（发酵工程专业论文）栀子色素的精制工艺优化.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 色素是一种着色剂，可应用于食品、医药和化妆品行业。色素分为化学合成 色素和天然色素两类，随着医学毒理学和生物学研究的不断深入，发现曾允许使 用的化学合成色素中有不少种类对人体都有不同程度的伤害，因而天然色素越来 越受到人们的欢迎。 我国是世界上生产栀子最多的国家，本研究用栀子果精制提纯栀子黄色素， 利用栀子黄废液为原料，用酶促法来生产栀子红色素。 栀子黄最佳浸取条件是溶剂为8 0 乙醇，温度为8 0 。采用大孔吸附树脂精 制提纯栀子黄色素，用四种树脂做动态洗脱，通过计算所使用的用水量，用酒精 量和产品的回收率以及酚甙比，得到结论是d 3 5 2 0 树脂精制提纯效果较差， h p d 1 0 0 a 树脂适合对栀子黄产品的酚甙比要求略低的生产，y w 树脂精制的栀子 黄效率高且酚甙比低，n k a 树脂的性能仅次于y w 树脂。后面选择y w 树脂做栀 子黄色素的精制提纯。用反梯度低浓度的乙醇可以较好地洗脱除去同时被吸附的 绿原酸等酚类物质。先用3 b v 的3 0 乙醇洗脱，再用6 b v l 5 乙醇洗脱可以将栀 子黄色素中的酚比从0 3 5 降低到0 1 8 7 ，甙比从2 6 0 降为0 ，栀子黄的回收率为 9 0 4 ，在不加载体的情况下精制粉末栀子黄色价达到e 1 锄埔= 2 2 5 9 4 。 在栀子红色素的生物转化实验中，在试剂瓶中进行栀子红色素生物转化，葡 萄糖积累量在反应进行1 8 小时后基本不再变化。5 3 0 n m 处的吸光度在反应进行1 8 小时后吸光度的变化已经非常缓慢或不再变化。我们把反应终止时间定在1 7 小时 与1 8 小时之间。 对栀子红色素的精制方法进行了探讨。酸沉淀法提纯色素，先用3 倍体积的 9 5 乙醇处理，沉淀水溶解后用1 8 盐酸调p h 至3 0 ，离心所得沉淀干燥的色素， 色价为4 2 2 3 ( e 1 。m 肼，5 3 2 n m ) ，得率为9 0 3 6 ；大孔吸附树脂吸附法提纯色素， 对五种大孔吸附树脂提纯色素进行比较，g d x - - 2 0 1 分离效果较好，其最佳洗脱条 件是上柱后，先用1 5 乙醇冲洗去除杂质，再用添加了0 5 0 添加物的5 5 乙醇 洗脱，收集洗脱液浓缩干燥，色素粉末色价为5 9 6 7 ( e l 。m 职，5 3 2 n m ) ，得率为8 8 2 5 。 关键词：栀子黄，大孔吸附树脂，精制，栀子红，生物转化 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t p i g m e n ti sak i n do fc o l o r a n ta n di sa p p l i e di nf o o d 、m e d i c a la n dc o s m e t i c a l i n d u s t r i e s p i g m e n tc a nb ed i v i d e di n t ot w oc a t e g o r i e s ：c h e m o s y n t h e t i c a lp i g m e n ta n d n a t u r a lp i g m e n t w i t ht h ed e v e l o p m e n to fm e d i c a lt o x i c o l o g ya n db i o l o g yr e s e a r c h ， m a n yk i n d so fc h e m o s y n t h e t i c a lp i g m e n t su s e di nt h ep a s th a v eb e e nf o u n dt ob e h a r m f u lt oh u m a nb o d ym o r eo rl e s s s on a t u r a lp i g m e n t sh a v eb e e ni n c r e a s i n e l y w e l c o m e db yp e o p l e t h i sr e s e a r c hi sb a s e do nt h et h ef a c tt h a to u rc o u n t r ya b o u n d si ng a r d e n i af r u i t s a n di sa i m e da tr e f i n i n g g a r d e n i ay e l l o wp i g m e n tt h r o u g hg a r d e n i a f r u i t sa n d p r o d u c i n gg a r d e n i ar e dp i g m e n ti n i n d u s t r i a ls c a l eb ye n z y m ep r o c e s su s i n gw a s t e l i q u o rf r o mg a r d e n i ay e l l o wp r o d u c t i o na sr a wm a t e r i a l t h eb e s tc o n d i t i o nf o rg a r d e n i ay e l l o wp i g m e n tl e a c h i n ga r et h e8 0 e t h a n o la n d 8 0 w eu s e d c o m p l e xm u t a g e n e s i s f o r g a r d e n i ay e l l o wp i g m e n tr e f i n i n g f o u rt y p e so fr e s i nw e r eu s e dt od od y n a m i ce l u t i o na n dt h ec o n c l u s i o ni sa sf o l l o w s t h r o u 曲c a l c u l a t i n gt h ea m o u n to fw a t e ru s e d ，w i t ha na l c o h o lv o l u m ea n dp r o d u c t r e c o v e r ya sw e l la sa z 3 8 n m 7 a 4 4 0 n ma n da 3 2 5 n m a 4 4 0 n m ：t h ed 3 5 2 0 r e s i ni sl e s se f f e c t i v ei n p u r i f i c a t i o nr e f i n i n g ；t h eh p d i o o ar e s i ni ss u i t a b l ef o rt h ep r o d u c t sw h i c hi sal i t t l e l o w e rr e q u i r e m e n to na 2 3 8 唧a 44 0 n ma n da 3 2 5 n n i a 4 4 0 n mi ng a r d e n i ay e l l o wp i g m e n t p r o d u c t i o n ；t h er e s i nw h i c hi sb e s te f f i c i e n to ng a r d e n i ay e l l o wp i g m e n tr e f i n ea n dh a s l o wa 2 3 8 n m a 4 4 0 n ma n da 3 2 5 n m a 4 4 0 n mi sy wr e s i n ，a n dt h en k ar e s i ni so n l yy w s e c o n d a f t e rt h ee x p e r i m e n ta b o v e ，w ec h o o s e dy wr e s i nf o rt h ef o l l o w i n gg a r d e n i a y e l l o wp i g m e n tr e f i n e dp u r i f i c a t i o n w i t ha n t i g r a d i e n tl o wc o n c e n t r a t i o no fe t h a n o lw e c a ne l u a t e dt h ec h l o r o g e n i ca c i dw h i c ha r ea b s o r b e di nr e s i n 3 b v3 0 e t h a n o le l u t i o n w a su s e df i r s t ，a n dt h e ne l u t i n g6 b v1 5 e t h a n o l ，w i t h9 0 4 r e c o v e r yr a t eo fg a r d e n i a y e l l o wp i g m e n tp r o d u c t s ，t h ea 3 2 5 n m a 4 4 0 n mc a n b er e d u c e df r o m0 3 5t o0 1 8 7 ，a n dt h e a 2 3 8 n m a 4 4 0 衄c a nb er e d u c e df r o m2 6 0t o0 w i t h o u tc a r r i e rt h ec o l o rv a l u e ( e l c m l fr e f i n e dg a r d e n i ay e l l o wp i g m e n tp o w d e rr e a c h e d2 2 5 9 4 ( e l c m l ，4 4 0 n m ) a sf o rt h eb i o t r a n s f o r m a t i o n e x p e r i m e n t o fg a r d e n i ar e dp i g m e n t ，w h e n b i o t r a n s f o r m a t i n gg e n i p e s i di n t og a r d e n i ar e dp i g m e n ti nr e a g e n tb o t t l e ，t h eg l u c o s e a c c u m u l a t i o nw a sn ol o n g e rc h a n g e da f t e r18h o u r sr e a c t i o n a n dt h ea b s o r b a n c ea t 5 3 0 n mw a sn ol o n g e rc h a n g e do rw i t hl i t t l ec h a n g e t h e nt h er e a c t i o nt i m ew a s s c h e d u l e dt ot e r m i n a t eb e t w e e n1 7h o u r sa n d1 8h o u r s t h i st h e s i sa l s os t u d i e dt h ed i s t i l l i n go ft h ep i g m e n t t h e r ea r et w om e t h o d s t h e f i r s to n ei sa c i dd e p o s i t i o nm e t h o d 9 5 e t h a n e lo f3b u l k sw a su s e dt od e p o s i t ，a n d t h e n1 8 h y d r o c h l o r i ca c i dw a su s e dt oa d j u s tp ht o3 0 p l a c et h es o l u t i o nf o r d e p o s i t i o na n dd r yt h ed e p o s i t i o n t h ec o l o rv a l u eo ft h ea b o v ep i g m e n tp o w d e ri s 4 2 2 3 ( e 1 锄埘，5 3 2 n m ) t h eo t h e ro n ei sm a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i na d s o r p t i o na n d d i s p e l l i n g a d s o r p t i o nm e t h o d f i v em a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i nw e r eu s e dt od i s t i l lt h e p i g m e n t t h es e p a r a t i n ge f f e c to f t h eg d x - 2 0 1i sb e s t t h eo p t i m a la b s t e r s i o n 湖北工业大学硕士学位论文 c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：a f t e rs a t u r a t i o n ，1 5 e t h a n o lw a su s e dt or e m o v ei m p u r i t y ； 5 5 e t h a n o lw i t h5 7 0 0a c c r e t i o nw a su s e df o ra b s t e r s i o n t h ea b s t e r s i o ns o l u t i o nw a s g a t h e r e dt ob ec o n c e n t r a t e da n dd r i e d t h ec o l o rv a l u eo ft h ea b o v ep i g m e n tp o w d e ri s 5 9 6 7 ( e 1 锄协，5 3 2 n m ) k e y w o r d s ：g a r d e n i ay e l l o wp i g m e n t ，m a c r o p o r o u sa b s o r b i n gr e s i n ，r e f i n e ，g a r d e n i a r e dp i g m e n t ，b i o t r a n c f o r m a t i o n i 潮班工堂大学 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：桐勺乏日期：7 年石月口日 学位论文版权使用授权书 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 力 学位论文作者鲐袜炎指删币签名：栌 日期：知1 年石月口日 嘲：叩 易月日 湖北工业大学硕士学位论文 1 1 天然食用色素概述 第1 章引言 用色素作为食品添加剂的物质之一，需要具有色、香、味、形俱全，并且能 够改善食品感官性的特点。而给人们的第一感官印象就是食品的色泽。褪色的食 品会让人们怀疑食品质量，没有了食欲。所以，食品的色调和色泽，以及着色的 稳定性，对食品本身是十分必要的。 食品工业广泛使用的食品添加剂，都是采用食用色素作为的重要组成成分， 食用色素可以对食物感官性状进行美化，比如增添诱人的颜色，使食物看起来更 加有食欲。同时食用色素还被广泛应用在医药及化妆品行业。从全球食品色素市 场来看，初略估计每年全世界的贸易额就会有9 4 亿美元，其中合成色素、天然 色素、天然来源色素、焦糖色素分别占4 亿、2 5 亿、1 9 亿和1 亿美元【1 1 。日本作 为食品色素生产大国，合成色素和天然色素( 9 0 是焦糖色素) 每年的产量分别 为2 0 0 万吨和2 万吨。而我国合成色素和天然色素( 8 0 是焦糖色素) 每年的产 量分别为3 0 0 0 吨和2 5 万吨，另外也有多种微生物发酵和植物提取物。获得 批准的食用色素，在国内就有6 5 种，而植物提取物就占有4 8 种【2 1 。 目前使用的食用色素有天然食用色素和合成食用色素两大类。食品着色工艺 发展，经历了一个漫长的过程【3 j 【4 l 。早在公元前，植物、动物及微生物作为主要原 料，古人就开始利用植物性天然色素给食品着色。但是随着发明了合成色素工艺 后，合成色素取代了天然色素的主要地位。由于合成色素具有着色力强、稳定性 高、色泽鲜艳以及无嗅无味、易溶、易调色等，尤其是其成本低廉的特点，在2 0 世纪中期前人们就开始广泛应用合成色素。但它有一个大缺点，即具毒性，多数 合成色素都是由含有苯环或荼环合成的偶氮化合物，均以焦油衍生物为主要原料。 由此看来合成色素本不仅没有对人体身体有益的成分，更有甚者它们却对人体均 可造成不同程度的危害。食用某些合成色素，甚至可能导致包括毒性、致泻性和 致癌性等严重后果，经过科学研究的不断深入，合成色素带来的危害性已经得到 人们深刻认识。与此同时天然色素已经重新得到了人们的重视。近年来，世界各 国都趋向充分利用天然色素，努力开发有利于人类身体健康的色素，满足人类发 展的需要。 天然食用色素大部分取自于果蔬、动物及矿物质，顾名思义就是源于天 湖北工业大学硕士学位论文 然资源的无毒性并可以食用的色素1 5 l 。有的天然色素还具有营养价值高、维 生物活性、色调自然、对人体具有医疗保健作用的特点【6 】【7 j 。在天然色素主要 成分中，像如1 3 一胡萝卜素等都是人体必须的营养物质i 引。但天然色素的稳 定性差是其一个较大的缺点，如光、温度、p h 值等外界因素都会对食品加工 及流通造成影响【9 j 。色素的色泽稳定和提取率也会受到色素提取工艺的不同 而有变化。从以上因素得知，目前推广使用天然食用色素的关键，就是如何 寻找较好的提取工艺，提高色素的稳定性和产品提取率。只有采用新的生产 工艺，获得更加优良的天然色素，才能满足日益增长的现代食品工业的需求。 因此，需要对传统的提取工艺进行改进，已成为添加剂行业非常迫切的问题 p o 。 1 2 栀子和栀子色素 1 2 1 栀子和栀子果的成分 栀子( g a r d e n i a ) ，系茜草科( r u b i a c e a e ) 植物栀子的果实，长椭圆形，呈深红色 或红黄色，见图1 ，9 1 1 月间成熟时采摘【1 1 l 。全国大部分地区有栽培，主要分布于 江西、湖南、浙江、福建、四川等地，根据塘河网作者杜永轩、金少庚、韩学广 报道，全国总栀子种植面积达到5 0 万亩，栀子干果总产量可达1 2 万吨【1 2 】。栀子 属卫生部颁布的首批食药两用资源，是传统中药。本草纲目由明朝的李时珍编 写，书中详细记载到：栀子的作用有具保护肝脏、降血压、有利于胆、镇静神经、 消除红肿、止血等。在中医的临床上有发现，栀子可用于治疗黄疽型肝炎、高血 压、扭挫伤、糖尿病等症【1 3 】。现代医学发现，栀子对一些细菌有抑制作用如：金 黄色葡萄球菌，双球菌等 1 4 1 。 2 图1 栀子树幽2 栀子果 f i 9 1 g a r d e n i a t r e e f i 9 2g a r d e n i a f r u i t 使用高教液相色谱来分析，发现栀子是由多种化学成分组成。其中主要成分 为藏花素和藏花酸【1 5 1 同时还含有丹宁、精油、果胶、d 甙甘露醇、b 谷甾醇、 绿原酸，同时还含有1 1 环烯醚萜甙类化合物等，其中以桅子甙为主1 ”】【用，此外在 果实和茎、叶、花中还检测出有挥发油【1 踟、多糖【1 9 1 等成分。 桅子黄色素f g a r d e n i a y e l l o w p i g m e n t ) 是一类天然黄色素，提取于栀子的果实 中，栀子黄色素的粗制提取液中的主要成分为3 太类：色素( 藏花素和藏花酸) ，环 烯醚萜甙和有机酸i 。其结构见图3 、图4 和图5 。 栀子黄色素的主要成分是a 一藏花素( a c r o c i n ) 和藏花酸( c t o c e t i n ) 。其中a 一减花 素，c 4 4 h “o m ，分子量9 9 72 1 ，是胡萝h 素二酸与右旋龙胆取糖成甙键，相接， 反式，较稳定，熔点1 8 6 ，最大吸收峰波长4 3 4 n m 。藏花酸c h 2 4 0 4 分子 量3 2 83 9 它是胡萝h 素二羧酸，为反式，最人吸收峰波长4 6 3 n m 。在实践的检 验中，栀于黄色素水溶液最大吸收峰在4 4 0 a m 处1 2 1 1 。 x c r o c i a lr = = x c r o c l n 2 ：r - x r + - y c m c j 帕r 1 x ，r - h c r o c e t i nr = r = i 图3 栀子黄色素的分子结构 f i 9 3 t h es t r u c t u r e o f g a r d e n i ay e l l o wp i g m e n t 硪 。 吣 湖北工业大学硕士学位论文 皇曼! ! ! 曼! ! ! ! ! ! i ；- ；n l ；! !；i! ! ! ! ! 曼皇皇! ! 皇曼! 鼍皇苎詈曼! ! 曼! ! 曼皇鼍皇暑鼍皇曼 类胡萝卜色素具有抗氧和抗光性能较差的缺点，并且易受酶的作用而褪色， 因为栀子黄色素的化学结构与类胡萝卜素的化学结构相似，所以也具有这些缺点 【2 2 1 【矧。藏花素的分子结构中具有许多全反式的共轭双键，主要有以下几个特点： ( 1 ) 容易引起双键异构化。也就是说，一部分双键变成顺式。导致稳定性下降； ( 2 ) 受氧氧化，经由环氧化等氧化分解； ( 3 ) 植物体内存在的脂质氧化酶，在脂质氧化酶的作用下容易分解。 受到氧化分解时，栀子黄色素会变成无色或褪去颜刨2 4 1 。有光存在时，这种 分解会加速的进行。因此，在栀子黄色素的储存和应用中，为避免接触氧应采取 有效措施。 c o o m e g j i x 晦i d i c 矗瑚g 删仍i d c c 论n i p i ag e n t i o b i o s i d e g e n i p o s i d e 图4 环烯醚萜甙的分子结构 f i 9 4 t h es t r u c t u r eo fi r i d i o d 环烯醚萜甙中，栀子甙为主要成分，分子式为c z 3 h 3 0 0 1 5 ，其分子量为5 4 6 4 8 。 栀子甙无毒，并且有促进胆汁分泌，帮助消化的功效。在实际栀子黄色素的水溶 液中，它的最大吸收波长为2 3 8 n m 2 4 1 。 栀子甙容易水解，水解生成的甙元具有半缩醛结构，半缩醛易进一步聚合， 得到结晶性甙元【2 5 1 。栀子甙在b 葡萄糖苷酶的作用下，水解，转变成了栀子甙元， 栀子甙元很容易和伯氨基酸结合，形成色素的中间体，在合适的条件下，这些中 间体，在热和氧的作用下很容易聚合，使共轭键增加，色带长移，颜色发生变化， 生成蓝色素【2 6 j ，反应生成的蓝色素和黄色素产生了绿色。因此栀子黄色素用于面 类食品中，当a 2 3 8 n ，n 厶帆大于0 4 时，会使面类制品发生绿变1 2 7 1 ，因此要对栀子黄 色素浸提液进行精制，以降低其在栀子黄色素的含量。 4 湖北工业大学硕士学位论文 h = c h c h i o r o g e n l ca c i d 图5 绿原酸的分子结构 f i 9 5 t h es t r u c t u r eo fc h l o r g e n i ca c i d 绿原酸( c h l o r g e n i ca c i d ) ，即我们所说的酚类物质( 后文均用栀子酚来表示绿原 酸) ，c 1 6 h 1 8 0 9 ，其分子量为3 5 4 3 ，在水溶液中它的最大吸收波长为3 2 5 n m 捌。在 栀子黄精制提纯中较难完全除去，根据日本栀子黄色素的标准，产品中 a 3 2 5 姗a 4 4 0 姗小于0 2 1 2 9 1 。 从上述的结构中可知，上述物质都属热敏性物质，在受热后遭破坏，因此， 为了保持色素的色泽及其营养价值，在生产过程中应尽量避免加热。 1 2 2 栀子色素概况 栀子黄作为一种天然的食用色素，安全性高，稳定性好，无任何的毒无副作 用。国内外对栀子黄色素的需求量逐步地增长，全球栀子黄色素的需求量约3 7 5 0 吨( 国内约9 0 0 吨) ，且以每年1 0 的速度增长。但目前全球栀子黄色素的总产量 不足2 0 0 0 吨，需求缺口很大，价格昂贵。另外，受种植地域适宜性的制约，能够 种植栀子的区域有限，在未来相当长的时间内，栀子黄色素紧缺的问题将依然很 难有很大改观。产品供不应求的矛盾将长期存在。目前我国每年约产栀子黄色素 5 0 0 吨，国内的价格为1 7 0 元公斤。在国外，日本、欧美市场每年需要栀子黄色 素量较大，光日本市场年需要量约为3 2 0 吨，其价格为4 5 美元公斤。在国内，大 型饮料厂为增加产品的市场竞争能力，也逐步使用食用天然色素代替食用合成色 素，仅健力宝集团一年就需要8 吨栀子黄色素。栀子黄色素主要是用于方便面的 着色。根据资料，我国2 0 0 7 年方便面的产量是4 8 9 亿包，总共仅方便面对栀子黄 色的需求量每年就是9 0 0 吨( 以上数据均来源汉元药材基地网 w w w h y y c j d n e t ) 。 栀子黄色素，传统上，主要用上色面制品。近年来，人们发现，栀子黄色素 对蛋白质和淀粉具有良好的染着性，所以栀子黄色素也广泛的应用于糖果、蜜饯、 5 湖北工业大学硕士学位论文 冰淇淋等食品中【训。但目前，美国和欧盟还没有批准栀子黄色素的使用，批准的 栀子黄色素替代品为从藏红花中提取的藏花素。根据国标g b 7 9 1 2 8 7 ，栀子黄 色素的最大使用量在食品中为0 3 9 k g ：粉末状产品的色价应在2 4 以上，流状产品 的色价应在1 5 以上1 3 1 】。 栀子黄色素由于其本身的特点，是目前国内外应用广泛的天然黄色素，并有 可能取代柠檬黄及日落黄等合成黄色素f 3 2 1 。栀子黄色素的质量与产品的纯度密切 相关，因此如果能引入先进的化工技术对其进行精制提纯，这样既能大大改善栀 子黄色素的各方面性能，而且它的应用范围可以得到很大的扩大。我国和日本等 国有多家厂商生产栀子黄色素。南开大学高分子化学研究所用吸附树脂法对栀子 黄色素乙醇水溶液进行精制，其栀子甙在最大吸收波长2 3 8 n m 处的吸光度值与栀 子黄色素在4 4 0 r i m 处的吸光度值的比值( 以下以a 2 3 s 衄a 4 4 0 衄表示) 从3 2 1 降到 0 7 l ，色素色价从1 1 7 2 提高到1 7 2 1 ，获得了良好的精制效果1 3 3 】。南昌大学环境 科学与工程学院采用大孔吸附树脂层析柱分离天然产物栀子黄色素溶液，得到栀 子黄产品a z 3 8 衄a 4 4 0 衄从2 1 2 降到o “，色素色价达到2 2 1 2 4 1 3 4 1 。无锡天彩生物 有限公司生产的栀子黄色素o d 值己经达到o 6 0 【3 5 1 ，但这些产品仍然不能达到国 际出v i 标准。目前日本能生产出高纯度的栀子黄产n 晶( a 2 3 8 衄a 4 4 0 n m 小于0 2 0 ) 3 6 1 ， 但作为商业技术机密，没有关于精制方法的详细学术报道。因此，探索新的精制 方法，进一步降低栀子甙和绿原酸在栀子黄色素中的含量，提高栀子黄色素的纯 度也是栀子黄色素研究中的重点之一1 3 。7 1 。 1 3 栀子黄色素的提取精制概况 1 3 1 提取的工艺要求 天然色素的提取将是生产中非常重要的过程，是否采用合理的提取工艺，是 否选择了合适的溶剂，产品的质量和产量会受到直接的影响，另外也会对其他工 序造成影响。因此，在提取工艺过程中，需要强调如下几点： ( 1 ) 在提取生产中，为了保持色素的稳定性，应尽量避免由光、热、霉菌等 导致的色素分解和破坏。 ( 2 ) 在色素的提取过程中，应避免或尽量减少不必要的杂质被提取出来，同 时也是减轻了后续净化和分离工序的工作量。尽管有些杂质将不可能完全被隔离， 但是如果适当地选择溶剂，采用合理的提取工序，色素的纯度将是很理想的。 6 湖北工业大学硕士学位论文 ( 3 ) 在保证提取效率的前提下，也要给予充分的分离时间。只有这样才能使 更多的色素从残渣中分离出来，减少原料产品的不必要的消耗，降低生产成本。 ( 4 ) 尽量保持较高浓度的提取液。因为溶液浓度过低，将为后面的浓缩工序 带来困难，所以取得足够的抽取率情况下，采用高浓度的提取液是很有必要的。 针对以上各项要求，似乎是有冲突的。这就要求从整体角度来综合考虑，根据原 料的自身的特性( 价格和种类) ，提取工艺的复杂程度，选用最适合的提取条件。 1 3 2 提取方法 为了从原料种提取出主要的色素成分，目前主要存在三种提取方法：一种是 压榨法，主要适用花、浆果等此类原料；第二种就是微波萃取法，本实验中不考 虑用此法；第三种就是溶剂提取法，使用适当溶剂将色素成分提取出来，这是目 前使用最广的一种方法。 ( 1 ) 压榨法 压榨法的原理是利用手工或机械的压力作用，使色素溶液透过破碎的果皮和 细胞壁被压榨出来。该方法是目前从一些新鲜原料中提取色素最常用的方法，已 经被工业上最普遍采用。 ( 2 ) 微波萃取法 与传统的溶剂浸提法相比，耗时少、效率高是微波萃取的主要特点。据相关 文献记载，传统方法中栀子黄色素的料液比1 ：1 2 ，在5 0 下，用浓度为6 0 的乙 醇溶液浸泡原料并重复提取2 次( 2 l l 次) ，色素提取率仅为9 2 5 ；色价也只有 5 0 5 0 。而在萃取次数和料液比相同的情况瞎，采用微波萃取法，提供的萃取功率 2 1 0 w ，适用浓度为5 0 乙醇水溶液只需萃取8 0 秒，就已经达到9 8 2 4 的色素提 取率，可达到5 6 9 4 的高色价指标，不仅如此，提取时间已经大大缩短【3 0 】。但是 该方法因为成本高，本实验不做考虑。 ( 3 ) 提取法 本实验主要研究的就是通过溶剂提取天然色素的方法。对于新鲜的和风干的 原料都适用此类方法，尤其方便工厂贮存那些风干原料，并且取得率很高，保证 了产品质量，已被普遍采用。提取法的主要原理即采用一定浓度的溶剂浸泡固体 的色素原料，使得原料中的色素溶解并进入溶液中。这是一种使原料从固态到液 态的转变，主要有溶剂浸泡后导致色素溶解，然后浓溶液扩散，最后自动调节获 得浓度平衡的过程。 本课题的原料为风干的栀子果，所以适宜采用提取法。栀子黄溶剂提取的工 7 湖北工业大学硕士学位论文 鼍鼍曼詈鼍詈詈曼詈皇皇! ! ! 詈詈詈詈! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 曼! ! 曼曼詈詈曼! ! 詈皇皇i ii ii | 寡 艺路线为： 栀子果一去壳粉碎一溶剂萃取脱脂一有机溶剂 提取一浓缩一精制一千燥一成品 t j 溶剂回收 1 4 栀子黄色素的精制 粗提取的栀子黄色素溶液含有许多杂质成分，对色素的稳定性，染着性及应 用范围有着直接的影响，必须进行进一步的精制和提纯。 用果胶酶处理、板框过滤、离心等方法可以对栀子黄色素提取液进行初步的 精制和提纯，能去除浸取液中的果胶、蛋白质等大分子物质哪j 。栀子甙是引起色素 绿变的主要原因，要去除栀子甙，必须进行进一步的纯化。目前常用的精制方法 有：溶剂分离法、两相提取法、酶精制法、膜分离法、层析法、树脂吸附法等， 但真正用于生产的很少，国内外仅有大孔树脂吸附法已应用于工业化生产。 1 4 1 溶剂分离 色素与杂质在不同溶剂中溶解度不同，所以可以用不同的溶剂，通过从较低 的极性到较高的极性进行分步提纯和分离，除去杂质。如色素的水提液中常含果 胶、蛋白质、黏液质等，可加入一定量乙醇或其他有机溶剂，可以沉淀这些杂质， 还可以利用不同的酸碱性对色素的溶解性不同进行一步的分离。 此法只能初步提纯，其提取的纯度不高，效率低，工业生产上不适合使用该 方法。 1 4 2 两相提取 目前工业和实验室普遍采用此法作为加工方法，主要选择热水、乙天然色素 的提取方法中，提取两相是目前最常用的方法，栀子黄色素属于类胡萝卜素类天 然色素，所以也具有较强的亲脂性，易溶于丙酮、氯仿等溶剂，几乎不溶于水、 甲醇和乙醇【3 9 】。但栀子黄色素藏花素即的分子结构中有含氧的基团，所以亲脂性 减弱，同时亲水性增加，比较容易溶解于乙醇和甲醇【矧。这是栀子黄色素浸取的 理论基础。 8 湖北工业大学硕士学位论文 醇、石油醚等为浸取的溶剂，适合用此法进行色素的提纯的有栀子黄、玫瑰 红色素、辣椒红、玉米黄、高粱红、越桔红等。其工艺过程为：原料一筛选 干燥破碎浸取过滤浓缩干燥制成粉剂或加溶剂成品 1 4 1 0 此法优点是：工艺简单、安全、节省能源且所用溶剂易回收，提取条件较温 和，色价无多大变化等，但采用此法存在着耗时、低效、低品质、操作复杂等缺 点，这也就更促使人们去寻求新的提取方法。 1 4 4 膜分离法 膜分离是利用一种具有选择透过性膜( 有天然的膜也有人t n 备的) ，以外界能 量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯 和浓缩的方法。膜分离技术甚至可代替传统的分离技术( 如精馏、提取、蒸发、结 晶等过程) ，这是由于其具有省能、高效、简单、造价低、易于操作等特点，所以， 是对传统分离方法的一次革命。 膜分离过程按其分离对象可分为气体( 蒸汽) 分离和液体分离。按其分离方法可 分为纳滤( 1 、盯f ) 、反渗透法( r o ) 、微滤( m f ) 、气体分离( g s ) 、超滤( u f ) 、电渗析( e d ) 和渗透蒸发( p 以及与其它过程相结合的分离过程。国外已有使用超滤膜精制天 然色素，我国也已有工业化实例，如精制甜叶菊甙等，但用于天然食用色素工业， 尚处于试验阶段。 1 4 5 层析法 层析法的特点是能将一系列有着相似结构的化学成分分开。到目前为止，该 方法是实验室里分离有效成分的常用方法。但是，层析法对操作技术有着非常细 致的要求，而且有着比较长的操作时间周期，所能分离处理的量比较小，所以要 在工业生产中应用成本高，而且难以实施。目前，此法在工业上主要是在实验室 中分离未知的有效成分，然后鉴定出分离出来的物质的化学结构，晟后依据化学 结构的理化特征来设计工业上的工艺条件。 层析法包括气相层析、液相层析、凝胶层析和离子交换法。离子交换层析和 液相层析在工业上应用较多，其余的层析法在应用较少【4 2 1 。吸附层析法应用的原 理主要是利用吸附过程中吸附是可逆的，处于一种动态平衡中，也就是吸附和解 吸附；再就是吸附剂对不同物质的吸附行为( 即吸附力的大小) 不同，不同的溶剂对 9 湖北工业大学硕士学位论文 皇! ! ! 曼! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 詈! 曼詈! 皇! ! 曼! 。；_ ii i i l 鼍! ! 皇 不同的物质的解吸能力也不同。这两个规律就是为什么吸附层析法能将混合物分 离的依据。当用一定溶剂洗脱时，不同物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断的 吸附解吸附再吸附再解吸附。在整个易过程中，被吸附的物质( 也就是吸附 力强的物质) 相对的移动得慢一些，而较难被吸附的物质( 也就是吸附力弱的物质) 则相对的移动得快一些，经过一定时间的洗脱，移动得快的成分被先收集，而移 动得慢些的成分被后收集，这样，有效成分就得以分离。 1 4 6 大孔树脂吸附法 大孔吸附树脂是一种有机的高分子聚合物，它不会被其他有机溶剂，包括酸 和碱所溶解。2 0 世纪中期，随着离子换树脂分离技术的发明，使用大孔树脂进行 分离新技术也得n - r 蓬勃发展1 4 3 j 。 制造大孔吸附树脂的原料主要是采用苯乙烯、q 甲基苯乙烯、甲基丙烯酸甲 酯、丙腈，加入适量的致孔剂二乙烯苯精制而成。典型的大孔吸附树脂为球状颗 粒，根据其吸附能力可以分为中极性、弱极性和非极性三种，常温下对稀浓度的 酸和碱都很稳定1 4 4 1 ，但在溶剂中会出现膨胀现象。大孔树脂的孔径与比表面积都 比较大，在树脂内部具有三维空间立体孔结构，由于具有吸附容量大、选择性好、吸 附速度快等诸多优点【4 5 】。范德华力( 一种分子间作用力) 或产生氢键的特性使大 孔树脂具体较强的吸附力i 矧。由于大孔树脂具有三维空间立体孔结构，能够筛选 不同分子大小的物质。因此，树脂的吸附机理和筛分原理就是利用了这个原理来 实现的：根据不同有机化合物的分子量大小差异，以及采用具有不同吸附能力的 大孔吸附树脂进行筛选1 47 1 。 大孔吸附树脂成本低，且提取纯度较高，操作简单，应用范围广，国内外工 业上广泛用大孔吸附树脂精制提纯天然色素l 钙1 。在本课题中，使用大孔吸附树脂 提纯精制栀子黄色素。 本课题采用大孔树脂吸附法提纯栀子黄色素。根据文献报道，综合考虑树脂 的孔径、直径等因素，提纯精制栀子黄色素的大孔吸附树脂种类很多，主要有 h p d 1 0 0 a 、h p d l 0 0 、n k a 、x 5 、a b 8 、d 3 5 2 0 等。不同的文献报道不一致， 各有说法。南昌大学环境科学与工程学院采用a b 8 大孔吸附树脂柱层析柱分离天 然产物栀子黄色素溶液，得到栀子黄产品a 2 3 8 。l _ 4 1 0 l m ，从2 1 2 降到0 6 4 ，色素色价 达到2 2 1 2 4 1 2 7 1 。中国科学院成都生物研究所采用h p d 1 0 0 a 树脂分离纯化栀子黄， 得到栀子黄产品a 2 3 8 咖a 4 4 0 哪- - 0 2 2 4 ，a 3 2 5 啪a 4 4 0 n m = o 2 1 6 ，收得率为5 8 7 i 俐。 有文献报道，用x 一5 大孔吸附树脂分离纯化栀子黄，所得产品a 2 3 8 n m a 4 4 0 i l m = 0 5 9 ， 1 0 湖北工业大学硕士学位论文 收得率8 8 8 1 5 0 l ，用n k a 大孔吸附树脂分离纯化栀子黄，所得产品a 2 3 s 哪a 枷衄 = 0 2 9 3 ，收得率7 5 4 1 5 1 j 。 在这里，我们将文献提到的这几种树脂和生产厂家提供的y w 树脂做平行实 验，进行比较来确定精制效果晟佳的几种树脂。 确定最佳的树脂，同时确定该树脂在吸附栀子黄洗脱精制过程中的用水量、 用酒精量，通过进一步的优化，寻找更佳的优化条件，提高栀子黄的纯度，降低 栀子黄产品中的酚比( a 3 2 5 唧a 4 4 0 岫) 和甙比( a 2 3 s 衄a 4 4 0 叫值) 。 1 5 栀子红色素的概况 关于栀子红色素的研究，在我国国内很少见相关的报道，规模化生产更是属 于空白。栀子红色素是另一种天然色素，由栀子甙在b 葡萄糖苷酶的作用，经过 一系列的生物转化制得【5 2 1 。栀子红色素不容易受酸碱作用的影响、耐高温、对蛋 白质和碳水化合物的染色性良好，安全无毒，所以是一种很有开发价值的天然色 素【5 3 】。而栀子红色素的生产在国内还未投入生产，而栀子红色素在日本已经开发 投入生产，并出1 ：3 到东南亚等地【5 4 1 ，所以研究栀子红色素的生物转化及提纯具有 非常重要的意义。 本课题研究主题是：过大孔吸附树脂对栀子黄色素的分离纯化，计算最佳的 分离条件，获得高色价的栀子黄色素，同时利用栀子黄色素生产后的废液，将其 中的栀子甙生物转化，得到高纯度的栀子红色素。 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章栀子黄的提取纯化工艺研究 2 ：1 实验材料与方法 2 1 1 实验仪器及设备 岛津u v - 2 5 5 0 双光束紫外分光光度计：日本岛津仪器株式会社 b p 2 2 1 5 电子天平：德国s a r t o r i u s 公司 旋转蒸发器r e 5 2 a a ：上海亚荣生化仪器厂 恒温振荡摇床：德国b b r a u n 公司 d k - - s 2 2 型电热恒温水浴锅：上海精宏设备有限公司 2 1 2 实验试剂及药品 栀子果：广西鹿寨 酒精：市售食用酒精 y w 、n k a 、d 3 5 2 0 、h p d 一1 0 0 、h p d 一1 0 0 a 、a b 一8 树脂：南开大学化工厂，河 北远威化工有限公司，河北沧州宝恩化工有限公司 其他为化学纯试剂 2 1 3 实验方法 2 1 3 1 栀子黄色素的精制提取纯化方法 1 2 湖北工业大学硕士学位论文 墨冀尝际翮 1 飘五孺湎一i 苎兰! ! 竺兰j 脂和凝固物 低浓度乙醇洗脱厂1 塑垦 收集并浓缩除去乙醇 栀子黄 紫外检测 确定吸附平衡点 高浓度乙醇洗脱 洗脱液 冈 l 一 2 1 3 2 栀子黄色素的稳定性研究 据文献报道，栀子黄色素不稳定，在高温和光的影响下，发生分解【5 5 1 。实验 中，我们主要考虑栀子黄溶液在高温下的不稳定性，实验过程中，栀子黄色素主 要以水溶液和乙醇溶液形式存在，所以我们分别用栀子黄水溶液和栀子黄的乙醇 溶液，在不同温度下，计算栀子黄色素吸光度的损失率，来研究其稳定性并为后 期的精制过程提供参考数据。 取三分相同的栀子黄水溶液和三分相同的栀子黄乙醇溶液，分别在6 0 ， 8 0 ，1 0 0 水浴中，间隔半小时检测一次其吸光度，根据吸光度的变化来计算栀 子黄在不同溶剂和温度下的损失率。栀子黄水溶液的稳定性结果如表1 所示。 湖北工业大学硕士学位论文 ! ! ! 詈! ! ! 曼鼍! ! ! ! 曼! ! 皇! ! ! ! ! 曼! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !