z o r b a xe d i p s ex d b - c 1 8 ( 4 6 x 2 5 0n l i 1 ，5 肛m ) 和p u r o s p h e rs t a rr p l s ( 4 6 m r n x 2 5 0n l n l ，50 x n ) 两根色谱柱进行比较，发现二者均能实现主要目的物的分离，但后 者对异仅酸顺、反异构体分离效果稍优。为更好分离目的物，在确定色谱柱和流动相基 本组成基础上，尝试对流动相组成进行优化，分别选用乙酸铵缓冲液：甲醇：乙腈( v l ：v 2 ：v 3 ) 为4 0 ：4 0 ：2 0 、4 0 ：5 0 ：1 0 、4 0 ：6 0 ：0 ，结果见图2 2 。结果表明当有机相全为甲醇时各组分分 7 2 1 1 5 ) 6 4 2 乏 争 争 争 玑 0 0 0 3 2 1 江南大学由贝士字位论又 离较佳，此时的流动相组成为乙酸铵缓冲液：甲醇= 4 0 ：6 0 。 c 异0 1 , 一酸顺反异构体的h p l c e s i m s 检测分析 应用优化得到的方法分析标准样品和液液萃取后啤酒样品，h p l c 图谱见图2 3 。 由图2 3 可见，标样及啤酒样品中各物质均分离较好。通过对比加标样品峰、标样 和样品图谱中各物质的保留时间、以及上述得到的各物质特征u v 吸收，确定图2 3 b 中 的峰1 6 均为目的峰，且其中峰2 、峰5 、峰6 是与标样相对应的反式异a 酸。 利用e s i m s 进一步确定各目的峰。图2 3 中各色谱峰对应的质谱图分别附图1 2 。 图2 - 3 标样( a ) 及液液萃取啤酒样品( b ) 的h p l c 谱图 f i g 2 - 3c h r o m a t o g r a m so fi s o - a a c i ds t a n d a r d s ( a ) a n db e e rs a m p l eb yl i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ( b ) 根据样品与标样各物质峰保留时间、样品与标样峰的分子离子信息及文献参考，各 物质峰得到鉴定。6 种异q 酸顺反异构体辨别信息与鉴定结果见表2 1 。 表2 16 种异q 酸顺k 异构体的辨别 t a b l e2 - 1i d e n t i f i c a t i o no fs i xc i s t r a n ss t e r e o i s o m e r so fi s o 仅- a c i db yh p l c d a d ，l c - m s 除以上信息，m s 图谱还给出了一些碎片离子，其形成途径列于附图1 2 各质谱图 右侧，这些碎片离子都能从各目的物的化学结构方面得到解释，与相应物质结构符合很 好，使上述定性结论得到进一步确认。 综上所述，添加乙酸铵缓冲液的流动相条件对顺式异蓓草酮与反式异加蓓草酮的 完全分离无能为力，为保证后续研究的准确性，我们将继续摸索可实现异a 酸6 种顺、 反同分异构体分离的条件。 2 3 2 乙腈甲酸缓冲液分离异0 【酸六种同分异构体条件的建立 a 基本分离条件的确定 采用反相色谱分离弱酸( 3 p k a 7 ) 或弱碱( 7 p k a 8 ) 样品时，通过调节流动相的 p h 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反 8 第二章异c i 酸顺、反同分异构体测定方法的建立 相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的p h 值越小，组分的k 值越大。据了解异a 酸六种 顺、反异构体的p k 处于弱酸范围，因此本研究利用此技术最终确定以甲酸缓冲液为流动 相分离各物质，并在色谱柱使用范围内对流动相p h 值( 2 5 、2 4 、2 3 ) 、分离流速、进样 量等基本因素进行了摸索，建立了一种在酸性条件下分离异仅酸六种顺、反异构体的方 法。该方法首次使用添加具有挥发性的甲酸缓冲液的流动相使异o 【酸六种顺、反异构体 得到基本分离，并实现了l c m s 对各分离峰的初步定性。该方法对应的基本分离条件为： 色谱柱：z o r b a xe c l i p s ex d b c l s ( 4 6 x 2 5 0i t l l n ，50 x n ) ； 流动相组成：a 相：甲酸缓冲液( p h i 2 3 ) ，b 相：乙腈； a ：b = 4 5 ：5 5 ；柱温3 5 ；检测波长为2 5 6a m ；流速2m l m i m 进样量为4l x l 。 上述分离条件对应的啤酒样品色谱图见图2 4 。 图2 4 基本分离条件下异o 【酸6 种顺反异构体的h p l c 图 1 ：反异合蓰草酮；2 ：顺一异合薇草酮；3 ：反异薇草酮； 4 ：顺异蓰草酮；5 ：反异加薇草酮；6 ：顺异加萑草酮 f i g 2 - 4h p l cm a po fs i xc i s t r a n si s o - a - a c i d su n d e rb a s i cs e p a r a t ec o n d i t i o n b 分离条件的进一步优化 改变流动相组成和柱温是提高色谱峰分离度的主要手段。本实验以上述分离条件为 基础，使用d r y l a b 软件对以上两个重要因素进行优化选择，以达到改善异q 酸六种顺、 反异构体峰的分离度的目的，其中因素优化实验设计见表2 2 ，柱温优化和流动相组成 优化输入参数情况分别见表2 3 和表2 4 。 表2 2 流动相比例及柱温的优化实验设计表 t a b l e 2 2e x p e r i m e n td e s i g no fm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o na n dc o l u m nt e m p e r a t u r eo p t i m i z a t i o n 实验编号实验条件 b 忙5 5 ；柱温：3 5 ；p h = 2 - 3 ；其他条件为基本条件 b = 5 5 ；柱温：2 5 ；p h = 2 3 ；其他条件为基本条件 b 哆扣6 5 ：柱温：3 5 ；p h = 2 3 ；其他条件为基本条件 b 忙6 5 ；柱温：2 5 ：p h = 2 3 ；其他条件为基本条件 9 2 3 优化柱温条件输入参数的描述 t a b l e 2 - 3d e s c r i b eo fi m p o r tp a r a m e t e ro fc o l u m nt e m p e r a t u r eo p t i m i z a t i o nc o n d i t i o n 9 江南大学硕士学位论文 顺异合薇草酮 反异薇草酮 顺异薇草酮 反异加薇草酮 顺异加萑草酮 色谱柱数据 1 1 5 71 1 8 3 4 6 0 00 8 71 2 2 21 4 1 5 7 8 0 0 1 0 3 1 4 1 81 2 0 11 0 00 8 51 4 9 01 5 4 3 4 0 0 0 8 5 1 5 4 67 6 0 3 2 0 00 9 71 6 3 29 4 8 1 7 o o 1 0 7 1 7 1 5 4 1 0 1 0 0 1 5 91 7 9 54 6 9 4 0 01 0 5 19 2 2 2 4 5 7 0 0 00 9 72 0 6 02 7 7 3 7 0 01 0 5 柱类型：c 18 ；柱长( c m ) ：2 5 ；直径r ( c m ) ：o 4 6 ；填料粒度( 岬) ：5 ；理论塔板 洗脱数据 流速( m l m i n ) 数：2 2 5 2 0 2b 5 5 l 2 - 4 优化流动相比例输入参数的描述 t a b l e 2 - 4d e s c r i b eo fi m p o r tp a r a m e t e ro fm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o n 反异合律草酮 顺异合薇草酮 反异蓓草酮 顺异i 辜草酮 反异加薇草酮 顺异加薇草酮 色谱柱数据 洗脱数据 5 8 82 3 3 7 9 0 00 3 01 0 6 93 4 9 51 0 0 0 8 5 6 4 81 1 0 4 9 4 0 00 4 01 2 2 2 1 4 1 5 7 8 o o1 0 3 7 5 8 1 10 5 4 0 0 0 3 514 9 015 4 3 4 o o0 8 5 8 1 77 2 9 5 5 0 0o 4 31 6 3 29 4 8 1 7 o o1 0 7 8 6 72 7 0 1 0 00 3 31 7 9 54 6 9 4 0 01 0 5 9 6 5 3 3 9 5 0 0 0 0 4 42 0 6 0 2 7 7 3 7 o o1 0 5 柱类型：c 18 ；柱长( c m ) ：2 5 ；直径( c m ) ：0 4 6 ；填料粒度( 岬1 ) ：5 ；理论塔板数：2 2 5 2 0 流速( m l m i n ) 2 柱温( ) 2 5 a 对柱温的优化 基于编号为1 、2 的实验数据，使用l c - t e m p e r a t u r e ( 2 r u n s ) 特征模型模拟分离进行柱 温优化。 、 h 、 。 一 图2 5 柱温优化分辨图 f i g 2 - 5r e s o l u t i o nm a po fc o l u m n t e m p e r a t u r eo p t i m i z a t i o n |1 、八 图2 62 0 下的预测色谱图 f i g 2 - 6p r e d i c t i o nc h r o m a t o g r a mu n d e r t e m p e r a t u r eo f 2 0 表2 5 柱温优化分辨结果 t a b l e 2 5r e s o l u t i o nr e s u l to fc o l u m nt e m p e r a t u r eo p t i m i z m i o n 降低柱温可以提高各峰的分辨率，在柱温预测外推法的范围内，柱温为2 0 。c 时对应 的各峰分辨率最大( 图2 - 5 ) ，此柱温下各峰间最小分辨率为1 5 5 ( 表2 5 ) ，预测色谱见图2 6 。 1 0 第二章异q 酸顺、反同分异构体测定方法的建立 b 对流动相比例( b ) 的优化 基于b = 5 5 ( 编号2 ) 和b = 6 5 ( 编号4 ) 两组实验数据，用l c - r pi s o c r a t i c b ( 2 r u n s ) 特征模型模拟分离对流动相比例进行优化。 厂 1 ； 厂j 八 ，j 图2 7 流动相组成优化分辨图 f i g 2 7r e s o l u t i o nm a po fm o b i l ep h a s e c o m p o s i t i o n 图2 8 流动相为5 9 b 时的预测色谱图 f i g 2 8p r e d i c t i o nc | 1 r o m a t o g r a mu n d e rm o b i l e p h a s ec o m p o s i t i o no f5 9 b 表2 - 6 流动相比例优化分辨结果 t a b l e 2 6r e s o l u t i o nr e s u l to fm o b i l ep h a s ec o m p o s i t i o no p t i m i z a t i o n 由图2 7 可以看到，在d r y l a b 预测外推法的范围内，分辨率在有机相b 为6 0 时达 到最大，此条件下各峰间最小分辨率为1 5 6 ( 见表2 6 ) ，但此时分辨率的稳定强度不够， 因此在兼顾稳定强度和分辨率两方面时，确定b 为5 9 时为最优流动相比例( 最小分辨 率为1 5 5 ) ，对应的色谱峰图为图2 - 8 ，由表2 5 结果可见，提高有机相组成不但可以促进 各峰的分离，还可以有效缩短分离时间。 c 异a 酸顺、反异构体的h p l c m s 检测分析 图2 9 是确定色谱条件下的固相萃取样品h p l c 图谱。可见该方法能够使异i x 酸各顺、 反异构体均达到基线分离。对比啤酒样品中各物质的特征u v 吸收、分析加标啤酒样品 以及对比标样与啤酒样品中各峰的保留时间，可知图2 9 b 中的峰1 6 均是我们的目的峰， 其中峰1 、峰3 、峰5 分别是与标样相对应的反式异0 【酸。 本研究使用e s i m s 对各目的峰进行初步定性。图2 1 0 为各物质峰对应的质谱图。 1 6 l 一 一卜心 m咄lgdraltt 图2 9 标样( a ) 及固相萃取啤酒样品( b ) 的h p l c 谱图 f i g 2 - 9c h r o m a t o g r a m so fi s o m e r i z e da a c i ds t a n d a r d s ( a ) a n db e e rs a m p l eb ys o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( b ) 江南大学硕士学位论文 蝗l ” 翟毫k 。3 彳气 峰4 蜀一 2 已5 3 2 印j2 略23 警 峰2 押 强螽2 掣叩 峰5 碍 2 吁；i ：晖2 。甲 r 峰3 2 晒3 2 邵l2 哪3 1 ，s 峰6 2 。p i ：略2 鼍s m z= zm ，2 图2 ，1 0 啤酒样品中各色谱峰的e s i 负离子质谱图( 峰号见图2 9 b ) f i g 2 - 10m a s sf r a g m e n t a t i o np a t t e mo fc o m p o n e n t si nb e e rs a m p l eu n d e re s i m si nn e g a t i v em o d e ( p e a kn u m b e r sr e f e rt oh p l cc h r o m a t o g r a m si nf i g 2 - 9 b ) 根据样品与标样各物质峰保留时间、样品与标样峰的分子离子信息及文献参考，各 物质峰得到鉴定。6 种异a 酸j l l 页反异构体辨别信息与鉴定结果见表2 7 。 9 2 76 种异叶酸顺反异构体的辨别 t a b l e 2 - 7i d e n t i f i c a t i o no fs i xc i s t r a n ss t e r e o i s o m e r so fi s o - a - a c i db yh p l c d a d l c - m s 除以上信息，m s 图谱还给出了一些碎片离子，它们可以从化学结构入手更进一步 的确认目的峰，图3 中峰l 、峰2 质谱图出现m z3 2 9 4 、2 7 8 3 、2 5 1 3 、2 3 3 9 、2 0 7 3 分别为相应物质失去一个1 8 ( h 2 0 ) 、6 9 ( c 5 h 9 ) 、9 6 ( c 6 h s o ) 、1 1 4 ( h 2 0 、c 6 h 8 0 ) 和 1 4 0 ( c 5 h 9 、c 4 h 7 0 ) 而形成，峰3 - - - 6 质谱图中m z3 4 3 4 、2 9 2 2 、2 6 5 3 、2 4 7 3 是对应 失去1 8 ( 一h 2 0 ) 、6 9 ( 一c 5 h 9 ) 、9 6 ( 一c 6 h 8 0 ) 、1 1 4 ( h 2 0 、c 6 h 8 0 ) 而产生。这些碎片离子都与 相应物质结构符合很好，进一步确认以上结论。 d 液液萃取与固相萃取样品前处理方法的比较 图2 1 1 液液萃取( a ) ，固相萃取( b ) 啤酒样品的h p l c 图谱 f i g 2 11c h r o m a t o g r a m so fb e e rs a m p l eb yl i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ( a ) a n ds o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( b ) 1 2 簪一 o 竽哥 。 啪 霉搿 。 伽 参哥 a 雠 咎一 。 啪 簪一 。 第二章异q 酸顺、反同分异构体测定方法的建立 异a 一酸各顺反异构体的前提取也是测定异g t 一酸各顺、反异构体含量中的关键步骤， 预处理一般有两个目的：一是尽量富集目的物；二是去除干扰物质，这样会使分析更准 确。样品预处理常用的方法有高速离心、过滤、超滤、选择性沉淀、衍生反应、液一固 萃取液液萃取、o a s i s 和s e p p a k 固相萃取等方法。本研究对传统液液萃取和固相萃取两 种样品前处理方法进行了比较，两种样品前处理方法对应的色谱图见图2 1 1 、回收率见 表2 8 、表2 9 。 表2 - 8 液液萃取回收率及r s d t a b 2 8t h er e c o v e r ya n dr s do f l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o nm e t h o d 表2 - 9 固相萃取回收率及r s d t a b l e 2 9t h er e c o v e r ya n dr s do fs o l i dp h a s ee x t r a c t i o nm e t h o d 异辛烷萃取样品对应的色谱图( 图2 1 1 a ) 前端溶剂峰峰形时高时低，缺乏足够的稳定 性，在目的峰前后有少量杂峰出现，可见该方法对目的物萃取专一性有限，其加标回收 率在7 1 3 4 9 2 4 3 范围( 表2 8 ) ；另外，异辛烷液液萃取过程中常出现乳化现象，需通过 离心去除，因此具有浪费时间、人力和实验费用等多个缺点。固相萃取前处理样品对应 的