（农产品加工及贮藏工程专业论文）赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究.pdf

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u s 0 4 5 h 2 00 5 ，m n s 0 4 - 4 h 2 0 5 ；最佳培养条件：接种量9 ，初始p h 值6 0 ，温度3 2 ，装液量 5 5 m l 2 5 0 m l ，转速2 0 0 r m i n ，在此条件下培养1 2 0 h 赤藓糖醇产量达 9 1 7 9 m 。 关键词：赤藓糖醇，菌种选育，发酵 b r e e d i n go fh i g h - - p r o d u c i n ge r y t h r i t o ls t r a i na n d o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n a b s t r a c t e r y t h r i t o li sak i n do fa d d i n gs w e e t e n e rw i t he d i b l es a f e t ya n df l a y o rl i k e s u c r o s e t h e r ea r es e v e r a lv i r t u e si n e r y t h r i t o l ，s u c h a sl o wc a l o r y ，h i g h s t a b i l i t y , a p p r o p r i a t e s w e e t t a s t e ，n o n c a r i o g e n i c ，n o n h y g r o s c o p i c h i g h t o l e r a b i l i t ya n d 、s oo n i th a sg r e a tp o t e n t i a lf o ra p p l i c a t i o ni nf o o da sa ni d e a l a s s i s t a n tm a t e r i a lf o rh y g i e n i c a lf o o d e r y t h r i t o lp r o d u c e db yf e r m e n t a t i o ni s m o r ep r o m i s i n gc o m p a r e dt oc h e m i c a ls y n t h e s i sm e t h o d i nt h i sp a p e r ，w e c a r r i e do u tas e r i e so f e x p e r i m e n t s ，i n c l u d i n gs c r e e n i n g ，s t r a i n su l t r o v i o l a t i n g a n do p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o np r o c e s s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o i l o w s ： 1 7s t r a i n sw e r eh i g he r y t h r i t o l - p r o d u c e r sw i t ht h ep r o d u c t i v i t yh i g h e r t h a n2 0 9 lw e r ei s o l a t e df r o mp o l l e n ，h o n e ya n dh o n e y c o m bc o l l e c t e d i n a p i a r yi nm o u n t a i nt a i a m o n g s t7e r y t h r i t 0 1 p r o d u c i n gs t r a i n s s t r a i nk 一2 3 p r o d u c e d4 6 8 9 le r y t h r i t o la f t e r13 2 ha n db a s e do ng l u c o s ei nam e d i u m c o n t a i n i n g2 0 g l u c o s e ，1 y e a s te x t r a c ta n d0 1 u r e a 2 e x a m i n a t i o n sw e r ec o m p a r e du n d e rv a r i o u sc u l t i v a t i o nc o n d i t i o ni nt h e w h i l eo fa c t i v a t i n g ，c o l l e c t i o na n d s c r e e n i n go nt h ee r y t h r i t 0 1 p r o d u c i n g s t r a i n s s e a i n gu pam e t h o dw i t has p e c i a lt c lw h i1et h ep l a t ew a sd e v e l o p e d b yt h ep e f i o d a t es o d i u m b e n z i d i n ea st h ec o l o rd e v e l o p i n gr e a g e n ta n dt h e s o l v e n ts y s t e mo fn b u t a n o la l c o h o l - a c e t i c a c i d w a t e r ( 4 ：1 ：5 ) a st h em o b i l e p h a s e ，t h a ti s ，m a d eap i e c eo fn o r m a lt c l t h r o u g ht h en o r m a ls a m p l es p o t i n g s a m p l e sw i t hg r a d i e n ta n dc e r t a i nq u a n t i t y i nt h ei n v e s t i g a t i o n ，j u s tr e q u i r i n g ar e s u l to ft c lw i t hs a m p l e st h a tc o m p a r i n gw i t hn o r m a l b o a r d s ow ec a n a n a l i z e dt h ee r y t h r i t o lt h a tc a m ef r o mt h es a m p l ew i t ht h eq u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t i v em e t h o d s 3 s t r a i nk 2 3a st h eo r i g i n a ls t r a i nw a st r e a t e dw i t hu v o n em u t a n t e r y 2 3 7p r o d u c e dm o r et h a n7 0 9 lw a ss e l e c t e d ，a n dt h eh e r e d i t a r ys t a b i l i t y 2 山东农业大学硕士学位论文 o ft h em u t a n te r y 2 3 7w a s i n v e s t i g a t e d i nt h e s h a k i n g f l a s k b y p a s s g e n e r a t i o nt e s t s t h et e s t sw a ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i cp r o p e r t yo f t h i s m u t a n tw a ss t a b l e 4 t h r o u g has e r i e so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h ee f f e c t so ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so nt h ep r o d u c t i o no fe r y t h r i t o lf r o ms t r a i ne r y 2 3 7s u c ha sc a r b o n s o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c e s ，i n i t i a lp h ，t e m p e r a t u r ea n do t h e rf a c t o r sw e r e s t u d i e d t h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o n m e d i aa n dc u l t u r ec o n d i t i o nw e r e e s t a b l i s h e d t h eo p t i m a ll i q u i dm e d i u mc o n s i s t e do f30 0 9 lg l u c o s ew a su s e d a sc a r b o ns o u r c e ，8 9 lc o m - s e e dl i q u o ra sn i t r o g e ns o u r c ea n do t h e ri n o r g a n i c s a l t s ( g l ) ：c u s 0 4 5 h 2 00 5 ，m n s 0 4 4 h 2 05 ：t h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n w e r e ：i n o c u l a b i l i t yq u a n t i t y9 ，i n i t i a lp h 6 0 ，m e d i u mv o l u m e55 m li n 2 5 0 m lf l a s k ，a g i t a t i o ns p e e d2 0 0 r m i na t3 2 c 。t h ey i e l do fe r y t h r i t o lr e a c h e d 9 1 7 9 li n1 2 0 h k e y w o r d s ：er y t h r i t o l ，b r e e d i n g ，f e r m e n t a t i o n 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 1 前言 1 1 赤藓糖醇的性质 1 i 1 赤藓糖醇的理化性质 赤藓糖醇是一种天然物质，在自然界中的分布非常广泛，海藻、蘑菇 类以及甜瓜、葡萄、桃等水果中均含有赤藓糖醇。由于细菌、真菌和酵母 能发酵产生赤藓糖醇，所以赤藓糖醇也存在于果酒、啤酒、酱油等食品中。 赤藓糖醇，英文名为e r y t h r i t o l ，其化学名为1 ，2 ，3 ，4 丁四醇，分子式 为c 棚l 0 0 4 ，分子量1 2 2 1 2 ，熔点1 2 6 。c ，沸点3 2 9 。c 3 3 1 ，外观为白 色结晶性粉末，粉碎性好，溶于水会吸收较多能量，溶解热为9 7 4 j g 。 由于赤藓糖醇是一种对称的分子，只以内消旋形式存在，可简化生产工艺， 省去了生物转化或合成时需要将对映异构体去除精制等一系列复杂的操 作步骤。其主要物化性质有： ( 1 ) 甜度 赤藓糖醇甜度约为1 0 蔗糖水溶液甜度的6 0 0 0 - 7 0 。在口中有清凉 感口味和蔗糖十分相似，无后苦味。与强烈甜味剂混合使用，能掩盖其不 良昧感，还可和甜菊苷或糖精共用。 ( 2 ) 耐热耐酸性 赤藓糖醇的耐热耐酸性很强，在各种食品加工条件下，对酸和热相当 稳定，不分解，不变色。即使在高温条件下也不会产生分解及加热变色。 另外，赤藓糖醇在和氨基酸共存的情况下，也不会发生美拉德反应。 ( 3 ) 溶解热 在结晶状态下食用时，赤藓糖醇和其它糖醇一样，赤藓糖醇溶于水中 时会吸收较多的能量，溶解热为9 7 4 j g ，赤藓糖醇的溶解热达葡萄糖的3 倍，山梨糖醇的2 倍，食用时有一种凉爽的口感特性。 ( 4 ) 溶解性 赤藓糖醇的溶解度在2 5 时为3 6 ( w w ) ，是山梨糖醇溶解度的1 2 ， 低温条件下得饱和度较低。这个溶解度在一般的食品加工时不会有问题， 但对于一些不希望糖醇析出结晶的食品，如果酱、果子冻类食品中，赤藓 糖醇必须和其它糖类、糖醇混合使用以防结晶析出。 4 山东农业大学硕士学位论文 ( 5 ) 吸湿性 赤藓糖醇结晶性好，吸湿性极低，易于粉碎制得粉状产品。在相对湿 度9 0 以上环境中也不稀释，比蔗糖更难吸湿，故十分适用在巧克力、口 香糖、糖果、粉末饮料之类忌湿食品中。 ( 6 ) 冰点与黏度特征 2 5 ，3 0 ( w w ) 的赤藓糖醇水溶液冰点为4 1 ，而同样条件下 山梨醇、蔗糖的冰点分别为2 5 ，1 2 。相对来说，赤藓糖醇的冰点 下降较大；赤藓糖醇在2 5 ，3 0 的水溶液，其粘度为3 c p ，易于在食品 加工中使用。 ( 7 ) 水分活性和渗透压 由于赤藓糖醇是小分子物质，具有很强的依数。i 生( c o l l i g a t i v ep r o p e t r y ) ， 诸如冰点下降、沸点升高以及高渗透压等，加上它较低的吸湿性及化为溶 液时的低粘度特性，使降低或控制水分子活度更易实现。水分子活度的降 低有利于提高食品的保存性，延长食品的货架期。赤藓糖醇在2 5 ，3 6 的水溶液，水分活度为0 9 1 ；2 0 ，1 5 ( w w ) 的赤藓糖醇水溶液的渗 透压为1 8 6 1 m d k g ，是蔗糖的3 2 倍，山梨糖醇的1 8 倍。 1 1 2 赤藓糖醇的功能性质 以淀粉为例描述糖类在人体中被利用的过程。淀粉首先被淀粉酶降解 成单糖即葡萄糖之后，到小肠部分才被吸收进人血液。在胰岛素的作用下， 葡萄糖进人细胞，进一步代谢最终成为二氧化碳和水。所有其他糖类，包 括双糖，均必须降解为单糖才被一吸收，山梨醇和甘露醇等糖醇在小肠中 吸收缓慢，到达大肠后，能被细菌发酵，增加菌体量并产生脂肪酸、甲烷 和氢气。脂肪酸进人肝脏，进一步代谢，产生能量和二氧化碳。 由于赤藓糖醇的分子很小，在小肠中，可以很快被吸收，只有很少量 进人大肠，被发酵分解。试验证明，在一次口服2 5 9 赤藓糖醇中，3 h 内， 几乎有4 0 的赤藓糖醇在尿中被排泄。大约2 4 h 内，有8 0 的摄人量均 被排出。未从尿中排出的部分，少量在结肠进行发酵分解，其余部分从粪 便中排出。 虽然从化学结构上看赤藓糖醇是一种多羟基化合物，但它的分子量很 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 小，所以在人体内及哺乳动物体内消化系统中的代谢方式与其它多元醇类 不一样。这使得赤藓糖醇具有以下几个适合于应用在功能性食品中的优越 性： ( 1 ) 赤藓糖醇的代谢 赤藓糖醇是小分子物质，通过被动扩散很容易被小肠吸收，大部分都 能进入血液循环中，只有少量直接进入大肠中作为碳源发酵。然而，进入 血液中的赤藓糖醇又不能被机体内的酶系统所消化降解，由于赤藓糖醇虽 然能被吸收，但人体缺乏代谢赤藓糖醇的酶系，所以只能透过肾从血液中 滤去，经尿液排除体外。 赤藓糖醇上述非常独特的代谢性，决定了它的极低能量值。整体能量 平衡试验结果也表明，赤藓糖醇的能量值最高仅1 6 7 k j g ，是所有多元醇 甜味剂中能量值最低的一种。 ( 2 ) 耐受性 进入机体内的赤藓糖醇中有8 0 会迅速、彻底被小肠吸收，所以其耐 受性很高，副作用很小。那些不被小肠吸收而直接进入大肠中供细菌作碳 源发酵用的低能量填充剂( 包括低能量填充型甜味剂，可能会带来两方面 的副作用：腹泻和肠胃胀气。有鉴于此，它们的日平均摄取量通常限制在 2 0 9 以内，虽然短时期内每天摄入5 0 9 也有较好的耐受性。小肠内壁高浓 度的不吸收碳水化合物会产生很强的渗透压，这样导致小肠壁粘膜表面产 生水流( w a t e r i n f l u x ) ，故引起了腹泻。而不消化吸收的碳水化合物进入大 肠中，被肠道细菌发酵产生大量挥发性物质，超出了能通过血液重新吸收 和随粪便排出的数量极限，故产生了肠胃胀气。这两种副作用的程度大小 还与摄取者个人的具体身体素质有关，严重者有时还会出现腹部痉挛和肠 内翻滚现象。对于赤藓糖醇来说，绝大部分能被小肠吸收，故其耐受性很 高，副作用很小。 ( 3 ) 对糖尿病人的适应性 由于赤藓糖醇不被人体酶系统代谢，进人血液后最终从尿中排出，所 以对糖代谢过程没有影响。试验证明，当每埏体重摄入l g 赤藓糖醇后， 血浆葡萄糖和胰岛素没有变化。即使3 h 以后，也未发现变化，所以糖尿 病人食用赤藓糖醇是安全的。 6 山东农业大学硕士学位论文 ( 4 ) 促进双歧杆菌的增殖 通过使用1 2 属4 9 种7 2 株肠内细菌，研究赤藓糖醇对肠内细菌的利 用情况，结果表明赤藓糖醇很难被这些肠内细菌利用。而赤藓糖醇对肠道 中有益人体健康的菌一双歧杆菌具有明显的增殖作用，双歧杆菌代谢产生 的短链脂肪酸乙酸和赤藓糖醇可以有效地抑制病原菌的生长，从而增加了 人体的免疫力。 ( 5 ) 防龋齿性 由于口腔中的细菌不能利用和发酵赤藓糖醇，特别是普遍认为的产生 龋齿的链球菌不能在赤藓糖醇中生长，所以食用赤藓糖醇不会引起口腔中 p h 值下降和产生牙斑。 1 2 赤藓糖醇的应用 1 2 1 赤藓糖醇在食品工业中的应用 赤藓糖醇经过急性、亚急性、慢性毒性试验等动物试验以及人体试验 确认安全无毒、食用安全性较好，允许添加量较高，不易引起腹泻或胃肠 等不适感。1 9 9 0 年日本食品法规批准赤藓糖醇可直接作为食品配料；1 9 9 7 年通过美国食品与药品管理局( f d a ) 批准，获美国f d a 安全食品配料 ( g r a s ) 认证和允许在标签上标注“有益于牙齿健康”；1 9 9 9 年世界粮 农组织( f a 0 ) 和世界卫生组织( w h o ) 联合组成的食品添加剂专家委 员会( j e c f a ) 批准赤藓糖醇作为食用甜味剂，无需规定a d i 值；1 9 9 9 年澳大利亚和新西兰食品监督局( a n 、a ) 批准赤藓糖醇作为食用配料， 我国在g b2 7 6 0 8 6 标准中也允许其在食品中应用。由于赤藓糖醇的热、 酸稳定性好，在一般性食品加工条件下，几乎不会引起褐变或分解现象， 在硬糖生产时高温熬煮也不会引起褐变。赤藓糖醇的热稳定性高使巧克力 生产的精炼可以在更高的温度下进行，进一步促进巧克力风味的形成，改 善产品的品质。赤藓糖醇的吸湿性差，在湿度为9 0 的环境也不易吸潮， 这一特性对巧克力、口香糖等食品加工很有利。赤藓糖醇的高吸热性使得 产品食用后具有持久的爽口清凉感觉，对改善口香糖、清凉性固体饮料和 糖果的品质十分重要。赤藓糖醇甜味爽净，在与蛋白糖、甜菊糖等高甜度 甜味剂复配时可有效地掩盖其后苦味；赤藓糖醇还可以降低酒精的异味， 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 改善蒸馏酒和葡萄酒的口感与风味，在蔬菜汁饮料中使用，可有效地抑制 蔬菜饮料特有的不良口味；在饮用咖啡时添加可有效地抑制咖啡的涩味。 赤藓糖醇的耐热和耐酸等特性，使得巴氏、高温或超高温等杀菌工艺对以 赤藓糖醇为甜味剂的饮料外观品质均不会产生影响。 1 2 2 赤藓糖醇在医药、保健品生产中的应用 赤藓糖醇的热量很低，“零热值甜味剂之称，因而可用于生产各种 低热量保健食品、减肥食品和饮料；由于赤藓糖醇特殊的生理代谢机理， 可用于开发糖尿病及葡萄糖不适症等人群的功能食品或饮料；赤藓糖醇的 抗龋齿性，不能被变形链球菌等病原菌利用，故由赤藓糖醇制成的糖果和 专用洁齿用品对保护儿童的口腔健康有积极的作用。在医药行业，赤藓糖 醇可作为药品的矫味剂和片剂的赋型剂，可有效改善药品的口感。最近的 研究还表明，赤藓糖醇的衍生物一二脱氧赤藓糖具有抗h i v 活性。赤藓 糖醇硝化后生成的硝基赤藓糖醇，可用于治疗心脑血管疾病和气喘病人的 药物。 1 2 3 赤藓糖醇在其他行业的应用 在化工行业，赤藓糖醇作为有机合成的中间体，在醇酸树脂、聚酯、 聚醚的合成以及油漆、炸药制造等方面具有广阔的应用前景。在化妆品方 面，赤藓糖醇可以代替甘油的部分作用，由于多数微生物不能够利用赤藓 糖醇，可以防止化妆品变质。另外以赤藓糖醇为原料合成一些稀有产物， 如以赤藓糖醇作为底物生产稀有的l 赤藓糖。日本r a h m a nm d m i z a n u r 介绍了利用赤藓糖醇由微生物氧化和l 核糖异构化酶的异构化生产l 赤 藓糖的技术，得率为1 8 ，然后通过离子交换色谱柱纯化，1 0 9 的赤藓糖 醇可以得到1 7 9 纯品l 赤藓糖。( 康维民，1 9 9 7 ) 。 1 3 发酵法生产赤藓糖醇的研究进展 1 3 1 生产工艺 赤藓糖醇的生产方法可分为化学合成法和生物合成法两种。化学合成 法可以由丁烯二醇与过氧化氢反应，其中丁烯二醇是由乙炔和甲醛先制成 山东农业大学硕士学位论文 2 丁烯1 ，4 二醇，然后将其水溶液与活性镍催化剂混合并加入阻化剂氨 水，在0 5 m p a 压力下通入氢气氢化，得到赤藓糖醇产品。以淀粉为原料的 化学合成法是将淀粉用高碘酸法生成双醛淀粉，再经氧化裂解生成赤藓糖 醇和其他衍生物。化学合成法生产赤藓糖醇的工艺存在流程长、成本高、 污染严重、条件要求高、产品安全性差等不足，无法与发酵法比拟，因此 没有实现工业化生产。 发酵法是以淀粉水解葡萄糖为原料，经耐高渗酵母菌株发酵产生赤藓 糖醇及少量的核糖醇、丙三醇等副产物，经分离、提取、精制获得高纯度 的赤藓糖醇产品，其得率大约5 0 。与化学合成法相比，具有条件温和、 易于控制、环境污染少、产品安全、原料来源丰富、成本低等优点，更易 于实现规模生产。赤藓糖醇发酵法工业化生产流程如下： 生产菌株发酵 i 淀粉一液化一糖化一葡萄糖一过滤一色层分离一净化 浓缩一结晶一分离一千燥 赤藓糖醇 1 3 2 生产菌种 工业上主要是用耐高渗酵母和其他主产赤藓糖醇的微生物发酵生产。 据文献报道，酵母菌可以产生赤藓糖醇是由b i n k e y 和w o l f o r m 在1 9 5 0 年首次提出的。1 9 5 6 年，加拿大s p e n c e r 等在研究高渗酵母产生甘油时， 发现因菌种生长速度、培养条件不同，可产生赤藓糖醇。此后又有许多对 高产赤藓糖醇的微生物进行筛选的研究，发现能生产赤藓糖醇的菌有假丝 酵母属( c a n d i d a 人球拟酵母属( t o r u l o p s i s ) 、毛孢子菌属( t r i c h o s p o r u m ) 、 三角酵母属( t r i g o n o p s i s ) 、毕赤酵母属( p i c h i a ) 等。目前类酵母真菌 m o n i l i e l l a 发酵的产物浓度和得率最高。m o n i l i e l l a 突变株h a t l 0 1 采用合 适的培养方式培养时，赤藓糖醇的最终浓度可达1 7 5 9 l ，得率7 0 ( 徐 莹，2 0 0 5 ) 。 日本、韩国、比利时等国均开展了发酵法生产赤藓糖醇技术的研究。 日本学者从土壤、发酵食品、果实、花粉等样品中分离、筛选、诱变育种， 9 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 得到了1 株产赤藓糖醇的耐高渗酵母菌a u r e o a s i d i u ms p s n 1 1 5 ，以葡萄糖 为原料，赤藓糖醇得率达5 0 。韩国j i n b p a r k 等筛选到l 株耐高渗酵母 菌t r i c h o s p o r o ns p 以葡萄糖为原料，3 5 发酵可产生1 4 1 9 l 的赤藓糖醇， 赤藓糖醇得率为4 7 。我国台湾学者s h i e j e al i n 等筛选到2 8 株赤藓糖醇 产生菌，其中1 6 菌株可以发酵3 0 的葡萄糖产生赤藓糖醇111 o g l 。美 国专利有t o r u l o p s i sv a r i a b i l i s ，t r i c h o s p o r o n o i d e sm e g a c h i l i e n s i s ， t r i c h o s p o r o n o i d e so e d o c e p h a l & 和p i c h & s p 普遍认为生产赤藓糖醇的最好 菌株，能够利用单糖和双糖，且不产生其他多元醇；韩国的y a n g 选育的 c a n d i d am a g n o l i a e 变异株m 2 ，将葡萄糖浓度提高到2 0 时，获得生产力 0 5 4 9 l h ，产率4 3 ，且分析变异株m 2 具有产物单一性原因可能是： m 2 的赤藓酮糖还原酶有很高的底物特异性；而相对于a u r e o b a s i d i u ms p 变异株的赤藓糖醇的代谢途径上，赤藓酮糖还原酶利用d 赤藓酮糖作为 底物时表现出最大的活性，但是d 甘油醛和二羟丙酮也可以作为该酶的 底物，造成其他醇的产生，因而使赤藓糖醇的转化率下降。 近年中国食品发酵工业研究院、江苏省微生物研究所、江南大学等科 研单位分别在菌种选育、生产工艺方面取得各种成果。国内一些生产厂家 利用国内外的科研成果，也掌握了用发酵法生产赤藓糖醇技术，其主要指 标已达到了国外的先进水平，开始了赤藓糖醇的工业化生产。 山东省食品发酵工业研究设计院自1 9 9 2 年开始致力于发酵法生产赤 藓糖醇技术的研究工作，经过几十年的努力，从花粉、蜂蜜等样品中筛选 获得1 株耐高渗酵母菌，经过自然分离、多次复合诱变、驯化等，菌株耐 高糖能力为5 0 以上，以淀粉水解糖为原料，l o o m 3 发酵罐发酵赤藓糖醇 产率为1 8 0 9 l 以上，转化率超过5 0 。目前已完成了赤藓糖醇发酵工艺技 术以及提取技术的中试及生产性试验，产品纯度超过9 9 ，各项理化卫生 指标均达到出口要求。前期研究结果表明，选育获得的赤藓糖醇生产菌性 能稳定、发酵条件粗放、易于控制、发酵速度快、发酵残糖低，发酵副产 物少，是优良的赤藓糖醇生产菌。经研究确定的生产工艺技术路线简单易 行，并已具备了大规模工业化生产的条件( 刘建军，2 0 0 7 ) 。 1 0 山东农业人学硕士学位论文 1 3 3 微生物合成赤藓糖醇的途径 目前己发现的微生物合成赤藓糖醇的代谢途径主要有两条：( 1 ) 奇异 乳酸菌( l e u c o n o s t o co e n o s ) 合成赤藓糖醇，即奇异乳酸菌在厌氧的条件 下，把葡萄糖转化为6 磷酸果糖，6 磷酸果糖进一步磷酸化并分解为4 磷酸赤藓糖( e r y t h r o s e 4 p ) 和乙酰磷酸( a c e t y l p ) ，4 磷酸赤藓糖经磷 酸酯酶水解生成赤藓糖醇：( 2 ) 短梗霉( a u r e o b a s i d i u m s p ) 合成赤藓糖 醇，即短梗霉通过磷酸戊糖途径( 聊) ，合成4 一磷酸赤藓糖再进一步脱 磷酸还原为赤藓糖醇。 他：p 刖。 睦。 1 ，i _ i ( o s e f r u c i t ) 蹦 吣n 哪4 i ，：、埘- 1 r y l h r ；t 嘲单矗i 瑚i 盯h d ”：啭 烈厂圳诺斗 p 纷 g l n o c o s l 0 6 , , , p c a ，此外，就理论得出的较佳搭配进一 步进行诱变验证，获得较佳的诱变条件为紫外线照射时间、距离和光复活 次数分别为l m i n 、1 5 c m 和3 次。 3 5 2 诱变高产菌株的筛选 以k 2 3 为出发菌株进行紫外线诱变，经平板筛选共挑取单菌落3 4 9 个，经摇瓶初筛、复筛获得几株赤藓糖醇高产突变株，结果如表6 所示。 山东农业大学硕士学位论文 表6 菌株k - 2 3 紫外线处理复筛结果 t a b l e6r e s u l to f s c r e e n i n gb yu l t r a v i o l e tr a d i a t i o nt r e a t m e n t 由表6 可以看出，突变株u l 7 8 赤藓糖醇产量达7 1 9 9 l ，经多次纯 化分离，得到一支性能稳定的高产赤藓糖醇突变株e r y 2 3 7 ，传接十代赤 藓糖醇产量保持在7 0 9 l 以上，表明该菌株是一支比较理想的、具有开发 应用前景的赤藓糖醇发酵生产菌株。 3 6 发酵培养基的优化 3 6 1 葡萄糖浓度对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 在5 0 m l 2 5 0 m l 的三角瓶，3 0 ，1 8 0 r m i n 摇床培养6 d 的试验条件下， 改变初始发酵培养基中初始葡萄糖的浓度，结果见图7 。 ，、 3 器 鼹 镳 繁 融 憔 ，、 装 褂 s 辩 1 0 2 03 04 05 0 葡萄糖浓度( ) r - - - - - i 赤藓糖醇圆残糖+ 转化率 图7 初始葡萄糖浓度对赤藓糖醇产量的影响 f i g 7e f f e c to fg l u c o s ec o n c e n t r a t i o no ny i e l d so fe r y t h r i t o l ”药加b m 5 o ll1111jl 如如o 3 3 2 2 l l 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 由图7 可以看出，随着葡萄糖浓度的增加赤藓糖醇的产量逐渐增大， 葡萄糖浓度为3 0 时赤藓糖醇的产量达到最大值( 7 4 5 9 l ) ，超过3 0 时赤藓糖醇产量开始下降；糖浓度在2 0 时转化率最高，超过2 0 后转 化率开始降低，发酵残糖量升高，综合考虑赤藓糖醇产量、转化率、残糖 等指标，因此，本试验条件下选择2 0 为初始葡萄糖浓度。 3 6 2 氮源对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 单独添加1 0 9 l 的玉米浆、豆粉、酵母膏、麦芽粉代替对照培养基中 的酵母膏和尿素进行摇瓶发酵；单独添加5 9 l 的硫酸铵、氯化铵代替对 照培养基中的酵母膏和尿素进行摇瓶发酵，分别考察有机氮源、无机氮源 对菌株e r y 2 3 7 的影响。在5 0 m l 2 5 0 m l 的三角瓶，3 0 ，1 8 0 r m i n 摇床 培养6 d ，结果见图8 。 ，、 毫 3 絮 镁 锰 姑 姑 憔 酵母膏玉米浆大豆粉麦芽粉硫酸铵氯化铵 口赤藓糖醇固残糖 图8 不同种类的氮源对赤藓糖醇产量的影响 f i g 8e f f e c to fd i f f e r e n tn i t r o g e no ny i e l do fe r y t h r i t o l 由图8 可以看出，各种氮源对菌株e r y 2 3 7 发酵产赤藓糖醇的影响差 异较大。最佳氮源为酵母膏和玉米浆，大豆粉和麦芽粉次之，n h 。c l 和 ( n h 4 ) 2 s 0 4 为氮源时赤藓糖醇产量较低。这可能是因为有机氮中的酵母 膏、麦芽粉、玉米浆因富含各种氨基酸和微量元素，对菌体的生长及产糖 醇都有较大的促进作用，而无机氮源的营养成分相对匿乏。由于玉米浆含 加加o 山东农业大学硕士学位论文 有丰富的氨基酸、维生素和微量元素，对微生物的生长代谢和产物的合成 有重要的促进作用，而且非常廉价，成本远低于酵母膏，故在本试验条件 下选择玉米浆为氮源。 3 6 3 玉米浆浓度对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 不同玉米浆浓度对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响，结果见图9 。 3 玉 、， 器 镁 - 链 锯 触 憔 3 579l l 玉米浆浓度( g l ) 口赤藓糖醇圈残糖 图9 玉米浆浓度对赤藓糖醇产量的影响 f i g 9e f f e c to fc o r nl i qc o n c e n t r a t i o no ny i e l d so fe r y t h r i t o l 由图9 可以看出，随着玉米浆浓度的增加，赤藓糖醇的产量有明显的 上升趋势，玉米浆浓度为7 9 l 时赤藓糖醇的产量最大，为7 0 4 9 m ，故在 本试验条件下最适宜的玉米浆浓度为7 9 t 。 3 6 4 无机离子对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 赤藓糖醇的积累是一个复杂的代谢过程，与许多酶的活性有关，金属 离子作为酶的激活剂或抑制剂直接或间接地影响着赤藓糖醇的积累。在含 葡萄糖2 0 ，玉米浆7 9 l 的发酵培养基中考察不同金属离子对菌株 e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响，结果见表7 。 舳加加m o 赤鳞糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 表7 无机离子对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 t a b l e7e f f e c to fi n o r g a n i cs a l to ne r y t h r i t o lp r o d u c t i o no fs t r a i ne r y 2 3 7 由表7 可以看出，添加c u 2 + 和m n 2 + 可提高菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇的 产量，添加量分别为l g tc u s 0 4 5 h 2 0 和5 9 lm n s 0 4 - 4 h 2 0 时赤藓糖醇产 量最大；添加c a 2 + 和c a c 0 3 影响菌株e r y 2 3 7 产赤藓糖醇，产量下降； 低浓度的m 9 2 + 和k h 2 p 0 4 对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响不大。添加 c u 2 + 和m n 2 + 可提高菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇的产量，分析原因可能是耐高 渗酵母在耗氧条件下可通过磷酸戊糖途径( h m p ) 合成赤藓糖醇。即在 磷酸戊糖途径下，4 磷酸赤藓糖在赤藓糖还原酶作用下脱去磷酸。赤藓糖 还原酶催化最后一步反应，被认为是关键酶，研究表明代谢中间产物延胡 索酸盐会抑制这种酶的活性，添加c u 2 + 可以抑制延胡索酸盐的产生，从而 提高赤藓糖醇的产率而添加m n 2 + 则可以改变细胞膜的渗透性。 3 6 5 发酵培养基的正交优化试验 在上述试验基础上，选择碳源( 葡萄糖) 、氮源( 玉米浆) 、c u s 0 4 5 h 2 0 和m n s 0 4 4 h 2 0 为因素( 见表8 ) ，进行4 因素3 水平的正交试验，结果 见表9 。 山东农业大学硕十学位论文 表8 正交试验的因素与水平 t a b l e8f a c t o ra n dl e v e lo fo a h o g o n a le x p e r i m e n t r3 6 6 3 1 0 2 70 1 3 70 5 2 0 正交试验结果表明，对赤藓糖醇产量的影响大小为：葡萄糖 氮源 m n s 0 4 4 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 ，最优的培养基组成为a 3 8 3 d 2 c l 。优化后的 3 3 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 培养基组成为( g l ) ：葡萄糖3 0 0 ，玉米浆8 ，c u s 0 4 5 h 2 00 5 ，m n s 0 4 4 h 2 0 5 。在此条件下验证发酵试验，平均产量可达8 3 9 9 l 3 7 发酵条件的优化 3 7 1 种龄对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 选择不同生长期的液体种子按1 0 接种量接种到发酵培养基中，3 0 、1 8 0 r m i n 振荡培养5 d ，测定发酵液中赤藓糖醇的浓度，考察接种种 龄对菌株产量的影响，结果如图1 0 所示。 9 0 8 0 意7 0 链 6 0 蒸5 0 低 4 0 3 0 1 8 2 u 2 z2 42 6 种龄( h ) 图1 0 种龄对赤藓糖醇产量的影响 f i g 1 0e f f e c to fi n o c u l u mt i m eo ff e r m e n to i ly i e l d so fe r y t h r i t o l 由图1 0 可以看出，以培养2 2 h 种子接种时，赤藓糖醇产量最高。分 析产生这种结果的原因可能与此时菌株e r y 2 3 正处于对数生长期有关， 此时酶系活跃，代谢旺盛，使延滞期缩短，有利于产赤藓糖醇能力提高。 故在本试验条件下选择最佳接种种龄为2 2 h 。 3 7 2 接种量对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 接种量适宜，既能保证合理缩短发酵周期，又能得到较高的发酵产赤 藓糖醇水平。为了考查种子接种量对赤藓糖醇发酵的影响，进行了不同接 种量的赤藓糖醇发酵试验。将种龄为2 2 h 的酵母种子按不同接种量，3 0 、1 8 0 r m i n 摇床发酵5 d 后，结果如图1 1 所示。 3 4 山东农业大学硕士学位论文 9 0 8 0 茜 7 0 篓6 0 猫5 0 低 4 0 3 0 o基l u1 21 4 接种量( ) 图11 接种量对赤藓糖醇产量的影响 f i g 11e f f e c to fi n o c u l u mv o l u m eo ff e r m e n to ny i e l d so fe r y t h r i t o l 由图1 1 可以看出，赤藓糖醇产量随着接种量的增加先升高后有所下 降，接种量为1 0 赤藓糖醇的产量达到最大值。这可能是由于过大的接种 量造成了发酵前期菌体生长过猛，繁殖代数过少，老化细胞比例增大，后 期细胞活力下降，不利于高产赤藓糖醇。故在本试验条件下选择最佳接种 量为1 0 。 3 7 3 培养温度对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 不同培养温度对赤藓糖醇产量的影响，如图1 2 所示。 j 3 链 黎 琏 长 2 02 53 03 54 0 温度( ) + 赤藓糖醇+ 残糖 3 面 、_ ， 鞭 鼷 图1 2 温度对赤藓糖醇产量的影响 f i g 12e f f e c to f t e m p e r a t u r eo ff e r m e n to i ly i e l d so f e r y t h f i t o l 巧如笛加：2 m 5 o 舳加 如如 赤藓糖醇高产菌株的选育及发酵条件的研究 由图1 2 可以看出，当温度由2 0 到3 0 时赤藓糖醇的产量随着培养 温度的升高而升高；温度由3 0 到3 5 的时，随着培养温度的升高，赤 藓糖醇的产量并没有明显的提高，这可能是由于发酵周期长，高温容易引 起发酵液水分的蒸发而影响发酵；但培养温度超过3 5 时，赤藓糖醇产 量开始下降，葡萄糖利用少且慢；故在本试验条件下选择最适培养温度为 3 0 。 。 3 7 4 初始p h 值对菌株e r y 2 3 7 赤藓糖醇产量的影响 培养基初始p h 对菌体的生长和酶的合成都有比较重要的影响，p h 高 低不仅会影响细胞膜所带的电荷，而且会通过改变培养基中有机化合物的 离子化程度来影响微生物细胞对营养物质的吸收，从而促进或抑制微生物 的生长及代谢物的分泌。培养基初始p h 值分别调节为4 、5 、6 、7 、8 ，如 图1 3 所示： ，、 j 8 硅 鞭 饿 憔 4 5 6 7 初始p h 值 + 赤藓糖醇十残糖 图1 3 初始p h 值对赤藓糖醇产量的影响 f i g 1 3e f f e c to f p hv a l u eo i ly i e l d so