（发酵工程专业论文）絮凝性酿酒酵母基因工程菌的构建与发酵.pdf

摘要 摘要 本研究的目的是采用遗传改良技术，使酿酒酵母絮凝基因凡d j 在发酵性能优良的 工业酿酒酵母中表达，得到絮凝重组工业酿酒酵母菌株，以利于在酒精发酵末期利用酵 母自身的絮凝沉降能力从醪液中分离细胞，节约酒精生产的能源成本。研究内容如下： 把酿酒酵母絮凝基因凡d j 接入表达载体p y x 2 1 2 ，构建重组质粒p y x f l o 并转化酿 酒酵母w 3 0 3 1 a ，得到絮凝重组酿酒酵母w 3 0 3 1 af 4 ；在质粒p y x f l o 中接入筛选 标记g 4 1 8 抗性基因勋刀 表达盒，构建重组质粒p y x f l o k a n 转化工业酿酒酵母 z w a 4 6 ，得到絮凝重组工业酿酒酵母z w a 4 6 f 2 ；利用絮凝重组菌z w a 4 6 f 2 进行细胞 回用反复分批发酵及连续发酵等生产酒精的工艺研究；以及对絮凝基因凡d ，编码产物 酵母胞壁蛋白f 1 0 1 p 进行研究。主要研究结果如下： 1 重组酿酒酵母w 3 0 3 1 af 4 的絮凝值达到7 0 且絮凝能力传代稳定；在培养基 初始p h2 5 7 o 范围内，重组菌w 3 0 3 1 af 4 絮凝能力变化不大；重组菌w 3 0 3 1 af 4 在细胞生长稳定期前期启动絮凝，其絮凝的启动和葡萄糖耗竭非耦联。实验结果证明可 以通过启动子删控制絮凝基因凡d j ，表达的遗传操作方法获得絮凝重组酿酒酵母 w 3 0 3 1 a f 4 ，为基因凡d j 在工业酿酒酵母中的表达奠定了研究基础。 2 工业酿酒酵母絮凝基因工程菌a y f 1 2 的絮凝值达到8 0 而且具有良好的传代 稳定性能。在初始p h3 5 5 5 范围内，其絮凝性能没有明显变化，但对其酒精生产能力 有较大的影响。重组菌a y - f 1 2 在细胞生长稳定期日仃期启动絮凝，其絮凝的启动和葡萄 糖耗竭呈非耦联关系。5l 发酵罐实验表明，重组菌a y f 1 2 和野生菌a n g e ly e a s t 的发 酵过程变化规律基本致，但前者较后者的发酵周期稍有延迟( 6h ) 。重组菌a y - f 1 2 的 酒精产量最高达到8 1 ( v ) ，酒精对葡萄糖的转化率达到其理论转化率的8 4 5 。 3 重组菌a p f l 2 在3 0 至4 0 的温度条件下，能保持较好的酒精发酵能力。在 3 0 5 0 温度范围内，菌体细胞的絮凝能力基本一致。重组菌a y f 1 2 在较高温度条件 下，既能保持较好的酒精发酵性能，又具有良好的絮凝能力。 4 絮凝重组工业酿酒酵母z 、a 4 6 f 2 的絮凝能力达到9 5 且絮凝传代稳定；在培 养基初始p h2 5 6 o 范围内，重组菌z w a 4 6 f 2 的絮凝性能没有明显变化，但对其酒精 生产能力有较大的影响；重组菌z w a 4 6 f 2 在细胞生长稳定期前期启动絮凝，其絮凝的 启动和葡萄糖耗竭呈非耦联关系；在3 0 5 0 温度范围内，菌体细胞的絮凝能力基本一 致。 5 5l 发酵罐实验表明，重组菌z w a 4 6 f 2 和野生菌z w a 4 6 的葡萄糖消耗、生物 量、p h 值和酒精浓度等过程参数的变化规律基本一致，但前者较后者的发酵周期稍有 延迟( 3h ) 。重组菌z w a 4 6 一f 2 的酒精产量最高达到8 6 ( v ) ，乙醇对葡萄糖的转化 率达到其理论转化率的8 9 8 ，和野生菌株相同。 6 絮凝重组工业酿酒酵母z w a 4 6 f 2 的细胞回用反复分批发酵共进行了2 6 批次， 结果表明，第6 批次的发酵强度达到最大值2 2 7g 1h ，比第一批次普通分批发酵提高了 江南大学博i ：学位论文 7 8 7 。酒精浓度在第1 1 和1 2 批次时达到最大值9 o ( v v ) ，此时糖转化率为0 5 0 g 。 当细胞回用至2 2 批次时，发酵强度为1 2 6 lh ，和第一批次相当，随后逐渐下降，因 此，重组菌z w a 4 6 f 2 反复分批发酵的细胞回用次数以2 2 批次为宜。 7 利用絮凝重组工业酿酒酵母z w a 4 6 f 2 进行连续发酵，发酵强度最大值达到3 8 2 lh ；重组菌z w a 4 6 f 2 单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵，即把重组菌经5 批 细胞回用反复分批发酵后再进行单级连续发酵，发酵强度进一步得到提高，最大值达到 5 8 2 鲋h 。 8 四种发酵工艺的结果表明，单级连续发酵的酒精发酵强度是普通分批发酵的3 倍，单级连续发酵耦合细胞回用反复分批发酵的发酵强度是细胞回用反复分批发酵的 2 6 倍，说明酒精生产的连续发酵工艺明显优于分批发酵。且单级连续发酵耦合细胞回 用反复分批发酵的发酵强度比单级连续发酵提高了5 2 4 ，表明利用单级连续发酵耦合 细胞回用反复分批发酵的工艺，可以达到高产率和高得率的酒精生产目标。 9 分离纯化得到絮凝重组酿酒酵母w 3 0 3 1 af 4 的胞壁蛋白f 1 0 1 p ，并进行w e s t 唧 b l o t 分析，表明絮凝蛋白f 1 0 1 p 分子量大小约2 0 0k d a 左右；考察了来自& c e 例括妇e w 3 0 3 1 a 的絮凝蛋白f 1 0 1 p 的特征，该蛋白活性受甘露糖抑制，而不受葡萄糖、麦芽糖、 蔗糖及半乳糖抑制，实验表明，& c 讹协砌ew 3 0 3 1 a 的胞壁絮凝蛋白f 1 0 1 p 属于典型 的f 1 0 1 型。胞壁絮凝蛋白f 1 0 1 pn 端活性区域研究表明，第1 9 6 至2 0 9 个氨基酸是f 1 0 l p 结合甘露糖的活性区域；第2 1 0 至2 4 0 个氨基酸，不是该蛋白与甘露糖结合的活性区域， 但是该区域对絮凝蛋白f l o l p 与甘露糖结合的活性有一定影响。 关键词：酿酒酵母；酒精；絮凝：絮凝基因凡d ；絮凝蛋白f 1 0 1 p ；发酵强度；反复 分批发酵；连续发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t 1 h ea b i l i 妙o fy e a s tc e l l st on o c c u l a t ei so f 。c o n s i d e r a b l e1 m p o r t a i l c ef o r t h em e le t h a n o l i z l d u s t 吼a si tp r o v i d e sa 1 1e 虢c t i v e ，e n v i r o n m e n t 衔e n d l ya n ds i m p l ew a yt os 印a r a t ey e a s t c e l l s6 o mm ej e i n a lc u l t u r en u i d t h ea i mo ft h i ss t u d yi st oc o n s t u c tar e c o m b i n a n ty e a s t u s i n gt h en o c c u l e n tg e n e 咒d jb yt h eg e n 商cm o d i f i c a t i o nm e t h o d t h er e s e a r c hi n c l u d e s t h ef o l l o w i n g ：f i r s t ，m er e c o m b i n a n tp l a s m i dp y x - f l ow a sc o n s t r u c t e du s i n gt h ee x p r e s s i o n v e c t o rp y x 2 1 2a n dg e n e 凡d ，a n dt h e nw a st r a n s f - o 咖e di n t o & 彤协励pw 3 0 3 1 a t h e t r a n s f o m l a n t y e a s tw 3 0 3 1 a f 4w a so b t a i n e d s e c o n d l y t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p y x f l o - k a nw a s c o n s n 弋i c t e du s i n gt h ep r e v i o u sv e c t o rp y x - f l oa n d 勉，z 比yc a s s e t t ea n d m e nw a s 位叽s f o m e di n t ot h ei n d u s t r i a ly e a u s ta n g e ly e a s ta n dz w a 4 6 ，r e s p e c t i v e l y t h e i n d u s t r i a l n o c c u l a t i n gy e a s ta y - f 12a n dz w a 4 6 一f 2w e r eo b t a i n e d t l l i r d l y ，t h e r 印e a t e d - b a t c hf e 】e n t a t i o nw i t hc e l lr e c y c l e da n dc o n t i n u o u sf e n n e n t a t i o nw e r ep e r f o 彻e d w i t hm er e c o m b i n a n ty e a s tz w a 4 6 一f 2 ，l a s t l y ，m ec e l lw a l lp r o t e i nf l olpe n c o d e db yt h e g e n e 凡d jw a ss t u d i e d t h em a i l lr e s u l t sw e r ed e s c 打b e da sf o l l o w s ： 1 t h ef l o c c u l a t i o na b i l 时o f t h et r 锄s f o 彻a n tw 3 0 3 1af 4r e a c h e d7 0 a n dw a ss t a b l e d u m gl4s 甜a 1b a t c hc u l t i v a t i o n s 1 1 1 ef l o c c u l a t i o no n s e to fm es t r a i n i si nt h ee 砌y s t a t i o n a r y 铲o w mp h a s e ，n o tc o i n c i d e n tw i t ht h eg l u c o s ed 印1 e t i o ni nt h ec u l t u r a lm e d i 啪 a n dt h ef l o c c u l a t i o na b i l i t yo ft h et m n s f o n n a n ts h o w e dn od i 能r e n c ew i t ht l l ei n i t i a lp h r a n 百n g 疗o m2 5t o7 0 t h ea b o v er c s u l t sm a d ei tp o s s i b l e 廿1 a tt h ei n d u s t r i a lf l o c c u l a t i n g y e a s tc o u l db eo b t a i n e du s i n gf l o c c u l a t i o ng e n e 凡d jc o 砷r o l l e db yp r o m o t o r 职， 2 n l ef l o c c u l a t i o na b i l i t ) ，o ft 1 1 ei n d u s t r i a lf l o c c u l a t i n ga y - fl2r e a c h e d8 0 t h e n o c c u l a t i o no n s e to ft h es t r a i ni si nt h ee a r l ys t a t i o n a r y 舀o w t hp h a s e ，n o tc o i n c i d e n tw i t l lt h e g l u c o s ed 印1 e t i o ni nm ec u l t u r a lm e d i u m a n dt h en o c c u l a t i o na b i l i t yo fm e 仃a n s f o 肌a i l t s h o w e dn od i f 虱。r e n c ew i t hm ei n i t i a lp hr a n 百n g6 o m3 5t o5 5 t h em a x i i i l u me t h a i l 0 1 c o n c e n 臼a t i o no f8 1 ( v v ) w i ma l le t h a n 0 1 如e l do ng l u c o s eo f8 4 5 o ft h et h e o r e t i cv a l u e w a sa c l l i e v e d f u n 量l e 肌o r et h ee 1 a n o lc o n c e n t r a t i o no ft h et r a n s f o 瑚a n ts t r a i na y - f12a n d i t so m e rp r o p 鲥i e ss u c ha sm eb i o m a s s ，r e s i d u a l 粤u c o s ec o n c e n t r a t i o na n dc h a n g eo fp h w e r es i m i l a rt ot h o s eo fm ew i l d - t y p es t r a i n 3 t h ef l o c c u l a t i o na b i l i t yo ft h et 舢s f o m a n ta y - fl2s h o w e dn od i f r e r e i l c ew i t h 哇l e t 锄p e 咖r e 舢舀n g 舶m3 0 t o5 0 a n dt l l ee t h a i l o lc o n c e n t r a t i o nr e a c h e d6 7 a t4 0 ，砌c hc o m b i n e dt h eg o o dp r o p e n yo fe h a i l 0 1p r o d u c t i o na 1 1 dt h em e n ：n o t o l e r a n c e 4 t h ef l o c c u l a t i o na b i l 时o fm ei n d u s t r i a lf l o c c u l a t i n gy e a s tz w a 4 6 一f 2r e a c h e dm o r e t h a n9 0 a i l dw a ss t a b l ed u 渤g2 0s 耐a 1b a t c hc u l t i v a t i o n s t h ef l o c c u l a t i o no n s e to ft h e s t r 咖i si nt h ee a ys t a t i o n a r y 罂o w t hp h a s e ，n o tc o i n c i d e n tw i m m e9 1 u c o s ed 印1 e t i o ni nt h e c u l t i l r a lm e d i 啪a n dt h en o c c u l a t i o na b i l i t yo ft h et r a n s f o m a n ts h o w e dn od i 船e n c ew i t h 重i i 江南大学博j 二学位论文 m ei n i t i a lp h 啪百n g 行o m2 5t o6 0 5 t h eb a _ tc _ hf 爸n i l e n t a t i o nw a sp e 向m l e di nt h e5lf e n n e n t o rw i t ht 1 1 ei n d u s t r i a l r e c o m b i n 锄tz 後4 6 f 2 t h em a x i m l 】me t h a i l o lc o n c e n t r a t i o no f8 6 ( v v ) w i t ha ne t h a n 0 1 y i e l do ng l u c o s eo f8 9 8 o fm et h e o r e t i cv a l u ew a sa c h i e v e d f u r t h e r m o r et l l ee t l l a n o l c o n c e n t r a t i o no ft h et r 孤s f o m l a n ts t r a i nz w a 4 6 - f 2a n di t so t h e rp r o p e r t i e sw e r es i m i l a rt o m o s eo fm ew i l d t y p es t r a i nz w a 4 6 6 。t h er c p e a t e d b a t c hf - e r m e n t a t i o nw a sp e r f o n n e dw i mt h ei r l d u s t r i a lr e c o l l r l b i n a n t z w r a 4 6 一f 2 i nm e6 t hb a t c h ，t h ef i n a le t h a j l 0 1c o n c e n t r a t i o nw a s8 5 f o r3 0h ，w h i c h c o r r e s p o n d e dt oav 0 1 u m e 一cp r o d u c t i v i t ) ro f2 2 7 鲫h a n dt h ep r o d u c t i v i t yw a si m p r o v e d b y7 8 7 ，c o m p a r e dw i t hm a to f1 2 7g 1hi nt h ef i r s tb a t c hf e r n l e n t a t i o n t h ee t h a j l o l c o n c e l l 仃a t i o nr e a c h e d9 o a tt 1 1 ee n do fm e1 1t ha n d1 2 mb a t c h e s ，w h i c hc o 盯e s p o n d e dt o t h e 姐e l do fo 5 g a sm ev 0 1 u m e t i cp r o d u c t i v i t yd e c l i i l e d1 2 6 朗h i nt l l e2 2 t hr o u n d ， w 1 1 i c hw a s1 0 w e rt h a nm eo r d i n a 眄b a t c hf e n n e n t a t i o n ，2 2r o u n d so fr e p e a t e d b a t c h f e n n e n t a t i o nw e r ea c c e s s i b l e 7 t h es i n 酉e - s t a g ec o n t i n u o u sf e n n e n t a t i o nw a sp e r f o m e dw i t ht h ei n d u s t r i a l r e c o m b i n a n tz w a 4 6 f 2 t h ev o l 啪e t r i cp r o d u c t i v i t yr e a c h e d3 8 2 鲋h a n di t s p r o d u c t i v i t yo ft h es i n 9 1 e - s t a g ef e r n l e n t a t i o nc o u p l e dw i t hr 印e a t e d - b a t c hf e m l e n t a t i o nw a s 5 8 2 1h 8 c o m p a r i s o no ft h ef o u rf e m l e n t a t i o n s ，s u c ha sb a t c hf e n l l e n t a t i o n ，r e p e a t e d - b a t c h f e 姗e n t a t i o n ，s i n 哲e s t a g ec o n t i n u o u sf e n n e n t a t i o na n dc o n t i n u o u sf b n i l e n t a t i o nc o u p l e dw i t h r 印e a t e d - b a t c hf e n n e n t a t i o n ， s h o w e dt h a tt h e p r o d u c t i v i t y o fs i n 哲e - s t a g ec o n t i n u o u s f e n n e n t a t i o nw a s3f o l d sa st h a to ft h eo r d i n a 巧b a t c hf e m e n t a t i o n ，a i l dt h ep r o d u c t i v i t yo f s i n 9 1 e s t a g ec o n t i n u o u sf e r m e n t a t i o nc o u p l e dw i t hr e p e a t e d - b a t c hf e 锄e n t a t i o nw a s 2 6f o l d s a st h a to fm es i n 9 1 e - s t a g ec o n t i n u o u sf e m e n t a t i o n t h er e s u l t sp r o v e dt h a tm ec o n t i 肌o u s f e 啪e n t a t i o nw i mt h er e c o m b i n a i l tz w a 4 6 f 2w a sp r i o rt ot h eb a t c hf e m l e n t a t i o n 9 t h ec e l lw a l lp r o t e i nf l ol po fm er e c o m b i n a n tw 3 0 3 1 af 4w a sp u r i f i e d t h er e s u l t o fw e s t e mb l o ts h o w e dt h a ti t sm ww a sa b o u t2 0 0k d a a n df l o1pb e l o n g st of l o1t ) r p e c h a r a c t o r i z e db yt h ei n h i b i t i o no fs u g a r s s t u d yo ft h en t e m l i n a lp a r to fm ep r o t e i nf l o 1p s h o w e dt h a ti t sa c t i v er e 酉o nw a s6 o m - a m i n oa c i d19 6t o2 0 9 ，髓a b l i n gm ep r o t e i nt o s e l e c t i v e l yb i n dt h em a j l n o s es u g a r s ，a n dt h er e g i o n 丘o m 锄i n oa c i d2 1ot o2 4 0c o u l dn o t b i n ds u g a r sb u th a ds o m en e g a t i v ee f f e c to nt h ea c t i v er e 西o n k e yw o r d s ：5 h c c 五口，d ，缈宝sc p 砒f 口e ； p r o d u c t i v i t y ；r e p e a t e d _ b a t c hf 锄e n t a t i o n ； e m a i l 0 1 ； f l o c c u l a t i o n ； n o c c u l a t i o ng e n e 凡d j ； c o n t i n u o u sf i 锄e n t a t i o n i v 主要符号对照表 主要符号对照表 d c w 细胞干重 e c酒精浓度 e f谷氨酸和苯丙氨酸 f l o絮凝值 凡d ， 絮凝基因 f 1 0 1 p絮凝基因凡d ，编码的蛋白 g c 气相色谱 舀c 葡萄糖 m a l 麦芽糖 m a i l 甘露糖 o r f 开放阅读框 p 发酵强度 r g残余葡萄糖浓度 t e m e d 四甲基乙二胺 t p i 磷酸丙糖异构酶 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：星h 积 日 期：? 暴年午qf 弓 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：王计永 ? 搿年f 0 f 第一章绪论 第一章绪论 1 1 概逆 乙醇俗名酒精。化学式为c z h s o h 。其生产方法包括化学合成法和微生物发酵法 ”。】。前者用石油裂解产生的乙烯与水台成酒精，所以这种方法受石油资源的限制。而 微生物发酵法主要以小麦、玉米、薯类、黑小麦等多种淀粉质作物或者甘蔗、甜菜等糖 料作物为原料”，经发酵、蒸馏而制成是古老传统、可利用再生资源的生产方法。 燃料酒精都由发酵法生产，主要有两种应用方式一种是把无水酒精按一定比例加 入汽油或柴油中，酒精在混合物中的比例不超过2 5 时，可以利用原有的汽车发动机； 另一种是把纯度为9 32 06 的酒精直接作为车用燃料，但需使用专门设计的具有更 高压缩比的发动机”。 1 2 世界燃料酒精i 业的发展现状 燃料和一个国家的经济发展密切相关，也是国家战略安全保障基础之一。从目前探 明的石油储量看，世界石油的开采期，乐观地讲有1 0 0 年左右，而悲观地讲只有3 0 一5 0 年 左右。世界太多数国家，包括我国在内，能源问题相当严重。另外，石油资源分布极 不均衡，大部分集中在海湾地区和俄罗斯等少数国家，很多国家对进口石油有着严重的 依赖性。国际能源署( i e a ) 2 0 0 7 年7 月初提出警告说，到2 叭2 年，全球对于原油的需求将 会以快于预期的速度增长，而产量却将会滞后。从而将导致一场能源供应的危机”。同 时，使用石化液体燃料所引起的环境污染也是人类面l 临的一大问题。 2 0 0 0 0 15 0 0 0 1 0 0 0 0 5 0 0 0 图1 12 0 0 5 2 0 0 7 年中黄巴印四国燃料乙醇产量 f 1 9 l - ld l s 岫u i m g o f 曲a n o l p r o d u c 6 0 c h l n a ，u s a ，b r a z i l 肌d l n d l a d u n g2 0 0 5 - 2 0 0 7 上世纪8 0 年代以来，许多国家都开始认同酒精作为一种替代性燃料的可行性。尽管 江南大学博： ：学位论文 受到石油价格下降的冲击，世界范围内的生物法燃料酒精生产也从未间断过。目前世界 燃料酒精产量最大的国家是美国、巴西、中国和印度，其2 0 0 5 2 0 0 7 年的酒精产量统计 如图1 1 所示【1 4 】。 美国已是燃料乙醇生产的第一大国，2 0 0 7 年8 月，美国乙醇产量达到6 8 1 3 亿加仑 ( 2 7 7 o 亿升) 。美国燃料乙醇生产主要依靠玉米，通过转基因技术和扩大种植面积，美 国玉米产量近年增长迅速，目前有3 0 的玉米是用于燃料乙醇的生产。除玉米乙醇外， 为促进纤维素乙醇的发展，2 0 0 5 年颁布的美国能源政策法案( e p a c t ) 为此制定了优惠 政策【1 4 】。 巴西2 0 0 6 年的酒精产量达到1 7 0 亿升。巴西使用甘蔗生产酒精，其生产成本低于谷物 酒精。实行蔗糖酒精热电联产，综合利用能源【l5 1 。在巴西的加油站里含水酒精的售价 已经降为汽油的6 0 7 0 【1 6 】，在全球率先实现了酒精相对于汽油的经济竞争力。 在我国，国家对酒精工业的发展也给予了高度支持。2 0 0 1 年4 月，中国宣布推广使用 车用乙醇汽油，并批准了吉林燃料乙醇公司、河南天冠燃料乙醇公司、安徽丰原生化公 司和黑龙江华润酒精公司等4 个年产能共1 0 2 万吨的燃料乙醇试点项目。2 0 0 6 年我国燃料 酒精总产量达到1 3 0 力吨( 居世界第三位) ，而酒精的年产能已经超过了1 0 0 0 万吨。预计 2 0 0 7 年燃料酒精产量约1 6 0 万吨；到2 0 1 0 年，预计燃料酒精的年产量可以达到2 0 0 万吨， 到2 0 2 0 年将可能达到1 0 0 0 万吨( 以发展非粮原料为主) 。从2 0 0 1 年开始，由于生物能源概 念的兴起，燃料乙醇技术的不断完善，中国酒精的产能与产量不断攀升，到2 0 0 6 年末中国酒 精产量已经达到5 8 l 万吨，如图1 2 所示f l7 1 。 7 r 一一一一一一 强。 一一鳓 黝o 一一一一 筑rn 一一m 灏 ”露_ l 8 绰o 绰 3 l o 旷 碑 o 痒0 6 卑 图1 22 0 0 0 2 0 0 6 年全国酒精产量 f i g 1 2 ，n l ee t h a n o lp m d u c t i o n 缸c h i i l ad u r i n g2 0 0 0 - 2 0 0 6 2 。 )蠡我嚣舷髯鬟酝嚣翳群噩鬃 簪铷缝缵鞋罅 | * 蟹錾娶嚣錾萎蝽 z瓣嚣黪嚣黪鏊群黎藜簿 锄 p，。，；，：一 粥 渤 蟒 0 第一章绪论 1 3 酒精的发酵工艺 1 3 1 高浓度酒精发酵 高浓度发酵最早由c a s e y 等提出，他们将高浓度发酵定义为含大于1 8g 可溶性固 形物l o og 发酵液( 大于1 8 0 p l a t o ) 的发酵【1 8 。2 0 】。也有将高浓度发酵技术定义为含2 7 l o o g 糖化液或更高的糖化液的制备和发酵【2 0 1 ，还有将高浓度酒精发酵技术定义为每升发酵 液含3 0 0g 或更高可溶性固形物的糖化醪的发酵 2 l 】。传统酒精发酵的发酵液的可溶性固 形物含量为1 1 1 2 0 p ，1 3 1 6 0 p 就被定义为高浓度发酵。然而，随着技术的进步和认识 的深入，高浓度的定义及其内涵也不断发生着变化。t h o m a s 报道，在2 0 酿酒酵母能 够完全发酵含3 8 3 9 可溶性固形物的小麦糖化液，可以产生超过2 1 的酒精。但是 也有学者认为在工业发酵中，由于存在酵母存活率、缓慢发酵和发酵停止等问题，因而 碳水化合物的浓度超过1 8 是不可行的【8 ，2 2 。0 1 。 采用高浓度发酵技术具有明显的优势【3 1 3 2 1 ，由于去除了不溶性物质，增加了发酵罐 的工作体积；玉米调浆用水量减少，最终得到的酒精清液数量大幅减少，而且除去大部 分用于调浆外，剩余部分将是很少，后续处理可减少蒸发设备投入和能源消耗，因此用 水量和能源消耗大幅降低；抑制生产过程中杂菌的生长和繁殖，减少清洗剂和杀菌剂的 使用。但是，采用高浓度发酵技术生产酒精的弊端也不容忽视。高浓度发酵的时间较长， 有时不能发酵完全，主要是由于产物抑制、高渗透压和营养不足等原因【2 0 】。当糖类浓度 大于2 7 0 l 时，酒精发酵异常缓慢，且残糖很高，主要是由于高浓度的糖类导致渗透 压增加，而渗透压对酵母的生长和代谢不利。 一般在工业条件下，糖浓度不超过2 0 ( i i l v ) ，因为逐渐增加的酒精浓度会阻碍 酵母的生长而使发酵停止。酵母生长的临界酒精浓度受到多种因素的影响，t h o m a s 峰2 1 2 2 ，2 5 - 2 8 1 ，j o n e s 【2 4 ，3 1 3 3 】和v 如u d e n 【3 4 】都做了详细的阐述。 章克昌等【3 5 】在1 9 9 7 年的专利中描述了种带渣浓醪发酵生产酒精技术，最终浓度 达到1 3 1 6 ，淀粉利用率9 0 以上，发酵时间5 0h 以内。黄宇彤等【3 6 】研究了添加 t w e e n 8 0 和麦角甾醇的高浓度酒精发酵，最终酒精浓度达到1 5 3 2 。在菌种筛选方面， 国内也做了一定尝试1 37 1 。 1 3 2 连续发酵 间歇发酵( 分批发酵) 的全过程在一个发酵罐中进行。发酵初始阶段糖分最高，随 着发酵过程的进行，糖分不断下降，发酵醪中酒精浓度不断增高，使酵母菌在发酵过程 中对环境的变化要不断适应，常常是菌体刚适应环境，发酵即结束了，这会导致酵母菌 群的实际损失很大。而连续发酵是一个和间歇发酵相对的概念。连续发酵过程的实现是 生物化学工程等多学科发展与结合的结果，连续发酵的优点如下【3 列： ( 1 ) 设备运行稳定并提高设备利用率。采用连续发酵法生产酒精，使设备始终处 于发酵运行状态，极大地减少了发酵辅助时间。同时，连续发酵时，醪液进入主发酵罐 即进入主发酵期，可提高设备利用率2 0 以上。 3 江南人学博l j 学位论文 ( 2 ) 提高底物的酒精产率。连续发酵无菌条件要求高，能够有效控制杂菌。发酵 醪液始终处于流动状态，使酵母菌与醪液充分接触，而且可及时排除发酵过程中产生的 c 0 2 ，从而增强菌体的发酵作用，提高底物的酒精产率。 ( 3 ) 不需要连续酒母扩培工序。工业生产中，连续发酵工艺可间隔2 0 天甚至1 8 0 天才接种一次酵母菌，而间歇发酵每天都要扩培菌种。虽然目前多数酒精企业在连续发 酵的实际操作中要补加一定比例的酵母菌，但与间歇发酵的扩培差别很大。 ( 4 ) 有利于实现自动化。在大型酒精发酵系统中，温度控制、定时定量加入糖化 醪循环、补加酵母菌菌液、添加营养液等均容易实现计算机控制。目前以玉米为代表的 谷物原料生产酒精的企业，其粉碎、液化、糖化及多塔多效蒸馏工艺中物料的进出、发 酵罐的液位、冷却水的用量等都已实现自动化控制，这为连续生产。连续发酵的稳定性 提供了保障。 目前，燃料酒精工业生产中所采用的发酵工艺，以连续发酵为主。而在实验室规模 的研究中，连续发酵多以结合细胞固定化包括载体固定化细胞【3 9 】和无载体细胞固定化 【4 0 啦】等技术一起进行，以及连续发酵和蒸馏【4 3 1 、细胞回用m 4 5 1 、废液全循环【4 6 】等研究方 法相耦合。 1 3 3 细胞固定化 在酒精发酵结束时，收集细胞并把细胞回用至下一批次的发酵中，省却种子扩培的 工序，节约了原料、用水、能源等一系列的生产成本。按照收集细胞方法的不同，可以 分为离心分离细胞回用分批发酵和固定化细胞回用分批发酵。离心分离是传统的分离细 胞方法，但在细胞回用的发酵工艺中，研究得较多的是固定化细胞回用技术，包括载体 固定化细胞回用技术及无载体固定化细胞回用技术。 1 3 3 1 载体固定化细胞 通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程成为细胞固定 化。固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。固定化 的方法主要包括吸附法和包埋法两大类【4 7 ，4 8 1 。用于固定化细胞的载体主要有硅藻土、多 孔陶瓷、中空纤维、琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联 树脂等。 n 旬a 邱o u r 等【”】用海藻酸钙固定化酿酒酵母细胞生产酒精，酒精产率达到2 8 鲋h ， 分批发酵酒精的最大产量提高近1 0 倍。t a k 锄i t s u 等【4 9 】在固定化反应器中用z m d 6 f 凰发酵 产酒精，产量翻了一番。嘲a d a 等【5 0 】把z 彤d 6 z 凰重组菌固定化，则糖浓度可以提高到 1 2 1 5 。g o g o i 等【5 1 采用琼脂固定化酵母细胞进行酒精发酵生产，以d 葡萄糖为底物， 当底物浓度为2 3 8 l 时，最大酒精浓度可达9 6 l 。s z 旬撕等【5 2 】用纤维素颗粒固定化酿 酒酵母，在流化床反应器中进行连续酒精发酵，平均生产强度可达3 9 4 鲫h ，平均酒精 浓度4 1 9 班。y uj 等【5 3 】用高梁渣固定酿酒酵母细胞生产酒精，糖转化率达到4 9 g ，酒 精产率达到5 7 2 朗h ，比未经固定化细胞的酒精产率高出2 2 4 倍。 4 第一章绪论 传统的固定化细胞技术均使用各种载体材料实现细胞固定化，载体材料的使用随之 带来了许多细胞生理、生态、工艺、工程和经济方面的问题。因此，载体固定化细胞技 术虽然已有近四十年的研究历史，真正实现大规模工业化应用成功的实例却不多。 1 3 3 2 无载体细胞固定化 人们早己发现，某些微生物细胞具有自絮凝( s e l f f l o c c u l a t i n g ) 的能力1 5 引，利用 这种细胞自絮凝形成的颗粒作为一种固定化细胞的方法，是固定化细胞技术中全新的概 念，与各种载体固定化细胞技术相比，细胞的固定化方法非常简单，不产生细胞固定化 过程的附加成本。具有自身絮凝能力的菌株有三种来源：菌株的遗传背景决定的自然絮 凝能力，利用原生质体融合技术获得自絮凝酵母，及应用基因操作技术获得絮凝重组酵 母。 马悦等【4 0 】对一株具有强絮凝能力的粟酒裂殖酵母变异株( 五忍d s 口c 口加，妒嚣 p d m 6 力在悬浮床生物反应器内进行了以木薯淀粉糖化液为发酵底物的酒精清液一级和 二级连续发酵研究，结果表明，二级连续发酵系统可明显改善一级系统的不足，并取得 了平均流加糖液浓度1 5 0 l ，发酵强度为9 7 1h ，流出液酒精浓度7 2 7 l ，残糖浓 度3 。7 4 l ，总糖利用率达9 0 。 靳艳等【5 5 】分别以酒精发酵性能优良但不具有自絮凝能力的酿酒酵母 ( c c 加加伦劣c e 删西f 口e ) 变异株和具有强自絮凝能力但酒精发酵性能较差的粟酒裂 殖酵母( 五拓叩口c c 矗以加聊) ，c 甜p d m 6 e ) 变异株为亲株，选育出了性能稳定，既具有优良酒精 发酵能力又具有强自絮凝能力的融合酵母菌株。利用该絮凝颗粒酵母进行酒精连续发 酵，其发酵工艺要求原料中的纤维质残渣在糖化后过滤去除，发酵过程为清液发酵，而 且酵母细胞在生物反应器中实现了固定化，故酒精精馏废液能够以较大的比例甚至“全循 环”直接拌料使用【5 6 1 。这样既解决了废液污染问题，又节省了工艺过程用水，同时废液 中残留的少量可发酵性糖富集后还可以继续利用。这为从发酵工艺本身解决酒精发酵面 临的重大环境污染问题提供了重要的研究思路。 应用这株自絮凝颗粒酵母进行酒精连续发酵，取得了一系列令人瞩目的研究成果【4 5 ， 4 6 ，5 6 。6 1 1 。刘传斌等【5 7 】在四釜串联气升环流悬浮床生物反应器系统中，进行了絮凝颗粒酵 母酒精连续发酵的研究。以c 0 2 为驱动动力，发酵液液蒸馏废液全循环，稀释率为o 2 m 。 发酵成熟醑酒精平均浓度为9 6 6 l ，残余还原糖和总糖分别为1 2 l 和4 1 l 。徐铁 军等【5 8 】建立了一套由四级磁力搅拌发酵罐串联组成、总有效容积4 0 0 0m l 的小型组合生 物反应器系统，以脱胚脱皮玉米粉双酶法制备的糖化液为种子培养基和发酵底物，进行 了自絮凝颗粒酵母酒精连续发酵的研究。在稀释速率为o 0 3 3 m 时，计算发酵系统酒精的设 备生产强度指标为3 3 2 鲫h ，与游离酵母细胞传统酒精发酵工艺相比，增加约1 倍。王 博等【4 5 】模拟现有酒精发酵行业普遍采用的多级发酵罐串联系统，建立了一套由三级串联 操作的搅拌式发酵罐和两个沉降罐组成的反应器系统，以脱胚脱皮玉米粉双酶法制备的 糖化液为发酵底物。实验结果表明：活化处理对改善发酵工艺技术指标方面发挥了显著的 5 南大学博学位论i 作用，发酵终点酒精浓度达到l o l l ，还原糖和残总糖分别在32 班和77g ，l 左右发酵 系统的设备生产强度指标为57 7 l h ，与无酵母回用的搅拌式反应器系统中自絮凝颗粒 酵母酒精发酵