（材料学专业论文）电活性介孔碳的合成及构建漆酶生物传感器的研究.pdf

摘要 本文基于研制新的固定化酶材料，合成的电活性有序介孔碳，既具有电活性， 保证酶生物传感器的氧化还原活性，又具有纳米孔道，有利于酶的固定和保持酶 生物传感器的生物物质活性，进而提高传感器的性能。漆酶( l a c ) 生物传感器具 有简便、高灵敏性、响应速度快的特点和广阔的应用前景，因此，选择漆酶固定 在电活性有序介孔碳修饰的金电极上构建成漆酶生物传感器，用于研究污水中邻 苯二酚的测定，为环境监测提供新思路。 ， 以有机交联水性环氧树脂网络为碳源，s b a 15 为模板，采用硬模板法合成 了具有电活性的新型有序介孔碳( n o m c ) 。紫外分析，表明介孔碳中含有大量的 瓦电子。透射电镜分析，表明其具有典型的二维有序六角介孔结构，孔径大约为 3 n m 。循环伏安测试表明，n o m c 修饰a u 电极在缓冲溶液中发生的是一质子一 电子的表面控制准可逆过程。 以n o m c 作为固定漆酶的负载材料，首次应用于漆酶生物传感器。n o m c l a c a u 电极催化邻苯二酚的氧化峰、还原峰电流均随着扫描速率的增加而线性 增加，且发生的是一质子一电子的电极过程。采用不同的固定化酶方法构建的 l a c 传感器中，由p d d a 静电吸附构建的传感器的综合性能最好。该传感器对底 物邻苯二酚的线性检测范围是o 6 7 8 5 9 “m ，选择灵敏度为o 3 4 9 a m ，k 孑值 为1 3 4 9 m m ，检测限为o 117 “m ( s n = 3 ) 。 为了提高介孔碳的电催化活性，合成了另一种新的功能化介孔碳 ( c u 0 o m c ) 。透射电镜和能量散射光谱仪分析表明，c u 元素成功地引入到介孔 碳孔道中形成了均一有序的介孔结构，且材料本身不含s i 元素。循环伏安测试 表明，c u o o m c a u 电极在p b s 缓冲溶液中具有良好的电催化活性。 c u o o m c l a c c s a u 电极在室温2 5 2 ，工作电压为+ 0 4 5 vv ss c e ，p h 值 为5 2 磷酸盐缓冲溶液的最佳实验条件下，表现了良好的传感性能，对邻苯二酚 的线性检测范围是o 6 7 1 5 7 5 m ，k 垆为4 0 2 5 p m ，最低检测限为o 8 0 7 州 ( s n = 3 ) 。此外，该漆酶传感器还具有较好的重现性和稳定性。因此，电活性介 孔碳可以作为一种新型的酶载体材料，提高了酶传感器的电子传导性能和敏感 性，降低了检测下限。 关键词：有序介孔碳漆酶生物传感器氧化铜改性介孔碳邻苯二酚 a b s t r a c t t h i ss u b j e c tb a s e do nr e s e a r c h i n gan o v e li m m o b i i i z a t i o nm a t e r i a lo fe n z y m e ， o r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o n ( o m c ) ， w h i c hw a s s y n t h e s i z e d ， n o to n l yh a dt h e p e f f o r m a n c eo fe l e c t r o n i c a la c t i v i t yt h a tg u a r a n t e e dt h er e d o xa c t i v i 够o fe n z y m e b i o s e n s o r ，b u ta l s oh a dt h es t r u c t u r eo fn a n o m e t e rp a s s a g e w a yt h a tw a sa d v a n t a g e o u s i na ni m m o b i i i z a t i o no fe n z y m ea n dm a i n t e n a n c eo fb i o l o g i c a la c t i v i 砂o fb i o s e n s o r ， a n df u r t h e ri m p r o v e dp r o p e r t i e so fs e n s o r s l a c c a s e ( l a c ) b i o s e n s o rh a st h es p e c i 6 c c h a r a c t e ro fc o n v e n i e n c e ，h i g hs e n s i t i v i t y ， r a p i dr e s p o n s ea n dw i d ea p p l i c a t i o n p r o s p e c t s t h e r e f o r e ，l a c 、v a ss e l e c t e da st h ee n z y m et of a b r i c a t eab i o s e n s o rw i t h o m cm o d 讯e de l e c t r o d et od e t e r m i n a t ec a t e c h o li ns e w a g e ，w h i c hp r o v i d e san e w i d e ai nt h ee n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g 。 an o v e lo r d e r e d m e s o p o r o u sc a r b o n ( n o m c ) w a s p r e p a r e dt h r o u 曲 h a r d - t e m p l a t em e t h o dw i t ho 唱a n i cc r o s s - l i n k e dw a t e 卜s o l u b i l i 哆e p o x yr e s i n a s c a r b o nr e s o u f c ea n ds b a 一15a st e m p l a t er e a g e n t ，w h i c hh a st h ep e 怕r m a n c eo f e l e c t r o c a t a l y s i sa c t i v e n e s s u l t r a v i o l e t - v i s i b l e ( u v v i s ) s p e c t r u ms h o w e dn o m c c o n t a i n sm a n y7 ce l e c t r o n s t r a n s m i s s i o ne l e c 仃o nm i c r o s c o p y ( t e m ) i n d i c a t e dt h a t n o m ch a st h e 够p i c a lt w o - d i m e n s i o n a lo r d e r e dh e x a g o nm e s o s t r u c t u r ew i t ha b o u t 3 n mo fh o l ed i a m e t e r t h er e s u l t so fc y c l i cv o l t - a m p e r e ( c v ) t e s t ss h o w e dt h e r e a c t i v ep r o c e s so ft h en o m cm o d 讯e da ue l e c t m d ei nb u a e rs o l u t i o nw a so n e p r o t o n o n ee l e c t r o np a r t i c i p a t e da n d r e v e r s i b l es u r f a c e c o n t r o l i i n gp r o c e s s t h el a cb i o s e n s o rw i t hn o m ca st h ei m m o b i l i z e de n z y m em a t e r i a lw a sf l r s t l y f a b r i c a t e d t h en o m c l a c a ue l e c t r o d ec o u l dc a t a i y z ec a t e c h o l ，w h o s ep e a kv a l u e s o fo x i d a t j v ec u i r e n ta n dr e d u c t i v ec u r r e n ta l ll i n e a r l vi n c r e a s e dw i t ht h ee l e v a t i o no f s c a n n i n gr a t e ，a n d i t s p r o c e s sw a so n ep r o t o n o n ee l e c t r o n r e v e r s i b l es u a c e c o n t r o l l i n g a m o n gb i o s e n s o r sp r e p a r e dw i t hd i f r e r e n ti m m o b i l i z e dm e t h o d s ，t h e o v e r a j ip r o p e r t i e so fl a cb i o s e n s o rb u i i tb ys t a t i ce l e c t r i c i t ya d s o 巾t i o no fp d d aw a s b e s t t h e1 i n e a rr e s p o n s er a n g eo ft h el a cb i o s e n s o rw a so 6 7 8 5 9 m ，i t ss e n s i t i v i t y w a s0 3 4 9 a m ，m i c h a e i i sc o n s t a n tw a s1 3 4 9 m m ，a n di t sd e t e c t i o nl i m i t a t i o nw a s 0 1 17 州( s 小= 3 ) af u n c t i o n a l i z e dm e s o p o r o u sc a r b o n ( c u o o m c ) w a ss y n t h e s i z e dt oi m p r o v e t h eej e c t r o c a t a l v s i so ft h eo m c t e ma n de d st e s t ss h o w e dt h a tc u 0 - o m ch a s h o m o g e n e o u so r d e r e dm e s o p o r o u ss t r u c t u r ew i t h o u tt h es i i i c o ne l e m e n t ，a n dt h a tt h e c o p p e re l e m e n tw a ss u c c e s s i v e l yl o a d e di nt h ep a s s a g eo fo m c c v t e s t si n d i c 2 l t e d t h a tc u o o m cm o d i n e da ue l e c t r o d eh a da n ea b i l i t yo fe l e c t r o c h e m i s t r yi nt h e p b ss o l u t i o n t h ec u o 0 m c 厂l a c a ue l e c t r o d ew i t hc h i t o s a na sm e m b r a n em a t e r i a l w a sf a b r i c a t e da n dd i s p l a y e dm o r ee x c e l l e n ts e n s i n gp e r f o r m a n c e sa tt h er o o m t e m p e r a t u r eo f2 5 2 ，t h ew o r k i n gp o t e n c i a lo f + o 4 5 vv ss c ea n dt h ep b s s o l u t i o no fp hv a l u e5 2 ： t h el i n e a rr e s p o n s er a n g ew a s0 6 7 1 5 7 5 l i ，m i c h a e l i s c o n s t a n t4 0 2 5 “m ，d e t e c t i o nj i m i t a t i o n0 8 0 7 “m ( s ，n = 3 ) ，r e s p e c t i v e l y a d d i t i o n a l iy ， t h i sb i o s e n s o rh a sg o o dr e p r o d u c t i o nq u a l - t ya n ds t a b i li t y t h e r e f o r e ，o m ca san o v e l i m m o b i l i z e dm a t e r i a lo fe n z y m ec a ne l e v a t et h ep e 墒r n l a n c eo fe l e c t r o t r a n s f e r r i n g a n ds e n s i t i v i 母，a n dc a nr e d u c et h ed e t e c t i o nl i m i t a t i o no fe n z y m eb i o s e n s o r k e yw o r d s ：o r d e r e dm e s o p o r o u sc a r b o n ，l a c c a s eb i o s e n s o r ，c o p p e ro x i d e f u n c t i o n a l i z e dm e s o p o r o u sc a r b o n ，c a t e c h o l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：程静 签字日期：2 d d 艿年乡月石日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤垄盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤鲞盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 程静 签字日期：2 d 蝎年月石曰 导师虢许磊午 签字日期： 加略年 6 月曰 第一章绪论 1 1 生物传感器 1 1 1 生物传感器的概念 第一章绪论 生物传感器是指用固定化的生物体成分( 如：酶、抗原、抗体、激素等) 或生 物体本身( 如细胞、细胞器、组织等) 作为分子识别元件，对被分析物具有高度选 择性的分析仪器，通常包括具有化学分子识别功能的生物材料、换能器件和信号 放大装置等三部分。生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子、材料 技术等多种学科相互渗透成长起来的新学科，这种交叉学科在理论上和技术上均 有许多新的问题要进行探索和开发，在应用上有极为宽广的领域可以进行开拓。 与传统的分析方法相比，生物传感器具有选择性高、分析速度快、操作简易和仪 器价格低廉等特点，而且可以进行在线甚至活体分析，因此引起了世界各国的极 大关注【l 】。 1 1 2 生物传感器的原理 生物传感器的原理为：当待测物质( 底物、辅酶、酶、维生素、抗原、抗 体、抗菌素等) 经扩散作用进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生化学反 应，产生的信息( 或光、热等) 继而被相应的化学或物理换能器转变成可定量和可 以处理的电信号或光信号等并输出，根据输出信号的大小或强弱便可知道所测物 质的浓度。 1 1 3 生物传感器的发展历程 1 9 6 2 年，c l a r k 等口1 人首先提出了把酶与电极结合起来测底物的设想，在氧 电极的基础上提出了研制葡萄糖生物传感器的设计原理。1 9 6 7 年，u p d i k e 和 h i c k s 3 1 报道了酶的固定化技术，并研制出世界上第一支葡萄糖酶电极，开创了生 物传感器的历史第一代生物传感器。 随后，许多其他生物组分和换能器相继应用到生物传感器中，逐步发展出组 织、微生物、免疫、酶免疫和细胞器等传感器，被称为第二代生物传感器。 第三代生物传感器是将生物技术和集成电路技术结合起来研制成的场效应 第一章绪论 生物传感器，其特征是微型化、集成化和多功能化。1 9 8 0 年，c a r a s 和j a n a t a l 4 首 先研制成功可测定青霉素的酶场效应晶体管生物传感器，这一成果实现了生物传 感器与微电子技术的结合，为生物传感器应用于医学领域的在体测定奠定了基 础。近些年来，新颖的光学检测转换元件如表面等离子体共振( s p r ) 等广泛应用 到生物传感器中。现在将生物传感器和流动注射分析与电脑技术相结合，有望发 挥更大的作用。 1 1 4 生物传感器的评价 发展生物传感器的最初目的是为了利用生化反应的专一性，高选择性地分析 目标物。但是由于生物单元的引入，生物结构固有的不稳定性、易变性，生物传 感器实用化还存在着不少问题，而实用化的生物传感器应该同时具有专一选择性 好、灵敏度高、稳定性和重现性好的特点，因此，需要对生物传感器的性能进行 综合评价。衡量生物传感器的主要性能指标有三个方面【5 】： ( 1 ) 稳定性 生物传感器上的固定化的生物材料其单元结构具有易变性，为了增加其稳定 性，最常用的手段是采用对生物单元具有稳定作用的介质、固定剂。研究表明用 合适的溶胶一凝胶作为生物单元的固定剂应用于酶电极，可以大大提高生物单元 的稳定性。 ( 2 ) 选择性 提高生物传感器的选择性主要可从两方面来实现：一、改善生物单元与换能 器之间的联系以减少干扰。二、选择设计新的活性单元以增加其对目标分子的亲 和力。如在酶电极中加入介体或对酶进行化学修饰可以提高这类电极的选择性， 其中介体或用于修饰的物质大都具有一定的电子运载能力。在此启发下，一些研 究者设想将酶活性中心与换能器之间用一些分子导线通过自组装技术连接起来 以消除电化学干扰。 ( 3 ) 灵敏度 对于一些特定的分析对象已发展了一些能大幅度降低检测限的技术。随着生 物传感器在食品、医药、环境和过程监控等方面应用范围的扩大，对生物传感器 提出了更高的要求。 此外，实现生物传感器的普遍应用，还需要使制各的酶电极价格低廉和寿命 长。 2 第一章绪论 1 2 漆酶 酶作为一种生物催化剂，具有很多特性：酶来自生物体，需在较温和的条件 下进行催化反应；酶催化效率非常高，比一般化学催化剂高1 02 1 0 1 3 ；酶具有高 度的特异性，酶对其催化的对象有高度的选择性，一种酶只作用于一种或一类底 物，而且酶催化反应几乎没有副产物；酶易失活，凡能使蛋白质变性的因素都能 使其失去催化活性1 。 由于以上特点，基于酶构建的生物传感器具有反应快速、高特异性、高灵敏 度、现场检测的特点，因而成为国内外的研究热点。 1 2 1 漆酶的分布与分类 1 8 8 3 年，日本学者y o s h i d a 首次在日本漆树( r h u s ve m i c i f e r a ) 树汁中发现漆 酶，后来证实，漆酶除了存在于植物中，还广泛地存在于真菌中。最近的研究表 明，细菌口1 和昆虫阳1 中也分别含有漆酶，而且漆酶在细菌中的分布可能还比较广 泛引。 根据来源不同，漆酶可分为真菌漆酶、细菌漆酶和漆树漆酶三种，其中商品 化的漆酶多来源于真菌漆酶。白腐真菌是自然界中最主要的漆酶生产者，约有7 0 种不同来源的白腐真菌菌株已经被鉴定能产生漆酶，其中绝大部分为担子茵( 约 占8 0 ) ，其次为子囊菌( 约1 5 ) ，极少数为半知菌和其他低等真菌( 约4 ) ，尚未 在酵母菌中发现有内源性漆酶。 1 2 2 真菌漆酶的结构与性质 真菌漆酶平均分子量一般为5 0 0 0 0 9 0 0 0 0 ，等电点( p i ) 为3 5 4 5 ，含糖约 1 5 3 0 。漆酶( l a c c a s e ，d i p h e n o l o x i d a s e ，e c1 1 0 3 。2 ) 一般含有4 个铜离子，根据 其光谱特征，可划分为3 种类型的铜：i 型铜、i i 型铜和型铜。i 型铜( 只有一个 铜离子，顺磁性) 具有典型的蓝铜谱带：紫外可见光谱上6 0 0 n m 处出现峰值，在 e p r ( 电子顺磁共振) 谱上有个小的平行超精细耦合结构，它参与分子内的电子 传递，把电子从底物传递到其他铜原子上；i i 型铜( 只有一个铜离子，顺磁性) 只具一般的e p r 谱带；型铜区由2 个型铜原子通过一个0 h 桥配位连接起来，组 成双核铜区，具有抗磁性，因而在e p r 上无谱带，紫外可见光谱上3 3 0 m 处的肩 峰是i 型铜的特征峰u 引。 近些年来，约有2 0 种不同来源的真菌漆酶得到提纯。不同来源的真菌漆酶在 底物专一性、最适反应温度和p h 值以及热稳定性等方面存在较大差异，其催化反 第一章绪论 应的动力学常数因所选择底物不同而改变。 真菌漆酶的最适反应温度和最适p h 值随所作用底物和缓冲液不同而变化。报 道的大多数真菌漆酶的最适反应温度通常在4 0 一5 5 之间，有较好的耐热性能。 木素降解真菌p m l ( b a s i d i o m y c e t ep m lc e c t 2 9 7 1 ) 漆酶i 是热稳定性最好的真菌 漆酶，当以愈创木酚为底物时，该酶的最适反应温度是8 0 。在6 0 条件下保温 1 小时，酶活性未见明显减少，并随着反应温度升高，酶活性随之增加n 引。多数 真菌漆酶的最适p h 值偏酸性，在4 o 6 0 之间，且在此p h 值范围内稳定性较好。来 自担子菌的r 垮d o p o m si i g n o s u s 漆酶是少数最适反应p h 值接近中性的漆酶之一 n 副，而来自紧缩斑褶菇菌( p a n a e o l u sp a p i l i o n a c e u s ) 的漆酶使用a b t s 作底物时，测 得的最适p h 值是3 o ；当使用2 ，6 二甲氧基苯酚为底物时，酶催化的最适反应p h 值 为8 0 n 制。 1 2 3 漆酶催化氧化作用的底物 漆酶作用的底物相当宽泛，按化学结构不同可将其分成六类n 朝，包括： ( 1 ) 酚及其衍生物：约占漆酶底物总数的一半，主要是邻、对苯二酚等多元 酚及其衍生物。漆酶不能催化氧化苯酚，却能催化氧化0 【一奈酚及某些一元酚的衍 生物n 6 。18 1 ，后者的取代基多在酚羟基的邻、对位，随着取代基的种类、数目和在 芳环位置的不同，反应活性也有差异； ( 2 ) 芳胺及其衍生物：其结构特点与酚类底物相似，主要是多氨基苯及其衍 生物： ( 3 ) 羧酸及其衍生物：一般是指在芳香酸底物中，芳环羧基的邻、对位连有 羟基、烷氧基或氨基；在非芳香羧酸中，碳链上连有酚或芳胺类基团。 ( 4 ) 甾体激素和生物色素：在有机溶剂和磷酸盐缓冲液中，真菌漆酶可催化 氧化雌甾二醇、雌激素三醇等；漆树漆酶催化氧化胆红素、苏木色精、茜素蓝s 等生物色素； ( 5 ) 金属有机化合物：如二茂铁( f e h ) 及其衍生物f e r ( r = c h 2 0 h ，c o o ， c h 2 f e ) 等【1 9 】； ( 6 ) 其他非酚底物：除了早期发现的亚铁氰化钾、抗坏血酸等外，近年来还 发现了1 苯基2 ( 3 ，4 二甲氧基苯基) 己二醇和吲哚的衍生物等【1 2 】。 1 2 4 漆酶催化氧化作用的反应机理 漆酶是单电子氧化还原酶，其活性位点包括三种不同类型的四个铜原子：i 型铜、i i 型铜、型铜。i i 型铜和型铜形成三核铜簇，其中2 个型铜通过羟基 相连，三核铜簇是双氧还原的位点。i 型和i i 型铜在漆酶催化过程中发挥负载和 4 第一章绪论 传递电子的作用；i i 型和型铜参与负载氧气的功能。它催化不同类型底物的氧 化反应机理主要是底物自由基的生成和漆酶分子中四个铜离子的协同作用。底物 结合于酶活性中心的i 型铜位点，通过c y s h i s 途径将电子传递给三核位点，该位 点又把电子传递给氧分子，使其还原成水。以漆酶催化氧化邻苯二酚为例，过程 如图卜1 所示。 。 2 c 一+ ( 藩酶氧化态) + 0 h 2 呲脯十占。口 叫2 g o ( 漆酶还原态) 十r1 - 卜2 e + 2 口 2 c u + ( 漆酶还原态) + 1 2 。2 + 2 e 2 口_ 2 c 一+ ( 漆酶氧化志) + h 2 0 图1 1 漆酶催化氧化邻苯二酚的过程 f i g 1 一lp r o c e s so fl a c c a s ec a t a l y z i n gc a t e c h o l 1 2 5 酶常用的固定化方法 在催化型生物传感器的制备过程中，酶的固定是一个极为重要的环节，酶的 固定方法影响酶的活性和传感器的稳定性。目前酶常用的固定方法有【2 0 】：包埋 法，吸附法，共价法，交联法。 ( 1 ) 包埋法：包埋法是把酶包埋于聚合物材料的网格结构或微胶囊结构中， 以防止酶蛋白渗出，而底物仍能渗入格子与酶接触反应。包埋法较为简便温和， 酶分子仅仅是被包埋在聚合物中，而未参加化学反应，生物活性破坏少，但此法 对大分子底物不适用，且储存稳定性和热稳定性差。由于在包埋法中，大多数酶 包埋在较厚的聚合物膜中，增大了传感器的响应时间。 ( 2 ) 吸附法：吸附固定是最简单的方法，酶分子直接吸附于不溶性载体电极 上，酶与载体之间的亲和力是范德华力、离子键和氢键。吸附法操作简单、易于 在许多材料上进行，它是一种较为温和的蛋白质固定方法，能有效地保留蛋白质 活性，酶电极的响应速度快( 一般不超过3 0 s ) 。但这种方法的酶负载量较低，这 就意味着灵敏度较低，同时吸附一般是可逆过程，吸附的酶易于脱落，因而随着 时间的延长，解吸也会减少灵敏度。因此这种酶电极的操作和储存稳定性差，最 多能使用一周，不适合实用化的要求。 ( 3 ) 共价键固定法：通过对电极进行化学修饰，再利用酶蛋白分子中可以进 行结合的一n h 、一o h 、一s h 、一c 0 0 h 等活性基团与电极表面上的反应基团 之间形成共价键连接。该方法形成的酶膜厚度与吸附法相似，且酶电极的响应速 度快、稳定性好，酶与载体之间的连接很牢固，稳定性好，无酶膜脱落和开裂现 第一章绪论 象。由于酶分子与载体材料表面形成较大的多点结合界面，共价法的结合力较强， 结合效率较高。该方法的操作反应条件激烈，影响固定的因素较为复杂。酶、载 体材料表面和连接试剂官能团的性质及其相互作用对结合效率有较大的影响，酶 的活性往往降低较大。 ( 4 ) 交联法：为了增加酶负载，进一步提高电极的稳定性，酶与多官能团试 剂进行交联反应，生成不溶于水的二维交联聚集体( 网状结构) ，交联形成的固定 化酶称为交联酶。与共价结合法一样，两者都是靠化学结合的方法使酶固定化， 其区别在于交联法使用了交联剂，常用的交联剂有戊二醛、鞣酸。单用戊二醛交 联得到固定化酶的方法很少单独使用，将此法与吸附法或包埋法联合使用可以达 到良好的加固效果。例如：先用己丁酯吸附，再用戊二醛交联等，但交联剂的使 用会严重降低酶的活性。 1 2 6 固定化的漆酶在生物传感器上的应用 固定化技术是使酶得到更广泛且有效利用的一个重要手段。固定化酶是酶工 程的核心内容之一。游离酶一般都溶于水，其本身也不稳定，利用后分离困难， 造成浪费。将酶固定于各种载体上j 就可以很方便地分离和重复利用，对提高酶 的利用效率，延长使用时间具有重要意义。 固定化的漆酶使漆酶的利用率、稳定性与机械强度等方面均较游离性的酶有 所提高，从而为生物传感器的制各提供了良好条件。漆酶传感器是以固定化漆酶 作为感受器，以基础电极作为换能器的装置。其工作原理是把漆酶电极插人待测 溶液中，漆酶催化底物发生化学反应产生生化信号，再由基础电极将生化信号 转变成电信号进行数据处理。漆酶在催化过程中消耗氧气，使得这一过程很容易 被转化为电信号而高灵敏地得到检测。张辉等乜采用壳聚糖负载漆酶为催化剂， 研究2 ，4 二氯酚、4 氯酚和2 氯酚的催化降解机理，探讨了反应时间、p h 值、反应 温度、氯酚浓度以及漆酶浓度对其降解效果的影响和最适降解条件。钞亚鹏等运 用d e a e 纤维素固定漆酶制成的高活力稳定的传感器，已用来检测煤炭、石油、 天然气、造纸等工业污水中的木素、酚类等物质3 。b 州a k 等将真菌漆酶吸附在 碳素纤维电极上，即通过戊二醛或碳二酰亚胺交联漆酶的羧基基团到碳素纤维 上，用来检测来自酿酒、造纸等工业污水中的酚类物质。其中，戊二醛的比例很 大程度上影响了生物传感器的灵敏性，因为它的存在会限制底物接近酶的活性 中心妲引。s z e p o n i c 等妇4 3 把真菌漆酶固定在碳上制成固定化酶电极，能有效催化负 极氧化还原，可精确测量浓度在0 2 7 0 m m o l l 范围的多酚、多胺基苯等底物。 z 川e 等乜朝在研究t r a m e t e sv i l l o s a ( 柔毛栓菌) 漆酶降解含氮的染料和催化芳香胺和 苯磷二酚中得到启示可以把漆酶固定在大电极上，通过联机系统连续监测酶的 6 第一章绪论 活性和从自然界用物理法转移的化学污染。漆酶传感器具有测试专一、灵敏、快 速、简便和准确的优点，并且稳定性较好，可以使用几十次到几百次。因此，它 己广泛地应用于发酵过程、临床诊断以及化学分析等各个方面。 漆酶传感器用来大范围监控混合物是科技更成熟的阶段，它不仅具有良好 的选择性和敏感性，并且随着时间的延长表现出更好的稳定性。这种生物传感器 扩大了观测混合物的范围，包括对酶活性有影响的催化剂和抑制剂扭3 1 。 1 2 7 影响漆酶生物传感器活性的因素 酶分子的分子量很大，同时酶具有活性，构象变化复杂，在不合适的条件下 很容易发生变性和失活，因此在固定化酶时，首先应考虑避免酶的失活。即使在 最适宜的条件，酶也会缓慢失活，因此研究酶的工作成功与否决定于能否避免使 酶不稳定的条件：在处理酶时最好不宜过分地延长时间，整个的制各过程应在 2 3 天内结束；使酶储存而不失活，最方便的是将其保存于深度冷冻的状态， 此时它一般能稳定数月之久。酶固定化后所引起的酶性质的改变，一般认为其原 因可能有两种：一是使酶本身变化；二是受固定化载体的物理或化学性质的影响。 所谓酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等 发生了变化；载体影响，则主要体现在固定化酶的周围，形成了能对底物产生影 响的扩散层，以及静电的相互作用等引起的。外界条件引起固定化酶性质变化的 因素主要有： ( 1 ) 温度对酶的影响 温度对酶促反应速度的影响有两个方面【2 6 j ：一个方面是在一定范围内当温 度升高时，反应速度也加快，这与一般化学反应一样；另一方面，随着温度的升 高而使酶蛋白质逐渐变性。酶被固定化以后其最适温度比天然酶高一些，一般因 酶而异，大致提高5 1 5 。 ( 2 ) 离子浓度对酶的影响 不同浓度的中性盐溶液对蛋白质有两方面的影响【2 l 一方面盐离子与酶分 子的极性和离子基团作用，降低酶分子的活度系数，使其溶解度增加。另一方面， 盐离子与水这种偶极分子作用，导致酶水合程度的降低，从而使酶的溶解度降低。 在盐浓度较低时，酶表现为易于溶解，产生盐溶现象。将盐的浓度提高到一定程 度以后，溶解度降低，发生沉淀，产生盐析。过高或过低盐的浓度都可以破坏酶 分子中的离子键，导致酶的活性受到影响。 ( 3 ) p h 值对酶的影响 在一定的p h 值【2 “2 7 】下，氨基酸所带正电荷和负电荷相等，净电荷为零，此 时的p h 值称为氨基酸的等电点。由于氨基酸具有两性解离，其带电情况就取决 第一章绪论 于环境的p h 值。当氨基酸处于等电点时，由于所带正负电荷相等，在外加电场 中就不会发生移动；介质的p h 值小于氨基酸的等电点，氨基酸带正电荷，此时 在电场中向阴极移动；介质的p h 值大于氨基酸的等电点，氨基酸带负电荷，此 时在电场中向阳极移动；象其他蛋自质变性一样，酶的失活速度在大多数的情况 下决定于溶液中的p h 值。大多数的酶在室温下p h 值4 5 或8 1 0 的溶液中失活。 ( 4 ) 有机溶剂对酶的影响 在溶液中加入与水互溶的有机物，可通过改变溶剂的介电常数皿7 1 使酶分子 间的静电引力改变而发生沉淀，一些有机溶剂使酶造成不可逆的活性损失，以致 引起完全变性。 1 3 介孑l 材料 1 3 1 介孑l 材料的概念 按照国际纯粹与应用化学协会( i u p a c ) 的定义乜引，孔径在2 5 0 n m 范围内 的多孔材料称为介孔( 中孔) 材料。1 9 9 2 年，美国m o b ij 公司k r e s g e 等瞳卅人首先 报道了孔径在1 5 1 0 n m 范围内可调节的新型介孔分子筛m 4 l s 。分子筛的规则 孔径从微孔范围扩展到介孔领域，这对于很多在沸石分子筛中难以完成的大分子 催化、吸附与分离等过程，无疑开拓了广阔的应用前景。同时，由于介孔材料具 有规则可调节的纳米级孔道结构，可作为纳米“微型反应器”，为从微观角度研 究纳米材料的小尺寸效应、表面效应及量子效应等提供了必要的基础。因此，介 孔材料科学近年来已经成为国际上跨化学、物理、材料等多学科的热点前沿领域 之一，更成为分子筛科学发展的一个重要里程碑。 1 3 2 介孔材料的分类 介孔材料的分类方法通常按化学组成和结构来区分。 ( 1 ) 按照化学组成分类 可分为硅基和非硅基两大类口引：前者主要包括硅酸盐和硅铝酸盐等；后者主 要包括过渡金属氧化物、磷酸盐和硫化物等。后者由于一般存在可变价态，展示 出硅基介孔材料所不能及的应用前景，但非硅组成的介孔材料热稳定性较差，煅 烧时容易造成介孔结构塌陷，且比表面积、孔容均较小，合成机理也不完善，对 它的研究不如硅基介孔材料活跃。 ( 2 ) 按照介孔是否有序分类 第一章绪论 可分为无序介孔材料和有序介孔材料。其中有序介孔材料是2 0 世纪9 0 年代初 迅速兴起的一类新型纳米结构材料，它利用有机分子表面活性剂作为模板 剂，与无机源进行界面反应，以某种协同或自组装方式形成由无机离子聚集体包 裹的规则有序的胶束组装体，通过煅烧或萃取方式除去有机物质后，保留下无机 骨架，而形成多孔的纳米结构材料，在催化、吸附、分离、传感器及光、电、磁 等许多领域有潜在的应用价值。 1 3 3 介孑l 材料的结构与特点 通过使用不同的模板剂和采用不同的合成方法可得到不同结构特征的介孔材 料，现将较为常见的介孔材料归纳如表卜1 所示。 表卜l 常见的介孑l 材料及其结构特征 ! 垦b ! 呈! 二! 兰垒也巳! 宝! q ! 里笪q e q 翌坚! 堡垒! ! ! i 垒! ! 垒旦垡尘兰i ! i ! 型坐! 垒! 兰垒坚垒里! 星! ! m a t e r i a l p h a s e p o r ec h a n n e l p o r ed i a m e t e r ( n m ) 介孔材料具有以下特点口鄙： ( 1 ) 长程结构有序； ( 2 ) 孔径分布窄并在1 5 n m 1 0 n m 系统调变； ( 3 ) 比表面积大，可高达】0 0 0 m 2 儋； 第章绪论 ( 4 ) 孔隙率高； ( 5 ) 表面富含不饱和基团。 以常见的s b a 1 5 为例，其主要结构参数为：粒度为约1 0 0 妒，孔径约6 o n m ， 比表面积约8 3 0 m 2 名，孔容积约1 3 m 3 g 。 1 3 4 介孑l 材料的改性 作为一种新型的功能性材料，介孔材料在结构上具有一系列的优点，深受科 学工作者的广泛关注，在分离、催化及纳米组装等方面具有极大的潜在实用价值。 但是化学反应活性不高和稳定性较低等缺点大大限制了介孔材料的实际应用。因 此，对介孔材料进行化学改性成为介孔材料领域研究的热点课题汹3 。 1 3 4 1 介孔材料改性的目的 ( 1 ) 提高水热稳定性 利用疏水性的物质进行改性，可以提高介孔氧化硅材料的水热稳定性，而且 可以改变材料对气体的吸附性能。 ( 2 ) 提高催化活性 利用具有催化性能的物质进行改性，比如对介孔材料进行离子或金属掺杂， 能够进行特定的化学反应，开发介孔材料在催化领域中的应用。 ( 3 ) 实现特殊的目的 利用具有特定官能团的硅烷偶联剂进行改性，则能够实现特殊的目的，如经 过巯基表面改性后的介孔材料由于巯基与重金属离子具有很强的亲和性被认为 是一种具有重要应用价值的潜在环境材料。同样还可以利用这种方法将介孔材料 设计为纳米反应器，实现纳米材料在介孔材料孔道中的合成。 1 3 4 2 介孔材料改性的原理 介孔材料的化学改性包括对材料骨架的修饰以及对孔道表面的功能化。由介 孔材料的表面化学性质研究可知，介孔氧化硅材料的表面含有三种硅醇键，即自 由硅醇键、双羟基硅醇键和水合硅醇键，其中前两者具有高的化学反应活性，而 水合硅醇键则没有化学活性不能发生化学反应，但水合硅醇键受热可以转变成自 由硅醇键。具有化学活性的硅醇键是介孔材料表面化学改性的基础。通过表面硅 醇键与活性组分成键，把催化活性位引入孔道或骨架。而对骨架的修饰可以通过 引入金属离子，使其周围的电荷过剩产生较强的质子酸中心或路易斯酸中心，或 通过金属掺杂后产生离子交换位，将催化活性组分引入。 1 0 第一章绪论 1 3 5 介孔碳 介孔碳是最近发现的一类新型的非硅基介孔材料，由于具有巨大的比表面积 ( 可高达2 5 0 0 m 2 g ) 、孔体积( 可高达2 2 5 c m 3 儋) 和介孔结构的规则性使其在择形催 化、选择性吸附与分离、传感、储氢及电极材料制备等方面的应用成为可能。此 外，由介孔碳制得的双电层电容器材料的电荷储量高，与金属氧化物粒子组装后 的电容量相比更是远高于市售的金属氧化物双电层电容器啦刮。 合成介孔碳的通常方法是硬模板法，利用m c m 4 8 、s b a 1 5 等介孔分子筛为 模板，选择适当的前驱物，如葡萄糖等，在酸的催化下使前驱物碳化，沉积在介 孔材料的孔道内，然后用n a o h 或 c l 等溶掉s i 0 2 ，就得到介孔碳。m a n i n 等用 m c m 4 8 为模板，首次合成出介孔碳c m k 1 3 1 】。随后，l e e 等使用s b a 1 为模板 合成了c m k 2 别，v i n u 等使用s b a 1 5 为模板合成了c m k 一3 口3 1 。另外一种方法是 仅仅在介孔的孔道内壁沉积上一定厚度的碳，除去介孔s i 0 2 后，得到同样是二维 六方阵列的碳纳米空心管口引。这些介孔碳的空间群与介孔分子筛相似，但孔和骨 架与介孔氧化硅刚好相反。介孔碳分子筛作为一种新开发的材料，不仅可以替代 一般的多孔碳材料作为电极和催化载体礴5 3 引，而且由于碳容易通过焙烧除去， 也可以作为二次硬模板为其它介孔材料的合成提供了可能。最近s c h i l t h 等利用 c m k 3 为模板成功的合成出有序度很高的s b a 15 材料阳引。 短短的几年间，非硅介孔材料的合成研究已取得了显著的进展，但是相对于 介孔氧化硅材料来说，非硅组成的介孔材料的研究报道还相对较少，特别是高质 量介孔材料的合成、改性及应用研究等方面还有待深入。 1 3 5 1 几种典型的介子l 碳材料及其孔性能 几种典型的介孔碳及其孔性能列于表1 2 中。 第一章绪论 表卜2 几种具有代表性的介孔碳材料的合成与孔性质陟蚓 t a b l el - 2 s y n t h e s i sa n dp o r ep r o p e n i e so fs e v e r a l0 m c m a t e r i a l s 1 3 5 2 介孔碳的应用 介孔碳作为介孔材料的一类，具有高的比表面积、孔容以及良好的导电能力， 使得介孔碳的应用研究越来越活跃。介孔碳用于主客体组装、电极材料，将极大 地提高相关材料的性能。 近年来，锂离子电池的迅速发展，促进了制造锂离子电池所使用的相关高性 能材料的发展。各种介孔材料作为电极、隔膜在锂离子电池方面的研究也得到人 们越来越多的关注。为了获得高性能的锂离子电池负极材料，f a n 等汹3 采用硬模 板的方法首先制得了介孔碳材料，然后在其三维空间内“浇注”上锡，得到锡基 碳复合材料，该材料克服了锂离子嵌入后导致的体积变化以及l i s n 合金粒子之 间的聚集。这种新型纳米结构的复合材料作为锂离子电池负极材料显示出比一般 纳米锡基材料更加优良的循环性能。 介孔碳材料在储能设备双电层电容器( e d l c ) 中的应用基础研究也受到 了人们越来越多的关注。以往活性炭材料的孔径较小( 通常小于2 n m ) ，不利于 水合离子在其孔道内的快速迁移，其微孔的比表面积难以完全地得到利用，这使 得由它制得的双电层电容器不能满足脉冲大电流冲放电的需求。相对而言，介孔 碳材料具有更大的孔径，高的比表面积以及良好的导电能力，