（发酵工程专业论文）菊芋发酵生产燃料酒精的研究.pdf

摘要 本论文主要研究了人工诱变、营养条件和培养条件对黑曲霉液体发酵产菊粉 酶的影响，并对菊粉酶的酶学性质进行了探索。而后对以菊芋为底物利用黑曲霉 s l 一0 9 和塞尔维亚酵母z - 0 6 采用同步糖化与发酵法生产酒精的工艺进行了优化。 用紫外线( u v ) 和亚硝基胍( n t g ) 等诱变剂对黑曲霉菌株s l 0 8 进行诱变处 理，结果表明：不同的诱变手段在对菌株的致死率和变异幅度上均有差异。黑曲 霉s l 0 8 可以最大程度地提高塞尔维亚酵母z 0 6 的发酵活力和耐酒精能力，通 过u v 、n t g 诱变，得到黑曲霉s l 0 9 ，酶活提高近两倍。 通过摇瓶小试，研究了营养条件和培养条件对黑曲霉s l 0 9 产酶的影响。实 验结果表明：改变碳源、氮源、表面活性剂以及培养基p h 都对s l 0 9 产酶有较 大的影响：经过优化得到最佳产酶条件为：菊芋粉5 0 9 l ；豆饼粉4 0 9 ，l ：蔗糖 酯6 9 l ：p h 6 0 。研究发现菊粉酶是一种诱导酶，蔗糖酯是一种比较有效的产酶 促进剂，在以葡萄糖为碳源的产酶培养基中，蔗糖酯可以将发酵最终内切酶和外 切酶的酶活分别提高到1 5 0 i u m l 和3 0 0 i u m l 。 以菊芋为底物，利用黑曲霉s l 0 9 和塞尔维亚酵母z 0 6 采用同步糖化与发 酵法，3 0 发酵4 8 h ，发酵醪酒精浓度达到1 9 6 ( v ) ，转化率达到理论转化 率的9 0 。 关键词：黑曲霉；菊粉酶；酒精；菊芋 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h es t u d ym a i n l ym v e s t 培a t e dt h ee 丘色c t so ft h em u t a g e n e s i s ，c o n d i t i o n so f 仰m t i o na n dc l l l t u ：r eo n 曲u l i n a s ep r o d u c t i o n b y 爿印e ，g 订胁玎瞎p r e m a i l 0 1 f e 姗e n t a t i o n舶mj e r s u l e ma n i c h o k e u s i n g爿印e 删如s一姆厂 s l 0 9a n d 踟 日加礁y c p sc p 旭v 枷z 一0 6w a sa l s os t u d i e d a 妒口r g f 淞 辔盯s l - 0 8w a st r e a t e db yu l t r a v i o l e t ( u v ) a i l dn i t r o s o g u a l l j d i n e ( n t g ) t h er e s u l t ss h o w e dt l l a tt h e yg o td i 仃e r e me 艉c t s0 ns t r a i ns l 一0 8 一印p 曙f f ，船 旧堙p r s l 一0 8 c a l l d r 锄a t i c a l l yi m p r o v e t h ec h a r a c t e r o f | s ：口c 如舯聊7 c 嚣 c 已措v 捃出口z 0 6w i t l lr c s p e c tt ot 1 1 ea c t i v i t yo ff e r i i l e n t a t i o na n dt | l ee t h a l l o lt o l e r a n c e s u b j e c t e db yu va n dn t gm u t a g e n e s i s ，4 印p 删盯啦嘲妒rs l 0 9w a si s o l a t e d ，锄d t h ee n 巧m ea c t i v i t i e sw e 陀e n h a l l c e d2t i m e sh i 曲e rt h a nt h eo r i g i n a ls 咖i n f l a s kl i q l l i d s t a t ef e 衄e n t a t i o ne x p e 血n e n t s 、v c r ec a m e do u t t h er e s u l t ss h o w e d t l l a tt 1 1 ec a r b o ns o u r c e ，i l i 仃i ) g e ns o l l r c e ，s l l r f a c t a l l t sa 1 1 dt 1 1 em e d i 啪p h 世b c t e dt h e p r o d u c t i o no fm u l i n a s es i 蛐f i c a i l t l y ， a 1 1 dt 1 1 e o p t i n l n c o n d i t i o nf o re i l z y m e p r o d u c t i o no b t a i l l e dw a s ：j e n l s a l e ma n i c h o k e n o l l r5 0 叽，s o y b e a l ln o l l r4 0 9 ，l ， s u c r o s ee s t e r6 9 la 1 1 dp h 6 o i tw a sa l s oi n t e r e s t m gt of i n dt h a ti n u l i n a s ei sa n m d u c i b l ee n z y m e ，m e a n w l l i l e ，t h es u c r o s ee s t e r ，a c t sa sa 1 1e 髓c t i v ea c c e l e r a i l t ， e n h a n c e d 血ee m 可m ea c t i v i t i e s i nt h em 芒蕊u 面u s i n gg l u c o s ea sc a r b o ns o u r c e t 0 1 5 0 ，h l la i l d3 0 0 i u 丫m lf o re x o i l l u l 面a s ea i l de n d o i n u l i n a s er e s p e c t i v e l y a sar e s u l t ，19 6 ( v 厂v ) o fe t l l a n o lw a sp r o d u c e d 矗d mj e m s a l e ma n i c h o k e n o l l rw i t l l i n6 0 ho ff e 咖e n t a t i o nb ys i m u l t a n e o u ss a c c h 撕矗c a t i o na 1 1 df e m e n 扭t i o n u s i n g 一驴e 穆f f 泌即弛rs l 0 9a n d 勋c c 南口m 掣c 船c e m v 括f n e z 0 6a t3 0 ，a n dt b e c o n v e r s i o ne m c i e n c yo f t h ej e m s a l e ma r t i c h o k et oe m a i l o lw a s9 0 o f t h et l l e o r e t i c a l e t h a l l o ly i e l d k e y w o r d s ：彳妒已，g 洲淞门辔p r ；i n u l i i l a s e ；e t l a n 0 1 ；j e m s a i e ma n i c h o k e 2 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 日期：九净多月日 ， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日期：扣年；月。日 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 酒精( 乙醇) 作为食品、化工原料，一直是我国发酵行业的主导产品，用微 生物法生产酒精的历史由来已久。2 0 世纪7 0 年代中期，许多科学工作者开始致力 于应用生物工程技术开发酒精发酵的新菌种、新工艺，以固定化细胞技术实现连 续发酵的研究相当活跃，但这项技术应用于酒精生产仍存在许多局限性。选育高 产酒精菌种直接应用于生产仍是人们努力的方向。2 0 世纪8 0 年代初，日本国立九 州大学h a y a s l l i d a 教授等人选育了一株耐高浓度酒精酵母w y 2 ，在人工合成培养 基中，以蔗糖或淀粉糖化液为底物，在3 d 内可产生1 8 6 以上的酒精1 1j 。尤其是 酒精可作为清洁能源，原料资源可以再生，大大刺激了这一领域的研究工作。我 国一直将选育优良的酒精酵母菌种和酒精发酵新工艺研究列为重点研究课题， “八五”期间开发的酒精浓醪发酵技术，产酒精浓度为1 3 ( v 厂v ) ，而目前大部分 工厂普遍采用的酿酒酵母菌种1 3 0 0 等菌株发酵产酒仅有( 8 9 ) ( v 厂v ) ，严重影响 了设备利用率和酒精产品成本【2 ) 】。因此，人们就开始寻找一种廉价原料和培育 优良菌种。 菊芋是菊科( c o m p o s i t a e ) 向日葵属中能形成地下块茎的栽培种，学名 h e l i a n t l l u st l l b e m s u sl ，别名洋姜、鬼子姜。地下块茎含丰富菊糖，系果糖多聚 物【4 】。多炒食或盐渍加工，还可制造果糖和酒精。对糖尿病有辅助疗效。原产北 美洲；茎直立，高2 3 m ；叶卵形，先端尖，绿色，互生；茎扁圆形，有不规则 突起；头状花序，花黄色；瘦果楔形，有毛。按块茎皮色分黄皮和白皮两个品种。 耐寒耐旱，块茎在6 7 芽眼萌动发芽，8 1 0 出苗，幼苗能耐1 2 低温， 1 8 2 2 和日照1 2 h 有利于块茎形成。块茎在一2 5 一3 0 的冻土层内能安全越 冬。主要生长特性：耐寒、耐旱能力特别强；抗风沙；繁殖力强；保持 水土：生产过程不需管理等。 菊芋作为一种可再生资源，它含有一种贮存性多糖菊粉，约占菊芋肥大 块茎干重的7 0 以上。菊粉( i n u l 岫是以b 1 ，2 键连接的末端为一个蔗糖基的多聚 果糖，可以通过生物技术将菊粉转化为果糖、酒精和蛋白质饲料等，可一举多得， 为山区资源的开发利用开辟一条很好的途径，将带来巨大的经济效益和社会效 益。国外此项研究始于7 0 年代，主要研究的国家有英国、日本、丹麦、韩国、 加拿大、美国、前苏联及印度等国。他们主要研究利用微生物菊粉酶生产超高果 糖浆和酒精发酵。现在正研究菊粉酶及产生菌的固定化技术和应用于菊粉的水解 江南大学硕士学位论文 工艺口。7 j 。但由于酶的稳定性和某些作用机制上存在一些问题，尚未见投入工业 化生产或中试的报道。国内此项研究起步较晚，有少许研究也仅仅局限于菌种筛 选和酶的性质研究。 高浓度酒精发酵是人们近年来普遍关注的一个研究课题。这一研究的技术关 键在于获得耐高渗透压且酒精发酵速率快的酵母菌。提高酵母菌的酒精耐受力、 解除高浓度酒精的抑制作用也是人们的研究热点】。研究结果表明：酵母菌对酒 精的耐受能力不仅仅是由于酵母细胞自身对不同水平的酒精耐受的内在能力，而 且与酵母原生质膜的脂类组成及功能、发酵营养状况、环境参数、碳水化合物底 物补充方式等因素有密切关系。酒精毒性的简要机制是：临界酒精浓度导致质膜 磷脂裂解，如果菌株质膜本身或发酵时具备相当营养及环境条件适宜等，酵母就 对酒精毒性有所适应和抵抗，特别是温度尤为明显。随着温度的不断提高脖母 质膜的磷脂量很快降低，以维持质膜的流动性和维持细胞活性【j 0 】。 由于黑曲霉菌丝体中富含有脂蛋白( p l ) ，这种物质已经被证明可以改善酵母 原生质膜的结构，从而显著提高酵母的发酵活力和耐酒精能力。在采用同步法生 产酒精的工艺中，由于是边糖化边发酵的模式，避免了传统酒精生产工艺中存在 的底物抑制现象，使发酵较为快速彻底的进行，大大降低的酒精的生产成本。上 世纪九十年代，有文献报道利用黑曲霉和酵母采用同步法以菊芋粉为底物生产酒 精，发酵周期长达5 天。 为了进一步提高发酵强度，降低生产成本，本研究采用边糖化边发酵的工艺， 通过改良菌种、优化产酶条件、探索酒精发酵工艺来提高酒精的生产强度，降低 生产成本。 1 2 菌种的选择 本实验研究将以黑曲霉为产酶菌，主要基于以下几方面的原因： 首先，黑曲霉是多种酶的生产菌株，酶系齐全【l ”。它除了能产菊粉酶外， 还可以产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等其他酶类，这些酶与菊粉酶有一定的协同 作用。 其次，研究表明黑曲霉菌丝体富含有能提高酵母发酵强度和耐酒精能力的 因子脂蛋白( p l ) 。而且黑蓝霉是公认的安全菌株，在应用它之前无需做长期 的毒性试验。 最后，黑曲霉可在多种底物上生长，培养条件租放，所产的酶多为胞外酶， 提取工艺简单。 第一章绪论 1 3 立题依据 菊芋系多年生草本，地下块茎形如生姜，在我国俗称“洋姜”，全国各地均有 分布。菊芋适应性和抗病能力都很强，尤其适合在贫瘠山地和不适宜种植粮食作 物的废弃土地上种植，不用施肥，但长势旺盛、产量高。经试验，每公顷山地菊 芋块茎产量达7 5 1 0 4 k g ，但这种资源至今未得到很好地利用l l ”。 目前，国际石油价格暴涨，美国甚至动用了战略储备石油，国内汽车用油价 格也是一涨再涨。有专家指出：世界己进入“准石油危机”时代。石油作为不可再 生能源，终究有枯竭的一天，在太阳能、风能、潮汐能、核能等能源的利用和推 广尤其是推广存在一定难度的今天，我们以什么作为能源? 与此同时，一方面国 家年年用保护价收购粮食以保护农民的利益，另一方面国库中普遍存在粮食陈化 的问题。此外还有连年丰收的农业杂粮、特粮及榨糖工业的副产品糖蜜等等。于 是，能源专家们将目光瞄准了酒精。汽油中添加1 0 的无水酒精配制成汽油醇， 每年可节约4 0 0 1 0 0 0 万吨的汽油。 从传统工艺上来看，国内外多采用先水解再糖化的两步法利用菊芋，此法的 优点是工艺比较成熟，缺点是能耗大且酒精产率较低，效果并不能令人满意。后 来，人们希望通过用同步法来解决这一问题。在这方面日本的t o y o l l i k on a l ( a 1 1 1 u m 等人【8 ，9 】研究的较早，也取得了一些成绩。他们在保持转化率和酒精产率与两步 法相差无几的情况下，大幅度的降低了能耗和成本。 本实验在前人研究的基础上进一步提高转化率和酒精浓度，使转化率和酒精 浓度分别达到9 0 和2 0 ( v v ) 左右。 1 4 主要研究内容 ( 1 ) 高产菊粉酶菌种的选育 ( 2 ) 菊粉酶发酵工艺的优化 ( 3 ) 菊粉酶酶学性质的初步研究 ( 4 ) 蔗糖酯对黑曲霉产酶的影响 ( 5 ) 同步法利用菊芋生产高浓度酒精 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章高产菊粉酶菌种选育 菌种选育的方法有多种，其中诱变育种是最常用的和较有效的一种育种手 段。它是在研究诱变机制的基础上选择合适的诱变因子、处理剂量和处理方法， 然后运用合理的筛选程序及适当的筛选方法，把优良的菌株选育出来，这是一种 较古老的育种方法，又是一种方便、费用低、收效较好的育种方法【1 3 _ 15 1 。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要原料和试剂 菊粉( 分析纯) 琼脂( 分析纯) 马铃薯 n a n 0 3 ( 分析纯) k c l ( 分析纯) k 2 h p 0 4 ( 分析纯) f e s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) m g s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) ( n 】 i 4 ) h 2 p 0 4 ( 分析纯) 去氧胆酸钠( 分析纯) 蔗糖( 分析纯) 蔗糖酯( 分析纯) n a a c 3 h 2 0 ( 分析纯) 冰醋酸( 分析纯) 亚硝基胍( n t g ) ( 分析纯) 2 2 2 培养基及试剂 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 超市购买 中国医药上海化学试剂公司 江苏无锡市民丰试剂厂 上海化学试剂厂 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 上海试剂一厂 s i g 锄a 上海试剂一厂 日本三菱食品公司 重庆化学试剂厂 中国医药上海化学试剂公司 s i g a m a 2 2 2 1 黑曲霉选择性培养基( g l ) 菊粉2 0 ，n 削0 33 ，k c lo 5 ，k 2 唧0 41 ，f e s 0 4 7 h 2 00 0 0 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ， ( n h 4 ) h 2 p 0 42 ，去氧胆酸钠1 ，琼脂2 0 ，p h6 7 ，o 1 0 m p a 灭菌1 5 m i n 。 2 2 2 2 黑曲霉摇瓶产酶培养基( 4 第二章菌种选育 蔗糖3 0 ，蔗糖酯5 ，n h 4 h 2 p 0 41 2 ，k c io 7 ，m g s 0 4 - 7 h 2 0o 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 0 1 ，p h4 5 ，o 1 0 m p a 灭菌1 5 m i n 。 2 2 2 3 斜面培养基( g ，l ) 马铃薯2 0 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂1 5 ，自然p h ，o 1 0 m p a 灭菌2 0 m i n 。 2 2 2 4 酵母种子培养基( g l ) 酵母膏1 0 ，蛋白胨2 0 ，葡萄糖2 0 ，自然p h ，0 1 0 m p a 灭菌1 5 m i n 。 2 2 _ 2 5h a c n a a c 缓冲液 a ：称取n a a c - 3 h 2 02 7 2 2 9 ，加水溶解定容至1 0 0 0 m l ；b ：量取冰醋酸1 1 4 6 m l 定容至1 0 0 0 m l 。取a 液4 3 m l ，b 液5 7 m l 混合。 2 2 2 62 的菊糖溶液 菊糖2 0 9 ，用上述醋酸缓冲液定容至l l 。 2 2 2 72 的蔗糖溶液 蔗糖2 0 9 ，用上述醋酸缓冲液定容至l l 。 2 2 3 主要仪器 l s b 5 0 l 立式圆形压力蒸汽灭菌器 p y x d h s 隔水式电热恒温培养箱 往复式恒温调速摇瓶器 7 2 1 分光光度计 p h s 2 5 酸度计 数显式恒温水浴锅 电子天平 超净工作台 生物显微镜 离心机 电热鼓风干燥箱 2 2 4 菌种及材料 上海医用核子仪器厂 上海市跃进医疗器械厂 江苏南通通海电器厂， 上海第三分析仪器厂 上海天达仪器厂 上海申顺生物科技有限公司 梅特勒托利多仪器有限公司 苏净集团安泰公司 南京江南光学仪器厂 上海医用分析仪器厂 上海第二五金厂 黑曲霉s l 0 8 岫弦，s l 一0 8 ) 是从甘肃产菊芋根部的土壤中筛选出来的，采 用马铃薯培养基1 1 7 1 3 0 培养3 d ，4 保藏。各菌株鉴定参照真菌的形态与鉴定 进行1 1 8 1 。酒精酵母为由本实验室分离、驯化并保藏的塞尔维亚酵母z - 0 6 c p 陀v 妇f d ez 一0 6 1 ，具有一定的耐酒精能力。该菌株在麦芽汁琼脂培养基旧斜面上 培养，4 保藏。 菊芋由甘肃雄鹰农产品公司惠赠，菊芋粉的制备是将洗净去皮的鲜菊芋切成 薄片，6 0 风干4 8 h ，使水分降到5 左右，然后粉碎过筛。 江南大学硕士学位论文 2 3 实验方法 2 3 1 诱变方法 2 3 1 1u v 诱变【1 4 】 孢子悬浮液的制备：取3 0 培养3 d 的斜面菌种，加无菌生理盐水洗下孢子， 两层擦镜纸过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，3 0 、l o o r m i n 振荡1 2 h 使孢予 分散，将其浓度调至1 0 6 r n l 。 诱变：吸取l o m l 单孢子悬浮液于直径为9 c m 的培养皿中，磁力搅拌下距1 5 w 紫外灯1 0 c m 照射不同时间，适当稀释，取o 1 m l 涂布平板。 2 3 1 2n t g 诱变【1 4 ，1 9 l 孢子悬浮液的制备：取3 0 培养3 d 的斜面菌种，加入无菌p h 6 o 的磷酸缓 冲液洗下孢子，两层擦镜纸过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，3 0 、1 0 0 r m i n 振荡1 2 b 使孢子分散，将其浓度调至l 西m l 。 诱变：加入等体积的孢子悬浮液于1 m m l 的n t g ( 用p h 6 0 的磷酸缓冲 液配制) 溶液中，3 0 、l o o r m 血振荡3 0 m i n ，立即稀释1 0 0 0 倍停止作用，然 后以1 0 0 、1 0 一、1 0 4 三个稀释度分别吸取1 m l 涂布平板。 2 3 2 菌种筛选的方法 2 3 2 1 黑曲霉的初筛 将鲜菊芋周围的土用无菌水洗下，稀释，并均匀涂布于选择性平板上，3 0 培养4 8 h ，选择透明圈较大的菌落进行摇瓶实验，检测菊粉酶活力，选出酶活 较高的菌株继续进行酒精发酵实验，检测其对酵母活力和耐酒精能力提高的程 度，筛选出用于进一步诱变的菌株。 2 3 2 2 黑曲霉产酶试验 将初筛得到的菌株分别接入装有1 2 0 m l 产酶培养基的5 0 0 m l 三角瓶中，3 0 摇瓶( 1 4 0 r ，m i l l ) 培养，2 4 h 后每瓶中加入1g 碳酸钙以维持p h 的稳定。定时 取样，用p h 5 6 的醋酸缓冲液稀释，5 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，取上清液进行酶活测 定。 2 3 2 3 u v 与n t g 复合诱变 先进行诱变剂对菌株的致死曲线，选择诱变剂量，再进行诱变育种。将诱变 后的菌株接种在选择性培养基上培养，以透明圈大小挑选产酶较强的菌株，然后 进行摇瓶复筛。 2 3 2 4 酵母种子的制备 从斜面上取一环酵母接入装有1 0 0 m l 种子培养基的5 0 0 i i 止三角瓶中，3 0 摇瓶( 1 4 0 r i 血) 培养3 0 h 。发酵液在4 5 0 0 0 r i n i i l 离心5 l i l i n ，收集酵母细胞。 第二章菌种选育 2 3 2 5 发酵试验 以蔗糖作为底物来确定各黑曲霉菌丝体对酒精酵母耐酒精能力的影响。将成 熟的酵母种子培养基离心，再把细胞重新均匀地分散于1 5 0 m l 、3 0 摇瓶培养 4 d 的黑曲霉s l 0 9 培养液中，补加蔗糖3 0 9 ，( n h 4 ) 2 s 0 40 - 4 5 9 ，k h 2 p 0 4 0 1 5 9 ， 调p h 5 o ，并使酵母细胞浓度为1 0 8 个m l ，3 0 于2 5 0 m l 三角瓶中静态发酵， 小剂量的蔗糖不间断地加入到发酵醪中，以使蔗糖浓度维持在抑制浓度以下。各 发酵瓶均配置装有3 0 硫酸的发酵栓，发酵产生的c 0 2 通过发酵栓被排放出去， 以维持发酵瓶的厌氧环境。由于c 0 2 的释放，发酵醪重量将减轻，可以通过发 酵醪所减少的重量来计算所消耗的糖量： 理论上释放c 0 2 的量( g ) 2 16 = 总耗糖量( g ) 9 0 发酵结束后，将发酵醪于4 ，5 0 0 0 “m i n 离心5 1 1 1 i n ，取上清液检测酒精含 量，并比较各自的发酵结果。 2 3 3 酶活的测定方法 2 3 3 1d n s 试剂【2 0 取酒石酸钾钠9 1 9 ，溶于5 0 0 i l l l 水中，于溶液中依次加入3 ，5 一二硝基水杨酸 3 1 5 9 ，加热搅拌使之溶解，再加入苯酚2 5 9 ，无水亚硝酸钠2 5 9 ，搅拌使之溶 解，冷却后定容1 0 0 0 m l ，贮存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2 3 3 2 酶活的测定 菊粉酶的活力分为内切酶( 菊粉酶) 活力和外切酶( 转化酶) 活力，分别使 用i 和s 表示。测定方法依据p e s s o n i 等人的报道进行阴，内切酶活力的测定是 以菊粉作为底物，取1 m l 稀释酶液加入4 m l2 的菊糖溶液( 0 2 m o l l ，p h 4 5 的醋酸缓冲液配制) ，5 0 反应3 0 m i l l ，以每分钟转化底物产生1 岫o l 还原糖所 需的酶量为一个活力单位。外切酶活力的测定是以2 蔗糖溶液代替菊糖溶液， 同上操作，以每分钟转化底物产生1 岬o l 还原糖所需的酶量为一个活力单位。i s 值反映了内切酶活力和外切酶活力的比值，该值越大则反映了该酶的内切活力相 对较高，反之则表示其外切活力相对较高。 2 3 3 3 酶活的计算： x = o d x k n ，c t 1 8 0 0 5 ) 式中：x _ 一酶活力 岫o l 葡萄糖( h 儿m i n ) 】 k 标准曲线中0 d 值为1 所相当的葡萄糖微克数 n _ 酶液稀释总倍数 卜反应时间( m i l l ) 1 8 0 _ 葡萄糖的分子量( g m 0 1 ) 0 5 反应液中酶液体积( m l ) 江南大学硕士学位论文 2 4 实验结果与讨论 2 4 1 黑曲霉s l 0 8 的选育 按“材料与方法”所述，经反复筛选得到6 株产酶较强的菌株，如图2 2 所示， 1 株青霉产酶活力最强，其次为2 株黑曲霉，2 株米曲霉和1 株木霉产酶能力最 弱。 星 已 蛭 锚 d 蔷虚卤。虚卤 a i g e r 吼- 0 6 a n i g e r 乩0 8a o r y z a e 0 4a o 盯z a e - 0 3p e n i c m i 岫0 ltr e e s c i 0 2 目内切酶活日外切酶活 图2 2 从土壤中分离出的6 株产菊粉酶较强菌株的产酶量 f i g 2 - 2e i l 刁，i l l ea c t i v i t ) ro f 6s 扛a i l l si s o l a t e dd i r e c t l y 舶ms o i l 2 4 2 高产菌株的发酵实验 将青霉一0 1 、黑曲霉s l 0 6 和黑曲霉s l 0 8 分别进行酒精发酵实验，并以不 含有任何菌丝体的实验作为对照，结果如图2 3 所示。从图2 3 可以看出，尽管 青霉一0 1 产酶活力较强，但该菌株对酵母的发酵活性和耐酒精能力基本没有促进 作用。然而，黑曲霉，特别是黑曲霉s l 0 8 ，其发酵进行7 2 h 后，酒精浓度达到 1 9 ( v 厂v ) ，所以该菌株的菌丝体对酵母的发酵活力和耐酒精能力有较强的提高 作用，这大概是由于黑曲霉s l 0 8 的菌丝体含有丰富的脂蛋白( p l ) ，这种物质 己被验证可以较大幅度地提高酵母的发酵活力和耐酒精能力( 1 0 ，2 “。 2 4 3 黑曲霉s l 0 8 的u v 诱变 紫外线对黑曲霉s l 一0 8 菌株的致死曲线如图2 4 所示，依据其它报道，采用 紫外线诱变的最佳正突变率所对应的致死率一般为6 0 一7 0 【1 4 l ，所以本研究采 用的紫外线诱变的致死率为6 2 ，以此确定诱变剂量( 即1 5 w 紫外灯，l o c m 距 离，照射时间为1 2 0 s ) 诱变处理孢子悬液，经选择性平板培养初筛，摇瓶复筛， 获得产酶活力较强的突变株黑曲霉s l 一0 8 2 ，其产菊粉酶活力和转化酶获利分别 达到3 0 抽i 和5 2 i u m l ，较出发菌提高了近5 0 。 第二章菌种选育 亘 蛋 链 怒 2 0 量 菌 1 5 矮 婆 1 0 照 5 o a n i g e r - 0 6a n i g e r - 0 8 p e n i c m i u m _ 0 lf r e e 嘲发酵时间+ 酒精浓度 图2 33 株高产菊粉酶菌种的酒精发酵 f j g 2 3 f e m l e n t a t i o nt e s t so f t h e3s t r a i n sw i t lh j g he n 珂m ea c t i v i t i e s 摹 铸 蜒 世 o6 o120 l802 4o 3 o 03 6 04 2 0 f ，s 图2 - 4u v 对黑曲霉s l 0 8 的致，e 曲线 f i g 2 - 4l e t l l a l 时c u r v eo f 一妒p 喇盯蚶岫弘rs l 0 8s u b j e c t e dt ou vm u t a g e n e s i s 2 4 4 黑曲霉s l 0 8 2 的n t g 诱变 采用亚硝基胍对黑曲霉s l 0 8 2 进行诱变。亚硝基胍对黑曲霉s l 一0 8 2 的致死 曲线如图2 5 所示，许多研究表明采用亚硝基胍诱变的最佳致死率一般应在为 9 0 左右，本研究采用的亚硝基胍诱变的致死率为9 0 【”】，由此确定诱变剂量( 亚 硝基胍浓度为1 o g l ，3 7 下处理9 0 m i n ) 处理样品，经选择性平板初筛，摇瓶 复筛，获得突变株黑曲霉s l 0 9 ，其内切酶活力和外切酶活力分别达到5 4 i u 位l l 和9 2 i u 1 l ，较出发菌提高了近2 倍。将该株菌在3 0 摇瓶培养4 d ，并进行发 酵实验，结果如表2 2 。 加 舳 o o o 0 o o 0 0 0 0 o o o 9 8 7 6 5 4 3 2 l 江南大学硕士学位论文 lo0 芝 8o 鐾 ao 雌 4o 2o o o3o6o90l2o l5o 图2 5n t g 对黑曲霉s l 0 8 2 的致死曲线 f l g 2 5l e t h a l 毋c u r v eo f 4 印p 曙川地 秘，s l _ 0 8 2s u b j e c t e d t on t gm u t a g e n e s i s 表2 - 2 黑曲霉s l l 0 9 的产酶和酒精发酵试验结果 t 曲l e2 _ 2e n 巧m ep r o d u c 廿o na n de t l l a i l o i t e s to f 丘h 辔盯s l - 0 9 由表2 2 可见，该酶的i 和s 值在培养4 d 后分别达到5 4 l u ，m l 和9 2 i u m l ； i ，s 值接近o 6 ，这结果与n a k 锄m 等人1 9 l 所采用的黑曲霉8 1 7 有很大的差别， 黑曲霉8 1 7 在摇瓶培养5 d 后，i 和s 值分别为6 8 5 i u 珈i ，和8 8 i u m l ，i ，s 值为 7 8 ：因此黑曲霉s l 一0 9 的发酵液显示出极强的外切酶活性。根据国外相关报道旧j ， 可以对这一实验现象解释为由于黑曲霉s l 0 9 的菌丝体含有丰富的脂蛋白( p l ) ， 所以在经过6 0 h 的发酵，使发酵醪酒精浓度达到2 1 ( v ) 。 2 4 5 黑曲霉s l 0 9 的诱变谱系 菌株u ( 删m l ) s ，( 叫m l ) i s提高比例， 4 印e 呼盯螂n 辔仃s l 0 8 2 03 50 5 7一 iu vm u t a g e n e s i s 4 e p p 删f ? z 岱”袒rs l - 8 2 3 0 5 20 5 85 0 ln t g m u t a g e n e s i s 4 印e 嚼玎淞n 堙缈s l 0 9 5 49 20 5 91 7 0 图2 - 6黑曲霉s l 广0 9 的诱变谱系 f i g 2 6m u t a g e n e s i sp e d i g r e eo f 4 置印，g 讲淞n 姆盯 如图2 6 所示，通过u v 和n t g 诱变，使菌株的酶活提高了近2 倍，而所 产酶的i ，s 值基本保持恒定，维持着较高的外切酶活力。比较u v 和n t g 诱变 结果可以看出n t g 在提高菊粉酶活力上是一种更为有效的诱变方法。 1 0 第二章菌种选育 2 4 6 黑曲霉s l 一0 9 传代稳定性研究 将黑曲霉s l 0 9 菌株在斜面培养基上传代5 次，每次接种产酶培养基，3 0 摇瓶培养4 d 后测定酶活，结果内切酶活力仍然保持在5 0 i u ，m l 以上，同时外切 酶活力也维持在9 0 i u m l 左右。表现出较好的传代稳定性。 2 5 本章小结 通过u v 和n t g 诱变，使菌株的酶活提高了近2 倍，而所产酶的i s 值基 本保持恒定，维持着较高的转化酶活力。比较u v 和n t g 诱变结果可以看出n t g 在提高菊粉酶活力上是一种更为有效的诱变方法。 尽管青霉菌株产酶活力较强，但该菌株对酵母的发酵活性和耐酒精能力基本 没有促进作用。因此，选用对酵母的发酵活力和耐酒精能力有较强的提高作用的 黑曲霉s l 0 8 作为进一步诱变的出发菌株。 黑曲霉s l 0 9 菌株经过多次传代接种，表现出较好的传代稳定性。 江南大学硕士学位论文 第三章菊粉酶的发酵条件优化及其酶学性质的初步研究 3 1 引言 在酶的发酵生产中，虽然菌种的产酶性能是决定产量的重要因素，但其营养 条件和培养条件对产酶的影响也不容忽视。除发酵培养基原料配方外，培养时间、 培养温度、接种量、装液量等对产酶也有影响。同时近年来酶法水解菊粉的研究 十分活跃p o 川，研究结果普遍认为该酶的最适催化p h 3 5 5 5 ，最适温度4 5 5 5 ，超过6 0 将很快失活。本研究对黑曲霉s l 0 9 产菊粉酶的生产工艺及其 酶学性质进行了较为深入的研究，以期为后来的酒精生产提供必要的理论和数据 依据。 3 2 材料与方法 3 2 1 主要原料和试剂 蔗糖( 分析纯) 菊芋粉 豆饼粉 可溶性淀粉( 分析纯) 蛋白胨( 生化试剂) 酵母膏( 生化试剂) 玉米浆( 生化试剂) 蔗糖酯3 7 0 ( s 3 7 0 ) ( 分析纯) 蔗糖酯7 7 0 ( s 7 7 0 ) ( 分析纯) 蔗糖酯9 7 0 ( s 9 7 0 ) ( 分析纯) 蔗糖酯1 5 7 0 ( s 1 5 7 0 ) ( 分析纯) 斯盘2 0 ( s p a n 2 0 ) ( 分析纯) 斯盘- 4 0 ( s p 锄4 0 ) ( 分析纯) 斯盘6 0 ( s p 孤一6 0 ) ( 分析纯) 斯盘一8 0 ( s p a n - 8 0 ) ( 分析纯) n h 4 c l ( 分析纯) n a n 0 3 ( 分析纯) 1 2 上海试剂一厂 自制 市购 上海试剂一厂 上海东海制药厂 上海酵母厂 华北制药集团 日本三菱食品公司 日本三菱食品公司 日本三菱食品公司 日本三菱食品公司 s i g 锄a s i g a m a s i g a m a s i g a m a 上海试剂一厂 中国医药上海化学试剂公司 第三章菊粉酶的发酵条件优化及其酶学性质的初步研究 h 3 p 0 4 ( 分析纯) m g s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) f e s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) n a a c - 3 h 2 0 ( 分析纯) 冰醋酸( 分析纯) c o c l 2 6 h 2 0 ( 分析纯) c u s 0 4 5 h 2 0 ( 分析纯) z n s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) m n s 0 4 h 2 0 ( 分析纯) l i 2 s 0 4 h 2 0 ( 分析纯) 3 2 2 培养基及试剂 3 2 2 1 黑曲霉摇瓶产酶培养基( g l ) 同2 2 2 2 。 3 2 2 2h a c n a a c 缓冲液 同2 2 2 5 。 3 2 2 3 2 的菊糖溶液 同2 2 - 2 6 。 3 2 2 4 2 的蔗糖溶液 同2 2 _ 2 7 。 3 2 3 主要仪器 同2 2 3 。 3 2 4 菌种 上海化学试剂厂 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 重庆化学试剂厂 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 中国医药上海化学试剂公司 黑曲霉菌株an 4 弘rs l 0 9 ，见第2 章。 3 2 5 培养方法 取一环斜面菌种孢予分别接入装有1 2 0 m l 产酶培养基的5 0 0 m l 烧瓶中，3 0 摇瓶培养( 1 4 0 r r n i n ) ，2 4 h 后每瓶中加入1g 碳酸钙以维持p h 的稳定。 3 2 6 酶液的制备 取0 5 i n l 培养液，p h 5 6 的醋酸缓冲液稀释2 0 倍，5 0 0 0 r m i n 离心5 m i i l ，取 上清液测定酶活。 江南大学硕士学位论文 3 2 7 酶活测定方法 同2 t 3 3 。 3 3 结果与讨论 3 3 1 表面活性剂对产酶的影响 表3 1 不同的表面活性剂对黑曲霉s l 0 9 产菊粉酶的影响 t h b l e3 1 p r o d u c t i o no f i n u l i i l a s e nt 1 1 em e d i u mc o n t a i n i n g v a r i o u ss i l r f a c t 柚t s a i l ds u g a re s t e r sb y 一印p 倡f 胁竹t 妒rs l - 0 9 从表3 1 可以看出，蔗糖脂，特别是蔗糖脂s 7 7 0 的加入对酶活的提高有显著 的促进作用，而起着相同表面活性作用的s p a n 并没有出现类似的情况，进一步研 究发现，由于蔗糖脂分子中含有一个蔗糖残基【2 7 1 ，而且不易被分解，所以蔗糖脂 是一种较理想的菊粉酶合成促进剂。 3 3 2 碳源的选择 表3 2 不同碳源对产酶的影响 t a b l e3 2e 岱斌o f c a r b o ns o u r c e so ni 1 1 u l i l l a s ep r o d u c d o n 由表3 2 可知不同碳源对菊粉酶的产生影响很大，碳源在浓度为2 0 叽时以菊 粉和菊芋粉较佳，实验中发现以菊芋粉为碳源产酶最高，发酵在第4 天达到高峰 期，之后略有下降。这大概是由于菊芋粉比菊粉含有更丰富的营养物质，更适合 作为底物应用于菊粉酶的生产。 第三章菊粉酶的发酵条件优化及其酶学性质的初步研究 3 3 3 氮源的影响 由表3 3 可知不同氮源对菊粉酶的产生影响较大，其中爿确翠rs l 一0 9 利用有 机氮源产酶效果比无机氮源要好，有机氮源的产酶高低顺序如下：蛋白胨 酵母 膏 豆饼粉 玉米浆。考虑到蛋白胨和酵母膏比较昂贵，本实验选择产酶活力仅 次于蛋白胨和酵母膏的豆饼粉作为发酵培养基的氮源。 从以上的研究结论可以明显看出爿枷弦rs l 0 9 产酶的i s 值基本保持在0 5 左 右，所以在以下的研究中就探索各因素对该株菌产菊粉酶( i ) 活性的影响。 表3 3 不同氮源对产酶的影响 t a b l e3 3e 舵c to f n i t r o g e ns o u r c e so ni n u l i n a s ep m d u c t i o n 氮源 蛋白胨酵母膏 玉米浆豆饼粉n h 4 h 2 p 0 4 ( n h 4 ) 2 s 0 4n h 4 c 1 尿素 酶活( 2 0 9 ，l )( 2 0 9 几)( 2 0 9 ，l )( 2 0 乒)( 2 0 9 l )( 2 0 叽) ( 2 0 9 ，l )( 2 0 叽) 内切酶 ( 1 u ，m l ) 外切酶 ( 1 u ，m l ) 3 22 91 92 21 41 21 31 0 6 05 54 24 8 2 7 2 42 21 9 3 3 4 无机盐、金属离子、p h 、装液量、接种量对发酵产酶的影响 在以菊芋粉为碳源，豆饼粉为氮源的前提下，分别在发酵培养基中添加不同 的无机盐，金属离子，产酶发酵条件同上。结果表明所添加的无机盐和金属离子 对产酶影响不明显，这大概是由于菊芋酚和豆饼粉中含有丰富的营养成分，足够 供给菌体生长需求的缘故f 2 8 1 。装液量和接种量对产酶的影响也不是很显著，但初 始d h 值的影响较为显著，如图3 1 、3 2 和3 3 所示，最佳产酶的装液量为8 0 m l ， 接种量为0 6 1 0 6 个r i l l 黑曲霉孢子，p h 为6 o 。 3456789lo d h 内切酶活加外切酶活 图3 1 初始p h 对产酶的影响 f i g _ 3 1e 丘b c to f i n u h n a s ep r o d u c 廿o nb yi 1 1 i t i a lp h 江南大学硕士学位论文 6 o8 01o o12 o14o 装液量，ml 图3 2 装液量对产酶的影响 f i g 3 2 e 抒b c to f t l l ev o l u m ei nn a s ko ni n u l i n a s ep r o d u c t i o n u zu 4o ，6o 8l 接种量，( m l ) 图3 3 接种量对产酶的影响 f i g 3 一 e 位c to f i i l o c u l 撕o no ni i l u l i n a s ep r o d u “o n 3 3 5 黑曲霉的发酵动力学曲线 在4 呻