（发酵工程专业论文）生物转化制备人参皂苷ck的研究.pdf

7 j l 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：生物建丝劐釜厶叁皇萱鲢的研究 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文 的规定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的 复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制 手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内 容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 是) ，保密期至溯矿年岁月o 日为止。 学生签名：圭垄导师签名：三触、 2 0 0 8 年3 月 摘偻 摘要 本论文埘能转化生成人参皂：舒c o m p o u n d k ( c - k ) 的酶的性质进行了研究，并对 人参皂苷c - k 进行分离纯化。在本论文中，分别对细菌和真菌两种微生物进行发酵培 养，提取出两种来源不同的酶，进而采川微生物酶转化法，通过改变人参二醇类皂苷 ( p p d ) 来转化生成人参皂苷c - k ，并用高效液相色谱对其纯度进行确认。 细菌m i c r o b a c t e r i u ms p g s 5 1 4 所产酶对r b l 等人参二醇类皂苷( p p d ) 降解过程 是p p d r 9 3 一r h 2 ，真菌s p g 1 8 所生成的酶与m i c r o b a c t e r i u ms p g s 5 1 4 菌不同，对 p p d 人参t 皂：f j ：降解途径为p p d f 2 一c k 。刚此，本论文采用真菌所产酶与p p d 作用获 得c k 。 真菌s p 9 4 8 菌酶经过d e a e c e ll u l o s e 离子交换层析柱分离后，经s d s 一聚丙烯酰 胺凝胶电泳测定酶分子量为7 7 k d a ，不同于前届研究生郑常龙从s p 8 4 8 菌酶分子量8 2 k d a 。最佳酶反应时间为2 2 h ，最适温度为4 5 ”c ，最适p h 值5 0 。其纯酶对于人参二醇 类皂苷i i ) l 、r b 2 、r c 、r d 、f 2 等单体降解能力强，说明该酶为多种糖苷水解酶；但是 对人参皂舒r b l 、r d 和f 2 可较大程度转化为人参皂苷c k ，而该酶对于人参皂苷r c ， 转化生成人参皂二舒c - k 的程度较小。 通过大量实验，人参二醇类皂苷与微生物产生酶反应后经过a b 一8 大孔吸附树脂处 理得到c - k 卡f l 品，进而用硅胶柱分离得到部分纯品c - k 和纯度为7 0 8 0 左右的c k ， 其c - k 的提纯方法有待于提高。 关键词：人参皂苷c k ：硅胶柱层析；高效液相色谱；真菌 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e ri st os t u d yt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h eg i n s e n o s i d a s ew h i c h c a nh y d r o l y z eg i n s e n o s i d et h ep r o t o p a n a x a d i o l t y p es a p o n i n ( p p d ) t og i n s e n o s i d e c o m p o u n dk ( c k ) ，a n dt oi s o l a t ea n dp u r i f yg i n s e n o s i d ec k i nt h i sp a p e r , t w od i f f e r e n t e n z y m e sa r eg o tf r o mb a c t e r i u ma n df u n g is e p a r a t e l y ，a n dt h e nt h ep r o t o p a n a x a d i o lt y p e s a p o n i n ( p p d ) i sr e a c t e da st h es u b s t r a t ew i t h t h et w od i f f e r e n te n z y m e st o p r o d u c e g i n s e n o s i d ec - k t h ep u r i t yo f t h eg i n s e n o s i d ec - k w a se x a m i n e db yt h em e t h o do fh p l c t h ee n z y m ei s o l a t e df r o mm i c r o b a c t e r i u ms p g s 514h y d r o l y z e sg i n s e n o s i d ep p dt o r h 2 ，t h ei n t e r m e d i a t ep r o d u c t i o ni sg i n s e n o s i d er 9 3 h o w e v e r , t h ee n z y m ei s o l a t e df r o m a r b i a b s p 4 8h y d r o l y z e sg i n s e n o s i d e p p dt o c k ，t h e i n t e r m e d i a t e p r o d u c t i o n i s g i n s e n o s i d ef 2 i n t h i s p a p e r , t h e c h a r a c t e r i z a t i o no ft h et w od i f f e r e n te n z y m e s ，t h e o p t i m u m c o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t e ，t h ec h o i c eo fd i f f e r e n tm e d i u m ，t h eo p t i m u mc u l t u r et i m e ，t h e o p t i m u m c u l t u r ep h ，a n dt h eo p t i m u mc u l t u r et e m p e r a t u r ew e r es t u d i e d i nt h es t u d yo fg i n s e n o s i d a s ef r o mf u n g i ，t h ed i f f e r e n ts t r a i n ，t h ed i f f e r e n tm e d i u m ，t h e d if f e r e n ti n d u c e rw e r ec o m p a r e db ys t u d y i n gt h ea b i l i t yo fp r o d u c i n gg i n s e n o s i d a s ei no r d e r t oh y d r o l y z et h ep p da sm u c ha sp o s s i b l e t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eo p t i m u mi n d u c e ri s s o p h o r af l o w e ra n dt h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o ni sa t30 t h es t r a i ns p 4 8f e r m e n t b y7 - 8d a y s i no r d e rt og e tm o r eg i n s e n o s i d ec k ，t h ec o n d i t i o no ft h ee n z y m er e a c t i o nw a sa l s o s t u d i e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u mm e d i u mw a sw h e a tb r a n ：s o p h o r af l o w e r = 3 ：1 ， t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t ew a sl t h eo p t i m u mc u l t u r et i m eo fg i n s e n o s i d a s e w a s2 2 h r , t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ew a sa t4 5 ca n dt h eo p t i m u mp h5 0 t h ee n z y m ew a s p u r i f i e db ya c o l u m no fd e a e c e l l u l o s ea n dc h e c k e dt h ep u r i f i c a t i o na n dm o l e c u l a rw e i g h t w i t ht h em e t h o do fs d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，t h em o l e c u l a rw e i g h tw a s 7 7 k d a a f t e rm a n ye x p e r i m e n t s ，t h ec r u d ee n z y m e - r e a c t e dp r o d u c t i o nw e r es e p a r a t e db y a b s o r b i t i v er e s i n s ( a b - 8 ) ，a n dt h ec r u d eg i n s e n o s i d ec kw e r es e p a r a t e db yt h el o w e r 人b s t r a c t p r e s ss i l i c ag e l c o l u m nt oo b t a i nt h e6 7 4 910 0 p u r eg i n s e n o s i d ec _ - ka n d10 97 0 - 8 0 p u r eg i n s e n o s i d ec k k e yw o r d s ：g i n s e n o s i d ec - k ：s i li c ag e ic o lu m n ：h i g hp e r f o r m a n c eii q u i d c h r o m a t o g r a m ：l u n g i 目录 第一章文献综述1 1 1 人参的分自i 、生长环境、形念、分类、及化学成分1 1 1 1 人参的分御、生长环境及形态1 1 1 - 2 人参的分类2 1 1 3 人参的化学成分3 1 2 人参皂苷的性质及命名4 1 2 1 苷类4 1 2 2 萜类( t e r p e n o i d s ) 4 1 2 3 皂菅( s a p o n in s ) 4 1 3 人参t 皂苷的化学结构特点及理化性质5 1 3 1 人参皂苷的化学结构5 1 3 2 人参皂苷的理化性质7 1 3 2 1 皂：舒的外观及溶解性7 1 3 2 2 皂苷的水解性8 1 4 人参皂： j ：的约理作用8 1 4 1 人参皂：酯：的肿j 留抑制作用8 。 1 4 2 人参皂苷的增憾免疫力作用9 1 4 3 人参皂：舒的抗疲劳作j f j l o 1 4 4j d , i , t 人参皂苷的约里卫活性1 0 1 5 改变人参皂州f - i 的糖摧| i j 提商其活性方而的研究1l 1 5 1 化学法改变电f r 糖坫：l l 1 5 2 酶法改变皂苷糖毖提高j t ：7 甜k l l 1 6 人参皂： ：的分离及分析方法12 1 6 1 常见的挺取j 纯化方法1 2 1 6 2 人参皂： j ：酸催化水解及酶解转化；1 2 1 6 3 人参皂苷分离及分析方法1 3 1 6 4 人参t 乜二莳结构洲定方法1 4 l l ? 止 1 7 人参皂苷结构改造方面的研究进腱1 4 1 7 1 人参皂二旨的化学水解和转化研究进腱1 5 1 8 本论文主要研究内容1 6 第二章实验材料与方法17 2 1 实验材料1 7 2 2 实验方法1 7 2 2 1 人参皂苷糖m 牌的分离纯化1 7 2 2 2 人参皂苷糖f 1 ：i 酶纯度及分予挝的测定1 8 2 2 3 酶反应的最适条件的确定2 0 2 2 4 酶法p p d 转化为人参皂：凸：酶c - k 2 0 2 2 5 产物的分离2 l 2 2 6 人参皂：舒c - k 的分离2 l 2 2 7 高效液棚色谱检测2 2 第三章结果与讨论2 3 3 1 产酶菌f i j 帅a - “- 选以及培养 l ：i f j 确定2 3 3 2 酶蛋i ，j 的分离提纯2 6 3 。2 1 i ) e a e 一纤维素枉分i | ：5 2 6 3 2 2 酶的纯度及其分子鼍2 9 3 3 生成c k 酶的性质3 0 3 3 1 刈r b l ，r b 2 ，r c ，r d ，1 ：2 等人参二醇类不同单体皂苷糖基的水解3 0 3 3 2 最通酶反应条件的确定3 2 3 4 从人参二舀窖类皂曲：p p d 大量制备人参皂断c - k 3 4 3 4 1 酶反应制备c - k 3 4 3 4 2 大孔树脂的分离除杂3 5 3 4 3 人参皂苷c k 的分离与提纯3 6 第四章结论。3 9 参考文献j 4 0 致谢：4 3 v 第4 幸艾献综述 第一章文献综述 人参是一种名贵药材，作为一科t 高档滋补珍品已有几千年的历史。人参在我国医 药史一i ：居于独特的地位，占有光辉的一页。古代关于人参的文字记载最早可追溯到春 秋战 咖寸代范蠡所著计然一书( 约成二】二公元自订1 8 0 年) ，该二”已有“人参出上党，状 类人形者善”的描述。我国历史上第一部药学典籍神农本草经一书详细介绍 了人参有“补血脏、安精神、定魂魄、止惊悸、除邪气、明目开心益智，久服轻身延年” 的功效。李时珍在他的历史性巨作本草纲目中，更是赋予了人参重要的药用地 位。人参的主要活性成分是人参皂苷，目f j 已分离并鉴定的人参皂苷达6 0 余种，各种 人参皂：许都有其独特的生理活性。大量研究结果表明：人参皂苷具有抗疲劳调节中枢神 经系统、延缓衰老、改善心脑血管供血不足、提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长等 作用。人参起源于中国，韩国与r l 本对人参进行了大量研究，近几年欧美等国家也加 快了埘人参的研究步伐。 1 1 人参的分布、生长环境、形态、分类、及化学成分 1 1 1 人参的分布、生长环境及形态 人参大部分分析i 于北荚、【1 | 业和东亚。主要分佰国家集巾于中国、俄罗斯、韩国。 我国野，l 人参分斫j 在吉林、辽宁、黑龙江及河北北部的山地。人参在开本、朝鲜也有 千年以上的历史，朝鲜的东医宝鉴以及r i 本的江户时代吉益东洞( 1 7 0 2 1 7 7 3 ) 的 药徽对人参的功能、主治、川法用量及方剂等，都有着非常详尽的记载心。1 2 7 4 年意人利旅行家马i i j 波罗就将我团东北产人参介绍给欧洲，但并未引起重视。至十七 世纪，塞姆德阿尔沃龙从商人的讲述中了解了人参，并向欧洲介绍了人参，1 6 9 7 年 鲍德伦在法旧科学院宵读了介绍人参的报告，至此，欧洲人j j 逐渐了解人参及其应用。 十七世纪后- i x t ，人参又脓居中固的俄国人传到俄固。然而，人参的植物学名却长 期没仃户：尘。1 8 4 2 年，俄刚牛i l f 物学家c a m e y e r 将生长在洲的高丽人参定名为p a n a x g in g s e n g 。1 9 3 5 年，瑞舆机物学家林奈( c l i n n e ) 创电人参属p a n a x ，人参山植物血 ) j i l 科( a r a lja c e a e ) l l 得一个属，p a n a x 起源于希腊字p a n ( 全面) 和a c o s ( 药物) ， 第一章文献综述 即“全面的药物”，“万灵药”之意。他为美洲产的人参定名为p a n a xq u i n g u e f o l i u ml ， 而没有为我国人参定名。 人参为多年生草本，人参生于红松为主的针阔混交材或杂木林下，分布区气候平 均气温在一l o 1 0 之间，年降雨量为5 0 0 - - 1 0 0 0 毫升；土壤为棕色森林土或山地灰 化棕色森林土。 人参高3 0 - 6 0c - n l ，根茎细长( 野生品) 或短粗光滑。叶的形态、数目随生长年龄 有一定的变化；一年生一枚三出复叶，俗称“三花 ；二年生一枚掌状复叶，俗称“巴 掌”；三年生二枚复叶，称“二甲子”；以后随年龄增加叶数，三复叶称“灯台子”；四 复叶称“四匹叶”；五复叶称“五匹叶”；一般到“六匹叶 ，即使年龄增加，叶数通常 也不增加。人参根粗壮肥厚，纺锤形。有较短地下根茎地上茎直立，不分枝，茎顶集 生叶数枚。叶具长柄，掌状复叶，小叶3 - 5 枚，中间小叶最长，侧小叶较小。小叶披 针状卵形，叶缘具细锯齿。伞形花序生茎顶，花小，淡黄绿色。花后结二枚核果，扁 球形，成熟时红色。 1 1 2 人参的分类 目前，人参的分类大体上可以分为以下十种口3 ： 2 第一章爻献综述 1 p a n a xg i n s e n gc a m a y e r 高丽人参，韩国、中国、俄国及f 1 本栽培和自生。 2 pq u i n g u e f o l u s l 美圈参( 西洋参或花旗参) ，加拿大、美国栽培。 3 p j a p a n i c u sca m a y e rr 本竹节人参，同本自生。 4 p a n a xn o t o g i n s e n ge h c h e n 三七参，又称阳七或参三七。生长在我国云南广西 等地。 5 pt r i f o l i u sl 美国假参( 闪耀之参) ，加拿大、美国栽培。 6 pp s e u d o n g i n s e n gv a r a n g u s t i f o l u sb u r k 央叶竹节参，中国南方自生。 7 pp s e u d o n g i n g s e n gv a rm a j o rb u r k 珠子参，中国南方自生。 8 尸p s e a d o n g i n s e n gv a rz i n g b r t m s i scrw v e t k 膨f e n g 姜状三七参，中国南方自 生。 9 尸p s e u d o n g i n s e n gr a rb i p i n n a t i f i d u ss e e n 花叶三七参，中国南方、印度北方自生。 1 0 e s p u l e a n a t u ss e e m 白三七参，中国南方自生。 其中f j 玎四种人参总类具有较高的商业丌发价值。 1 1 3 人参的化学成分 经研究表明人参的化学成分比较复杂，其主要有效成分是人参皂：符，它具有人参 的主要牛理活性，含量约4 - - 7 。人参中除含人参皂苷外，还含有多糖、b 醉、胡萝 卜醇( d a u c o s t e r 0 1 ) 、麦芽酚( m a l t 0 1 ) 、人参炔醇( p a n a x y n 0 1 ) 、人参环氧炔醇( p a n a x y d 0 1 ) 、 人参炔( g i n s e n g n e ) 及有机酸、挥发油、脂肪酸、肽类、维生素、氨基酸等多种有效 成分。人参所含挥发油的化学成分有倍半萜类、长链饱和羧酸和少量芳烃类。半萜类 是挥发油的主要成分。此外，红参中还含有焦谷氨酸等。对于人参皂苷的研究，若以 1 8 5 4 年g a r r i g u e s 由西洋参中分离的道德人参奎酮( p a n a q u i l o n ，c 3 5 h 5 6 0 1 4 ) 算起，至今 已有百余年的历史。在本世纪6 0 年代以前，人参的研究进展缓慢，人们只能根据直觉、 直观的j l j t 析进行研究，称为古代朴素的研究阶段，在此阶段中积累了大量的临床经验。 6 0 年代以后，山于科学技术发展，对人参化学成分的分离、提纯和结构鉴定的研究取 得了突破性的进展，为现代科学研究阶段。1 9 6 3 年s h i b a t a 等刊将由人参根巾提取出 的总皂苷称为人参皂：舒r x ( g i n s e n o s i d e r x ) ，并依薄板层析的r f 值，山低到高把人 参皂背命名为人参皂：旨r o 、r a 、r b l 、r b 2 r c 、r d 、r e 、r f 、r g l 、r 9 2 、r 9 3 和 r h 2 。1 9 7 6 年r i 本学者y a h a r a 1 等从人参叶中分离出皂二f j ：r b l 、r b 2 、r c 、r d 、r e 、 r g l 及根t f ，未发现的新皂：莳g f l 、g f 2 、g f 3 ，又从花蕾中分离出r d 、r e 、r g l 三 第一章文献综述 种皂苷。1 9 7 8 年同本的真f f l 庄司瞵j 报道了另两种单体皂苷r b 3 和2 0 ( s ) 葡萄糖人参 皂苷r l 本世纪9 0 年代初我国学者在国内外研究基础上，对人参根及其地上部分的 皂苷成分又深入地进行了分离鉴定，对单体皂苷的化学代谢、半合成、碱水解及分析 方法进行了系统研究，自人参茎叶中得到l o 种新的皂苷成分，分别为2 0 ( r ) 人参 皂苷r h 2 、r h 3 、l a 、f 4 、2 5 羟基人参皂苷r 9 2 、2 5 一羟基人参皂苷一r h l 、i a 、i b 、 k o r y o g i n s e n s i d e r 1 和r 2 。1 9 8 2 年国内蔡列培等人从人参茎叶中分离鉴定了r b 2 、r e 、 i 础、r e 、r 9 2 六种成分旧1 。1 9 8 6 徐绥绪等人u 伽从人参茎叶中分离鉴定t k 种皂苷成分， 1 9 6 6 年以后新皂苷r 9 5 、i 、r f 2 、r s 3 n h 5 1 等单体又被陆续报道。 1 2 人参皂苷的性质及命名 1 2 1 苷类 苷类( g l y c o s i d e s ) 又称配糖体，是糖或糖的衍生物如氨基糖，糖醛酸等与另一非 糖物质通过端基碳原子而连接成的化合物，其中非糖部分成为苷元( a g l y c o n e ) ，又称 为配糖基，其连接的键则称为苷键。由于单糖有a 、d 两种端基异构体，因此形成的 苷也可分为a 苷及p 苷两种类型，多种中草药的有效成分为苷类。苷类多数是固体， 其中糖基少的苷可成结晶，而糖多的苷则呈无定形粉末。多数苷类呈左旋性，但水解 后，由于生成的糖多有右旋性，致使水解产物亦常右旋性。苷的分子中由于含有糖基， 与苷元相比，有一定的亲水性，而苷元一般呈亲脂性。 1 2 2 萜类( t e r p o n o i d s ) 萜类是天然物质中最多的一类化合物，已有两万多种，自然界分布很广，三萜在 自然界以游离或糖苷的形式存在，与糖结合成的糖苷称为三萜皂苷。萜类从结构来看 是异戊二烯聚合体及其衍生物，般以五个碳为单位。三萜类化合物是基本骨架为3 0 个碳原子组成的天然产物，除少数为直链或 环三萜外，大多数为四环或五环三萜， 常见的类型有达玛烷型( d a m m a t a n e ) ，羊毛脂烷型( l a n o s t a n e ) ，大戟烷型( e u p h a n e ) ， 齐墩果烷型( o l e a n a n e ) 和乌索烷型( u r s a n e ) 。 1 2 3 皂苷( s a p o n i n s ) 皂苷是一类结构复杂的螺簿烷及其相似生源的甾体化合物的低聚糖苷及三萜类化 4 第一节文献综述 合物的低聚糖苷，可溶于水，其水溶液经震荡能产生大量持久性肥皂样泡沫，因而称之 为皂：侮。 皂：f j ：在c i 然界分和很广，我国占代劳动人民用来洗衣服的皂荚、无患子即含有大量 皂：管，其中，以薯蓣科、百合科、五加科、毛莨科、伞形科、豆科、远志科、葫芦科等 分柿最广，一些常用中药如人参、麦冬、甘草、柴胡、桔梗、知母中都含有大量皂苷。 此外在海洋生物如海参、海星和动物中办有发现。多数皂苷具溶血作用，能降低水的 表面张力而起乳化剂作用，井对人体粘膜有一定的刺激性，能反射性促进呼吸道粘膜 分泌使浓痰稀释而易于排除。皂苷还具有免疫调节、抗菌消炎等多方面的生物活性， 如人参皂苷能促进r n a 、蛋白质的生物合成、调节机体代谢、增强免疫功能等；齐墩 果酸( o l e a n o l i ca c i d ) 具有抗菌消炎、保肝作用；甘草皂苷( g l y c y r r h i z i n ) 具有促肾上腺皮 质激素( a c q h ) 样作用。 1 3 人参皂苷的化学结构特点及理化性质 1 3 1 人参皂苷的化学结构 人参皂苷属于三萜类皂苷，按其皂苷元的结构不同可分为三种类型：一类是齐墩 果烷型，i 坏三萜皂苷，其皂苷元为齐墩酸( o l e a n o n i ca c i d ) ，此类皂苷普遍存在于含 有三萜皂苷类的植物中，自然界并不乏见，例如人参皂苷r o 。另两类是达玛烷型的四 坏三萜类皂苷，它们在人参皂苷中占大多数，目前认为是人参的主要活性成分之一。 在达玛烷型人参皂营中，依皂苷元的不同，可将此型人参皂苷分成两类，即皂苷 元为2 0 ( s ) 一原人参二醇的，均称为人参二醇型皂苷，有r a l 、一r a 2 i r b i 、r b 2 、r e 、 r d 、r g ”r h 2 等：皂苷元为2 0 ( s ) 一原人参三醇的，均称为人参三醇型皂苷，有r e 、 一r f , - r g l 、一r 9 2 、一r h l 和2 0 ( s ) 一葡萄糖人参皂苷r f 等。所谓人参二醇、人参三醇并 非足人参皂营的真性皂苷元，凼为真性人参皂苷元在酸性条件下，难以保持原形物质。 依据上述分类原则，可将人参皂苷分为三类，具体如下： 1 、2 0 一( s ) 原人参二醇( p r o t o p a n a x a d i 0 1 ) 类：包括人参皂苷r a l 、r a 2 、r a 3 、 r b j 、r b 2 、r b 3 、r c 、r d 、r 9 3 、r h 2 等。 2 、2 0 - ( s ) 原人参三醇( p r o t o p a n a x a t r i 0 1 ) ：包括人参皂：杼r e 、r f 、r 2 0 g l u c o f 、 r g l 、r 9 2 、r h l 等。 3 、齐墩果酸( o i e a n o n i ca c i d ) 类：仪有人参皂营r o ，其结构如下。 筇帝文献综述 人参皂苷r o ：r = b g i c u a ( 2 一1 ) 一1 3 一g l cr ：= 1 3 一g l c 但是，有一些人参皂营具有2 0 ( s ) ，2 0 ( r ) 两种结构，例如，人身皂苷r 9 3 ，r h 2 ， r g z ，r h i 等，在表l ，2 分别列出了具有s ，r 型的原人参二醇和原人参三醇的结构图： r 表1 原人参二醇 t a b l e ip r o t o p a n a x a d i o lt y p eg i n s e n o s i d e s ( p p d ) 6 第一章义献综述 h o o - r l 2 0 ( 翻- p p 1g i n s e n o s i d e h 0 o - r i 2 0 ( r ) p p tg i n s e n o s i d e 表2 具有r s 型的原人参三醇 t a b l e 2p r o t o p a n a x a t r i o lt y p eg i n s e n o s i d e s ( p p t ) 1 3 2 人参皂苷的理化性质 1 3 2 1 皂苷的外观及溶解性 人参皂苷为人参的主要有效成分，含量约4 ，人参皂苷由于分子量较大，大多为 白色或乳白色无定形粉术，或为无色针状结晶。无嗅，味微甘苦，人参皂苷具有吸湿 性，有刺激黏膜而引起喷嚏之作用，多含有一定的结品水并有一定的熔点，可作为鉴 定的物理常数。皂苷的乙酰化物及全甲基化合物也有一定的熔，k 且熔距短。人参皂 苷的皂酯：元及精部分有多个不对称中心。因此，具有一定旋光f ，e ，比旋光度也i 叮供作 鉴别的物理常数。多数人参皂苻易溶于甲醇、乙醇及丙二醇中，难溶于水及极性小的 有机溶齐t jl t 。i i | 于人参皂许f 内将元类型 l r a r b r c r d r e r f r g r h 。其中极性大的 皂苷在水i i lj j 较人的溶解度，几乎不溶于氯仿、乙醚等，f j 机溶剂1 1 ；棚反，极f l - d , 的 皂莳则能溶于氯仿、乙醚t | i ，f f i j ) l 乎不溶于水| | l 。 ， ；i ；一章= 文献综述 1 3 2 2 皂苷的水解性 皂：苷的水解仃_ 二种方式，可以一次完全水解，生成皂菅元及糖：也可以分步水解， 即部分糖先被水解形成次生苷。由于皂苗：所含的糖足2 一羟基糖，1 人j 此水解条件较为剧 烈，要用一定浓度的黼酸、硫酸、高氯酸等。由于水解条什的剧烈，酸水解往往易引 起皂仔元发生脱水、坏合、双键位移、取代基位移、构型转化等变化，水解产物为人 工次生物。如刚0 1 m o l 的盐酸水解3 0 m if i 、可使三萜皂苷c 一2 0 上的原子发生差向异 构化，并使天然皂苷的侧链双键发生水合作用。又如过去认为人参皂苷的原皂苷元是 人参二醇( p r o t o p a n a x a d i 0 1 ) 和人参三醇( p r o t o p a n a x a t r i 0 1 ) ，其实这二者均是原皂苷元在 酸水解过程中异构化的产物，人参皂苷的原皂苷元为2 0 ( s ) 一原人参二醇 ( 2 0 ( s ) - - p r o t o p a n a x a d i 0 1 ) 和2 0 ( s ) 一原人参三醉 2 0 ( s ) - - p r o t o p a n a x a t r i 0 1 。含有酯苷 键的皂：许可被碱水解，水解后可得到次级苷。另外，皂苷也可被酶水解。皂苷可被酸或 酶水解，水解后生成的皂：舒元可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂，但不溶于水。皂 营元为结品状物质。 1 4 人参皂苷的药理作用 关于人参皂： ：单体成分的药理活性的研究，一直是很活跃的领域，这方面的研究 报道有很多。人们已从人参的根、茎、叶中分离得到了大量的人参皂苷，并对这些皂 苷的结构和生理功能进行了较为详尽的研究。正如前面谈到的，这些皂苷根据皂：舒元 的不同分为三类，为齐墩甲烷型三萜皂苷、人参二醇型皂苷和人参三醇型皂苷。在每 一类中，它们的皂：肯元结构足完全相同的，区别主要是在糖链的结构不同。而含有不 同糖链结构的人参皂苷不仅生物活性效价不同，而且作用也不一样。如人参二醇型皂 苷r 勘和r h 2 ，他们的皂苷元部分是一一样的，差别c 一3 位的糖链上。r h 2 比r 9 3 少一 个b - d - 葡萄糖，而阿者在生理作用上印棚差很大，r h 2 具有很蚀的抑制癌细胞增贿 功能，而r 9 3 卸不具有这种助能铲 1 4 1 人参皂苷的肿瘤抑制作用 人参皂苷的抗i i , l , 剜4 - ：j l j 也冈此被广为关注。实验证明，人参提取物可以预防治疗 食道癌、钳癌、肺删i i | i 、j j i ：癌等多种癌症1 。 进一步研歹芒农i j ，人参皂：好的抗肿瘤作川机制t j 概括为3 个力i f i i ，( 1 ) 挺- 岛机体免疫 ， 第一章义献综述 系统- j q it t i , 痛细胞生长，( 2 ) 使癌细胞冉分化逆转成非癌细胞，( 3 ) 直接杀灭癌细胞。更为 令人关注的是人参皂：舒，特别是r h 2 对多种癌细胞的直接杀伤作用。目f j 可观点认为， 这种作川足通过诱导| j t i 瘸细胞凋i ：而将其杀灭。细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，它 不同于细胞坏死。凋亡过程伴随一系列细胞生化和形念学特征的改变，包括细胞染色 体突变、雏因组dna 断裂、细胞缩小、细胞膜变形等等。细胞凋亡是一个复杂的网 络式的多方位调控过程，人参皂：肾r h 2 诱导肿瘤细胞凋亡机制也币在进一步研究中， 但人参皂：许有鼹著的抗痛功效已是不争的事实心2 。2 。 人参皂苷r 9 3 ：研究表明，在众多的人参皂：旨单体中，r 9 3 是确有抑癌作用的人 参皂苷单体。在国内，已经山吉林亚泰丌始批量生产的参一胶囊，是国家一类中药抗 癌单体新药，其最主要的药理成分就是人参皂苷r 9 3 。临床实验证明，人参皂苷r 9 3 对多种实体瘤的抑制率达6 0 ，对肿肿瘤转移和肝肿瘤转移抑制率为7 0 - - 8 0 人参 皂苷r 9 3 抗癌抗血栓的药理效用主要表现在：1 、人参皂苷r 9 3 对肿瘤细胞具有较好 的抑制作用，主要作用于细胞增殖周期的g 2 期，抑制癌细胞有丝分裂自仃期蛋白质和 a t p 的合成，使癌细胞的增殖生长速度减慢；2 、人参皂苷r 9 3 具有抑制癌细胞浸润 的作用，其作川机理主要是通过剂量依赖性抑制l p a 导致的细胞内c a 2 + 的上升，从 而抑制了癌细胞的单层细胞浸润；3 、人参皂苷r 9 3 具有抗肿瘤细胞转移的作用，抗 转移机理研究i = 芷实，人参皂：薛r 9 3 对癌细胞肺转移的抑制作用与其抑制肿瘤细胞附着 和浸润基底膜的纤维连接蛋白和层粘连蛋白有关，亦与抑制肿瘤新生血管的形成有关； 4 、人参皂：酵r 9 3 可以促进肿瘤细胞凋亡； 5 、人参皂苷r 9 3 对荷瘤小鼠免疫功能有 促进作用，可以提高n k 细胞和i l 2 的活性水平。此外，人参皂苷r 9 3 还有很强的 抗j f l l 栓，治疗高血压，促进血液循环的药物疗效。 1 4 2 人参皂苷的增强免疫力作用 个体发育在性成熟后不久，证常的免疫功能就丌始下降。人参皂苷r g l 通过促进血 清中广i 蛋白、丫球蛋白的合成，增强脾删! 中蛋白质合成效率来提高抗原刺激抗体生成的 效率，它还能通过提高机体ca m p ( 环化腺嘌呤磷酸核苷酸) 的浓度来刺激t 、b 淋巴 细胞的功能成熟。人参三醇类皂苷能通过直接增加白细胞介素6m r n a 的稳定性而促 进其转译效率，进而增加亡j 细胞介素6 的产生。而白细胞介索6 对t 、b 细胞和巨噬 细胞具有促分化效应汜4 1 。最近b e r e k 等人1 还发现，人参皂苛r c 和r d 能促进t 细胞 增破，提l i q 天然杀伤细胞( nk ) 的活性，从而提高机体免疫力。 9 筇一一常文献综述 1 4 3 人参皂苷的抗疲劳作用 小白鼠登绳、登轮、游泳和振荡实验瞄引结果盟示，人参皂越：有定的抗疲劳作用。 对其f i ：) t j 机耻彳j 3 点解释：( 1 ) 实验r | - 1 发现小鼠服用人参皂：酋：后乳酸的生成量明j i ! 降低， 乳酸脱氢酶活力提高。说明动物机体剧烈运动时产生的大量乳酸氧化生成丙酮酸，进 而进入三段酸循环产生能遣，为肌肉活动提供新的能量。( 2 ) 摄入人参皂苷的小鼠体内 脂肪分解速度明显加快，说明人参皂：忤可使机体较早的动用脂肪作为疲劳时的能源供 应心。( 3 ) 人参皂：f ；：通过抑：b 0 肾j t 腺嗜铬细胞分泌儿茶酚胺口州米调节神经系统，为机体 解除疲劳感觉。 1 4 4 几种人参皂苷的药理活性 关于人参单体成分的药理活性的研究，国外始于7 0 年代，国内始于8 0 年代初期。 现简单介绍如下： 人参皂苷r b l ：人参皂苷r b l 及其类似物均能增强神经生长因子( n c f ) 对器官 中的培养胍脊髓后f 艮神经肖的轴突旁枝的促进作而对交感神经节起抑制作用；人参皂 ：舒一r bl 对培养细胞d n a 修复有促进作用；r b l 对大鼠胚胎大脑皮质神经元的存活有促 进作用。 人参皂苷r b 2 ：人参皂苷r b 2 具有抗炎作用，对急性及慢性炎症均有抑制作用； 人参皂苷r b 2i i j 增强肝糖代谢系统及能量产生系统的功能。 人参皂：苗：r c ：具有抑制巾楸神经作用，抑制r n a 合成作用，促进血清蛋白质合成 作用，使分解蛋白质酵素活性化作用，促进刺激副肾皮质荷尔蒙分泌作。 人参皂：f = r d ：具有促进副肾皮质衙尔蒙分泌作用。 人参皂苷r e ：具有抑制中枢神经作用，促进d n a 、r n a 合成作用，促进血清蛋白 质合成作用，蛋白质分解酵素活性化作用，促进刺激副。肾皮质荷尔蒙分泌作用。 人参皂：舒r f ：具有与腩神经细胞育关联的镇痛作用。 人参皂苷r g i ：具有使中枢神经兴奋作用，抗疲劳作用，恢复疲劳作用，改善记 忆、学刊机能，促进d n a 、r n a 合成作用，蛋白质分解酵索活性化作用。 人参r 皂 j ：r 9 2 ：具有抑制j f j l 小板凝集作用，蛋白质分解酵索活性化作用。 人参皂二泞r h l ：具有抑制癌细j 地增值作用，抗肿瘤作用。 人参皂营r h 2 ：能强烈抑制多种癌细胞增殖，促进癌细胞分解转换为正常细胞。 人参皂：舒r h 3 ：能抑制癌细胞向证常细胞扩敝以及控；i l j j i i l , j , 扳凝集。 i o 旃一市义献综述 人参皂苷c k ：具有抑制破骨细胞生长作用。 1 5 改变人参皂苷的糖基而提高其活性方面的研究 众所周知，天然皂： j ：的分子结构不一定是活性最佳状态，如果改变皂苷的结构， 可能使_ l l i i r , - 性提高j l 4 。倍，几百倍。f l f i 由于皂苷结构复杂，有目的的改变皂：f j = 糖基来 提高其活性的报道还很少，到f jf j 订为止，大体归纳为化学法和生物酶法两大类来改变 皂苷糖基。 1 5 1 化学法改变皂苷糖基 在电仆结构的研究l f l ，化学裂解法占有重要的地位。化学裂解法包括酸水解法， 乙酸水解法，- - , t ：日酸水解法，s m i t h 降解水解法，四醋酸铅裂解法，醋酸一吡啶裂解 法，重氮f f 烷裂解法，光解法和电解法等，其中以酸水解法使用最多。酸水解的一般 方法是将皂苷溶于t l c l 或h ：s 0 溶液中，( 如不溶解可以加少量甲醇，乙醇等极性溶剂 助溶) 加热一段时| 1 j j ，然后减压蒸去有机溶剂，水溶液用有机溶剂萃取，或用过滤法 收集析出的皂苷元沉淀。 化学裂解法虽然操作简单，但由于反应太剧烈，许多皂苷元吞：此条件下会发生化 学变化，使f j 究： 作变得复杂。近几年发现，在适宜的反应条件下，一般糖：莳键均可 以用碱法裂解。陈英杰。m 川等利用碱水解法，对人参三醇型皂苷r 9 2 进行水解，得到 了原人参三醇型皂菅元和人参皂苷r h i ，陈燕萍。世3 等采用人参二醇型皂：舒r b 3 ，r b 2 ， r d 等混合物，进行碱水解，结果制得了人参皂苷r h 2 ，但是，其得率很少。 、1 5 2 酶法改变皂苷糖基提高其活性 皂：符的梆i 基大部分足d 一葡萄糖，l 一阿拉伯糖，d 一术糖，l 一鼠李糖，d 一葡 萄糖醛酸，d 一半乳糖等，除了l 一鼠李糖为0 【一糖：绔键外，其他大部分为p 一糖苷键。 所以，要酶法改变皂 j ：榭泓g ，则需要用p 一葡萄糖许酶等外切型糖千1 ：酶。长期以来， 有关外切型糖