（发酵工程专业论文）糖化酶工业生产菌株选育及其种子制备工艺优化.pdf

摘要 摘要 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶( g l u c o a m y l a s ee c 3 2 1 3 ) ，是水解淀粉的主要酶类， 广泛应用于食品、医药、发酵等工业。作为我国酶制剂中的支柱产品，糖化酶产品已成 为酶制剂产品中产量最大的品种，出口亦达到较大的数量，但是当前的问题是产品售价 已降至接近制造成本，企业获利甚微。因此，进一步选育糖化酶高产菌株，缩短发酵生 产周期，降低生产成本，对糖化酶的工业生产仍然具有十分重要的意义。 本文以获得高糖化酶活性菌株为目标，通过对实验室保藏的糖化酶工业生产菌株黑 曲霉c i c i mg a h l 4 进行多次低能盯离子束诱变，最终筛选出了一株糖化酶高产菌株 3 8 3 ，其糖化酶产酶水平较出发菌株高出3 1 7 。经过5 代遗传稳定性实验结果表明， 连续传5 代，3 8 3 菌株产酶活力维持稳定，具有良好的遗传稳定性。本研究中，建立了 一种以潮霉素抗性为检测指标的新的诱变育种初筛方法，以之为初筛手段，经过多轮复 筛及传代验证筛选得到了3 8 3 菌株，证明该方法是一种行之有效的新方法。 为了提高糖化酶工业生产菌种的研究和应用效率，针对丝状真菌形态变化对产酶的 影响，本文以糖化酶工业生产菌株黑曲霉g b 0 5 0 6 为出发菌株，在该菌原始培养流程的 基础上对其活化培养基配方及种子液体培养方法进行了改良。实验结果表明，在固体活 化培养基中添加0 2 的酵母粉及l 的玉米淀粉，有利于在保持原有酶活力的基础上加 速菌体生长；加入4 0 粒，粒径3 4 m m 的玻璃珠1 3 0 r m i n ，摇床培养可以获得更为分 散、均一利于发酵的种子液；液体种子制备的较优条件为初始p h 5 8 ，装液量6 0 m l ， 琼脂加量0 。l ，培养天数5 d 。由此，糖化酶种子制各时间较现在工业生产上使用的工 艺缩短了4 d ，进行的后续糖化酶摇瓶发酵产酶水平最高时是原工艺的1 1 8 倍。此改良 后的方法应用于诱变菌株的摇瓶筛选，同样得到了相当稳定的发酵结果，并显著缩短了 诱变菌株的筛选周期。 关键词：糖化酶，工业菌株，筛选方法，离子束诱变，液体培养方法，菌丝体形态 a b s t r a c t a b s t r a c t g l u c o a m y l a s e ，a l s ok n o w na sa m y l o g l u c o s i d a s e ，i sa l le x t r e m e l yi m p o r t a n te n z y m ef o r s t a r c hh y d r o l y s i sp r o c e s s e s i ti sw i d e l yu s e di nf o o d ，m e d i c a la n df e r m e n t a t i o ni n d u s t r y i n t h ep a s ty e a r , t h eg l u c o a m y l a s ep r o d u c th a sb e c o m eo n eo ft h el a r g e s tp a r t si no u re n z y m e i n d u s t r ya n di t se x p o r ta l s oc o m e st oal a r g es c a l e h o w e v e r , t h ep r o b l e mi s ，a l o n gw i t ht h e d e v e l o p m e n to fe n z y m ei n d u s t r y , t h ep r o d u c t i o nc o s ti sn o te c o n o m i cb e c a u s eo ft h ey i e l do f g l u c o a m y l a s ei sc o n s i d e r a t e l yl o w t h e r e f o r e ，f u r t h e rs c r e e n i n gt h eg o o ds t r a i n s ，r e d u c t i o no f t h ef e r m e n t a t i o nc y c l et i m ea n dt h ep r o d u c t i o nc o s ta r es t i l lv e r yi m p o r t a n t i nt h i sp a p e r ，l o we n e r g yni o nb e a mi m p l a n t i n gw a su s e dt om u t a g e n i z ea s p e r g i l l u s n i g e rc i c i mg a h 14f o rs c r e e n i n gh i g hy i e l dm u t a n t o n eo fm u t a n t s ，t h es t r a i n38 - 3s h o w e d h i g hp r e f e r e n c et op r o d u c eg l u c o a m y l a s e t h ei m p r o v e m e n to fg l u c o a m y l a s ea c t i v i t yo f38 - 3 w a s1 317 - f o l do fg a h14 t h er e s u l to fg e n e t i cs t a b i l i t yt e s to f5g e n e r a t i o n ss h o w e dt h a t s t r a i n38 3p r o d u c ee n z y m ea c t i v i t yf r o m9 8 t o10 3 an e wa n de f f e c t i v ep r e s c r e e n i n g m e t h o d ，u s i n go fh y g r o m y c i nb a ss c r e e n i n gi n d e x ，w a ss e tu pt oo b t a i nt h es t r a i n38 3 a n d i th a sb e e np r o v e dt ob ea ne f f i c i e n tm e t h o dt os c r e e nt h eh i g ha c t i v i t ys t r a i n s i nt h i sp a p e r ，ap r o c e s sf o ri n o c u l u m sp r e p a r a t i o no fa n i g e rc i c i mg b 0 5 0 6 ，a g l u c o a m y l a s e p r o d u c i n gi n d u s t r i a ls t r a i n ，w a sd e v e l o p e da n do p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h es t r a i ng r e ww e l lw h e ny e a s te x t r a c t ( o 2 ) a n dc o i ns t a r c h ( 1 ) w a sa d d e di n t ot h e b a s a lm e d i u m h i g hl e v e l so fg l u c o a m y l a s ew e r ep r o d u c e dw h e n4 0p a r t i c l eo fg l a s sb e a d s w e r ea d d e di n t ot h em y c e l i ag r o w t hm e d i u m t h eo p t i m u mc u l t u r ec o n d i t i o n so nl i q u i d i n o c u l u m sp r e p a r a t i o no fa n i g e rc i c i mg b 0 5 0 6w e r et h ei n i t i a lp h5 8 ，l i q u i dc a p a c i t y 6 0 m l ，a g a r0 1 ，5d a y sc u l t u r ep e r i o d b yu s i n gt h eo p t i m i z e dp r o c e s sf o ri n o c u l u m s p r e p a r a t i o n ，t h ec y c l et i m ew a ss h o r t e n e db y4d a y sa n dt h eg l u c o a m y l a s ey i e l di n t h e s u b s e q u e n tf e r m e n t a t i o nt e s tw a s1 18 一f o l do ft h eo r i g i n a lp r o c e s s k e y w o r d s ：g l u c o a m y l a s e ，i n d u s t r i a ls t r a i n ，h y g r o m y c i nb ，i o nb e a mm u t a g e n i c ，c u l t u r a l c o n d i t i o no p t i m i z a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 丞数 日 期： 遨 兰! 耳 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 苤煎 导师签名： e l 期： l i 叫j _ 棚。jl 。 ? 7 i 第一章绪论 第一章绪论 1 1 糖化酶简介 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶( 1 , 4 0 【一葡聚糖葡聚糖水解酶，e c 3 2 1 3 ) ，是由一系列 微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精、葡萄糖浆 的主要酶类，现已被广泛地应用于食品、医药、发酵、纺织等工业，是世界上生产量最 大应用范围最广的酶制剂产品之一1 1 2 j 。； 1 1 1 糖化酶的特性及研究进展 糖化酶的底物专一性很低，它除了能从淀粉链的非还原性末端切开i f , 一l ，4 葡萄糖苷 键外，还能缓慢水解a 1 ，6 葡萄糖苷键和a 1 ，3 糖苷键释放葡萄糖，因此糖化酶作用于直 链淀粉和支链淀粉时，能将它们全部水解为葡萄糖。糖化酶所水解的底物分子越大，水 解速度越快，而且酶水解速度还受到底物分子排列上的下一个键的影响【2 】。f o g a r t y 3 】的 研究表明糖化酶水解麦芽糖的能力是异麦芽糖的1 0 0 倍。6 0 【葡糖糖基麦芽糖的水解速 率仅为麦芽糖的4 5 ，这表明邻近a 1 ，4 链的0 【1 ，6 糖苷键较独立的a l ，6 链更易被打开， 因此水解分支密集的糖原较淀粉困难。如该酶能容易的水解含一个0 c 1 ，6 葡萄糖苷键的 潘糖，却很难水解只含一个0 【1 ，6 葡萄糖苷键的异麦芽糖，对含有两个伐1 ，6 键的6 2 异 麦芽糖基麦芽糖则完全无法水解，若用分子结构中含有i f , 1 ，6 和0 【一l ，4 键的潘糖为底物时， 首先切开的是0 【。1 ，6 键，然后再切开q 1 ，4 键，因此它作用于支链淀粉是从非还原性末端 顺次切下葡萄糖单位，在遇到0 c 1 ，6 键分支处，便形成一个类似于潘糖的结构，将i f , 1 ，6 键切开后，再将i f , 1 ，4 键迅速切开，而使支链淀粉分解。 潘糖异麦芽糖 图卜1 潘糖，异麦芽糖，异麦芽三糖结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r ef o r m u l ao f p a n o s e ，i s o m a l t o s ea n dm a i t o t d o s e 有关糖化酶性质测定的报道有很多，目前对糖化酶性质的测定主要集中在最适温度 和最适p h 值的研究上。工业上应用的糖化酶多是应用它的热稳定性，一般真菌产生的 糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生的糖化酶耐高温性能优于真菌。糖化酶最适反应温 度为4 0 6 0 ，但是某些嗜热菌株如hl a n u g i n o s a l 4 】和a n i g e ri m d c cn o 1 2 0 3 ( 5 j 的最适 反应温度能高达7 0 。c i o s t r i d i u mt h e r m o h y d r o - s u l f u r i c u m 糖化酶是目前已报道的糖化酶 江南人学硕士学位论文 中耐热最高的酶，在5 0 的淀粉溶液中，7 0 条件下酶完全稳定，在8 5 。c 处理l h 其酶 活性仍保持5 0 。我国学者李多川【6 】曾报道过一株嗜热真菌( t h e r m o m y c e s l a n g u g i n o s u s ) ，其最适作用温度7 0 。c ，最适p h 5 7 ，在6 0 c 条件下2 4 小时不丧失活性， 7 0 的半衰期4 5 分钟，8 0 的半衰期2 0 分钟，是目前国内发现的热稳定性最高的糖化 酶。 真菌糖化酶的含量最丰富，关于真菌糖化酶性质的研究最深入。大多数真菌糖化酶 的最适反应p h 为4 5 6 0 ，糖化酶通常在酸性条件下稳定。相比较而言，黑曲霉糖化酶 具有较强的耐酸性和耐热性，p h 3 0 、6 0 、3 h 后，仍具有4 0 以上的活力。而来源于 h u m i c o l al a n u g i n o s a 的糖化酶是个例外，直到p h 值达到1 1 0 都能保持稳定。糖化酶的 等电点一般范围在p h 3 7 7 4 ，这一性质具有种属特异性。部分已纯化糖化酶性质如表 1 1 。 表卜l 部分已纯化糖化酶性质 t a b l e1 - 1t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fs o m ep u r i f i e dg l u c o a m y l a s e s 米源 最适p h最适温度( ) 等电点参考文献 a s p e r g i l l u sa w a m o r i 4 56 03 7 【7 】 a s p e r g i l l u sn i g e ri i i a n i g e rv a l lt i e g h e m a o r y z a ei i i i i i a s a i t o ， c l o s t r i d i u m t h e r m o s a c c h a r o l y t i c u m f l a v o b a c t e r i u ms p h a i o b a c t e r i u ms o d o m e n s e h u m i c o l al a n u g i n o s e r h i z o p u ss p i i i i i i r h i z o p u sn i v e u s a s p e r g i l l u s f l a v u s a s p e r g i l l u sn i g e rg a l g a 2 l a c t o b a c i l l u sa m y l o v o r u s c o r t i c i u mr o l f s i igl g 2 g 3 g 4 g 5 s c y t a l i d i u mt h e r m o p h i l u m s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m t h e r m o m u c o r i n d i c a e s e u d a t i c a e h a d 4 5 5 0 4 5 5 0 4 7 3 5 4 5 4 5 4 5 4 5 5 o 5 5 6 5 7 5 6 6 4 5 4 5 5 0 4 5 5 0 5 5 4 0 4 2 4 5 6 o 5 5 4 8 - 5 4 7 o 6 0 3 4 6 04 o 6 5 6 0 6 0 5 0 4 0 5 0 7 0 6 5 6 5 7 0 4 0 6 0 6 0 7 8 7 8 7 9 7 0 6 9 5 6 5 6 5 6 3 8 5 8 7 8 7 8 8 8 4 5 3 8 3 9 5 4 3 9 3 8 5 3 9 0 3 8 5 4 0 4 ，l 7 08 3 【2 0 】 【2 1 】 6 0 【2 2 】 1 1 2 糖化酶高产菌株的选育 从自然界直接分离到的野生型菌株积累产物的能力往往很低，无法满足工业生产的 需要，这就要求我们对它们进行菌种改造，即育种。育种的手段主要有定向培育、诱变 育种、杂交育种、细胞融合和基因工程等育种技术。其中诱变育种和基因工程育种是最 为常用的两种技术。2 0 世纪4 0 年代开始诱变育种，获得青霉素高产变异菌株。目前仍 4 嘲 嗍 埘嘲 嘲 嘲忉 嘲 聊 r；r；rl r l r l f l 第一章绪论 是一种比较经济、高效的育种方法。诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的 微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从 中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。基因工程育种是以分 子遗传学的理论为基础，综合分子生物学和微生物遗传学的重要技术而发展起来的- - f - j 新兴应用科学。自2 0 世纪末问世以来便受到了全世界的广泛关注，并得到了飞速发展， 特别是在微生物分子育种方面取得了巨大的成功，重组人胰岛素的上市就是第一个例 证。随后又陆续应用基因工程技术对各种微生物的性状进行了改造，使目标代谢产物的 产量得到大幅提高，并实现了工业化生产，如酶、维生素、氨基酸、激素、促红细胞生 长素等。随着生物化学、遗传学、分子生物学以及各种生物技术的发展，使微生物各种 代谢产物快速产业化，以满足人类日益增长的需求。同样，在糖化酶菌种选育方面，获 得糖化酶高产菌株主要有以下两条途径：1 通过传统的物理化学诱变来筛选糖化酶高产 菌株；2 利用d n a 重组技术构建优良的工程菌株，如增加糖化酶基因的拷贝数，通过 定向突变筛选蛋白酶、葡萄糖苷转移酶缺陷株等。 糖化酶自1 9 8 8 年引入我国，曾经在我国出现过一个研究高潮。传统诱变方面，1 9 9 8 年，谷海先等【2 3 】对黑曲霉a n 1 4 9 菌进行自然分离、紫外线和n t g 的复合诱变处理， 得到了一株高产糖化酶的菌株w g 9 3 ，经3 0 l 发酵罐试验，酶活力达2 9 k u m l ( 原糖化 酶生产发酵水平为1 2 k u m l ) 。1 9 9 3 年，李俊刚等【2 4 】对生淀粉糖化菌黑曲霉s 1 原生质 体采用( 入1 = 2 6 0 n m ，入2 = 2 6 6 n m ) 能量为8 m j 的激光直接照射，得到高酶活力的生淀粉糖 化酶突变株，比出发株酶活力平均提高3 7 4 ，最高突变株酶活力达到7 4 5 u l ，比出 发株提高9 1 。1 9 9 8 年，李俊刚等【2 5 】又以黑曲霉5 2 3 原生质体为对象，经激光、紫外 线和亚硝基胍复合诱变，选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉n l 3 ，其生淀粉酶活 力为1 5 6 u m l 。基因工程方面，直接而有效提高现有工业菌株产酶活力主要基于以下两 方面策略：1 使用强启动子以提高结构基因的表达效率；2 增加结构基因拷贝数来提 高表达量。s w i f i t ：6 1 对携带有2 0 个糖化酶基因拷贝的重组菌a n i g e rb 1 进行了糖化酶发 酵研究，在其最大生长速率时糖化酶的产量达到1 5 0 m gg a m gb i o m a s s 。1h 1 。r y s z k a l 2 ，j 对整合了多拷贝糖化酶基因的重组菌进行了糖化酶发酵研究。对于液态发酵，重组菌 a a w a m o r ia a 2 2 和a n i g e ra n 2 0 的糖化酶活力是出发菌株的两倍，对于固态发酵， 重组菌a a w a m o r ia a 1 4 的糖化酶活力比出发菌株提高了8 5 。 1 1 3 茵体形态变化对发酵产酶的影响 丝状真菌在发酵工业上长期以来一直用于抗生素、酶类和有机酸等的生产，尤其在 工业用酶生产中确立了核心地位。丝状真菌强大的分泌酶类等蛋白质的能力是与它们的 腐生生活方式相适应的。丝状顶端和分支不断生长向底物拓殖，利用菌丝体分泌各种大 量水解酶类将蛋白质降解为可被吸收的营养分子共生长需要。菌丝的生长是顶端生长， 菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后端的为老龄菌丝。菌丝 断片也有前后之分，它被接种到新鲜培养基里和在培养过程中，在菌丝断片的幼龄端会 重新形成新的生长点，通过顶端生长使茵丝延长。这条菌丝又可以产生分支菌丝。在生 长过程中，菌丝分支的密度同营养状况密切相关，营养丰富，分支点与菌丝生长顶端的 江南人学硕士学位论文 距离短，即分支多而频繁；营养贫乏，分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。 前面已经提到，糖化酶工业生产菌绝大多数为丝状真菌，丝状真菌与单细胞微生物 相比，最大的不同之处在于个体形态在其生命周期中会发生变化。这种变化以液态发酵 过程最为显著和复杂，而这种形态变化往往会导致发酵产物也发生变化。m e t z l 2 8 j 教授在 他的博士论文中第一次提出了液态条件下丝状真菌发酵过程中菌体形态、过程参数和产 物生产之间的复杂关系图( 见图1 2 ) 。有关菌体形态变化对糖化酶的生存影响的文献鲜 有报道，但不少研究者在研究过程中己发现这一问题。短而高度分支的菌丝形态被认为 更有利于酶的生产【2 吼3 l 】。a m a i l u l l a h 【3 2 j 指出搅拌强度对发酵液中菌丝形态的形成影响巨 大，他指出在分批发酵阶段，生物量浓度、糖化酶分泌水平均随搅拌强度的增大而增加。 w o n g w i c h a r n l 3 3 1 等的研究结果表明氧气限制的培养基中，黑曲霉b 1 d 生长的典型形态 为长而稀疏分支的菌丝体；而富氧阶段则变为短而高度分支的菌丝形态。这种菌丝形态 为后续的发酵培养提供了更多、更分散的萌发点，不仅有利于糖化酶的分泌，也有利于 降低发酵液粘度，从而进一步有利于氧气的传递。 p r o e e s sc o n d i t i o n s m e d i u mc o m p o s i t i o n ， t e m p e r a t u r e ，p h ，s h e a r m o r p h o l o g y t ，o r 删m a u c t t i o nh g r 。w m i b r o t h r h e o l o g y 88卜一mitransfer x i n g r 1 1 儿与 h e a t t r a n s f e r 图卜2 液态条件下丝状真菌发酵过程中菌体形态，过程参数平产物生产之问的复杂关系 f i g 1 - 2c o m p l e xi n t e r a c t i o n sb e t w e e nm o r p h o l o g y p r o d u c t i v i t ya n dp r o c e s sc o n d i t i o n si ns u b m e r g e d f e r m e n t a t i o n so ff i l a m e n t o u sm i c r o o r g a n i s m s l 3 3 1 1 1 4 糖化酶生产茵的快速筛选策略 在发酵工业中，大量耗用糖化酶，筛选糖化酶产生菌的工作相当繁杂。因而妨碍了 糖化酶的生产。传统筛选糖化酶产生菌的方法是利用次亚碘酸盐法，该方法是化学测定 法。它除要求发酵滤液作样品外，也无法排除0 【淀粉酶和葡萄糖苷转移酶的影响。单菌 落琼脂柱育种技术是一种能大量筛选菌株的方法，被不少学者应用于糖化酶产生菌的筛 选。1 9 7 7 年，j m e y r a t h 创造一种能去除葡糖苷转移酶影响的筛选方法，其本质也是化 学检测法。即利用麦芽糖为底物，与菌块柱的反应混和液通过薄板色层分析器干燥显色 6 第一章绪论 并染色，来挑出不产葡糖苷转移酶的菌落。此方法虽可排除葡糖苷转移酶的干扰，但难 以区分每个菌落间糖化酶产量的差别，且流程工序繁杂。郭维烈、郭庆华f 3 4 】利用指示菌 平板法快速筛选糖化酶产生菌，其原理是：琼脂柱的体积是相等的，所含营养成分也是 相同的；当生长在他上面的不同菌株的生产性能不同时，分泌在琼脂柱里的糖化酶量也 不一样；根据对糖化酶敏感的指示菌形成的生长圈大小与茵落直径的比值，筛选出较优 菌株。该法对产糖化酶的菌种有特异性，而且可以进行糖化酶产量的比较。 除琼脂柱育种方法外，直接通过高含量淀粉平板筛选糖化酶产生菌株，也是较简单 快速的方法，但该方法灵敏度低，更无法排除其他葡萄糖苷键水解酶系的干扰，不适合 高产糖化酶的工业生产菌株的筛选。2 脱氧d 葡萄糖( 2 d e o x y d g l u c o s e ，2 - d g ) 是葡 萄糖的结构类似物，它是一种非代谢糖。因为脱氧葡萄糖更容易被己糖激酶和6 磷酸果 糖激酶磷酸化而积聚2 脱氧葡萄糖6 磷酸从而抑制了糖的酵解过程。利用2 - d g 降解产 物阻遏物筛选酶的高产菌株有众多报道。管斌等【35 】通过利用紫外线、亚硝基胍等对里氏 木霉进行诱变，用“以2 脱氧葡萄糖作为降解产物阻遏物”的高效筛选方法，选育得到 一株抗分解代谢阻遏的突变株，使纤维素酶活力提高了三倍。p a r d e e pk 啪a r 【3 6 】使用亚 硝酸及6 0 c o 诱变t h e r m o m u c o ri n d i c a e - s e u d a t i c a e ，在含o 5 9 l 的2 - d g 查氏平板上筛选 到了一株诱变子，其糖化酶活力比出发菌株提高了1 8 倍。m e h r d a da z i n 等【3 7 j 对 a s p e r g i l l u so r y z a e 进行亚硝酸诱变，混合使用o 2 2 d g 与0 0 8 脱氧胆酸钠筛选0 【淀 粉酶高产菌，其筛选到最好诱变子的糊精化时间与糖化力分别是出发菌株的5 1 3 和6 7 3 倍。以上方法在野生型菌株的选育方面确实发挥了非常重要的作用，但作为现有工业菌 种的筛选指示剂，则显得有些力不从心。随着基因工程，蛋白质工程，代谢工程的发展， 微生物分子水平代谢调控机制逐渐被揭示出来，并逐渐应用于工业菌株的改良。m a n o r a 等【3 8 j 通过对土曲霉洛伐它汀合成的代谢流分析，找到了影响该过程的关键调控因子，及 其基因序列，该研究小组进一步克隆了该基因启动子序列z d 伊，并与腐草霉素基因b l e 融合，构成了l o v f - b l e 报告筛选系统，携带有l o v f - b l e 片段的土曲霉经过诱变处理涂布 在含有腐草霉素的抗性平板上，通过高腐草霉素抗性菌株的筛选，最终获得了一株突变 株，其洛伐它汀产量是出发菌株两倍多。这一研究结果为我们进一步研究工业微生物的 高效筛选策略提供了思路。 1 2 离子束工程简介 2 0 世纪8 0 年代初期，正当离子注入金属、半导体等材料进行表面改性、掺杂等研 究开展得如火如茶之际，余增亮【3 9 j 等另辟蹊径，率先尝试将离子注入技术用于农作物品 种的改良，于1 9 8 6 年首次发现离子注入水稻生物效应，并在几个水稻品种上，通过离 子注入诱变获得了损伤低、突变率高、突变谱广的统计结果。经过十多年的探索，这一 研究己发展成为重离子生物学的一个新阶段，形成了辐射生物学一个新的领域一低能重 离子生物学p9 。，引起国内外的关注。 1 2 1 离子束工程概述 低能重离子是指能量在1 0 1 0 0 k e v 之间的原子序数大于氦的剥离原子核，其在生命 科学领域的应用即诞生了低能重离子生物学。加速后的重离子具有一定的静止质量，注 7 江南大学硕：f = 学位论文 入的离子束有刻蚀作用。同时，还具有高线性能量转移( l e t ) 和尖锐的b r a g g 峰。不同 的质量数、电荷数和能量又可根据需要进行组合，这种离子注入生物体后，质、能、电 的联合作用比核辐射对生物体的作用内容更为丰富。低能重离子与生物体系相互作用是 一个复杂的过程。从离子注入那一时刻起到终点生物学效应，作用时间跨越1 0 - 1 9 _ 1 0 9 s ， 经历物理、化学、生化和生物学阶段，具有能量沉积、质量沉积、动量交换和电荷交换 等四因子效应。因子的复杂性导致了效应的特异性。离子注入诱导生物体高的诱变效率、 后代产生可遗传的当代变异、“反常辐照损伤 ( 即在低注量段，生物存活与注入离子量 的关系呈现先降后升再降的“马鞍型曲线) 等等，与y 射线辐照等电离辐射诱导的生 物效应有较大的差异。特别是“反常辐照损伤”现象在离子注入有机小分子、质粒d n a 、 细胞和种子等都有表现，是一个较普遍的现象，现已成为辐射生物学研究的热点问题之 一o 1 2 2 离子束工程研究进展 离子束在遗传改良上应用最早的是诱变育种，其中主要是植物种质的改良。近年来， 离子束技术逐渐应用于工业微生物菌种的改良，并取得了丰硕的成果。通过离子束注入 工业微生物，大幅度提高了多种工业微生物发酵产物的产量。浙江农业科学研究院利用 离子束辐照糖化酶生产菌不同生长阶段的孢子，经摇瓶发酵，产酶力活从1 5 万发酵单 位平均提高到2 万单位。姚建铭等对利福霉素菌株进行离子束辐照，经诱变得到的利福 霉素菌种的发酵水平提高了3 5 【4 0 1 。黄文彩等用n + 注入链霉素菌，筛选到2 株效价 高，性能稳定的菌株，已投入大规模工业生产。许安等【4 2 】用此法获得的维生素c 生产菌 创国内外二步法发酵糖酸转化率新高，v c 新菌株糖一酸克分子转化率高达9 4 。v c 在 3 0 0 t 发酵罐上糖一酸克分子转化率高达达到9 4 8 ，几乎达到菌种转化率的极限。离子 束生物工程菌生产a a ，在5 0 t 发酵罐上，干菌体得率为3 ，总脂占干菌体的3 5 ， a a 占总脂的5 0 以上。高出美国、日本2 5 0 l 发酵水平的1 3 3 倍。利用离子注入麦角 甾醇产生菌，获得较出发菌产率提高5 5 - 6 0 的高产菌株，其遗传性状稳定，于1 9 9 8 年3 月通过江西赣南制药厂的验收。作为一种新的诱变手段，离子束注入工程必将对工 业微生物的选育工作作出巨大的贡献。 1 3 本论文的立题意义及主要研究内容 糖化酶自1 9 8 8 年引入我国后，在糖化酶高活力菌株选育及酶制剂应用技术方面曾 在我国出现过一个研究高潮，取得了一批成果。然而由于种种原因，近十年来，这方面 的研究工作进入低潮，相关的成果报道锐减。作为我国酶制剂中的支柱产品，其售价已 降至接近制造成本，企业获利甚微。因此，加大研发投入，改良菌种和优化工艺，提高 发酵酶活力降低制造成本已成为当前必须面临的一个重要课题。 本试验室一直致力于糖化酶工业生产菌株的遗传改良。中国高校工业微生物资源与 信息中心保藏的a s p e r g i l l u sn i g e rc i c i mf 0 4 1 0 是一株糖化酶的工业生产菌株，本实验 室曾对该菌进行了原生质体制备、再生及转化条件的研究，并建立了黑曲霉原生质体转 化系统1 4 引。以此出发，本实验室克隆了a n i g e rf 0 4 1 0 糖化酶基因g l a a ，并将其转入彳 8 第一章绪论 n i g e ，f 0 4 1 0 ，获得携多拷贝g l a a 的转化菌株，其糖化酶活力比出发菌株提高了至少 1 7 5 1 4 4 。 在糖化酶启动子研究方面，本实验室通过分子生物学手段克隆a n i g e rf 0 4 1 0 菌株 糖化酶基因启动子，在该启动子后连接潮霉素抗性基因，并通过原生质体转化将其转入 a n i g e rf 0 4 1 0 菌株中，获得了以潮霉素作为报告基因指示启动子活性的转化子g a h l 4 。 基于已有研究基础，本课题首先对a n i g e rg a h l 4 菌丝体进行低能矿诱变的条件 进行了摸索，包括注入能量、剂量的确定，保护剂的选择，诱变方法的确定；其次，采 用潮霉素抗性平板对所获得的诱变菌株进行针对性筛选，并对糖化酶高产菌株进行抗性 稳定性及传代稳定性分析。以期为建立糖化酶工业生产菌株诱变育种新思路奠定基础。 同时，从丝状真菌菌丝形态对发酵产酶的影响出发，对糖化酶工业生产菌株液体培养条 件进行了优化，希望能够缩短种子制备及发酵周期，从而进一步降低生产成本，提高糖 化酶工业生产菌株的实验室应用和发酵生产的效率。 本论文的主要研究内容： 1 建立黑曲霉g a h l 4 菌丝体低能n + 注入诱变体系； 2 建立以潮酶素抗性作为报告基因对糖化酶高产菌株筛选体系； 3 糖化酶工业生产菌株种子液体培养条件优化。 9 江南大学硕士学位论文 第二章材料与方法 2 1 菌株 a s p e r g i l l u sn i g e rc i c i mg b 0 5 0 6 。该菌为携多拷贝糖化酶基因】。 a s p e r g i l l u sn i g e rc i c i mg a h l 0 ，1 1 ，1 4 ，1 7 。该系列菌株为潮霉素抗性基因随机 整合到宿主染色体上，并且该基因的表达由糖化酶启动子控制调节【4 5 1 。 以上菌株均为本实验室改造过的基因工程菌，出发菌株均为糖化酶工业生产菌么 n i g e rc i c i mf 0 4 1 0 。以上菌株均由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心 ( h t t p ：c i c i m c u s y t u e d u o n ) 提供。 2 2 主要试剂 潮霉素b ( h y g r o m y c i nb ) 来自上海博大泰克生物工程有限公司； 胰蛋白胨、牛肉膏、和酵母浸提物均为o x o i d 产品； l y s i n ge n z y m e 为s i g m a 公司产品； c e l l u l a s e 、s n a i l a s e 、s d s 、p e g8 0 0 0 均为华美生物工程公司产品； 以下试剂均为国产分析纯： n a c l 、n a n 0 3 ，k 2 h p 0 4 ，k c l ，m g s 0 4 ，f e s 0 4 ，冰乙酸，蔗糖； 玉米淀粉、玉米浆均产自无锡。 2 3 主要仪器 恒温金属浴( 杭州博日科技有限公司，型号h b 1 0 0 ) 全温摇床柜( 太仓市实验设备厂，型号h y g a ) 隔水式恒温培养箱( 上海精密实验设备有限公司，型号g n p 9 0 8 0 ) 超净工作台( 苏净集团安泰公司) 生物传感分析仪( 山东省科学院微生物研究所，型号s b a 4 0 c ) 电子分析天平( 瑞士梅特勒托利多公司产品，型号a l l 0 4 ) 台式高速离心机( 美国s i g m a 公司产品，型号1 1 5 ) 台式高速冷冻离心机( 美国s i g m a 公司产品，型号4 k 1 5 ) 超生破碎仪( 瑞士梅特勒托利多公司产品，型号s o n i c s7 5 0 ) 冷冻干燥机( 美国l a b c o n c o 公司产品，型号f r e e z o n e4 5 ) 离子注入机( 中科院等离子物理研究所研制，型号i b b d e v i c e ) 2 4 培养基和培养条件 活化培养基i ：采用t z 培养基，每升含有3 9 牛肉膏、1 5 9 蛋白胨、2 9 酵母抽提物、 2 9n a c l 、1 5 9 玉米淀粉、2 0 9 琼脂，p h 5 8 。 活化培养基i i ：在c d 培养基中分别加入1 玉米淀粉( c d l ) 或0 2 酵母粉( c d 2 ) 或两者的混合物( c d 3 ) ，p h 5 8 。 种子固体培养基：采用查氏固体( c d ) 培养基，p h 5 8 。 种子液体培养基：每升含有3 9 牛肉膏、1 5 9 蛋白胨、2 9 酵母抽提物、2 9 氯化钠、 1 5 9 淀粉、1 9 琼脂，p h 4 5 。 l o 第二章材料与方法 摇瓶发酵培养基：每升含有3 0 9 玉米浆、3 0 9 硝酸铵、1 0 0 9 葡萄糖，p h 5 5 。在发酵 培养基中接入8 种子液，3 4 ，2 2 0 r m i n ，摇床发酵1 2 0 - - 1 4 4 h ，三角瓶装液量为 5 0 m l 2 5 0 m l 。 2 5 诱变方法 2 5 1 菌种活化 将7 0 。c 冰箱的黑曲霉重组菌甘油管保藏物适当稀释涂布t z 培养基，3 4 c 培养 7 2 1 2 0 h ：以t z 平板上挑出单菌落划线于c d 培养基，3 4 c 培养7 2 1 2 0 h ；从c d 平板 上挖4 c m 2 左右的琼脂块放入种子培养基，3 4 静置培养9 6 1 4 4 h ，三角瓶装液量 6 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶。 2 5 2 生长曲线绘制方法 经活化后的种子液培养过程中，分别在4 8 h ，7 2 h ，9 6 h ，1 1 0 h ，1 2 0 h ，1 3 0 h 取l m l 培养液置入1 5 m l 无菌离心管，对应编号，经1 0 3 稀释后，取1 0 0 p l 分别涂布对应编号 的t z 平板，每时问点设三个平行。 2 5 3 保护剂添加方法 经活化后的种子液，分别取l m l 置入9 个1 5 m l 无菌离心管，每三个一组对应编 号；离心收集菌体，并以1 0 0 肛l l o 甘油重悬；三组菌体分别于甘油中浸泡0 m i n ，2 m i n ， 5 r a i n 后，涂布于对应编号的三组无菌载玻片，无菌风吹干；每组各取一个载玻片分别 置于维持真空状态0 m i n ，5 m i n ，10 m i n ；取出，以3 0 0 p l 无菌水重悬；每个样品涂布三 块t z 平皿，3 4 培养4 8 7 2 h 后，计数。 2 5 4 潮霉素抗性敏感性的确定 分别提取转化子g a h l 0 ，g a h l1 ，g a h l 4 ，g a h l 7 染色体，并以此为模板，扩增 糖化酶基因及潮霉素抗性基因。染色体提取方法及p c r 扩增方法参见文献【4 5 1 。 同时，将四株菌的c d 培养液1 0 。1 稀释，分别涂布于含潮霉素0 ，8 0 0 t g m l ， 1 0 0 0 ；- t g m l ，1 2 0 0 t g m l ，1 4 0 0 p g m lt z 平板，3 4 4 c ，培养4 8 7 2 h ，以确定潮霉素对 g a h l 4 生长的最小抑制浓度。 2 5 5 离子束诱变出发菌悬液的制备 为了获得较为单一、分散的用于诱变的菌体，本试验分别采用冻干后研磨、超声波、 玻璃珠、玻璃珠与吐温混合对经活化的菌丝体悬液进行打散处理。 2 5 6 离子束诱变 黑曲霉菌丝体细胞用l m l 无菌水或1 0 的甘油将菌体洗至无菌空平皿，涂匀，以 无菌风吹干，准备进行离子注入。以为注入离子，注入能量为1 0 6 0 k e v ，注入剂量 分别为( 2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ) x 2 5 x 1 0 1 3 n + e m 2 进行脉冲式注入，靶室真空度为1 0 。3 p a 。 江南火学硕上学位论文 2 6 筛选方法 2 6 1 初筛方法 离子注入完成后，用l m l 无菌水洗脱，稀释后涂布在含1 0 0 1 0 0 0 0 ) a g m l 潮霉素的 t z 抗性平板中进行突变株的筛选。 2 6 2 复筛方法 将初筛获得的高潮霉素抗性突变株转接于t z 培养基平板，并以种子液活化方法培 养种子液。 在发酵培养基中接入8 种子液，3 4 c ，2 2 0 r m i n ，摇床培养1 2 0 1 4 4 h ，三角瓶装 液量5 0 m l 2 5 0 m l 三角瓶。 2 6 3 酶活测定方法 糖化酶酶活测定：按q b 7 4 6 8 0 标准，原轻工部部颁标准测定( 稍变动) 。 酶活定义：1 9 固体酶粉( 或l m l 液体酶) ，于4 0 。c 、p h = 4 6 的条件下，l h 分解可 溶性淀粉产生l m g 葡萄糖，即为一个酶活力单位，以u g ( u m l ) 表示。 酶活测定方法及试剂配制方法参见文献 4 6 , 4 7 】。 2 7 原生质体制备 ( 1 ) 黑曲霉菌株在t z 培养基上3 4 。c 培养9 6 h ； ( 2 ) 挑选标准菌落划