（发酵工程专业论文）海藻糖合酶特性及固定化条件的研究.pdf

山东轻t 业学院硕十学位论文 摘要 海藻糖是一种安全的天然糖类，具有非还原性，保湿性，热酸稳定性，抗冻 结、干燥性等特性，而且它对生物大分子和生物体组织有着非特异性的保护作用。 海藻糖在分子生物学、医学、食品工业、化妆品工业、农业等领域有着广阔的应 用前景，但是海藻糖制取上的困难限制了它的广泛应用。本研究立足于利用海藻 糖合酶酶法合成海藻糖，研究内容包括海藻糖合酶高产菌株恶臭假单胞菌p 0 6 的 诱变选育，海藻糖合酶的分离纯化、酶学特性及酶的固定化条件的研究。 本课题以恶臭假单胞菌( 本研究室保藏菌种p s e u d o m o n a sp u t i d ap 0 6 ，简称p 0 6 ) 为出发菌株，经过紫外线与亚硝基胍复合诱变最终选育出一株海藻糖合酶高产突 变株p 0 6 3 5 。与出发菌株相比，其产酶能力提高了1 2 5 倍。突变株p 0 6 3 5 经1 0 余代传代实验，具有良好的遗传稳定性。 海藻糖合酶属于胞内酶，自p 0 6 3 5 菌株破壁而得，粗酶经过s e p h a d e x g 7 5 和s e p h a d e x g 2 0 0 凝胶过滤柱后，通过s d s p a g e 电泳验证其纯度，得到两条亚 基带，并测定它们分子量分别为5 5 0 0 0 d a 和5 0 0 0 0 d a ，并对其酶学特性进行了研 究。 本研究首先对四种固定化载体的固定化效果进行考察，并对酶活和稳定性较 好的固定化酶的固定化条件进行优化。确定戊二醛浓度为0 5 、液态酶与壳聚糖 凝胶的配比为1 ：1 、交联p h 值为8 o 、交联温度为1 5 、交联时间为1 2 h 条件下， 固定化海藻糖合酶的活性最高。 本研究还以细菌纤维素为载体，采用吸附交联的方法将海藻糖合酶固定化， 在最适固定化条件下，1 5 吸附2 0 h ，然后与6 戊二醛在1 5 交联2 0 h 。实验发 现，与游离酶相比，固定化酶的最适p h 值向碱性方向移动0 4 ，为p h 7 4 ，最适 作用温度为4 5 ，比游离海藻糖合酶提高5 ，酸碱稳定性、热稳定性均有较大 提高；重复使用6 次后，酶剩余活力保持在8 6 左右，有较好的操作稳定性和重 复使用稳定性。 在细菌纤维素固定海藻糖合酶的条件下，本文对麦芽糖浓度、反应时间与反 应温度等因素对麦芽糖转化率的影响进行了研究。结果表明：麦芽糖浓度对转化 率影响很微弱；反应初期，温度越高，生成海藻糖的初始速度越快，但是到反应 末期，反应速度减弱得也越快，转化率反而不是很高；固定化酶转化麦芽糖为海 藻糖的最佳反应时间为1 8 小时，这时可以获得最高含量的海藻糖。酶反应最适环 境温度4 0 ，得到海藻糖浓度为5 2 7 6 m g m l 。 关键词：海藻糖；海藻糖合酶；壳聚糖；细菌纤维素；固定化海藻糖合酶；酶 学特性 山东轻一j ：业学院硕士学位论文 a b s t r a c t t r e h a l o s ei sas e c u r en a t u r a ls a c c h a r i d e ，i ti sn o n - r e d u c i n ga n ds t a b i l i z e dt oh e a t a n da c i d b e c a u s et r e h a l o s ee x h i b i tp r o t e c t i v ea c t i o na g a i n s td a m a g eo fb i o l o g i c m o l e c u l e ，i tc o u l db ew i d e l yu s e di nm o l e c u l a rb i o l o g y ，p h a r m a c e u t i c a l s ，f o o d s t u f f , c o s m e t i ca n da g r i c u l t u r ee t c t r e h a l o s e su s e sa r er e s t r i c t e dd u et ot h ed i f f i c u l t yi n p r o d u c i n gi t t h i ss t u d ym a i n l yd i s c u s s e dt h es y n t h e s i so ft r e h a l o s eb yt r e h a l o s e s y n t h a s e t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t si n c l u d et h es c r e e no fp s e u d o m o n a sp u a a d ap 0 6 w h i c hp r o d u c i n gt r e h a l o s es y n t h a s e ，t h ep u r i f i c a t i o no ft r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m e ， i m m o b i l i z e de n z y m ea n dt h ep r o p e r t i e so ft r e h a l o s es y n t h a s e b a s e do np s e u d o m o n a s p u t i a d ap 0 6 ，t h em u t a n ts t r a i np 0 6 - 3 5w h i c h w a st r e a t e d w i t hu l t r a v i o l e ta n dn t gi n d u c e m e n tw a ss c r e e n e da n dg o t t h ea b i l i t yo ft h em u t a n tt o p r o d u c et r e h a l o s es y n t h a s ei n c r e a s e d1 2 5t i m e sc o m p a r e dw i t hp 0 6 p 0 6 - 3 5h a da g o o dg e n e t i cs t a b i l i t ya f t e r1 0g e n e r a t i o n sb yt r a n s f e ro fc u l t u r ee x p e r i m e n t t r e h a l o s es y n t h a s ei sak i n do fi n t e r c e l l u l a re n z y m e ，t h ec e l lo fp 0 6 - 3 5w a s d i s r u p t e dt or e l e a s et h ee n z y m e t h ec r u d ee n z y m ew a sp u r i f i e db ys u i n gg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yo fs e p h a d e xg 7 5a n ds e p h a d e x g 2 0 0 t h ee n z y m ea p p e a r e dt ob ea d i m m e rs i n c ed e t e r m i n e db ys d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) t h e i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r e5 5 0 0 0 d aa n d5 0 0 0 0 d ar e s p e c t i v e l y a n dt h e nt h e c h a r a c t e r i s t i co ft h ee n z y m ew a sw o r k e do v e r t h ee f f e c t so ff o u rc a r r i e r sf o re n z y m ei m m o b i l i z a t i o nw e r ef i r s t l yr e s e a r c h e d ，a n d t h ec o n d i t i o no fe n z y m ei m m o b i l i z a t i o nw h i c hh a dag o o de n z y m ea c t i v i t ya n ds t a b i l i t y w a so p t i m i z e d t h ec o n c e n t r a t i o no fa l d e h y d ew a s0 5 ，t h er a t i oo fq u a l i t yf o rl i q u i d s t a t e de n z y m ea n dp o l y s a c c h a r i d eg e lw a s1 ：1 ，t h ep hv a l u eo fu n i t ew a s8 0 ，t h e t e m p e r a t u r eo fu n i t ew a s1 5 t h eo p t i m a lt i m eo fu n i t ew a s1 2h o u r s t h et r e h a l o s es y n t h a s ew a si m m o b i l i z e do nb a c t e r i a lc e l l u s o s eb ya d s o r p t i o na n d c r o s s l i n k i n g t h eo p t i m u mc o n d i t i o nf o ri m m o b i l i z a t i o nw a si n v e s t i g a t e d ，a n ds t a t e da s 2 0 t lt r e h a l o s es y n t h a s ew a sa d s o r b e dw i t hl gd r yb a c t e r i a lc e l l u s o s ea tp h 7 0a n d 1 5 cf o r2 0 h ，f o l l o w e db yb e i n gt r e a t e dw i t h6 g h t a r a l d e h y d ea t1 5 。cf o r2 0 h s o m e p r o p e r t i e so ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew e r ec o m p a r e dw i t ht h o s eo ft h en a t u r ee n z y m e t h eo p t i m u mp ho ft h ei m m o b i l i z e de n z y m ew a s7 4 ，w h i c hw a s0 4h i g h e rt h a nt h a to f n a t u r ee n z y m e b e s i d e s ，i t so p t i m u mr e a c t i o nt e m p e r a t u r ew a s4 5 ，w h i c hw a s5 h i g h e rt h a nt h a to ft h en a t u r ee n z y m e t h es t a b i l i t i e so ft r e h a l o s es y n t h a s eo ne n d u r i n g p hc h a n g i n g ，h e a tt r e a t m e n ta n dm u l t i p l eu t i l i z a t i o nw e r eo b v i o u s l yi m p r o v e da f t e r i m m o b i l i z a t i o n t h er e a c t i o nc o n d i t i o n sf o rp r o d u c t i o no ft r e h a l o s eb yt r e h a l o s es y n t h a s ew e r e d e t a i l e ds t u d i e d t h ee f f e c t so ft h em a l t o s ec o n c e n t r a t i o n ，i n c u b a t i o nt i m ea n d t e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nr o t a t es p e e dw e r es t u d i e da b o v ea 1 1 t h em a l t o s ec o n c e n t r a t i o n h a dv e r yl i t t l ei n f l u e n c eo nt h ec o n v e r s i o nr a t i o a tt h eh e g m n i n go fr e a c t i o n ，t h el o n g e r t h et i m ea n dt h eh i g h e rt h et e m p e r a t u r e ，t h em o r et r e h a l o s e b u ti nt h ee n d ，t h e c o n v e r s i o nr a t i ow a sl e s s t h eo p t i m a lr e a c t i o nt i m ew a s1 8 h o u ra n dr e a c t i o n t e m p e r a t u r ew a s4 0 cf o ri m m o b i l i z e de n z y m ec h a n g i n gm a l t o s et ot r e h a l o s ea n dt h e h i g h e s tc o n t e n to ft r e h a l o s ew a sa c q u i r e d k e y w o r d s ：t r e h a l o s e ；t r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m e ；c h i t o s a n ；b a c t e r i a lc e l l u l o s e ； i m m o b i l i z e dt r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m e ；e n z y m a t i cp r o p e r t i e s 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 聋盗垫 日期： 丝! ! 年生月l 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 茸选堕一 导师签名： 山东轻工业学院硕七学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 “海藻糖”这个术语源于一种沙漠甘露虫茧蜜，它是由法国化学家b e r t h e l o t 发 现的( n w a k a & h o l z e r ，1 9 9 8 ) | 1 2 1 。海藻糖是由两个吡喃环葡萄糖分子通过半缩醛羟 基以a 1 ，1 糖苷键缩合而成的非还原性双糖。它的分子式为c 1 2 h 2 2 0 1 1 2 h 2 0 ， 相对分子量为3 7 8 3 3 ，无水海藻糖的分子结构如图1 1 所示【3 1 。 o o h ( a ) 海藻糖分子的h a r w o r h 式 0 0 h ( b ) 海藻糖分子的构象式 图1 1 海藻糖的分子结构 f i g u r e l 1m o l e c u l es t r u c t u r eo ft r e h a l o s e 最先阐述这种结构的是b r e d e r e c k ，他在1 9 3 0 年采用化学方法进行了论证。我 们通常所说的海藻糖为a , a 型海藻糖，化学名称为a d 吡喃葡萄糖基a d 吡哺葡 萄糖苷( a d - g l y c o p y r a n o s y l - a d - g l y c o p y r a n o s i d e ) ，也被称作蘑菇糖( m u s h r o o m s u g a r ) 1 4 1 ，其实它还有两种同分异构体( i s o m e r s ) ，即a ，b 型海藻糖( 新海藻糖， n e o t r e h a l o s e ) 和6 , b 型海藻糖( 异海藻糖，i s o t r e h a l o s e ) ，只是后两种在自然界很 少见【5 ，6 】。目前研究较多的是天然存在的a , a 型海藻糖，它是天然双糖中最稳定的 糖类，只被具有特异性的海藻糖酶所分解。 1 2 开发背景 第1 章绪论 1 8 3 2 年初w i g g e r s 从黑麦的麦角菌中首次分离出海藻糖结晶化合物【_ 7 1 。1 8 5 8 年，b e r t h e l o t 从一种海藻( t r e h a l am a n n a ) q b 分离到这种物质，于是定名为海藻糖 ( t h e h a l o s e ) 1 引。海藻糖广泛存在于自然界中，如动植物及微生物中，尤其是在酵母、 霉菌以及蘑菇等真菌中其含量可达1 5 以上1 9 】。在许多情况下，该糖是昆虫血糖的 主要成分【1 0 j 。近几年来，发现人体肾脏存在有海藻糖酶，能合成海藻糖。 研究表明，某些物种对外界恶劣环境，如干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透 压及毒性物质等，所表现出来的抗逆耐受力与这些物种体内存在的海藻糖密切相 关【1 ，具有独特的不同于其它碳水化合物的生物学特性，能在上述环境下保护生 物体细胞蛋白质、脂肪、糖类、核酸等组分不受损害，可保护d n a 防止放射线引 起的损伤【1 2 1 ，外源性的海藻糖也能对生物体及生物大分子有着良好的非特异性的 保护作用【l 引，因而这使得其有许多用途，如在医药和微生物学中作细胞防冻剂、 诊断试剂和生物产品的稳定剂、化妆品的有效成份、食品防腐剂、农业上培育抗 旱作物等。 海藻糖的这些特殊功能，引起了各国科学家的极大兴趣，2 0 世纪8 0 年代后， 相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖已成为国际上最近开发的 主要低聚糖之一。 1 3 海藻糖的生物学特性及功能 天然海藻糖在常温下是白色结晶，易溶于水、热乙醇，不溶于乙醚、丙酮， 无毒无害，无过敏性，具有甜味，在体内可被降解成葡萄糖而被利用。海藻糖的 基本性质如表1 1 1 1 4 , 1 5 1 所示。 表1 1 海藻糖的基本性质 t a b l e1 1b a s i cp r o p e r t yo ft r e h a l o s e 名称性质 a 熔点 b 熔解热 c 甜度 d 吸湿性 e 消化性 溶解度 温度( ) 溶解度( g 1 0 0 9 ) 饱和浓度( ) c 1 2 h 2 2 0 1 1 2 h 2 0 9 7 c 1 a h z z o n 2 51 5 c c 1 2 h 2 2 0 l l 2 h 2 0 5 7 8 k j m o l c 1 2 h 2 2 0 l i 5 3 4 k j m o l 相当于蔗糖的4 5 c 1 2 h 2 2 0 n - 2 h 2 0r h 一9 0 ，c 1 2 1 - 1 2 2 0 1 lr h 一 3 0 有吸湿性 在体内可经海藻糖酶分解消化吸收 ( 1 0 0 9 水中海藻糖的重量曲 1 0 2 03 04 05 0 6 0 7 0 8 0 9 0 5 5 36 6 98 6 31 0 9 11 4 0 11 8 4 12 5 1 43 6 5 9 6 0 3 3 5 64 0 84 6 35 2 2 5 8 3 6 4 87 1 57 8 5 8 5 8 2 山东轻t 业学院硕+ 学位论文 续表 名称性质 g 渗透压 浓度( ) 51 02 03 0 渗透压( m o s m k g ) 1 9 3 2 9 85 9 01 2 2 9 h 稳定性 水溶液对p h 稳定性( p h 3 5 - - 1 0 ，1 0 0 c ，2 4 h r ) 水溶液对热稳定性( 水中，1 2 0 c ，9 0 m i n ) 水溶液对热稳定性( 在含有氨基酸或蛋白质的沸水中，9 0 r a i n ) 水溶液长期保存稳定性( 3 7 c ，1 2 月) 9 9 以上残留 不褐变 不褐变 不分解，不褐变 海藻糖作为一种应激代谢物，能赋予低等动物、植物和微生物等抵抗营养缺乏、 高温、低温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣环境的能力【1 6 , 1 7 】，它具有在严酷环 境下保护生物体的生物膜、脂质体、蛋白质、核酸等结构和功能的特殊功效，它使 细胞内保持湿润，防止细胞内各种养分的损失，从而让这些生物处于无水生活状态， 如在生产具有较高“耐贮性”的活性干酵母时，海藻糖含量在1 1 ( 以固形物计) 以下的干酵母，其活性保存期短，不易贮存；海藻糖含量在1 2 至1 4 左右时， 其保存期间可延长4 6 个月；而当海藻糖含量超过1 6 时，其保存期可达1 2 个月 以上。由此可见，海藻糖在保护生物体结构和功能上所起的决定性作用。 然而，使海藻糖引起关注的重要原因却是外源性的海藻糖同样对生物体和生 物大分子有良好的非特异性保护作用1 1 8 , 1 9 l 。科学家对保存条件苛刻的一些酶类、 病毒、疫苗、抗体和重组蛋白等在海藻糖存在的条件下干燥和复水后的功能性进 行了研究，结果令人振奋。黄成根等研究发现，在干燥条件下，海藻糖对测定血 清胆固醇的胆固醇氧化酶( c h o d ) 、胆固醇脂酶( c h e ) 、辣根过氧化物酶( p o d ) 等三 种诊断工具7 0 、5 5 和3 7 存放4 0 天、1 5 0 天和2 1 0 天后，测定这三种酶的酶 活力，测定结果如表1 2 所示。 表1 2 三种酶在海藻糖溶液中干燥后的稳定性 t a b l e1 2t h es t a b i l i t yo ft h r e ek i n d so fe n z y m e sa f t e rd r y i n gi nt r a h a l o s ea q u a 3 第1 章绪论 注：酶保活率计算公式| 2 0 1 ： 保活率( ) = 有海藻糖或无海藻糖保护酶活力单位新鲜混合后酶活力单位( 1 1 ) 结果表明，在3 7 存放2 1 0 天、5 5 存放1 5 0 天、7 0 高温存放4 0 天后其活 性仍可保持在9 0 0 , 4 0 以上，而未加海藻糖的这三种诊断工具酶在上述条件下其活性保 持率均在2 0 以下，加海藻糖保护的酶活力是不加保护的酶活力的4 5 倍，且这 三种诊断工具酶间无明显区别，说明在干燥过程中海藻糖对多种诊断工具酶具有 明显保护作用。 英国剑桥的q u a d r a n t 研究基金会把口n d , j l 麻痹症疫苗与海藻糖一起干燥， 发现在干燥状态下4 5 保存时其稳定性和液态4 保存时相当。这项研究的成功， 引出了新一代疫苗，从此人们不用担心口服d , j l 麻痹症疫苗从生产工厂到使用地 的贮存和运输危及产品活性的问题，极大地推动了于2 0 0 0 年在全世界范围内消灭 了d , j l 麻痹症。 1 4 海藻糖的生物保护机制 关于海藻糖的生物保护机制，国外科学家进行了大量的探索，提出了4 种假说： “水替代”假说，“玻璃态”假说，“优先排阻”和“化学稳态”假说。这4 种假 说的相互补充基本能够解释海藻糖保护生物分子的机制。 1 4 1 “水替代”假说 c r o w e 等根据在海藻糖存在条件下干态磷脂与水合磷脂物理性质相似这一现 象，提出了“水替代 假说解释海藻糖对干态生物膜的保护作用。此假说认为， 海藻糖能与生物分子形成氢键，代替空间结构所必须的水分子。即生物体内的蛋 白质、核酸、糖类、脂质类及其它生物大分子周围均包着一层水膜，这层水膜是 维持生物大分子的结构、功能必不可少的物质基础，当干燥、冷冻等条件下失去 水膜时，海藻糖分子能在失水部位与生物大分子以氢键连接，形成一层保护膜以 代替失去的结构水膜，而不至于使生物分子丧失活性。c r o w e 和c a r p e n t e r 对傅立叶红 外转换( f h r ) 数据的研究有力地支持了这一假说。 1 4 2 “玻璃态 假说 1 9 8 9 年，g r e e n 等提出，海藻糖的高效生物保护作用与它的玻璃态形成有关。 海藻糖水溶液干燥时黏度随浓度的增加而增大，当达到一定浓度且糖未结晶时， 其水溶液就会玻璃化，这种状态称为玻璃态。“玻璃态 假说认为，当生物成分 干燥时，海藻糖紧密地包住相邻的分子，形成一种在结构上与玻璃状的冰相类似 的碳水化合物玻璃体，其扩散系数很低，分子运动和分子变性非常微弱，能够使 4 山东轻：i ：业学院硕士学位论文 生物分子维持一定的空间结构。 1 4 3 “优先排阻”假说 t i m a s h e f f 等1 2 1 l 提出，认为海藻糖等小分子糖类不直接与蛋白质空间结构相互 作用，而是优先与蛋白质表面的水分子结合，结果蛋白质的溶剂化层半径减小， 分子结构更紧密，构象更稳定，有利于抵御外界极端环境的影响。该假说可以解 释溶液中海藻糖对生物分子的稳定作用。s o l a p e n n a 等对海藻糖与其它低聚糖、单 糖的水合体积进行了研究，结果表明，海藻糖水合体积为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、 果糖的2 5 倍，在溶液中可结合更多的水分子。这一结果可以很好地解释海藻糖保 护生物分子的效果优于其它低聚糖的原因。 1 4 4 “化学稳态 假说 海藻糖是最稳定的糖之一，它是完全非还原性的，它的糖苷键在糖类中活化 能最低，从而几乎不水解。这样，它在极端条件下也不会产生分解，从而与蛋白 质或肽作用的美拉德反应机会也大大降低了。 以上四种假说都可说明对某些生物大分子的保护作用，但到目前为止仍没有 更全面进一步阐明海藻糖对生物大分子的保护机理，这需要作更深入的研究。 1 5 海藻糖的检测方法 海藻糖含量的测定在海藻糖工业生产和应用研究中起到了相当重要的作用， 选用适当的测定方法将对生产者和研究者起到事半功倍的效果。现在应用的海藻 糖分析方法主要有纸层析法、薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱法、葸酮 比色法、酶法等方法。 1 5 1 纸层析法 现在，纸层析法在生物化学特别是在糖类的分析中仍得到广泛的应用。纸层析法 的关键是选用合适的展开剂和显色剂，用于海藻糖分析的展丌剂主要有【2 2 】： 正丁醇：醋酸：水= 4 ：1 ：2 ( v v ) 正丁醇：乙醇：丙酮：水= - 5 ：4 ：3 ：2 ( v v ) 醋酸乙酯：甲酸：醋酸：水= 3 0 ：7 5 ：7 5 ：5 ( v v ) 正丁醇：醋酸：水= - 5 ：1 ：2 ( v v ) 正丁醇：甲酸：水= 1 5 ：3 ：2 ( v v ) 酚水的上层饱和液 显色剂可用由a g n 0 3 的水一丙酮饱和溶液( 水：丙酮= 1 ：2 0 0 ( v v ) ) 与含 l g n a o h 晶体的1 0 0 9 乙醇水溶液( 乙醇：水= 1 ：1 ( 叭m ) ) 两种溶液组成的显色剂【2 3 】。 1 5 2 薄层层析法 5 第1 章绪论 现在海藻糖的定性定量分析，国外主要借助于高效液相色谱，但在我国高效 液相色谱还不普遍的情况下，这一方法的应用往往受到实验室条件的限制，并且 对于菌株筛选、培养及提取过程中大量的海藻糖进行快速定性定量分析，完全依 赖于高效液相色谱也不是一个高效经济的方法，而用薄层层析法来对海藻糖进行 定性定量分析则是十分便利的【2 4 l 。应用时采用硅胶g f 2 5 4 ( 2 0 0 x 5 0 ) 板，选用正丁醇： 吡啶：水= 1 5 ：3 ：2 ( v v ) 为展开剂，以l g 酚、5 m l 的9 8 浓硫酸溶于1 0 0 m l 9 5 乙 醇中作为显色剂，同样能很好的将海藻糖与葡萄糖、蔗糖等小分子糖分开。同样 还可以用正丁醇：乙醇：水= 2 ：1 ：1 为展开剂、1 0 1 5 硫酸溶液为显色剂进行 海藻糖的定性定量分析。 1 5 3 高效液相色谱法 高效液相色谱是理想的高效、快速进行海藻糖定性定量分析的方法。通常采 用的色谱柱是氨基键合相柱，检测装置为示差折光检测器。如采用进样量为取l 、 2 5 0 x 4 6 m mn h 2 柱为色谱柱、乙腈：水= 7 ：3 为流动相、流速为l m l m i n 、柱温为 室温、示差折光检测器( h p l 0 4 7 a ) 为检测器进行海藻糖定性定量分析。 此外，高效阴离子交换脉冲安培法【2 5 1 在海藻糖的定量分析中的应用也有报 道。该方法属于高效液相色谱【2 6 】的一种，它的基本原理是若将糖溶液的p h 提高 至1 2 1 4 ，中性糖类化合物的羟基会发生完全的或部分的解离而形成氧负离子，可 以进行阴离子交换。 1 5 4 气相色谱法 r 气相色谱也可以用于糖组分的分离与检测上，因为糖是不挥发性物质，所以， 必需制成相应的挥发性衍生物。气相色谱来分析糖类时，用得最多的挥发性化合 物是t m s ( 三甲基硅烷基) 衍生物【2 7 彩1 。g l a e v e r 等用气相色谱对海藻糖进行了测 定，测定条件及步骤如下：h e 气为载气，注射器和检测器温度分别为2 5 0 和 3 0 0 ，柱温在1 9 0 保持2 m i n ，接着以3 0 m i n 的速率升至2 5 0 ，再在此温 度下保持1 0 m i n ，将海藻糖样品( 先经过冷冻干燥) 溶解于2 0 比l 的二甲基酰胺中， 然后再加2 毗l 的- ( - - q j 基硅烷基) 一三氟乙酰胺( 含l 三甲基氯硅烷) 进行三甲 基硅烷化。 还有报道用气质联用色谱和气一液色谱川及近红外反射光谱法【3 2 】对海藻糖 进行定量检测。 1 5 5 蒽酮比色法【3 3 , 3 4 】 蒽酮比色法是目前常用的定糖方法，其原理是糖类( 包括多糖) 在硫酸作用下 脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合产生蓝绿 色曲糠醛衍生物，颜色的深浅即可作为定量的依据。 1 5 6 酶法【3 5 , 3 6 】 6 山东轻上业学院硕士学位论文 海藻糖的酶法测定是近年发展起来的一种测定方法，它的基本原理是通过海 藻糖酶对海藻糖的特异性水解，产生的葡萄糖再用葡萄糖氧化酶一过氧化物酶系统 进行检测。海藻糖酶的来源是广泛的，即可以从兔的肾脏1 3 7 j 中提取，也可以从芽 胞杆菌、酵母【3 8 j 、藻类【3 9 j 等微生物中提取。这种方法的优点在于不需要昂贵的分 析仪器，操作简便。但问题在于自行制备海藻糖酶会增加研究的工作量，而商品 海藻糖酶的价格又较高。 1 6 海藻糖的生产方法及研究进展 生产海藻糖目前主要依靠生物合成的方法，能够积累海藻糖的物种并不多， 而且其含量一般随物种所处的环境不同而发生变化，一旦适宜，海藻糖又迅速降 解。目前，正在研究和开发的方法m 2 l ：抽提法、发酵法、酶法、基因重组植物 生产法。 1 6 1 微生物抽提法 最早生产海藻糖的方法是从面包酵母、啤酒酵母中提取【4 3 l ，这也是目前制备 海藻糖的主要方法1 4 4 1 。海藻糖是酵母营养细胞和孢子的一种重要贮存的碳水化合 物，对调节和保护细胞在极端条件下的活力有重要作用。多种生长因素，如营养 饥饿、提高温度、干燥或冷冻等都会使细胞海藻糖含量显著增高。 酵母中海藻糖的合成依赖于两种酶，海藻糖6 磷酸合成酶( u d p gt r e h a l o s e 6 - p h o s p h a t es y n t h a s e , e c 2 4 1 1 5 ) 和海藻糖一6 - 磷酸酯酶( 呖只t r e h a l o s e6 - p h o s p h a 纶 p h o s p h a t a s e , e c 3 1 3 1 2 ) ，这两个酶只能以高能量的化合物6 。磷酸一葡萄糖和u d p 葡萄糖为底物，因此产率不高。 这种方法首先通过诱变、细胞融合或基因重组选育海藻糖含量高的菌株，然 后采用高浓度的培养基及高渗透压换环境进行发酵，并在发酵结束前让酵母菌“饥 饿 2 3 小时才送入碳源( 这就是苏联爱尔坎沙哈斯流程) 。富集酵母细胞，先 用酒精浸提，然后加入乙酸铅去除蛋白质，再用硫化氢除过量的铅，浸提液用活 性炭脱色，蒸法浓缩结晶析出海藻糖晶体。自从1 9 5 0 年l a u r a 首次从各种酵母中 制备出海藻糖，并证明了活性干酵母中海藻糖含量较高之后，l i l l i e 等报道了采用 三氯乙酸提取海藻糖；1 9 9 1 年，y u m i y o s h i k a w a 等报道了用温度为7 3 以上、浓 度为4 5 5 0 乙醇水溶液可得到较高提取率；1 9 9 5 年山崎彬等【4 5j 采用高压处理酵 母以提高抽提率；我国已将这种方法列为“九五攻关计划，葛文光等】对提取工 艺进行了改进，取得了较好的效果；中科院微生物所7 1 4 课题组采用此法，每吨 发酵液可得3 4 公斤海藻糖；中科院微生物所7 0 8 课题组“利用废弃酵母生产海 藻糖”经过专家鉴定，于1 9 9 9 年开始推向市场，但这种方法制造成本过高，价格 昂贵限制了这一方法的工业应用。 7 第1 章绪论 除酵母菌外，大肠杆菌、链霉菌、乳酸菌、微球菌和真菌等，也有海藻糖的 积累现象【4 1 1 。据报道记载的真菌有2 0 几个属3 3 个种等均可以作为丌发海藻糖的 菌种资源。 1 6 2 微生物发酵法 微生物发酵法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵代谢生产海藻 糖，再从培养液中分离精制获得海藻糖。早在1 9 6 9 年，t s u z u k i 等用以烷烃为碳 源的节杆菌( a r t h r o b a c t e r 印) 发酵生产海藻糖，但产量不高。从这以后，采用诱变、 细胞融合或基因重组选育产海藻糖含量高的菌株，然后采用高浓度的培养基及高 渗发酵来生产海藻糖。如m y a g a w a k 等利用微球菌( m i c r o c o c c u s ) 的变种n 0 3 9 生产 海藻糖；s h i b u y aj 等以糖蜜和尿素等组成培养基，通过棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m m o l a s s ec o l a2 8 5 ) 好气培养3 0 h 生产海藻糖；k a s s e ni 等对大肠杆菌中、v u o r i oo e 等对酵母菌中的海藻糖基因进行了克隆，通过发酵生产海藻糖。1 9 9 9 年谢慧敏等 m 从长白山天池水中获得一株产海藻糖菌株c b 3 9 ，鉴定可能是胶样菌属( c o l l o i d e s ) 的一个新种，其发酵液中的海藻糖含量约是酵母菌所产海藻糖的3 倍。 1 6 3 基因工程法 近年来，基因重组法在植物上取得了一定进展。通过直接将合成海藻糖基因导 入植物中去，使植物自行积累海藻糖。在重组植物方面，荷兰的m o g e n 与v a n d e r 公司通过提高甜菜、马铃薯等农作物中海藻糖的含量，取得了成功并已得到其生产 技术的专利保护。另外，采用基因技术将古细菌中的游离海藻糖酶基因克隆到大肠 杆菌中，得到了热稳定的合成海藻糖酶，进而用这些酶来生产海藻糖，也取得了较 理想的结果。 1 6 4 酶法合成海藻糖 酶法合成海藻糖是指利用酶制剂所具有的转糖基作用，在离体条件下作用于 底物，生产海藻糖。该法以其具有较高的特异性和快速温和等特点，引起了广大 科研工作者的兴趣，成为现在研发海藻糖工业化生产的热点并作为是可能短期见 效的可行性途径之一。至今发现的酶法生成海藻糖的合成途径有： ( 1 ) 通过麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶以麦芽糖为底物合成海藻糖 在l a c t o b a c i l l u sb r e v i s 中发现了麦芽糖磷酸化酶( m a l t o s ep h o s p h o r y l a s e ) ，而海 藻糖磷酸化酶( t r e h a l o s ep h o s p h o r y l a s e ) 【4 8 】则存在于e u g l e n ag r a c i l i s ，a f a r i c u s b i s p o r u 一4 9 1 ，s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e 5 0 , 5 1 】中，它们催化麦芽糖合成海藻糖的反应是： 麦芽糖+ p i 麦芽糖磷酸化酶 葡萄糖+ b 一葡萄糖一1 一磷酸 葡萄糖+ b 一葡萄糖一1 一磷酸 8 海藻糖磷酸化酶 海藻糖+ p i 山东轻上业学院硕士学位论文 ( 2 ) 通过海藻糖合酶以葡萄糖为底物合成海藻糖 在担子菌p 口s 渤嘲，c e 纪) 和灰树花( g ，和肠f r a n d o s a ) 5 2 】中，海藻糖是由海藻糖 合酶( t r e h a l o s es y n t h a s e ) 催化葡萄糖生成的，它的合成途径是： d 一葡萄糖+ a d 一葡萄糖一1 一磷酸 海藻糖合酶 海藻糖 ( 3 ) 通过糖基转移酶和淀粉酶以淀粉或麦芽寡糖为底物合成海藻糖 1 9 9 3 年m k a t o 等从日本群马县酸性温泉中分离到一种嗜超高温古细菌 ( h y p e r t h e r m o p h i l i ca r c h a e ) - - 硫矿硫化叶菌m 和l o b u ss o l f a t a r i c u sk m l ) 5 3 l 。从该 菌分离纯化得到一种糖基转移酶( g l u c o s y l t r a n s f e r a s e ) 和一种淀粉酶 ( a m y l a s e ) ，可以淀粉或麦芽寡糖为底物合成海藻糖，它们的合成途径是： 淀粉( 或麦芽寡糖) 鳖燮驾a 一1 , 1 葡糖基海藻糖( 或麦芽寡糖基海藻糖) a 一1 ，1 葡糖基海藻糖( 麦芽寡糖基海藻糖) 垦骂海藻糖 ( 4 ) 通过麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶以麦芽糊精为底 物合成海藻糖 在节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p q 3 6 ) 、芝田硫化叶菌m 扣l o b u ss h i b a t a e ) 、 b r e v i b a c t e r i u mh e l v o l u m 、m i c r o c o c c u sr o s e u s 等菌中发现了麦芽寡糖基海藻糖合酶 ( m a l t o o l i g o s y l t r e h a l o s es y n t h a s e ，t r ey ) 和麦芽寡糖基海藻糖水解酶 ( m a l t o o l o g o s y l t r e h a l o s et r e h a l o h y d r o l a s e ，t r ez ) 。它们能催化麦芽糊精生成海藻糖， 它们的合成途径是： 麦芽糊精耋茎查鲨茎塑矍塑全竺- 麦芽寡糖基海藻糖壅茎塞整茎塑鍪鲨查堡海藻糖 ( 5 ) 通过海藻糖6 磷酸合酶和海藻糖6 磷酸磷酸酯酶以葡萄糖为底物合成 海藻糖 酵母菌和大肠杆菌可利用海藻糖6 磷酸合酶( t r e h a l o s e 6 p h o s p h a t e s y n t h a s e ，o s t a ) 和海藻糖- 6 一磷酸磷酸酯酶( t r e h a l o s e - 6 一p h o s p h s t ep h o s p h a t a s e ，o s t b ) 以 葡萄糖为底物合成海藻糖【5 4 1 ，它们的合成途径是： u d p 一葡萄糖十6 一磷酸葡萄糖 海藻糖一6 一磷酸合酶 6 一磷酸海藻糖 6 一磷酸海藻糖塑蔓塑二鱼二壁墼壁墼塑堕，海藻糖 ( 6 ) 通过海藻糖酶以葡萄糖为底物反向合成海藻糖 海藻糖酶( t r e h a l a s e ) 存在于酵母菌( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、细菌、霉菌等多 种生物中，海藻糖酶是水解酶，可水解海藻糖成两分子葡萄糖。但海藻糖酶也可 在一定条件下催化葡萄糖反向生成海藻糖。 2 葡萄糖 海藻糖酶 9 海藻糖 第1 章绪 论 ( 7 ) 通过蔗糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶以蔗糖为底物合成海藻糖 在肠膜明串珠菌a t c c l 2 2 9 1 1 55 1 、土镶杆菌口g 阳6 口c 纪，玩mv i t i s ) 、链霉菌 ( s m u t a n s ) 和嗜糖假单胞菌中存在着一种葡糖基转移酶一蔗糖磷酸化酶( s u c r o s e p h o s p h o r y l a s e ) ，它能将