（动物学专业论文）胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因igf2和h19+mrna表达的影响.pdf

胰岛素对小鼠早期胚胎 印迹基因i g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响 中文摘要 本研究旨在探讨胰岛素对小鼠植入前胚胎印迹基n i g f 2 和h 1 9m r n a 表达的 影响，并通过胚胎体外添加胰岛素培养和胚胎母体糖尿病环境的实验，从分子水 平探讨胰岛素对胚胎发育的分子机理。 1 体外实验 将收集的2 - c , e l l 胚胎平均分为两份，分别置于加入o 2 5 删h 塔的k s o m 培 养液和不加h l s d m o n s ) 的k s o m 中体外培养4 8 小时，发育至早期囊胚转移入同期 假孕的正常母鼠子宫角。实验发现：实验组囊胚发育率高于对照组9 3 4 ，配对t 检验显示差异极显著( p o 0 1 ) ；实验组出生重比对照组高1 6 1 ，配对t 检验差 异极显著( p 0 0 1 ) ；r e a l - t i m e r t - p c r 检测至h a s 组早期囊胚i g f 2 和h 1 9 m r n a 表达量分别是对照组的1 8 倍和2 2 倍；半定量r t - p c r 和r e a l t i m ep c r 对第1 4 天胚胎i g f 2 h 1 9 的m r n a 表达检测结果显示：实验组i g f 2 和h 1 9m r n a 表达量 均显著高于对照组( p 1 8 m m o l l 的糖尿病小鼠与正常雄鼠交配，取发育至1 4 天的胚胎，用半定量r t - p c r 和 r e a l - t i m ep c r 两种方法对i g f 2 和h 1 9 基因的m r n a 表达水平进行检测。结果发现： 糖尿病仔鼠的出生重比对照组低2 7 o ( p 0 0 1 ) ；s t z 模型组e 1 4 胚胎i g t 2 m r n a 表达水平显著降低( p 0 0 5 ) ； r e a l - t i m ep c r 结果显示s t z 模型组e 1 4 胚胎i g f 2 表达量是对照组的o 6 8 ，h 1 9 表达量是对照组的0 9 6 。结果显示：小鼠早期胚胎发育环境中胰岛素水平的降低 会使胚胎印迹基因i g f 2m r n a 表达水平下降，从而阻碍胚胎的生长发育。 通过对胚胎高胰岛素和低胰岛素发育环境的研究证实，胰岛素能加速胚泡的 形成，提高囊胚发育率，增加新生仔鼠的出生重，并促使印迹基因i g f 2 h 1 9m r n a 表达增加。提示：印迹基因的表达变化可能是胰岛素影响胚胎发育的分子机理之 一口 关键词：胰岛素；胚胎发育；印迹基因；r e a l t i m ep c r e f f e c to fi n s u l i no ni m p r i n t e dg e n e si g f 2a n dh 19 m r n a e x p r e s s i o n o fm o u s ep r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o a b s t r a c t t h e p r e s e n ts t u d y w a sa i m e dt or e v e a lt h ea l t e r a t i o n so fe x p r e s s i o no ft h e g r o w t h - r e l a t e di m p r i n t e dg e n e s ，h 1 9a n di g f 2 ( i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r2 ) i ne m b r y o s a n df e t u s e s ，a f t e rp r e i m p l a n t a t i o ne x p o s u r et oi n s u l i n ，a n dt or e v e a lt h em o l e c u l a r m e c h a n i s m si n v o l v e di ni n s u l i ns t i m u l a t i o nt h ee m b r y od e v e l o p m e n tb o t hi nv i v oa n d i nv i t r o 1 i nv i t r oe x p e r i m e n t 2 - c e l le m b r y o sw e r ec u l t u r e di ne i t h e r0o r0 2 5p g m li n s u l i nt ot h eb l a s t o c y s ts t a g e a n dt h e nt r a n s f e r r e di n t op s e u d o p r e g n a n tt e e i p i e n tm i c e i n s u l i ne x p o s u r ec a u s e da n s i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nt h ec e l ln u m b e ro fb l a s t o c y s ta n da ne l e v a t i o ni nb i r t hb o d y w e i g h t t h er a t i oo ft h eb l a s t o c y s tc e l ln u m b e ro fi n s u l i n e x p o s e dg r o u pw a s9 3 4 h i g h e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ；t h eb i r t hb o d yw e i g h ti ni n s u l i n - e x p o s e dg r o u p w a s1 6 1 h i g h e rt h a nt h a to f t h ec o n t r o lg r o u p 口 o 0 1 ，p a i rt - t e s t ) r e a l - t i m er e v e r s e t r a n s e r i p t i o n - p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n a n a l y s i s r e v e a l e dt h a t e x p o s u r e o f p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o st oi n s u l i ni n c r e a s e dt h em r n ae x p r e s s i o no fb o t hi g t 2a n d h 1 9i nb l a s t o e y s te m b r y o sa n de 1 4f e t u s e s t h em r n a e x p r e s s i o no f i g f 2o f b l a s t o c y s t i ni n s u l i n - e x p o s e dg r o u pw a s1 8f o l d , o f e o n 仃o lg r o u p ，a n dh 1 9w a s2 2f o l do f c o n t r o l g r o u p ；t h em r n ae x p r e s s i o no fi g f 2a n dh 1 9o fe 1 4f e t u s e si ni n s u l i n - e x p o s e dg r o u p w e r eb o t h1 5f o l do fc o n t r o lg r o u p o u rr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a te x p o s u r eo f p r e i m p l a n t a t i o ne m b r y o st oi n s u l i ni n c r e a s e dt h em r n ae x p r e s s i o no fb o t hi g qa n d h 1 9i nb l a s t o e y s te m b r y o sa n de 1 4f e t u s e s ，a n dp r o m o t e dt h ed e v e l o p m e n to f e m b r y o s 2 i nv i v oe x p e r i m e n t m o u s em o d e l so f d i a b e t e sm e l l i t u sw e r ei n d u c e db y1 5 0m g k g 1d o s e so f s t zt h r o u g h i n t mp e r i t o n e a li n j e c t i o n t h e nt h ed i a b e t i cf e m a l em o u s ew a sm a m dt ot h en o r m a lm a l e m o u s e t o t a lr n ao f e l 4f e t u s e sw e r ee x t r a c t e d m r n ae x p r e s s i o nl e v e l so fi g f 2 h 1 9 i nf e t u s e so ne 1 4w e r ed e t e c t e d u s i n g r e a l t i m ep c r r e a l t i m er e v e r s e t r a n s e r i p t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt r e a t e dg r o u pd e c r e a s e d t h em r n ae x p r e s s i o no f i g f 2 i ne 1 4f e t u s e s t h em r n ae x p r e s s i o no fi g f 2i n d i a b e t i cf e t u s e sw a so 6 5 一f o l do fc o n t r 0 1 a n d t h eb i r t hb o d yw e i g h ti ns t zt r e a t e d g r o u pw a s2 7 o l o w e rt h a nt h a to ft h ec o n t r o lg r o u p ( p o 0 1 ) t h ep r e s e n ts t u d y p r o v i d e dt h ee v i d e n c et h a tm a t e r n a ld i a b e t e s ( 1 0 ws e r u n li n s u l i n ) a l t e r st h ee x p r e s s i o no f i m p r i n t e dg e n e s ，a n da f f e c t sf e t a ld e v e l o p m e m i nc o n c l u s i o n ，i n s u l i ns t i m u l a t e sp r e i m p l a n t a t i o ne m b r y od e v e l o p m e n tb ya c c e l e r a t i o n t h ec a v i t a t i o nf o r m a t i o n ，i n c r e a s i n gb l a s t o c y s tn u m b e ra n db i r t hb o d yw e i g h t t h e r e s u l td e m o n s t r a t e d ，t h a tt h em e c h a n i s mo fi n s u l i n sa c t i o nm a yi n v o l v et h ei n c r e a s eo f t h ee x p r e s s i o no fi m p r i n t e dg e n e sw h i c hc o n t r i b u t e st ot h el a t e rf e t a ls t a g e s k e yw o f l s ：i n s u l i n ；d e v e l o p m e n t ；i m p r i n t e dg e n e ；r e a l t i m ep c r 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因l g f 2 和h 1 9 m r n a 表达的影响! 符号说明 b a s ep a i r t h r e s h o l dc y c l e d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y - n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e g l y s e r a l d e h y d e 3 - p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e h o u r c h o r i o n i cg o n a d o t r o p h i n i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r k j i o b a s e m i l l i g r a m m i n u t e m i u i l i t e r m e s s a g ed b o n u e l e i ca c i d p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n s e r u mg o n a d o t r o p h i n r e v o l u t i o n sp e r m i n u t e s p e c i f i cp a t h o g e n - f r e e m i c r o g r a m m i c r o l i t e r 碱基对 临界循环数 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 甘油醛一3 一磷酸脱氢酶 小时 绒毛膜促性腺激素 胰岛素样生长因子 国际单位 千碱基( 对) 毫克 分钟 毫升 信使核糖核酸 聚合酶链反应 孕马血清促性腺激素 转每分钟 无特定病原体 微克 微升 却q一叭一一。|茎埘妨 嘴嘶蚰一呱岬l|；峙 扬州大学硕士学位论文 ! 文献综述 一、胰岛素与胚胎发育 1 胰岛素促进植入前胚胎蛋白合成 在小鼠胚胎培养时，短期或长期添加胰岛素，均促进小鼠桑椹胚、囊艇、扩 张囊胚蛋白质的合成【i 1 1 ，胰岛素和i g f 2 共同作用可启动卵裂、促进胚泡形成，并 可刺激胚胎细胞和滋养层细胞中蛋白质的合成：到囊胚期，随着胰岛素浓度的增 加，胚胎的蛋白质合成增加 3 】。其机理可能是通过胰岛素受体起作用，胰岛素受体 具有高度的特异性，对胰岛素有高度的亲和力 4 1 。胰岛素受体结合植入前胚胎具有 时期特异性，胰岛素受体结合的发生、分配和结合程度在早期胚胎各期变化很大， 其最大结合力出现在后期胚胎和新生儿【5 1 。r o s e n b i u mi y 等证实，在哺乳动物， 胰岛素受体特异结合在桑椹胚和囊胚，在非受精卵和2 细胞、4 细胞、8 细胞胚均 没有结合胰岛素受体【6 】。 小鼠胚胎合成蛋白所需的氨基酸直接来自于母体产道或子宫内降解的蛋白， 胚胎首先内吞吸收降解的蛋白，然后分解子宫内的内源性蛋白，提供胚胎所需的 大量氨基酸。在胚胎生理上，外源性蛋白的合成和代谢是重要的蛋白组成部分。 胰岛素对内吞的影响和分解外源蛋白的作用已通过小鼠胚胎的离体培养中得到证 实1 4 】，胰岛素对外源蛋白的降解也得以证实，胰岛素刺激囊胚转运外源氨基酸，同 时，胰岛素还能完全抑制外源蛋白的降解，与刺激外源蛋白的合成相一致，以致促 进胚胎总蛋白水平的升高p ，辜l 。胰岛素内吞内源蛋白的作用是通过胰岛素受体和 i g f - 1 受体起作用，母体产道内检测到胰岛素和i g f l 受体，提示这些因子在体内正常 调节囊胚的蛋白代谢，可能是为胚胎的植入作蛋白储备，为滋养层细胞的大量能 量需求、生长和内吞所用同。 2 胰岛素增加细胞数量和刺激形态学发育 2 细胞胚胎培养时添加胰岛素，加速囊胚腔形成，增加发育至囊胚的数量1 9 ，1 0 1 ， 其机理可能是由于产生促有丝分裂活动或减少细胞死亡，刺激胚胎细胞数量增加 【l l 】。胰岛素对囊胚数量的提高是通过增殖内胚层细胞而实现的，将添加胰岛素发 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因i 啦和h 1 9m r n a 表达的影响! 育的囊胚转入假孕母鼠，其出生重比对照增加1 0 ，而胎盘重不受影响 1 2 l 。内胚 层细胞与胎儿出生重直接相关，而胎盘重与滋养层细胞相关，实验证实，胰岛素 不影响滋养层细胞数量【1 1 ，1 3 】。与胰岛素刺激胚胎蛋白合成一样，胰岛素受体在内 胚层也发挥作用，胰岛素在滋养层结合胰岛素受体，跨表皮细胞转运至内胚层， 结合内胚层的胰岛素受体，而刺激有丝分裂原【1 4 1 5 1 。 3 胰岛素促进早期胚胎的发育 激素在哺乳动物植入前胚胎的代谢调节中起着很重要的作用，前列腺素和胰 岛素影响植入前胚胎的糖代谢，人类和其它哺乳动物胎儿血清中的胰岛素水平与 胎儿初生重及体高呈正相关，在子宫内，胰岛素发挥着代谢和生长促进的角色咋9 1 1 , 1 2 1 。 激素和生长因子与胚胎发育密切相关，它们调节着各个器官系统的发育和分 化。其中，胰岛素能促进胎儿的生长发育，r a p p o l e e 与k a p u r 等在小鼠子宫腔液中 检测到i i l s 的存在【l6 ，切，d o h e r t y 等发现小鼠早期胚胎不能合成i n s 1 引。对患糖尿病 大鼠或i n s 分泌破坏小鼠模型的研究发现，其胚胎退化率增加。i n s 作为母源性因子， 与相关受体结合后，可影响胚胎发育，它们在胚胎发育的各个阶段都发挥着重要功 能。 二、印迹基因与胚胎发育 妊娠期胎儿的大小和重量因动物的种属而异，出生重量主要由胎盘的大小所 影响以及来源于双亲等位基因之一的一套印迹基因的表达与特性所决定f 嘲。印迹 基因在调节哺乳类动物胚胎的妊娠重量中起重要作用。哺乳类不同动物的胚胎经 体外操作和培养，均发生胚胎发育的混乱，最终导致动物表型改变，出现低出生 重、巨大儿、胎盘异常及出生后死亡等。 1 印迹基因的基本概念 基因组印迹是一种新发现的不同于经典孟得尔遗传的现象，是指体细胞来源 于不同亲代的一对等位基因发生的差异性表达，即机体仅表达来自亲本一方的等 位基因，而另一方不表达或很少表达伫o 2 。基因组印迹揭示了一种亲本特异的基 因表达调控机制，通过差异甲基化来调节不同亲本来源的基因的表达水平。大量 扬州大学硕士学位论文 4 实验证实小鼠配子形成或胚胎形成的过程会启动或者加强印迹的作用，从而导致 来自于不同亲本的等位基因差异化印迹的表达或者沉默【2 2 】。虽然亲本印迹的分子 基础还不明确，但对大量“印迹”基因进行的研究表明d n a 甲基化已成为“印迹” 修饰最可能的机制【矧。 印迹基因的适时适量表达是胎儿正常生长发育的必备基础之一，印迹功能的 紊乱可以引起胎儿的生长发育异常，导致各种不同疾病综合征的发生如侏儒症 ( s i l v e r - r u s s e l l ) 、a l b r i g h t 综合征、p r a d e r - w i l l i 综合征、w i l m s 瘤等等 2 4 1 。 2 印迹基因i g l 2 和h 1 9 i g f 2 基因、h 1 9 基因是目前研究最多的印迹基因，两者在人类和小鼠均印迹。 i g 位和h 1 9 都定位于小鼠7 号染色体末端，h 1 9 位于i g f 2 上游仅1 0 0 k b 处，他们 基因定位相近，共用同一调控体系 2 5 , 2 6 1 。 i g f 2 ( i n s u l i n 1 i k e g r o w t h f a c t o r 2 ) 胰岛素样生长因子2 ，只在来源于父系的等 位基因上获得表达( 母系基因沉默，即母系印迹) ，是由6 7 个氨基酸构成的多肽。 i g f 2 是哺乳动物胎儿生长发育的主要调控因子，对胚胎的正常发育产生重要的影 响，通过基因突变实验证实，当该基因失活时，出生胎儿的体重仅为野生型胎儿 的6 0 。h 1 9 基因是母系表达基因( 父系基因沉默，即父系印迹) ，当h 1 9 基因失活 后，其雌性胎儿出生时的体重比正常胎儿重2 7 2 7 1 。目前为止，h 1 9 的生物学特性 还不清楚，它是唯一一个以m r n a ( 不编码蛋白质) 形式存在的基因，小鼠和人 h 1 9 基因有保守的一级结构和部分二级结构，但无开放阅读框阿j 。 3 i g f 2 h 1 9 基因的组织特异性表达 i g e 2 转录子在二细胞阶段的胚胎中开始出现，此时合子基因组发生第一次转 录，母源转录子开始减少【2 9 ，3 们。到囊胚期表达达峰值，并可检测到l g f 2 蛋白1 3 n 。 d o h e r t y 等人的研究结果是h 1 9 在植入前胚胎中的表达峰值出现在胚泡出现时期 ( 如图1 ) 【3 2 1 ；同时也有人认为在小鼠桑椹胚和囊胚早期，h 1 9 基因没有表达，出 生后h 1 9 基因表达减少【3 3 l 。通过对体外操作的胚胎及胚胎干细胞中等位基因表达 的研究发现，h 1 9 在发育早期的印迹并不稳定【3 4 】。a n g e l aj v i l l a r ( 1 9 9 5 ) 等人发 现i e , f 2 在新生和成年小鼠的卵巢、初级卵母细胞以及发育各个时期的睾丸中均有 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因i g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响 ! 表达：h 1 9 表达于睾丸发育的各个阶段但在新生儿卵巢受限【3 5 】。i g f 2 的表达在出 生后迅速下降，但在人类，i g f 2 在一生中均保持了一定的表达水平。 图1 正常体内不同时期的胚胎中h 1 9 表达谱 4 体外环境对i g f 2 h 1 9 印迹的影响 体外培养时，一些印迹基因表达的改变可能是影响胚胎异常的原因。例如， k h o s l a s 将植入前胚胎置于添加胎牛血清和无胎牛血清的m 1 6 中培养，研究发现： 添加组，只有5 0 的胚胎发育至囊胚，1 3 囊胚在假孕母鼠体内发育至有活力的1 4 天胚胎，且出生后体重明显下降，i g f 2 和h 1 9 表达也明显下降 3 6 1 。 u n g r o 对大鼠成纤维细胞体外培养，在低血清浓度和高密度细胞培养时，发现 i g f 2 和h 1 9 相互印迹，在细胞出现融合前，两基因表达一致上升，但i g f 2m r n a 水平升得更多，i g f 2 母系等位基因印迹状态随着细胞融合状态的持续时间而改变， 具有时间依赖性，当细胞传代后，i g f 2 有效表达和印迹状态的改变可以延续到细胞 下一代。相反，h 1 9 基因印迹表达不受生长条件的改变，当细胞融合后，其表达 明显被抑制。这种在生长抑制条件下，印迹状态改变的机率支持表位改变的假设 【3 刀。 d o h e r t y as 将2 细胞胚胎在w h i t t e n 。s 培养基培养，h 1 9 父系沉默的等位基因 也出现异常表达，但在k s o m + 氨基酸培养基中，h 1 9 父系等位基因很少有表达。 k s o m + 氨基酸培养基与体内子宫内环境相接近，因而不影响印迹基因h 1 9 的表达 3 s l 。众多实验证明：h 1 9 较其它印迹基因对体外操作敏感，如小鼠体外受精和胚 扬州大学硕士学位论文! 胎培养后，h 1 9 印迹丢失f 3 4 , 3 9 1 ；s h a m a n s k i 将精子核微注射入小鼠卵细胞的实验中 发现：5 个印迹基因包括s n r p 和i g f 2 在侏儒症胚胎和胚胎外组织中均正常印迹， 但h 1 9 基因正常抑制的父系等位基因在胚胎外得到表达1 4 0 1 。因而体外培养能严重 且选择性地影响印迹基因的表达和印迹。 w uq 等将1 细胞胚胎暴露于四氯二苯( t c d d ，一种环境污染物) ，使其发育至 囊胚，检测1 4 天胚胎组织的i g f 2 和h 1 9 基因的表达量，结果两基因表达均下降【4 ”。 z h ub 也证明x - 射线辐射会影响h 1 9 印迹基因的表达，并能遗传至后代 4 2 1 。 三、本研究的目的和意义 综上所述，印迹基因在胚胎发育中起着重要的作用，鉴于胰岛素作为母源性 因子，与相关受体结合后可影响胚胎发育，胰岛素对早期胚胎发育的作用是否通 过印迹基因起作用，至今仍没有相关的研究。因此本试验通过体外和体内两部分 实验，来研究胰岛素对早期胚胎发育的可能分子机理，为进一步研究胚胎早期发 育环境与胎儿发育及未来成长的关系，成年期某些疾病的诊断，表遗传学的研究 提供有用的参考数据。 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因i g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响! 第一部分胰岛素对植入前小鼠胚胎印迹基因 i g f 2 h 1 9 表达水平的影响 哺乳类不同动物的胚胎经体外操作和培养，均发生胚胎发育的混乱，最终导 致动物表型改变，出现低出生重、巨大儿、胎盘异常及出生后死亡等，一些印迹 基因表达的改变可能是影响胚胎异常的原因。i g f 2 基因、h 1 9 基因是目前研究最 多的印迹基因，两者在人类和小鼠均印迹。本实验利用小鼠胚胎体外培养技术， 探讨胰岛素对子代生长发育的影响及可能的分子机理。 1 材料 1 1 主要试剂及仪器 超数排卵所用的兽用p m s g 、h c g 购自宁波市激素制品有限公司；胚胎体外培 养液k s o m ，胚胎冲洗液m 2 按表l 配制，所用试剂购自s i g m a 公司、o i b c o b r l 公司、 m e r k 公司；i n s 购自s i g m a 公司；a m v 逆转录酶购自p r o m e g a 公司；d n a s e ( r n a s e f r e e ) ，r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ，r a n d o mp r i m e r ，r t a qd n a 聚合酶，d n t p 均购自大 连宝生物工程有限公司；r n e a s y m i n ik i t 购1 1 1 q i a g e n 公司；d e p c 购自f l u c a 公司； 实时荧光定量p c r 试剂盒q 啪t i q t m s y b rg r e e e ns u p e r m i x ( b i o r a d 公司) ；其他 为国产分析纯。 s t e m i2 0 0 0 c 解剖显微镜( z e i s s 公司) ；m i c r og a l a x yc 0 2 培养箱( r sb i o t e e h 公司) ；f a l c o n 3 5 3 6 5 3 培养i i k ( 6 0 x1 5 m m ) ( b e c t o nd i c k i n s o n 公司) ；n d 1 0 0 0 紫外 分光光度仪( n a n od r o p ) ；e x p e f i o n 全自动电泳系统( b i o r a d 公司) ：p t c 2 2 5 型p c r 仪和c h r o m 0 4d e t e c t o r 实时荧光定量p c r 仪( m jr e s e a r c h 公司) 。 扬州大学硕士学位论文 表1k s o m 和m 2 成分表 8 j k s o mlm 2 | | 成分( m g l o o m l )| ( m g l o o m l ) ：s i g m a 产品编号 n a c l5 5 55 5 3 3s5 8 8 6 k c l1 8 53 5 6p5 4 0 5 k j - 1 2 p 0 4 ：4 7 51 6 2 p5 6 5 5 m g s 0 47 h 2 0 ，4 9 5 2 9 3m7 7 7 4 ； c a c h 2 1 - 1 2 0 2 5 2 5 2c7 9 0 2 ： n a i - i c 0 3 2 1 03 4 9s5 7 6 1 g l u c o s e3 61 0 0g6 1 5 2 ； n a - p y r u v a t e 2 23 6p4 5 6 2 ：d l l a c t i ca c i d ，s o d i u ms a l t0 17 4 m l ， 0 4 2 0 m l l 13 7 5 ； 1 0 m m e d t a 1 0 0 1 a l ；无 ! e - 6 6 3 5 f s t r e p t o m y c i n ，5 5s9 1 3 7 p e n i c i l l i n6 36p7 7 9 4 o 5 p h e n o lr e d o 1 m l0 1 m lp0 2 9 0 h e p e s ；无 ；4 9 6 9m e r k 3 9 1 3 3 8 l g l u t a m i n e1 4 6无；g8 5 4 0 ji g i b c o b r l m e me s s e n t i a la m i n oa c i d s；l m l无 11 1 3 0 0 5 1 g i b c o b r l m e mn o n - e s s e n t i a l 从0 5 m l无1 1 1 4 0 0 5 0 b s al o o4 0 0a - 4 3 7 8 1 2 实验动物及饲养环境 6 8 周龄s p f 级i c r 小鼠，体重2 8 - 3 0 9 ，购自中科院上海实验动物中心上海 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基囡l g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响 ! 斯莱克实验动物有限公司，许可证号：s c x k ( 沪) 2 0 0 3 - 0 0 0 3 ，清洁级动物房中 饲养，密度5 只 盒，温度2 0 2 4 ，相对湿度4 0 6 0 ，喂以配方饲料，自由采 食和饮水，自动光控( 1 2 h 明1 2 h 暗) 。 2 方法 2 1 胚胎的体外培养 选取阴道潮红、肿胀的发情母鼠腹腔注射8 i up m s g ，4 6 - - 4 8 h 后腹腔注射8 i u h c g ，随后l 雌1 雄合笼交配，第二天早晨7 ：o o 9 ：o o 见栓为交配成功。大约 在注射h c g 后4 3 h - - - 4 5 h 小时，从小鼠输卵管伞部( 图1 - 1 ) 冲出2 - c e i l 胚胎( 图 l 一2 ) 。将来自同一母鼠、形态较好的2 - c e l l 胚胎对等分成两份，一份置于8 0 0 i u l 含 0 2 5 r t g m li n s 的k s o m 培养液中作为实验组，一份置于8 0 0 r t l i ( s o m 培养液中作为 对照组。培养密度为5 0 - - 6 0 个胚胎平皿。将平皿置于培养箱内5 c 0 2 、3 7 c 培养。 注射h c g 后5 0 h 6 5 h 体外发育至4 - c e l l ( 图1 - 3 a ) ，6 5 h 7 7 h 为8 - c e l l 和桑椹胚时 期( 图1 - 3 b ) ，7 7 h 1 0 2 h 出现囊胚腔，发育比较快的已经到扩张囊胚( 图1 - 3 c ) ， 也有个别2 - c e l l 发育阻滞。 体外培养4 8 h 时，统计实验组和对照组的囊胚发育情况。 圈卜1 输卵管喇叭口( x 4 0 ) 图卜22 - c e l l 胚胎( x 4 0 ) 扬州大学硕十学位论文 a b 图l - 3 胚胎体外发育阶段( 8 0 ) a ：注射h c g 后5 0 h , - 6 5 h 体外发育至4 - c e l l b ：注射h c g 6 5 h 7 7 h 体外发育至8 - c e l l 和桑椹胚 c ：注射h c g 7 7 h 1 0 2 h 体外发育至囊胚 注：有1 个2 - c e l l 发育阻滞 图1 - 4 胚胎转移手术 图l 巧1 4 d 胚胎( 2 0 ) 眼睑形成，体符发育完 全，处于器官发生阶段 c 1 0 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因l g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响 卫 2 2 胚胎的转移及转移后的发育 l 的戊巴比妥钠腹腔注射同期假孕的正常i c r 母鼠，麻醉后剖腹，用2 l g 针 头在子宫角处打洞( 图l - 4 ) ，每侧子宫转入1 0 个囊胚，手术在2 0 分钟之内完成， 术后将母鼠置于3 7 c 恒温台上，苏醒后转入笼内饲养，1 只盒。怀孕1 4 d ( e 1 4 ) 音0 腹取胚胎( 图1 5 ) ，并用液氮迅速冷冻以备后用。其余实验组和对照组已孕母鼠， 让其继续怀孕至仔鼠出生，称量f l 代出生重。 2 3 胚胎的收集和c d n a 的获得 2 3 1 胚胎总r n a 的提取 分别在注射h c g 后1 2 2 0 h 、4 2 - 4 8 h 、4 8 6 0 h 、6 0 6 8 h 、7 8 8 0 h 、9 0 9 2 h 收集 小鼠体内正常发育的原核胚、2 - c e l l 、4 - c e l l 、8 - c e l l 、致密桑椹胚、早期囊胚各5 0 个，以及6 0 个体外培养的实验组和对照组新鲜囊胚，用a c i dt y r o d e s ( p h2 。3 - 2 4 ) 去除胚胎表层的透明带后，在无菌p b s 中清洗5 - 6 次，最后溶于5 “l 的溶解液【o 5 n o n i d e tp - 4 0 ，1 0 m mt r i s ( p h8 0 ) ，1 0 r a mn a c l ，3 m mm g c l 2 】，置于冰上待用。如果不 立即逆转录，必须用液氮迅速冷冻后置于7 0 。c ，最多保存2 周 4 3 1 。 分别选取已孕的5 只实验组母鼠和5 只对照组母鼠，颈椎脱臼处死后每侧子 宫各取全胚2 个，即收集2 0 个实验组和2 0 个对照组e 1 4 全胚，投入液氮迅速冷 冻。样品按r n e a s ym i n ik i t 的操作规程提取总r n a ，所得总r n a 经d n a s ei ( r n a s ef r e e ) 3 7 处理2 0 m i n ，7 5 灭活1 5 m i n 消化去除基因组d n a 后，经n a n o d r o p 紫外分光光度仪测定其o d 值，并用e x p e r i o n 全自动电泳系统鉴定r n a 的 质量，对r n a 质量严格控制。 2 3 2 r n a 反转录 向经d e p c 处理的反应管中加入： 总r n a 随机引物 总体积 7 0 孵育5 m i n 后，立即放置冰上5 m i n ，并离心。 5 m ( 囊胚) 1 嵋( e 1 4 胚胎) 0 5 1 x g l l m 扬州大学硕士学位论文 里 再向反应管中加入： k 吣烈r e v e r s et r a n s e r i p t a s e5xr e a c t i o nb u f f e r 5 t x l d n t p s ( 1 0 m m ) 。 2 5 u l r i b o n u c l e a s ei n h i b i t o r ( 4 0 u u 1 ) 11 1 1 a m vr t ( 3 0 u u 1 ) l m 补n u c l e a s e f r e ew a t e r 至2 5 i _ t l 3 7 孵育l h ，再将反应管置于9 5 5 r a i n 终止反应后放置冰上。 2 4 半定量r t - p c r ( s e m i - q u a n t i f i v er t - p c r ) 分析 2 4 1 内参照的选择 理想的内参基因应该稳定表达于不同类型，不同时期的细胞和组织( 如正常细 胞和癌细胞) ，而且其表达量相近，无显著性差别，表达水平与细胞周期以及细胞 是否活化无关。根据这个原则，本实验设计了g a p d h 和1 8 s 两种管家基因的引 物，分别在原核胚、2 - c e l l 、8 - c e l l 、致密桑椹胚和早期囊胚中进行扩增，选择合适 本研究的管家基因。由于管家基因的扩增范围很广，用扩增目的基因的条件对 g a p d h 和1 8 s 进行扩增，以保证后续实验条件的同一性。 g a p d h 引物：u p 5 一c a c a g t c a a g g c c g a g a a l g 一3 ， d o w n5 - t c t c g t g g t t c a c a c c c a t c ，3 1 8 s 引物： u p 5 c g g a c a t c t a a g g g c a t c a - 3 d o w n5 a a g a c g g a c c a g a g c g a a a 3 反应体系如下：1 0 b u f f e r ( 含1 5 m mm f + )2 o 肛l d n t p ( 2 5 r a m ) 1 6 u j 正向引物1 山 反向引物l i l l e d n a 2 t l t a qd n a 聚合酶( 5 u u 1 ) o 2 u l h 2 0 1 2 2 m 终体积2 0 u 1 反应程序： 陶凌云：胰岛素对小鼠早期胚胎印迹基因i g f 2 和h 1 9m r n a 表达的影响 旦 9 5 9 5 5 6 7 2 7 2 2 0 s 飞2 8c y c l e s 2 0 。 j 2 4 2 半定量r t - p c r 分管p c r 可能人为地造成目的基因和内参基因表达的差异，所以本实验设计 将目的基因和内参基因在同一p c r 管之内进行扩增。考虑到目的引物和内参引物 可能出现竞争抑制，本实验设计了一对抑制内参基因的引物，即在内参基因的上 下游引物3 端添加n h 2 。将内参基因的引物和内参抑制基因的引物按照1 ：9 、2 ：8 、 3 ：7 、4 ：6 、5 ：5 、6 ：4 、7 ：3 、8 ：2 、9 ：1 混合( 称为内参基因m i x ) 待用，目的基因i g f 2 h 1 9 和内参基因的引物浓度均为1 0 p m o l l - l l 。将待检的所有样品e d n a 包括实验组和对 照组全部混合，作为p c r 模板。 i g f 2 引物：u p 5 - g t g t g t g t c a g c c a a g c a t g 3 d o w n5 - c a a a t g t g g g g a c a c a g a g g 3 h 1 9 引物：u p 5 - t a c c c c g g g a t g a c t t c a t c 一3 d o w n5 - t a t c t c c g g g a c t c c a a a c c - 3 反应体系如下：1 0 xb u f f e r ( 含1 5 r a mm 矿+ ) d n t p ( 2 5 r a m ) i g f 2 或h 1 9 正向引物 反向引物 按最佳比例混合的1 8 sm i x 引物 c d n a t a qd n a 聚合酶( 5 u i i i ) h 2 0 终体积 反应程序同上。 p c r 产物经1 4 琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的基因与内参基因的光强度比值接 咄卸m m m m 却沈叩撕脚m埘脚m嘶 扬州大学硕十学位论文竺 近1 ：l 的为最佳，选择这个比值的内参基因m i x 作为半定量r t - p c r 的内参照。 随后将2 0 个实验组和2 0 个对照组e 1 4 胚胎e d n a 共4 0 个样品按照上述p c r 体 系和程序进行p c r 扩增，1 4 琼脂糖凝胶电泳结果用t a n o ng i s 分析软件进行分 析，目的基因o d 内标基因o d 作为统计依据，数据运用s p s s l 3 0o n ew a y a n o v a 进行统计。本实验重复两次。 2 5 实时荧光相对定量p c r( r e a l t i m ef l u o r e s c e n tr e l a t i v eq u a n t i t i v e r t p c r ) 分析 实时荧光定量p c r 分为绝对定量和相对定量：绝对定量可以测定目的基因的 准确拷贝数但必须有标准品，做标准曲线；相对定量需要设置内参对目的基因进 行均一化( 目的基因拷贝每一个内标基因拷贝) ，但不需要设置标准品，主要用于 差异表达分析、芯片结果验证等。本实验是检测i n s 作用前后胚胎中i g f 2 h 1 9 表达 水平有无差异，所以选择相对定量p c r 。l g i 2 、h 1 9 、内参基因的引物同2 4 中半 定量r t - p c r 分析。 反应体系如下： q u a n t i q r m s y b rg r e e e ns u p