（发酵工程专业论文）海藻糖合酶高产菌株的选育及酶学特性研究.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 海藻糖作为一种非特异性的保护剂，它具有对生物大分子和生物体组织非特 异性的保护作用，从而在分子生物学、医学、食品工业、化妆品工业、农业等领 域有着广阔的应用前景，但由于其制取上的困难限制了它的广泛应用。目前海藻 糖有多种制取方法，而酶转化法被认为是一种最有前途的海藻糖生产方法。本研 究立足于利用海藻糖合酶酶法合成海藻糖，研究内容包括产海藻糖合酶菌株的选 育及其培养特性的研究，海藻糖合酶的提取和纯化、酶学特性的研究，海藻糖的 提取等。 通过高温、高渗等条件从自然界筛选到一株产海藻糖合酶活性较高的菌株 n o 6 2 ，并以其为出发菌株，通过物理和化学诱变方法，得到一株优良的诱变株 p 2 3 3 7 作为本实验的生产菌株。并对其形态特征及生理、生化特性的研究。通过 正交实验及响应面法优化确定了其产酶最佳诱导培养基的组成及培养条件，在此 优化条件下对菌株进行培养，所得酶活力为4 8 8 2 u g 湿菌体，比原始条件下的酶活 力( 3 6 7 5 u g 湿菌体) 提高了3 2 9 3 。 海藻糖合酶属于胞内酶，必须将细胞破碎使其释放到发酵液中。本实验确定 了脂溶法( 甲苯破碎法) 为破碎方法，得到最优的破碎处理条件：甲苯浓度2 、 破壁温度3 5 c 、料液比1 ：2 0 和1 5 0 r m i n 搅拌条件下反应2 5 h 。粗酶液经过s e p h a d e x g 7 5 和s e p h a d e x g 2 0 0 凝胶过滤柱，通过s d s p a g e 电泳验证其纯度，得到两条亚基 带，并测定它们的分子量分别为5 5 k d a 和5 0 k d a ，并对其酶学特性进行了研究。 以米氏方程为基础，求得海藻糖合酶的固有参数米氏常数k m 为8 x 1 0 4 m o l l ， 最大反应速度v m 为3 2 4 x 1 0 。5m o l ( l s ) 。 本文还对实验所得的海藻糖粗液进行了分离纯化。将海藻糖粗液进行酸解， 使麦芽糖分解成单糖，海藻糖保留率达9 1 9 ；而后采用活性炭柱分离，用去离子 水和5 乙醇分级洗脱，可将单糖、麦芽糖和海藻糖分开，然后通过离子交换等步 骤提取出海藻糖，其结晶纯度为9 7 5 。另外，通过旋光仪、傅立叶红外光谱仪等 测试手段，最终可以确认海藻糖合成酶将麦芽糖转化0 【，0 【型海藻糖。 关键词：海藻糖：麦芽糖；海藻糖合成酶：菌株选育；纯化 摘要 a bs t r a c t t r e h a l o s e ( a d g l u c o p y r a n o s y l 一理一d - g l u c o p y r a n o s i d e ) e x i s t s i nn a t u r e w i d e l y ， e s p e c i a l l yl o w e rp l a n t s ，a l g a ，b a c t e r i a ，f u n g i ，y e a s t s ，i n s e c t s ，a n di n v e r t e b r a t e s b e c a u s e t r e h a l o s ee x h i b i tn o ns p e c i a l i z e dp r o t e c t i v ea c t i o na g a i n s td a m a g eo fb i o l o g i cm o l e c u l e ， i tc o u l db ew i d e l yu s e di nm o l e c u l a rb i o l o g y ，p h a r m a c e u t i c a l s ，f o o d s t u f f , c o s m e t i ca n d a g r i c u l t u r ee t c t r e h a l o s e su s e sa r er e s t r i c t e dd u et ot h ed i f f i c u l t yi np r o d u c t i o n a t p r e s e n t ，t h e r ea r em a n yw a y st op r o d u c et r e h a l o s e ，b u tt h ee n z y m em e t h o di sr e g a r d e d a st h em o s tp r o m i s i n go n e t h i ss t u d ym a i n l yd i s c u s s e dt h es y n t h e s i so ft r e h a l o s eb y t r e h a l o s es y n t h a s e t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t si n c l u d et h es c r e e no fas t r a i np r o d u c i n g t r e h a l o s es y n t h a s e ，t h e i n v e s t i g a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n ，t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n o ft r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m ea n ds e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft r e h a l o s e a s t r a i n , n o 6 2 ，p r o d u c i n gt r e h a l o s es y n t h a s eh i g h l yw a ss c r e e n e du s i n gi m p r o v e d m e t h o da c c o r d i n gt ot h ei n t e r a c t i o no ft r e h a l o s ew i t hh i g ht e m p e r a t u r ea n di n f i l t r a t i o n b a s e do nn o 6 2 ，w es c r e e n e da n dg o tt h ep - 2 3 - 3 7s t r a i nt h a tw a st r e a t e dw i t h u l t r a v i o l e ti n d u c e m e n t t h es t r a i n 7 sm o d a l i t ya n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e ra r er e s e a r c h e d u s i n go r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n dr e s p o n ds u r f a c ea n a l y s i s ( r s a ) t oo p t i m i z et h e c o n s t i t u t ea n dc u l t u r ec o n d i t i o no fi n d u c e m e n tc u l t u r em e d i u mw h i c hi sm o s ta d a p tt o p r o d u c ee n z y m e ，t h e nw ec u l t u r eb a c i l l u su n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n w ec a r lf i n dt h a t t h eh a r v e s to ft h ee n z y m ec o m eu pt o4 8 8 2 u gw e tt h a l l i t h ea c t i v i t yo ft h ee n z y m ei s 3 2 9 3 m o r et h a nt h a tu n d e ro r i g i n a l i t yc o n d i t i o n ( 3 6 7 5 u gw e tt h a l l i ) t r e h a l o s es y n t h a s ei sak i n do fi n t e r c e l l u l a re n z y m e ，s oc e l ld i s r u p t i o ni si m p o r t a n t f o rr e l e a s i n gi t t o l u e n ed i s r u p t i o nw a sc h o s e na so u re x p e r i m e n tm e t h o d t h eo p t i m a l d i s r u p t i o nc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：t o l u e n ed o s a g e2 ，t h a l l i a o l u e n e 2 1 ：2 0 ，3 5 c a n d15 0 r m i nf o r2 5 h t h ec r u d ee n z y m ew a s p u r i f i e db yu s i n gg e lf i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h yo fs e p h a d e x g 7 5a n ds e p h a d e x g 2 0 0 t h ee n z y m ea p p e a r e dt ob ea d i m m e rw h e nd e t e r m i n e d b y s d sp o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) t h e i rm o l e c u l a rw e i g h tw e r e5 5 k d aa n d5 0 k d ar e s p e c t i v e l y a n dt h e n w o r ko v e rt h ec h a r a c t e r i s t i co ft h ee n z y m e f o l l o w i n gm i c h a e l i s m e n t e nk i n e t i c sw eg e tt h ei n h e r e n tp a r a m e t e ro ft r e h a l o s e s y n t h a s ee n z y m e ，k mi s8 x1 0 4 m o l l ，v mi s3 2 4 x 1 0 一m o l ( l s ) t h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft r e h a l o s ew a sa l s or e s e a r c h e d t h em a l t o s et h a t e x i s t e di ne n z y m a t i cr e a c t i o nl i q u i dw a sh y d r o l y z e di n t og l u c o s eb ym a l t a s e ，w i t ht h e t r e h a l o s er e m a i n e d91 9 a n dt h e ng l u c o s ea n dt r e h a l o s ec a nb es e p a r a t e db y s u c c e s s i v ed i s p l a c e m e n tw i t hh 2 0a n d5 c h 3 c h 2 0 ht h r o u g hac h a r c o a lc o l u m n u 山东轻工业学院硕士学位论文 t r e h a l o s ew a sp u r i f i e db yi o n e x c h a n g ee t ca n dp u r i t yi s9 7 5 a tl a s tw ec a n a f f i r m e dt h a tt r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m ec a nt r a n s f o r mm a l t o s et oa , a - t r e h a l o s eb y i n f r a r e ds p e c t r o m e t r ye t cd e t e r m i n e dm e a n s k e y w o r d s ：t r e h a l o s e ；m a l t o s e ；t r e h a l o s es y n t h a s ee n z y m e ；s t r a i ns c r e e n i n g ； p u r i f i c a t i o n i i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名：j 蠡 导师签名： 隅4 年月午日 r 期：丑年上月互日 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 引言 第1 章绪论 海藻糖( t r e h a l o s e ) ，化学名甜d 吡喃葡萄糖基a - d 吡哺葡萄糖苷 ( a - d g l y c o p y r a n o s y l a - d - g l y c o p y r a n o s i d e ) ，是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟 基缩合而成的非还原性双糖。它的分子式为c 1 2 h 2 2 0 l l 2 h 2 0 ，相对分子量为 3 7 8 3 3 ，无水海藻糖的分子结构如图1 1 所示。 c h 2 0 h 海藻糖分子的h a r w o r t h 式 海藻糖分予的构象式 图1 1 海藻糖的分子结构 f i g u r e l 1m o l e c u l es t r u c t u r eo f t r e h a l o s e 1 8 3 2 年初w i g g e r s 从黑麦的麦角菌中首次分离出海藻糖结晶化合物【l 】。1 8 5 8 年，b e r t h e l o t 从一种海藻( t r e h a l am a n n a ) q b 分离到这种物质，于是定名为海藻糖 ( t h e h a l o s e ) 。海藻糖广泛存在于自然界中，如动植物及微生物中，尤其是在酵母、 霉菌以及蘑菇等真菌中其含量可达1 5 以上【2 】。海藻糖按糖的分子连结方式存在 着三种异构体，即0 【，0 【型海藻糖、0 c ，d 型新海藻糖( n e o t r e h a l o s e ) 和p ，d 。型异海 藻糖( i s o t r e h a l o s e ) 。目前研究较多的是天然存在的0 【，0 型海藻糖，它是天然双 糖中最稳定的糖类，只被具有特异性的海藻糖酶所分解。研究表明，某些物种对 外界恶劣环境，如干旱、高温、脱水、冷冻、高渗透压及毒性物质等，所表现出 来的抗逆耐受力与这些物种体内存在的海藻糖密切相关【3 l ，具有独特的不同于其 它碳水化合物的生物学特性，能在上述环境下保护生物体细胞蛋白质、脂肪、糖 第1 章绪论 类、核酸等组分不受损害，可保护d n a 防止放射线引起的损伤【4 】，外源性的海 藻糖也能对生物体及生物大分子有着良好的非特异性的保护作用【5 1 ，因而这使得 其有许多用途，如在医药和微生物学中作细胞防冻剂、诊断试剂和生物产品的稳 定剂、化妆品的有效成份、食品防腐剂、农业上培育抗旱作物等。随着其独特的 生物学性质及功能的发现，海藻糖逐渐成为国内外一大研究热点。 1 2 海藻糖的生物学特性及其功能 天然海藻糖在常温下是白色结晶，易溶于水、热乙醇，不溶于乙醚、丙酮， 无毒无害，无过敏性，具有甜味，在体内可被降解成葡萄糖而被利用。海藻糖的 基本性质如表1 1 【6 ，7 】所示。 表1 1 海藻糖的基本性质 t a b l e1 1b a s i cp r o p e r t yo f t r e h a l o s e 名称性质 a 熔点 c 1 2 h 2 2 0 l l 2 h 2 0 9 7 c c 1 2 h 2 2 0 l l 2 5 1 5 c b 熔解热c 1 2 h 2 2 0 n 2 h 2 0 5 7 8 k j m o l c 1 2 h 2 2 0 l l 5 3 4 k j m o l c 甜度相当于蔗糖的4 5 d 吸湿性 c 1 2 h 2 2 0 n 2 h 2 0r h _ 9 0 ，c 1 2 h 2 2 0 1 1r h 之3 0 有吸湿性 e 消化性在体内可经海藻糖酶分解消化吸收 溶解度 ( 1 0 0 9 水中海藻糖的重量曲 温度( ) 1 02 03 04 05 06 07 08 09 0 溶解度( 1 0 0 9 ) 5 5 36 6 98 6 31 0 9 11 4 0 11 8 4 12 5 1 43 6 5 96 0 3 饱和浓度( )3 5 64 0 84 6 35 2 25 8 36 4 87 1 57 8 58 5 8 g 渗透压 浓度( ) 51 02 03 0 渗透压( m o s m k g ) 19 32 9 85 9 012 2 9 h 稳定性 水溶液对p h 稳定。l 生( p h 3 5 - 1 0 ，i o o 。c ，2 4 h 0 9 9 以上残留 水溶液对热稳定性( 水中，12 0 。c ，9 0 m i n )不褐变 水溶液对热稳定性( 在含有氨基酸或蛋白质的沸水中，9 0 m i n ) 不褐变 水溶液长期保存稳定性( 3 7 c ，1 2 月)不分解，不褐变 海藻糖作为一种应激代谢物，能赋予低等动物、植物和微生物等抵抗营养缺乏、 高温、低温、干燥、高渗透压、有毒物质等恶劣环境的能力【8 一，它具有在严酷环境 2 山东轻工业学院硕士学位论文 下保护生物体的生物膜、脂质体、蛋白质、核酸等结构和功能的特殊功效，它使细 胞内保持湿润，防止细胞内各种养分的损失，从而让这些生物处于无水生活状态， 如在生产具有较高“耐贮性”的活性干酵母时，海藻糖含量在1 l ( 以固形物计) 以下的干酵母，其活性保存期短，不易贮存；海藻糖含量在1 2 至1 4 左右时， 其保存期间可延长4 6 个月；而当海藻糖含量超过1 6 时，其保存期可达1 2 个月 以上【10 1 。由此可见，海藻糖在保护生物体结构和功能上所起的决定性作用。 然而，使海藻糖引起关注的重要原因却是外源性的海藻糖同样对生物体和生 物大分子有良好的非特异性保护作用 h j 2 。科学家对保存条件苛刻的一些酶类、病 毒、疫苗、抗体和重组蛋白等在海藻糖存在的条件下干燥和复水后的功能性进行 了研究，结果令人振奋。黄成根等研究发现，在干燥条件下，海藻糖对测定血清 胆固醇的胆固醇氧化酶( c h o d ) 、胆固醇脂酶( c h e ) 、辣根过氧化物酶( p o d ) 等三种 诊断工具7 0 、5 5 和3 7 存放4 0 d 、1 5 0 d 和2 1 0 d 后，测定这三种酶的酶活力， 测定结果如表1 2 所示l l 引。 表1 2 三种酶在海藻糖溶液中干燥后的稳定性 t a b l e1 2t h es t a b i l i t yo ft h r e ek i n d so fe n z y m e sa f t e rd r y i n gi nt r a h a l o s ea q u a 注：酶保活率计算公式【1 3 1 ： 有海藻糖或无海藻糖 保活率c ，= 蒜麓飘 结果表明，在3 7 存放2 1 0 d 、5 5 存放1 5 0 d 、7 0 高温存放4 0 d 后其活性仍 可保持在9 0 以上，而未加海藻糖的这三种诊断工具酶在上述条件下其活性保持率 均在2 0 以下，加海藻糖保护的酶活力是不加保护的酶活力的4 5 倍，且这三种 诊断工具酶间无明显区别，说明在干燥过程中海藻糖对多种诊断工具酶具有明显 保护作用。 英国剑桥的q u a d r a n t 研究基金会把口服小儿麻痹症疫苗与海藻糖一起干燥， 发现在干燥状态下4 5 保存时其稳定性和液态4 c 保存时相当。这项研究的成功， 引出了新一代疫苗，从此人们不用担心口服小儿麻痹症疫苗从生产工厂到使用地 的贮存和运输危及产品活性的问题，极大地推动了于2 0 0 0 年在全世界范围内消灭 第l 章绪论 了小儿麻痹症。 1 3 海藻糖生物功能的作用机制 对于海藻糖生物功能的作用机制，科学家提出了种种假设，但还没有非常明 确的理论能解释。目前，主要有四种假说解释海藻糖能特异性稳定生物分子的机 制【1 4 1 7 】： 1 3 1 “水替代”假说 c r o w ej h 【1 8 】等根据在海藻糖存在的条件下干态磷脂和水态磷脂的物理性质 相似这一事实，提出了“水替代”假说来解释海藻糖对干态生物膜的保护作用。该 假说认为生物体中的蛋白质、糖、脂类和其它大分子物质周围都包围着一层水膜， 这层水膜对维持生物大分子的结构和功能是必不可少的，当生物大分子失去维持 其结构和功能特性的水膜时，海藻糖能在生物大分子的失水部位以氢键形式连接， 形成一层保护膜以代替失去的结构水膜【l9 1 。c r o w e 等对海藻糖对人生长素的保护 性研究和1 9 9 8 年o l i v e r 等指出在严重脱水期间海藻糖和磷脂的直接结合正是保持 机体完整性的重要原因也是支持该假说的例证【2 0 1 。 c r o w e 等认为一些糖和一些多羟基化合物的保护特性是由于糖结合大分子代 替了水化作用的水分子。这是一种理想的解释，遗憾的是很少有直接的证据支 持这一假说。而且，海藻糖与葡萄糖对限制性内切酶稳定性影响的显著差别就 与“水替代”假说不符【2 1 1 。 1 3 2 “玻璃态”假说 该假说认为在干燥生物活性物质时，通过海藻糖玻璃化转变的趋势，海藻糖 紧密地包住相邻近的分子，导致无定形连续相的形成，在结构上与玻璃态的冰相 似，这种非晶体结构的扩散系数很低且在这种结构中分子运动和分子变性反应非 常微弱【2 2 1 。 在干燥过程中，聚合和脂质相变是破坏膜结构的两个主要因素。海藻糖和其 它糖都能抑制干燥过程膜泡的聚合，但仅抑制膜泡的聚合不足以稳定干燥过程的 膜泡结构，还需要降低相变的温度，才能有效地稳定膜结构。而海藻糖水溶液在 室温干燥时，溶液的粘度会随着浓度的增加而加大，当浓度足够大且未出现糖的 结晶时，海藻糖水混合物就会玻璃化，此时海藻糖所处的状态称为玻璃态。1 9 8 9 年，g r e e n 等提出了海藻糖的高效力生物保护作用与它的玻璃态形成有关，糖类在 生化保护作用中效力的顺序由强到弱依次是海藻糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖，这 恰恰与它们玻璃态转化温度( t g ，物料由于外界作用如干燥、冷冻等，减少了体 系中的自由水，就有可能使物料成分由晶体胶质态转变为非晶态或无定性态的玻 璃态即玻璃态转变，这一转变点的温度就称为玻璃态转变温度) 由高到低的顺序 是一致的，海藻糖具有高t g 值常常被认为是它在生物保护作用中比其它糖类具有 4 山东轻丁业学院硕士学位论文 优越性的原因。 1 9 9 2 年c o l a c o 等发现生物大分子与海藻糖形成一种类似水晶状的玻璃体结 构，从而在干燥及冷冻时可得到有效地保护，这是“玻璃态”假说的有力证据。2 0 0 0 年杨小民等研究发现海藻糖的羟基同酶分子以氢键的形式结合，提高了酶的热变 性温度，提高了酶的热稳定性【2 3 】。另外，海藻糖分子包裹在酶分子周围或填充在 酶分子的空间结构内特别是酶的活性部位附近并形成玻璃态，将酶蛋白的空间结 构固定，从而避免酶的失活。但“玻璃态”假说也不能完全解释现有的实验现象如高 温下海藻糖对生物制品的稳定性问题。 1 3 3 “优先排阻”假说 t i m e s h e f f 等【2 4 】提出这一学说，用来解释溶液状态蛋白质的稳定作用。他们认 为海藻糖与其它一些小分子糖类不直接与蛋白质结构相互作用，而是优先与水结 合，使它们从蛋白质分子中的溶剂化层中排除出来，导致酶的溶剂化层半径减少， 蛋白质的表观体积减少，可移动性降低，蛋白质分子结构更趋紧密，构像更稳定， 从而抵御外界极端环境的影响。从热动力学角度讲，糖的加入使蛋白质和糖的化 学势增加，不稳定性增加，这样能够稳定蛋白质的天然构像。这一假说是建立在 几种假设基础上的。首先，加入稳定溶质，蛋白质去折叠的自由能变化增加；其 次，蛋白质的降解取决于热动力学稳定性；再次，变性状态的溶质排阻程度比 天然构像的高。最后，这一假说也可以衍生到冷冻过程，但前提是以上假设对“冷 冻浓缩”溶液仍然有效。 据报道，海藻糖的水化体积比蔗糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖大2 5 倍，因此， 分子排阻效应更明显，故蛋白质的优先排阻在较低的浓度下就能实现，导致比其 它双糖更强的稳定效果【2 5 。 1 3 4 “化学稳态”假说 海藻糖是最稳定的糖之一，它是完全非还原性的，它的糖苷键在糖类中活化 能最低，从而几乎不水解。这样，它在极端条件下也不会产生分解，从而与蛋白 质或肽作用的美拉德反应机会也大大降低了巾j 。 以上四种假说都可说明对某些生物大分子的保护作用，但到目前为止仍没有 更全面进一步阐明海藻糖对生物大分子的保护机理，这需要作更深入的研究。 1 4 海藻糖的分析方法 海藻糖含量的测定在海藻糖工业生产和应用研究中起到了相当重要的作用， 选用适当的测定方法将对生产者和研究者起到事半功倍的效果。现在应用的海藻 糖分析方法主要有纸层析法、薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱法、葸酮 比色法、酶法等方法。 5 第1 章绪论 1 4 1 纸层析法 纸层析法与近年来发展起来的亲和层析、等速电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法 来说是一种“古老”的方法。但由于操作简便，不需要特殊仪器设备，消耗样品量少， 所以这个方法在生物化学特别是在糖类的分析中仍得到广泛的应用。海藻糖分析的展 开系统较多，刘传斌等人 2 6 1 为分离酵母提取液中的海藻糖、糖原和葡萄糖，采用了正 丁醇：丙酮：水：醋酸= 1 0 ：6 ：6 ：2 系统为展开剂，显色剂系统有两部分组成：a 液为a g n 0 3 的水丙酮饱和溶液，水：丙酮= 1 ：2 0 0 ；b 液是将l g n a 0 h 晶体溶于l o o g 乙醇水溶液中 制得，其中乙醇：水= 1 ：1 。天津科技大学的王兰等【2 6 】建立了一套用纸层析法定量测量 胞内及发酵液内海藻糖的方法，展开剂为正丁醇：丙酮：水：醋酸= 1 0 ：3 ：6 ：2 ，洗脱剂为 o 1 m o l l 的h c l ，洗脱时间为1 6 小时，当点样量为4 0 岭1 0 0 “g 时，定量测定的吸光 度与海藻糖含量有一定的线性关系。 1 4 2 薄层层析法 薄层层析主要用于定性分析。其原理与纸层析相同，只是固定相材料不同。 对于分析性质、结构相似的双糖，如海藻糖、蔗糖、麦芽糖等，寻找合适的展开 和显色系统非常重要。毛忠贵等【2 8 】建立了一套有效分离海藻糖、蔗糖、麦芽糖的 系统，即薄层制板用硅胶磷酸二氢钠；展开体系为正丁醇吡啶水( 6 ：4 ：1 ) ；显色剂 为2 0 的硫酸甲醇溶液。该方法能灵敏地检测出上述几种混合糖溶液中含2 1 t g 以 上的海藻糖。此外，用于薄层层析分析海藻糖的系统有：展开剂为正丁醇：乙醇：水 = 2 ：1 ：1 ，显色剂为1 0 1 5 的硫酸溶液；展开剂为正丁醇：吡啶：水= 1 5 ：3 ：2 ，显色剂为 1 9 酚及5 m l 9 8 的浓硫酸溶于1 0 m l 9 5 的乙醇等。 用薄层层析法来对海藻糖进行定性分析则是十分便利的。 1 4 3 高效液相色谱法 高效液相色谱是在原有的液相柱层析基础上，引入了气相色谱的理论，并加 以改进和发展来的，是理想的高效、快速进行海藻糖定性定量分析的方法。它与 经典的柱层析主要不同之处在于应用了颗粒直径小的高效层析柱填充剂，以及随 之配用了高压输液泵、高灵敏度检测器和自动描记自动收集装置，从而使它在分 离速度上比起经典的液相柱层析要快数一百倍。不同的柱有不同的分离机制，通 常采用的色谱柱是氨基柱，检测装置为示差折光检测器。如采用进样量为5 p , l 、 2 5 0 x 4 6 m mn h 2 柱为色谱柱、乙腈：水= 7 ：3 为流动相、流速为1 m l m i n 、柱温为 室温、示差折光检测器( h p l 0 4 7 a ) 为检测器进行海藻糖定性定量分析。 此外，高效阴离子交换脉冲安培法【2 9 】在海藻糖的定量分析中的应用也有报 道。该方法属于高效液相色谱 3 0 1 的一种，它的基本原理是若将糖溶液的p h 提高 至1 2 1 4 ，中性糖类化合物的羟基会发生完全的或部分的解离而形成氧负离子，可 以进行阴离子交换。 6 山东轻工业学院硕士学位论文 1 4 4 气相色谱法 气相色谱也可以用于糖组分的分离与检测上，因为糖是不挥发性物质，所以， 必需制成相应的挥发性衍生物。气相色谱来分析糖类时，用得最多的挥发性化合 物是t m s ( 三甲基硅烷基) 衍生物 3 1 - 3 3 】。g l a e v e r 等用气相色谱对海藻糖进行了测 定，测定条件及步骤如下：h e 气为载气，注射器和检测器温度分别为2 5 0 和 3 0 0 ，柱温在1 9 0 保持2 m i n ，接着以3 0 m i n 的速率升至2 5 0 ，再在此温 度下保持1 0 m i n ，将海藻糖样品( 先经过冷冻干燥) 溶解于2 0 此的二甲基酰胺中， 然后再加2 0 此的二( 三甲基硅烷基) 三氟乙酰胺( 含1 三甲基氯硅烷) 进行三甲基 硅烷化。 还有报道用气质联用色谱【3 4 】和气液色谱3 5 1 及近红外反射光谱法【3 q 对海藻糖 进行定量检测。 1 4 5 蒽酮比色法 葸酮比色法是目前常用的定糖方法，其原理是糖类( 包括多糖) 在硫酸作用下脱 水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合产生蓝绿色 曲糠醛衍生物，颜色的深浅即可作为定量的依据。由于其它糖类与葱酮试剂也发 生显色反应，因此测量值偏大【j 川。 1 4 6 酶法 海藻糖的酶法测定是近年发展起来的一种测定方法，它的基本原理是通过海 藻糖酶对海藻糖的特异性水解，产生的葡萄糖再用葡萄糖氧化酶过氧化物酶系统 进行检测【3 8 , 3 9 】。海藻糖酶的来源是广泛的，即可以从兔的肾脏【4 0 1 中提取，也可以 从芽胞杆菌、酵母【4 l j 、藻类等微生物中提取。这种方法的优点在于不需要昂贵的 分析仪器，操作简便。但问题在于海藻糖酶的制备方法不同，所制备的海藻糖酶 种类不同，活力不同，都可能会对结果产生一定影响，而且分析成本也很高。 海藻糖的应用研究进展 1 9 9 5 年以前，海藻糖的应用因其价格昂贵仅限于医药及化妆品方面，但自从 日本等少数国家能以淀粉为原料，通过酶合成法大量生产，其价格大幅度下降， 开拓了更多的应用领域，而且随着其功能性质及作用机理的不断深入认识，其应 用前景必然更加广泛，作为天然生物保护剂，它的应用可能导致生物制品业的重 大变革，解决冷链带来的经济问题，具有很大的经济和社会效益。 1 5 1 海藻糖对生物制品的保存 目前，多数易失活生物制品，如血液制品( 血浆、血液球蛋白等) 、疫苗、菌苗、 单克隆抗体、载药脂质体等，往往采用冷冻干燥制备及低温保存。如果干燥这些 生物制品时添加海藻糖，不仅可以保存其较高的生物活性，而且能改善产品工艺 条件，使其能在常温下保存【4 2 1 。n i e l s e n 等【4 3 1 的科学实验证明，对保存条件要求苛 7 第1 章绪论 刻的细菌、病毒类疫苗、蛋c a ( 酶) 类、抗体等生物制剂在含有适量海藻糖的情况下， 均可在常温下保存而不失活，这对生物制剂有效期的延长应用创造了条件。近年 来，学者们对在干燥和冻融过程中海藻糖对生物制品的保护作用方面开展了大量 的研究，使海藻糖在这方面的应用范围也在不断拓宽，应用范围主要集中在菌体 及细胞、脂质体、活性蛋白质以及动物组织等活性的保护方面。 ( 1 ) 菌体及细胞 胞外海藻糖同胞内海藻糖一样起到对细胞的保护作用，研究人员以此为依据， 将海藻糖用于菌体细胞保藏，大大提高了细胞的存活率。海藻糖能稳定胞内蛋白 质、核酸等生物大分子的结构，很多生物体如酵母或细菌能在细胞内积聚海藻糖 以抵抗干燥、高温等不利于生存的条件。关于海藻糖对细菌细胞存活影响的研究 国外有很多报道，科学家们分别用甘油、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖和脱脂牛奶作 保护剂，冷冻干燥保藏h e l i c o b a c t e r p y l o n 、布鲁氏菌属细菌等微生物，表现出较高 的存活力，但效果最明显的是海藻糖和脱脂牛奶。郑从义等也报道了不同浓度的 蔗糖和海藻糖作为保护剂对盐生盐杆菌菌株冷冻干燥存活力的影响，结果表明， 两种糖在不同浓度水平( 海藻糖6 ，蔗糖1 8 ) 时的保护效果相似m 】。研究发现， 海藻糖对于一些具有外覆膜结构的生物活性材料，例如细胞如动物的生殖细胞、 胚胎细胞具有降低细胞膜内的张力，以避免受到冷冻伤害的作用。最近有报道认 为细胞中少量的海藻糖就可大幅度提高哺乳类动物细胞在冷冻和干燥情况下的存 活率【4 5 】。 除了微生物细胞和动物细胞外，也有外源海藻糖的加入有利于增强植物细胞 在冰冻和随后的冻融过程的生存率的报道【4 6 1 。例如，先将植物细胞用1 0 的海藻 糖溶液预处理，然后将其在悬浮在高浓度的海藻糖溶液。当海藻糖被用做抗冻保 护剂时，在细胞内外的海藻糖都起到稳定细胞膜的作用。 ( 2 ) 活性蛋白质类 活性蛋白质类，包括一些酶、抗体、疫苗、血液制品等，它们的分子中都含 有蛋白质的结构，并且直接影响其功能。活性蛋白质类物质都比较容易失活，保 存时需要很严格的条件。这类物质保存的应用研究很多，多采用真空冷冻干燥法 制备和低温下保存。研究表明，海藻糖能给它们的干燥和保存带来极大的方便。 例如某些酶类，在有海藻糖存在时，可在室温或3 7 。c 下经空气干燥后再在室温下 存放几年，生物活性仍不会发生明显变化。将其再水化后能完全恢复其生物活性。 r o s s is 等【4 5 】把限制性内切酶与一些成玻载体或高聚物溶液一起真空干燥后，考察 了它们的稳定性，发现在所有在试的溶质中，海藻糖和蔗糖是最有效的。它们可 使这些限制性内切酶在3 7 贮存至少2 0 d 而无活力损失，在4 5 贮存至少1 2 d 。 c o l a c o 等1 4 7 1 研究- j d n a 限制性内切酶、d n a 连接酶和d n a 聚合酶等工具酶在海藻 糖溶液中于室温下干燥与贮存的稳定性。这类分子生物学研究必需的酶试剂很容 8 山东轻工业学院硕士学位论文 易失活，通常在2 0 下贮存和运输。上述酶于适当缓冲液( 含海藻糖1 0 1 5 ) 中， 置于3 7 或室温下通风干燥，得到干燥酶试剂。干燥的酶于不同温度下贮存不同 的时间，然后检测其活性，并与制造商建议的冰冻贮存方法进行比较，结果发现， 凡未加海藻糖干燥的酶样，其活性完全丧失，所有加海藻糖干燥的酶样，其活性 均可恢复，其它试验过的限制性内切酶和海藻糖一同干燥时，同样可以恢复活性。 这样干燥的酶，甚至在7 0 。c 保存3 5 d 后，仍能精确地切断d n a ，在3 7 保存9 个月， 或在最适作用温度3 7 。c 与室温下各存放1 小时，交替9 6 次，仍无活性损失。而其它 种类的保护剂都起不到这样的保护效果。 英国剑桥q u a d r a n t 公司和世界卫生组织将合作，利用海藻糖干燥d , j l 麻痹疫 苗，以解决从生产地到第三世界国家的长途运输的冷冻问题。 m a u r o 等【58 】研究了海藻糖对酵母细胞质中的焦磷酸酶的保护，他们发现 l m o l l 的海藻糖或2 m o l l 的葡萄糖能够有效地削弱由于肌盐对焦磷酸酶带来的结 构和构象变化。 e s t e v e sm a r i ai z a b e l 等【4 9 】研究了海藻糖对免疫共轭物的稳定作用。以往经过冷 冻干燥，再水化和在4 0 。c 条件下培养9 , b 时后其残余活力为3 5 ，而加了海藻糖后， 在4 0 培养4 d 还能保持8 0 的活力。海藻糖保护的酶体系的高温稳定性在生物传感 器的应用上也具有良好的前景，s o d ek o j i 等 5 0 】研究了不同添加剂对冻干的吡咯喹 啉醌葡萄糖脱氢酶( p q q g d h ) 活力的影响，发现1 0 0 m m o l l 的海藻糖是最有效的， 冻干的p q q g d h 在8 0 。c 存放1 小时后仍有8 0 的活力存在，而在2 8 能存放一个多 月，没有明显的活力损失，这样就可以用作生物传感器成分；a p p l e t o n 等人利用海 藻糖稳定的固定化葡萄糖氧化酶体系显示了非常强的操作稳定性【5 。m a d h a v i 等【5 2 1 发现海藻糖能防止肌血球素的瓦解和保存其内在的运动性。他们认为海藻糖是通 过防止蛋白质内部固有水分子的逃逸，保存了蛋白质内在的活力的。 杨小民等【5 3 】研究了几种糖对纤维素酶热稳定性的影响，发现在体系经过冷冻 干燥后，海藻糖无论在常温还是高温条件下，都有较好的保护作用。黄成根等【5 4 j 对海藻糖对胆固醇醋酶的常温干燥保护进行了研究，得到的结论是含0 1 5 0 2 0 m o l l 海藻糖的t r i s h c i 缓冲液，室温风干，酶的稳定性良好，3 7 放置六个月后， 用蒸馏水复溶后，其酶活力几乎无损失。而陈黎忠等【5 5 j 证实了海藻糖对人血清酶 在冻结状态也具有保活作用，其平均保活率是无海藻糖组的1 3 8 倍。 此外，海藻糖还被应用于质膜h + a t p a s e 、a - 淀粉酶、a - 葡萄糖苷酶、各类脱 氢酶、过氧化物酶等的保护上，取得了可喜的结果p 引。 ( 3 ) 脂质体 脂质体是一种人工制造的细胞样结构，可作为水溶性物质的载体，由脂双层 包围一个含水小室，水溶性物质可被封闭在脂质体内部。但脂质体不易长期贮存， 且在冷冻干燥时易发生融合并导致脂质体内容物的泄漏。也有报道说只要在脂质 9 第1 章绪论 体的内外都保持一定浓度的海藻糖溶液，则在冷冻干燥和再水化过程中，脂质体 膜就可以保持其结构的完整性【5 7 】。童桥等网的研究表明，当有足够数量的海藻糖 存在时，包载抗肿瘤药物阿糖胞昔及阿霉素的脂质体经真空干燥再水化后，其原 内容物保存率可达8 0 以上，远远大于无海藻糖处理时的保存率。海藻糖可使脂质 体处于一种干燥状态，而不损坏其结构的完整性，有利于脂质体的贮存、包装和 运输，有利于脂质体在制药工业中的应用。此外，在研究海藻糖的稳定作用机理 时，由于脂质体类似于细胞膜双脂层的结构，人们常常用它作为模型体系来研究 海藻糖和膜的相互作用。 ( 4 ) 组织及器官的保存 海藻糖亦被用于医学中的外科领域，用来保护皮肤、血液和器官等，为器官 移植和生殖工程等提供有力的保障。s a h a 等【5 9 】发现，将牛的胚胎置于有海藻糖的 和无海藻糖的溶液，之后再将胚胎保存在液氮中，等保存一段时间之后将胚胎解 冻，在一定的培养基中生长，检测其存活率，结果表明加入海藻糖的胚胎的存活 率明显增高。b e a t i eg i l l i a n 6 0 】等用海藻糖作为保护剂用于对人体胰腺小岛的低温储 存，发现9 2 能复原。h i r a t a 等【6 1 1 用海藻糖和其它物质一起成功地对狗肺进行了1 2 小时的保存，移植后经多次灌注仍显示有令人满意的充氧能力，他们认为海藻糖 在细胞膜周围形成一种稳定的环境，保护肺部内皮细胞不受损害。另外，在一个 切片组织保存的标准体系中，兔耳的皮组织被保存在各种用海藻糖( 7 ) 取代了同 浓度的葡萄糖的溶液中，将表皮的移植片接到另一个温度在4 c 分别存放2 4 ，4 8 和 7 2 d x 时，各溶液中被移植的表皮的存活率在4 c 和2 4 d 时的培育条件下没有变化。 但是，在经过4 8 d 时后，有海藻糖的溶液的总体嫁接存活率要大( 9 0 比6 0 ) 。在 7 2 d 时之后，这一数字就更加明显【6 2 1 。 1 5 2 海藻糖在食品工业上的应用 除以上活性材料的保护外，因为与其它糖类相比，海藻糖具有安全无毒、甜 味温和、可生物代谢、非龋齿性及可以遮盖异味的特性，此外因为它的非还原性， 它不易发生非酶褐变，具有很强的化学稳定性、酸稳定性和热稳定性，所有这些 特性使它在食品工业中有着广泛的应用前景。 ( 1 ) 海藻糖与食品相关的一些性质 甜味温和同1 0 的蔗糖溶液相比，海藻糖的甜度为蔗糖的4 5 。海藻糖的甜 味来得快，甜味持续时间比蔗糖要稍长一些。温和的甜味使食品体系中的其它风 味得以增强。 非还原性海藻糖是一种非还原性双糖，因此它不容易与氨基酸或蛋白质发 生美拉