（发酵工程专业论文）植物美白提取物的筛选及作用机理探索.pdf

植物美白提取物的筛选及作用机理探索 s t u d i e so nt h es c r e e n i n ga n dt h ea c ti o n m e c h a n is mo fw h it i n gp l a n te x t r a c t s 专 业： 筮醛王程一 研究生：王鹏 生物技术与食品科学学院 2 0 1 0 年4 月 中文摘要 皮肤色素沉着是由各种内、外因素引起的以面部色素形成过多为表现的病理 性变化，临床上常见于黄褐斑、雀斑和黑斑病等多种疾病。由于多方面因素的限 制，目前尚缺乏完全有效的美白剂治疗，但经国内外众多学者的研究，结果表明 植物提取物对于色素沉着性疾病具有一定的疗效。我们基于这个事实，从细胞分 子生物学角度，研究不同种植物提取物在皮肤美白功能方面的作用机理。 首先，以2 0 种常见的植物提取物为对象，研究其酪氨酸酶抑制作用和抗氧 化作用，筛选不仅具有强酪氨酸酶抑制活性，而且具有抗氧化性的植物提取物。 结果表明，2 0 种样品均表现出不同程度的酪氨酸酶抑制作用和抗氧化能力。其 中，绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃具有显著的酪氨酸酶抑制活性和强抗氧化能力。 其次，以b 1 6 小鼠黑素瘤细胞为受试细胞，探讨葡萄籽、绿茶、巴西大樱 桃3 种样品对细胞的增殖、酪氨酸酶的活性及黑色素合成的抑制作用。结果表明， 葡萄籽、绿茶、巴西大樱桃3 种样品对细胞内酪氨酸酶活性和黑色素的合成具有 显著的抑制作用，而且无毒副作用。我们还证明了葡萄籽提取物对黑素瘤细胞内 酪氨酸酶的蛋白表达有下调作用。 在上述研究的基础上，以m r c 5 人胚肺成纤维细胞为受试细胞，考察绿茶、 葡萄籽、巴西大樱桃3 种样品对h 2 0 2 氧化损伤细胞模型的抗氧化保护作用。结 果表明，上述3 种植物提取物能有效地减轻h 2 0 2 对m r c 5 细胞的损伤，并对细 胞内的r o s 活性氧具有一定的清除作用。 最后，对绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃3 种植物提取物进行了h p l c 纯化及 l c m s 的成分分析，发现三种植物提取物中可能的有效成分是维生素c 或原花 青素类物质。此外，将植物提取物制成美白化妆品成品，并对美白功效进行了验 证试验，为化妆品美白原料的选择提供参考。 通过上述实验，证实了绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃3 种植物提取物具有抑制 黑素瘤细胞黑色素合成的作用，其作用机理可能在于：可以直接抑制黑素瘤细 胞内的酪氨酸酶的蛋白表达。对酪氨酸酶活性的抑制和强抗氧化能力也对阻断 黑色素合成具有重要作用。另外本实验还证实，无细胞系统蘑菇酪氨酸酶抑制试 验适于美白植物提取物的筛选，而黑素瘤细胞黑色素合成的抑制实验能更准确地 判定美白植物提取物的功效和机理。 关键词：植物提取物；酪氨酸酶；抗氧化性；b 1 6 黑素瘤细胞；m r c 5 人胚肺 成纤维细胞；功效评价 a b s t r a c t h y p e r p i g m e n t a t i o ni sak i n do fp a t h o l o g i c a lv a r i a n tc a u s e db yv a r i o u si n t e r n a l a n de x t e r n a lf a c t o r sa n dc h a r a c t e r i z e db yb r o w np a t c h e s ，i n c l u d i n gs u c hd i s e a s e sa s c h l o a s m a , f r e c k l e ，a n dm e l a n o s i s d u et ov a r i e dl i m i t a t i o n s ，t h es a f ea n ds u c c e s s f u l t r e a t m e n t sa r el a c k i n g i t ss h o w e dt h a tv a r i e dp l a n te x t r a c t sc a nb eu s e da sa d e p i g m e n t i n ga g e n ta c c o r d i n gt ot h ec l i n i c a lt r i a l s o ，w em a d eas t u d yo ft h ea c t i o n m e c h a n i s mo f t h i se f f e c to nt h eb a s i so f m o l e c u l a rb i o l o g i c a lp r i n c i p l e f r i s t l y , o u ro b j e c t i v ew a st oi n v e s t i g a t et h ee f f e c t so ft w e n t yp l a n te x t r a c t s ( g r e e nt e ae x t r a c t ，g r a p es e e de x t r a c ta n ds oo n ) a g a i n s tt y r o s i n a s ea c t i v i t ya n d r a d i c a lf o r f u r t h e rs c r e e n i n gp l a n te x t r a c t s ，w h i c hp o s s e s s e dn o to n l yt y r o s i n a s e i n h i b i t o r ya c t i v i t i e sb u ta l s oa n t i o x i d a n tc a p a c i t ys i g n i f i c a n t l y i t sr e s u l t ss h o w e dt h a t t w e n t ys a m p l e so w n e db o t ht y r o s i n a s ei n h i b i t o r ya c t i v i t i e sa n da n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s a tv a r i o u sl e v e l s g r e e nt e ae x t r a c t ( g s e ) ，g r a p es e e de x t r a c t ( g s e ) a n db r i z i ll a r g e c h e r r ye x t r a c t ( b l c e ) e x h i b i t e ds t r o n g e rt y r o s i n a s ei n h i b i t o r y a c t i v i t i e sa n d a n t i o x i d a n tc a p a c i t yt h a no t h e r s i nt h es e c o n dp a r t ，m e l a n o m ab16c e l l sw e r ee m p l o y e di nt h i ss t u d y , t h e i n t e r f e r e n c eo ft h r e ep l a n te x t r a c t s ( g t e ，g s ea n db l c e ) i nt h em e t a b o l i s mo f m e l a n o c y t e sw a se v a l u a t e d ，i n c l u d i n ge f f e c t so nt h ep r o l i f e r a t i o no fc e l l s ，t y r o s i n a s e a c t i v i t ya n d m e l a n i nc o n t e n t i tp r o v e dt h a tt h r e ep l a n te x t r a c t sh a df e w e re f f e c t so n p r o l i f e r a t i o no fc e l l s ，a n da tt h es a m et i m ei tc a l li n h i b i tt h ea c t i v i t yo ft y r o s i n a s ea n d m e l a n i nb i o s y n t h e s i so fm e l a n o c y t e s i na d d i t i o n ，w ef o u n dt h a tg s ec a n d o w n r e g u l a t et h ep r o t e i ne x p r e s s i o no ft y r o s i n a s ei nm u r i n eb 16m e l a n o m a b a s e do nt h es t u d i e so fa b o v em e n t i o n e dm a i n l y , ( m r c - 5 ) h u m a nf e t a ll u n g d i p l o i df i b r o b l a s tw e r ee m p l o y e di nt h i ss t u d y , t h ep r o t e c t i v ee f f e c to ft h r e ep l a n t e x t r a c t s ( g t e ，g s e a n d b l c e ) a g a i n s t o x i d a t i v es t r e s sw a se v a l u a t e du s i n g h 2 0 2 - i n d u c e do x i d a t i v es t r e s so fh u m a nd i p l o i df i b r o b l a s t sm r c 一5c e l lm o d e l o u r r e s u l t ss h o w e dt h r e ep l a n te x t r a c t sa t t e n u a t e dh 2 0 2 - i n d u c e dc e l l u l a ro x i d a t i v ed a m a g e o u rf i n d i n g sd e m o n s t r a t e dt h a tg s ec a np r o t e c ta g a i n s to h 2 0 2 - i n d u c e dh u m a nd i p l o i df i b r o b l a s t sc e l ld e a t h f i n a l l y , g t e ，g s ea n db l c ew e r ea n a l y z e db yh p l c l c - m s ，t h e i n v e s t i g a t i o nf o u n dt h a t e f f e c t i v e c o m p o n e n t so ft h r e ep l a n te x t r a c t sm a y b e p r o a n t h o c y a n i d i n sa n dv i t a m i n ec ，w h i c hm a yd e t e r m i n et h ec o n t r i b u t i o nt ot h et o t a l s k i nw h i t i n gp r o p e r i t i e s i nt h em e a n t i m e ，t h ee f f i c i e n c ye v a l u a t i o no fs e v e r a le x t r a c t s m a d ef r o mw h i t e n i n gc o s m e t i cp r o d u c t sw a si n v e s t i g a t e d i ti sd a t at h a tm a y p r o v i d e m a t e r i a ls e l e c t i o nw i t hr e f e r e n c et ow h i t e n i n gc o s m e t i c si n d u s t r y a l lt h ea b o v ee v i d e n c e sp r o v e dt h a tg t e ，g s ea n db l c ec a ni n h i b i tt h e m e l a n i nb i o g e n e s i s ，t h ed i r e c tr e a s o ni st h er e d u c t i o no fp r o t e i n e x p r e s s i o no f t y r o s i n a s ei nm e l a n o c y t e s ；t h eo t h e ri st h e i rm a r k e d l ya n t i o x i d a n ta n dt y r o s i n a s e i n h i b i t i o n p r o p e r t i e s s ow es u g g e s tt h a tt h en o n - c e l l u l a rm u s h r o o mt y r o s i n a s e i n h i b i t i o ne x p e r i m e n tm a yb ea d o p t e da sa 虹n do fi n i t i a lt r a i lf o r t h es e l e c t i o no fn e w d e p i g m e n t i n gc o m p o u n d s w h i l e ，t h ee f f i c i e n c ye v a l u a t i o no fd e p i g m e n t i n ga g e n t s h o u l db et e s t e dw i t l lt y r o s i n a s ea c t i v i t yi n h i b i t i o ne x p e r i m e n to f m e l a n o c y t e s k e yw o r d s ：p l a n te x t r a c t s ；t y r o s i n a s e ；a n t i o x i d a n t ；b16m e l a n o m ac e l l ；m r c 一5 h u m a nf e t a ll u n gd i p l o i df i b r o b l a s t ；e f f i c i e n c ye v a l u a t i o n 目录 第一部分前言 1 1 1 天然酪氨酸酶抑制剂的研究进展2 1 1 1 竞争性天然酪氨酸酶抑制剂 2 1 1 2 非竞争性天然酪氨酸酶抑制剂3 1 1 3 线性混合竞争性天然酪氨酸酶抑制剂4 1 1 4 其它植物提取物对酪氨酸酶的抑制作用的相关参数 4 1 2 皮肤美白剂功效评价的主要方法 6 1 2 1 细胞水平的功效评价6 1 2 2 动物试验法 6 。 1 2 3 人体皮肤试验法6 1 2 4 细胞生物学培养法 7 1 3 本课题的背景和意义7 第二部分美白植物提取物的初步筛选 9 2 1 材料9 2 2 试剂、耗材与仪器 9 2 3 实验方法 1 0 2 3 1 无细胞系蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验 1 0 2 3 2 无细胞系统自由基清除能力的测定， 1 1 2 4 实验结果 1 1 2 4 1 无细胞系蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验 1 1 2 4 2 无细胞系统自由基清除能力的测定 1 2 2 4 3 葡萄籽、绿茶、巴西大樱桃提取物活性的功效比较 1 3 2 5 讨论1 5 第三部分绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃提取物对体外培养b 1 6 黑素瘤细胞黑色素合成 代谢的影响 1 7 3 1 材料1 7 3 2 耗材与仪器 1 9 3 3 实验方法1 9 3 3 1 三种植物提取物对黑素瘤细胞增殖的影响1 9 3 3 2 三种植物提取物对黑素瘤细胞黑色素合成的影响2 0 3 3 3 三种植物提取物对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响 2 0 3 3 4 葡萄籽提取物对黑素瘤细胞酪氨酸酶的蛋白表达的调节作用2 0 3 4 实验结果2 2 3 4 1 三种植物提取物对黑素瘤细胞增殖的调节作用 2 2 3 4 2 三种植物提取物对黑素瘤细胞黑素合成的调节作用 2 3 3 4 3 三种植物提取物对黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的调节作用 2 4 3 4 4 葡萄籽提取物对黑素瘤细胞酪氨酸酶蛋白表达的调节作用 2 4 3 5 讨论2 5 第四部分绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃提取物对体外培养的m r c 5 人胚肺成纤维 细胞的抗氧化保护作用 2 8 4 1 材料2 8 4 2 耗材与仪器2 8 4 3 实验方法2 8 4 3 1 绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃对h 2 0 2 氧化损伤的m r c 5 细胞的保护作用2 9 4 3 2 葡萄籽提取物对体外培养的m r c 5 细胞内的( i 的s ) 活性氧的清除作用2 9 4 4 实验结果：2 9 4 4 1m r c 5 细胞h 2 0 2 氧化损伤模型的建立 2 9 4 4 2 绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃对h 2 0 2 氧化损伤的m r c 5 细胞的保护作用3 0 4 4 3 葡萄籽提取物对体外培养的m r c 5 细胞内的( r o s ) 活性氧的清除作用3 1 4 5 讨论3 2 第五部分绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃提取物纯化、成分分析及美白化妆品的功效 3 5 验证 5 1 材料：3 5 5 2 耗材与仪器：3 5 5 3 实验方法3 5 5 3 1 绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃的h p l c 纯化和l c m s 成分分析3 5 。5 3 2 美白化妆品的功效验证 3 6 5 4 实验结果3 6 5 4 1 绿茶、葡萄籽、巴西大樱桃的h p l c 纯化和l c m s 成分分析3 6 5 4 2 美白化妆品的功效验证3 9 5 5 讨论4 0 参考文献j 。 4 2 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明5 0 致谢 5 1 第一部分前言 人类皮肤的颜色取决于黑色素的含量与分布，黑色素形成的生理过程基本可 以概括为3 个阶段：黑色素细胞产生黑色素；黑色素颗粒通过黑色素细胞树枝状 突起向角朊细胞转移；转移至角朊细胞的黑色素颗粒随表皮细胞上行至角质层， 并随角质层脱落而排泄【l 】。但是由于受紫外线、遗传、内分泌、炎症介质、饮 食不当等因素的影响，黑素代谢异常，皮肤黑素过快增长和分布不均，就会造成 局部皮肤过黑及色素沉着，表现为黄褐斑、雀斑和炎症后色素沉着等病症。 酪氨酸酶t y r o s i n a s e ( e c 1 1 4 1 8 1 ) 又称多酚氧化酶，它广泛存在于动植 物体和人体内，是生物体合成黑色素的关键酶【2 翔。在过去的3 0 年里，酪氨酸酶 在许多领域中都作为不可或缺的工具酶来使用。1 9 9 5 年，b o u r q u e l o t 和b e r t r a n d 在对真菌r u s s u l an i g r i c a n s 的研究中，发现这种蘑菇的新鲜切片在空气中会由红 变黑，经分析第一次发现了这种酶。后来，这种酶被鉴定为酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) 。 普通的蘑菇和人体非良性黑素细胞酪氨酸酶的活性中心是一种双核铜聚合物，酪 氨酸酶在高等植物和菌类中以多种形式存在，如未成熟状态、成熟的休眠状态以 及活化状态。然而，关于其动力学特征和各种类型之间的关系才刚刚开始被研究 【4 1 o 目前公认的黑色素合成途径是：酪氨酸一多巴酸一多巴醌一多巴色素( 或二 羟基吲哚酸) 一黑色素低聚体一黑色素。常用的美白化妆品的主要作用恰恰在于 影响酪氨酸酶、黑色素细胞及黑色素的新陈代谢。由于黑色素合成量与酪氨酸酶 的活性呈正相关，所以抑制其活性从而减少黑色素的生成，将有助于治疗色素沉 着性皮肤病。随着化妆品行业的飞速发展，“组份天然化及“回归大自然 的 呼声已成为化妆品工业的潮流，化妆品的原料天然化倍受重视。“纯天然”酪氨 酸酶抑制剂日益成为化妆品中的一个主要组成部分。因此，寻找有效且对人体无 不良反应的天然酪氨酸酶抑制剂已成为药学和化妆品行业研究的趋势。过去二十 年黑素细胞和黑色素合成的生化和激素的调节的研究已取得重大的进展，为现代 美白化妆品的研发提供了科学依据和理论基础。我国中草药资源丰富，天然植物 制药的历史悠久，但有关于此的科学开发与运用研究相对滞后，而将其用于化妆 品有效成份的生理功效实验研究则更为匮乏。 1 1 天然酪氨酸酶抑制剂的研究进展 近年来，酪氨酸酶抑制剂的研究非常活跃，随着许多酪氨酸酶抑制剂问世， 如早期的纯化学物氯化氨基汞、过氧化氢及氢醌，中期的果酸和近期的天然植物 提取物熊果苷、v i t c 衍生物、绿茶提取物、甘草提取物、曲酸及其衍生物以及肉 皮素拮抗剂等大量化学合成的抑制剂及植物来源的天然抑制剂得到开发应用，酪 氨酸酶抑制剂被应用到各个领域中。 根据抑制剂与酶的作用方式的不同，酪氨酸酶的抑制类型有竞争性抑制、非 竞争性抑制、线性混合竞争性抑制几种类型。 1 1 1 竞争性天然酪氨酸酶抑制剂 陈贵霞等【5 】研究了桑黄素对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用。结果表明：桑黄素对 蘑菇酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用。而且桑黄素对蘑菇酪氨酸酶 抑制作用的k m 值随着抑制剂浓度的增大而增大，而v 0 不随着抑制剂浓度增大而 变化。表明酶底物的亲和力下降，抑制剂的存在阻碍了底物和酶的结合，可知桑 黄素对二酚酶的抑制作用表现为竞争性可逆抑制作用。 邓湘庆等【6 1 研究了川芎提取物对酪氨酸酶的抑制作用。结果表明：川芎提取 物对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用，抑制率达到5 0 的川芎提取物 浓度i c 5 0 值约分别为0 2 6s l 和0 5 0g l ，比熊果苷抑n - 酚酶活性的i c 5 0 值 1 4 4g l 4 , 得多。并确定酶的抑制作用表现为竞争性抑制，对酪氨酸酶的抑制常 数为0 2 0g l 。 杨景冲【7 】等对滨海白首乌提取物对酪氨酸酶的抑制活性进行研究。结果表 明：白首乌提取物对酪氨酸酶抑制作用显著，白首乌提取物最终浓度8 0 0 # g m l 时，酶活力相对维生素c 抑制率达5 6 以上。白首乌提取物的存在阻碍了底物和 酶的结合对酪氨酸酶的抑制类型是竞争性抑制。 综上所述，竞争抑制性作用特点为：a 竞争性抑制剂往往是酶底物的结构类 似物；b 抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c 抑制剂浓度越大， 则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d 动力学参数：k m 值增 大，v m 值不变。 本文针对黄酮醇一山萘酚f 8 1 、2 羟基一4 一甲氧基苯甲醛【9 1 、3 ，4 一二羟苯甲醛、 一2 一 前言 5 一羟甲基一2 一糠醛1 0 1 、桑黄素嘲、甘草黄酮1 1 1 、栎精f 1 2 】、异甘草素一葡萄糖芹菜甙、 异甘草甙、甘草查耳酮甲【1 3 1 、b u d d l e n o i da 、b u d d i n o i db 【1 4 1 、r e dk o j i 1 5 1 、 k a e m p f e r o l 1 们、n o b i l e 血【1 7 1 、川芎【6 】、大豆异黄酮【1 8 】、滨海白首乌阴、黄苓【1 9 】等 多种天然酪氨酸酶抑制剂的抑制活性相关常数进行总结( 见表1 1 ) 表1 12 0 种天然活性成分对酪氨酸酶活性的影响 t a b l - le f f e c to f t w e n t yp l a n ta c t i v ec o m p o n e n t so nt y r o s i n a s ea c t i v i t y 注：i c 5 0 值是指达到5 0 抑制率时的样品浓度 1 1 2 非竞争性天然酪氨酸酶抑制剂 龚静等【2 0 1 对红景天水提液对酪氨酸酶的抑制活性的研究表明：红景天水提 液的i c 5 0 值为3 9 m g r r d ，在6 0g m l 浓度以下红景天提取液随着浓度的增加其抑制 率也明显呈线性变化。红景天水提液对酪氨酸酶表现为非竞争性抑制。说明红景 天水提物与酪氨酸酶分子上的独立部位结合，不与底物竞争活性中心。 龚盛昭等【2 1 1 对肉桂酸对酪氨酸酶的抑制作用的研究表明：肉桂酸对酪氨酸 酶单酚酶和二酚酶活性均有良好抑制作用，对单酚酶和二酚酶活力的相对抑制率 达到5 0 的肉桂酸浓度i c 5 0 值约分别为0 3 7m m o f l 和o 6 1m m o f l 。肉桂酸对酪氨 酸酶活性的抑制属于非竞争性可逆抑制类型的特征。 一冀一 前言 综上所述，非竞争性抑制作用特点为：a 抑制剂与底物可同时与酶的不同部 位结合；b 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用：c 动力学参数l ( 仃l 值 不变，v m 降低。 本文针对茴香酸、茴香醛【2 2 】、银杏叶提取物【2 3 1 、3 , 4 二羟基肉桂酸、4 羟基 3 甲氧基肉桂酸【州、9 一羟基一4 甲氧基补骨脂素【2 5 1 、橘皮苷【1 7 1 、橘皮香精油【2 6 1 、 红景天水【2 0 1 、肉桂酣2 1 】等多种天然酪氨酸酶抑制剂的抑制活性的相关参数进行 总结。( 见表1 2 ) 表1 - 2 8 种天然活性成分对酪氨酸酶活性的影响 t a b l - 2e f f e c to f e i g h tp l a n ta c t i v ec o m p o n e n t s0 1 1t y r o s i n a s ea c t i v i t y 1 1 3 线性混合竞争性天然酪氨酸酶抑制剂 龚盛昭等【2 7 1 对从牡丹皮中提取的丹皮酚对酪氨酸酶活性的影响进行研究， 结果表明：导致酪氨酸酶活力下降5 0 的丹皮酚浓度为0 6 0m m o l l ，从而确定 丹皮酚是酪氨酸酶的混合型抑制剂i 邱凌等【2 8 】对芦荟皮酪氨酸酶抑制剂有效成分进行研究，研究表明：芦荟皮 质部提取物对蘑菇酪氨酸酶有较强的抑制作用，其i c 5 0 值为0 4 3 9m g m l 。并确定 其抑制类型属于混合型。 黄璜等对曲酸作为化妆品添加剂的增白作用机理进行研究，研究表明： 曲酸对酪氨酸酶的单酚酶和二酚酶活性均有抑制作用。其效应为可逆抑制效应。 测定导致单酚酶活力和二酚酶活力下降5 0 的抑制剂浓度( i c 5 0 ) 分别为3 1 o 和 2 0 0 # m o l l 。曲酸的抑制机理表现为混合型效应。 1 1 4 其它天然提取物对酪氨酸酶的抑制作用的相关参数 前言 针对仙蜜果粉末( 花瓣、花苞、花芯) 【3 0 】、谷胱甘肽、壳低聚糖、低聚糖、 熊果苷【3 1 1 、繁缕、律草、鬼针草【3 2 】、带氯菌素、白藜芦醇、氧化白藜芦醇、茶 多酚、五倍子、泥湖菜、白芨、大蓟、黄杨【3 3 1 、3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，8 一六甲氧基黄酮蚓、 黑米糠提取液【3 5 】等多种天然酪氨酸酶抑制剂进行总结。( 见表1 3 ) 表1 - 33 3 种天然活性成分对酪氨酸酶活性的影响 t a b l 3e f f e c to f t h i r t y - t h r e ep l a n ta c t i v ec o m p o n e n t so nt y r o s i n a s ea c t i v i t y 名称采集源 提取物浓度酪氨酸酶的抑制率 仙蜜果粉末 熊果苷 谷胱甘肽 壳低聚糖 壳聚糖 繁缕 乌韭 垂盆草 j 辜草 鬼针草 带氯菌素 白藜芦醇 氧化白藜芦醇 茶多酚 葛根黄酮 五倍子 牡丹皮 苦参 天麻 地骨皮 六月雪 双花 泥湖菜 炒川断 苍耳子 连翘 威灵仙 白芨 大蓟 黄杨 3 4 ，5 ，6 ，7 ，8 六甲氧 基黄酮 黑米糠提取液 仙蜜果花瓣 仙蜜果花苞 仙蜜果花芯 植物提取物 化学合成物 壳聚糖衍生物 海产品外壳 繁缕地上部分 乌韭全草 垂盆草全草 j 辜草地上部分 鬼针草全草 大绿柄桑木 葡萄 桑 绿茶 葛根 五倍子虫瘿 牡丹皮根皮 苦参根 天麻根 地骨皮根 六月雪地上部分 双花一花 泥湖菜鲜叶 炒川断根 苍耳子种子 连翘果实 威灵仙根 白芨茎 大蓟全草 黄杨干叶 c i t r u sf r u i t 黑米糠 0 6 6m g m l 质量分数1 5 0 2 o 8 0 8 0 5m g m l 0 2m g m l 0 2m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 1 3 # m o l l 5 4 6 z m o l l 1 5 # m o l l 2 m m o l l 2 m n l o l l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5 m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 0 5m g m l 4 6 2n 毕g l o 4m g m l 8 8 4 4 9 7 4 7 5 9 4 8 8 4 0 5 8 5 。0 0 8 4 5 0 8 0 0 0 4 4 7 0 2 6 8 0 1 5 6 0 1 1 7 0 5 6 0 5 0 0 0 5 0 0 0 5 0 0 0 5 1 4 9 3 2 1 8 8 6 0 0 6 2 8 0 5 8 1 0 4 6 5 0 4 5 8 0 5 1 1 0 4 1 2 0 5 0 7 0 4 6 8 0 5 4 3 0 4 4 5 0 1 6 2 0 1 7 2 0 1 5 3 0 4 0 8 0 5 0 0 0 8 0 5 0 前言 1 2 皮肤美白剂功效评价的主要方法 目前，市场上充斥着大量皮肤美白的产品，广大的消费者只能通过广告宣 传来了解皮肤美白产品的功效。而且，目前我国还未出台一套评价皮肤美白产品 的标准程序，所以皮肤美白剂的功效评价方法也多种多样。此部分根据王寒清等 3 6 1 对皮肤美白剂功效评价的研究为基础，概括总结出几种较为流行的皮肤美白 剂功效评价方法，为皮肤美白剂的功效验证方面的工作提供参考。 1 2 1 细胞水平的功效评价 1 2 1 1 测定培养细胞中酪氨酸酶的活性 评价美白化妆品的功效主要以检测施加美白化妆品有效成分后，是否抑制酪 氨酸酶活性为主要手段，而酪氨酸酶活性检测方法有放射性同位素法、免疫学法 和生化酶学法，其中以生化酶学法较为简单成熟。酶的来源可以从蘑菇，也可以 从b 1 6 黑色瘤细胞或动物皮肤中得到。 1 2 1 2 测定样品对细胞黑色素含量的影响 美白化妆品功能评价的最重要检测指标就是细胞中黑色素含量的测定。到目 前为止，一直采用分光光度法测定黑素细胞中的黑色素含量，此方法经典稳定， 但由于需要将被测细胞破碎，专门提取黑色素进行比色分析，从而导致操作步骤 比较复杂，实验要求高，使其应用受到一定的限制。 1 2 2 动物试验法 将黄棕色豚鼠背部两侧剃毛成若干1c r u x 2c i i l 大小的去毛区。用棉棒将化妆 品依次涂一圈，每日2 次。另设去毛皮肤空白区对照。2 8 天后，取豚鼠皮肤活组 织进行检查。固定、包埋和切片，对基底细胞中含黑色素颗粒细胞及多巴阳性细 胞计数，与去毛皮肤空白区进行对照比较。该方法采用黄棕色豚鼠，其皮肤黑素 细胞和黑素小体的分布近似于人类，试验结果重复性好，较小鼠模型更宜用于研 究化妆品的美白功能。 1 2 3 人体皮肤试验法 1 2 3 1 色素沉着的抑制效果试验 随机选择皮肤健康的成人前臂内n 2c mx 2c m 区域为受试部位，一侧为试验 区，一侧为对照区。每周末用色度计测定一次。根据皮肤色度减退程度评价美白 剂的功效。 前言 1 2 3 2 用实际使用试验测定污斑改善效果 实际使用试验的评价方法是凭视感制定，用图像解析进行污斑的定量化， 确认增白剂污斑的改善效果。目前，建立的增白效果的测定方法是测定紫外线照 射后二次黑化的预防和减弱。用图像解析法测定污斑的改善效果的尝试被各化妆 品厂采用，而目前测定污斑明确改善效果的报告几乎没有。 1 2 4 细胞生物学培养法 采用黑色素瘤细胞进行培养，由于黑素瘤细胞具有能够多次传代、生长快和 培养条件相对较低等优点，成为筛选美白剂时的首选细胞。利用细胞生物学方法 可以从多个途径分析黑色素的形成机理： ( 1 ) 光镜观察：黑色素瘤细胞的存活状况、外部形态及黑色素合成量。 ( 2 ) 四唑盐比色( m m t ) ：测定观察组和对照组吸光度值，根据吸光度值计算 细胞增殖指数，观察美白剂对黑色素瘤细胞生长情况的抑制作用。 ( 3 ) 化学分析法或免疫学方法对酪氨酸酶活性或含量进行测定，观察美白剂对 酪氨酸酶的抑制作用。 ( 4 ) 通过分子生物学方法对黑色素合成过程中相关酶( 酪氨酸酶，d h i c a 氧化 酶和多巴色素互变酶) 的m r n a ( 信使核糖核酸) 、d n a ( 脱氧核糖核酸) 的表达水平及酪氨酸酶合成量进行测定，以评价美白剂对这些酶的影响。 ( 5 ) 人体试用法结合仪器测定。人体试用法一般以人体前臂皮肤为受试部位， 以避免光照对于皮肤色度的影响。将美白剂涂于人体皮肤上，用皮肤颜色 测定仪观察涂敷美白剂前后肤色的变化，评价美白效果。 1 3 本课题的背景和意义 目前化妆品市场上的美白产品大多数以酪氨酸酶抑制剂为主，并且每年以较 快的速度发现新的该类化合物。虽然随着研究的深入，会出现不仅仅只是通过抑 制酪氨酸酶而达到降低黑色素生成的美白剂，但是酪氨酸酶抑制剂仍占据非常重 要的地位。这类化合物主要来源于植物提取物，它们不仅可以达到抑制黑色素合 成和沉积的作用，而且具有保护皮肤免受内、外界有害物质侵害，改善皮肤环境、 防止皮肤老化的作用3 7 1 。 然而，目前可用于商业用途的酪氨酸酶抑制剂种类很少。美白剂发展思路还 存在许多局限性，如天然、高效的活性原料较少；美白剂的研究开发多限于单一 前言 黑色素形成酶的限制，美白剂间的协同效应的研究较少；酪氨酸酶抑制剂中的有 效成分不清楚等。另外，对这些酪氨酸酶抑制剂的细胞毒性、低稳定性都限制了 它的应用。 科学全面的设计理念是皮肤美白剂发展的关键。我们在开发美白剂的过程 中，认识到功效活性成分必须具备以下一种或几种功能：( 1 ) 抑制黑色素细胞 增殖。( 2 ) 抑制黑色素形成：抑制酪氨酸酶、多巴互变酶、d h i c a 氧化酶 活性；还原黑色素形成过程各中间体，或与之结合以阻断黑色素形成。阻断二 羟基吲哚( d m ) 聚合为黑色素。( 3 ) 抑制黑色素颗粒转移至角朊细胞。( 4 ) 加速角朊细胞中黑色素向角质层转移；软化角质层和加速角质层脱落。( 5 ) 减 少外源性因素如紫外线、氧自由基等对黑色素形成生理过程的负面影响【3 引。 对于美白剂功效评价的相关研究，主要通过考察活性成分对酪氨酸酶活性的 抑制程度，来评价其效用。而依据不同功能综合评价美白剂功效的实验研究还很 少。基于市场上天然皮肤美白剂缺乏和美白剂功效评价模式单一的缺陷，本实验 选取市场上流行的、可能具有一定美白效果的天然植物提取物为筛选对象，在参 考气血调和的原料基础上，对这些提取物的酪氨酸酶抑制能力和抗氧化能力进行 考察，欲筛选出高效的天然的美白原料，从而为化妆品原料的选择提供依据，为 高效、无副作用美白化妆品的开发奠定基础。 第二部分 第二部分美白植物提取物的初步筛选 酪氨酸酶( e c1 1 4 1 8 1 p p o ) ，是一种含铜糖蛋白，广泛存在于自然界中， 它是生物体合成黑色素的关键酶。美白剂通过抑制酪氨酸酶的活性，从而达到抑 制黑素细胞黑色素合成，发挥美白功效。而酪氨酸酶作用的发挥离不开自由基的 强氧化作用，超氧阴离子具有激发黑色素合成过程的作用，而羟基自由基是造成 皮肤老化、黄褐斑产生的重要原因。 首先以美白领域较为流行的美白剂熊果苷和维生素c ( v c ) 作为对照，观察 2 0 种常见的植物提取物对无细胞系统酪氨酸酶活性的影响。其次，测定具有显 著酪氨酸酶抑制活性的植物提取物对无细胞系统的羟基自由基和超氧阴离子自 由基的清除能力，通过上述实验初步筛选出兼具强酪氨酸酶抑制活性、强抗氧化 性的植物提取物，为进一步进行美白作用机理研究提供实验材料。 2 1 材料 本实验共选择2 0 种常见的植物提取物。其中芦荟提取物、绿茶提取物、蝉 衣提取物、根皮提取物、沙棘提取物、芒果提取物、珍珠绣线菊提取物、茴香提 取物购自庆阳康贝利通生物公司，桑椹提取物、苦参提取物、苍耳子提取物、桑 树提取物、白芷提取物、龙眼多糖提取物购自西安三江生物公司，葡萄籽提取物 购自河北宝恩生物公司；灵芝提取物、甘草提取物、丹参提取物购自湖州珍露生 物公司，巴西大樱桃提取物、瓜拉那提取物购自大连闻达国际有限公司；熊果苷 由北京诚志生物公司提供；维生素c ( v e ) 由天津天狮生物发展有限公司日化实验 室提供。 2 2 试剂、耗材与仪器 l - d o p a 、蘑菇酪氨酸酶( s i g m a 公司) ；抗羟自由基试剂盒、抗超氧阴离子 自由基试剂盒( 南京建成生物工程研究所) ；0 4 5 # i n 滤头( h y e l o n e ) ；离心管； 石英比色1 1 1 1 ；n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 、n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 均为市售分析纯；t 6 分光光度计 ( 北京普析通用仪器有限公司) ，电热恒温水浴锅( 上海精宏实验设备有限公 司) ；漩涡混合器( 上海环球物化有限公司) 。 一。一 第二部分 2 3 实验方法 2 3 1 无细胞系蘑菇酪氨酸酶活性抑制实验 1 样品配制： ( 1 ) 初步筛选样品的配制：用磷酸缓冲液溶解样品，将每种样品均配制成浓度 为1m g m l 的样品待测。 ( 2 ) 进一步筛选样品的配制：用磷酸缓冲液溶解样品，将每种样品分别配制成 浓度为0 1 、0 2 5 、o 5 、1 0 、5 0 、1 0 0 、1 5 0 、2 0 0m g m l 的样品并用0 4 5 a n 的 滤头过滤备用。 2 体外酪氨酸酶抑制活性的测定： 对马晶波【3 9 】体外酪氨酸酶抑制研究方法做了改进，取2m 1 含不同浓度的植物 提取物样品( 空白样以磷酸缓冲液代替) 与酪氨酸酶( 1 0 0 u ) 的混和液，3 7 孵育1 0m i n ，加入0 0 0 3 m o l l 多巴反应液1m l ，继续在3 7 孵育2m i n ，立即在 4 7 5n l n 处测吸光度。并选取抑制活性较高的1 0 种样品进行进一步研究。酪氨酸酶 活性抑制率按下列公式计算： 抑制率= ( a - b ) 一( c d ) ( a b ) ) x 1 0 0 ( 2 1 ) 、 其中，a 为未加样品加酪氨酸酶的混合液在4 7 5n l n 处测得的吸光度；b 为未 加样品且未加酪氨酸酶的混合