（发酵工程专业论文）虾青素的提取及其β环糊精包合物制备工艺的研究.pdf

摘要 摘要 随着人们生活水平的提高，虾青素以其超强的抗氧化和着色性能及抗肿瘤和 增强免疫的生理功能逐渐成为食品和医药领域的研究开发热点。本论文对红发夫 酵母中虾青素的提取及提取液中脂肪的去除方法进行了优化研究，并采用环糊精 包合技术对虾青素皂化液进行包合以提高其稳定性和利用率，对环糊精包合条件 进行了正交优化研究。 首先研究了红发夫酵母中虾青素的提取方法，比较了酸热法、超声波法、研 磨法和二甲基亚砜法四种破壁方法对酵母的破壁效果，同时对正己烷和丙酮以及 正己烷和乙醇的不同配比的混合溶剂对类胡萝h 素的提取效果进行了研究。通过 实验，确定了虾青素提取适宜的破壁方法为酸热法，提取溶剂为正己烷：丙酮( v ：v ) = 1 ：l 的混合溶剂。 皂化由于除去了色素提取液中大部分的酵母油脂，能提高虾青素一卢一环糊精 包合物的包合率，但皂化时虾青素受热和碱的作用被破坏的程度随皂化条件加剧 面增加。通过对皂化条件进行优化研究，得出优化的皂化条件为：温度2 0 ；n a o h 浓度0 0 2 1 m o 】几；每克干酵母提取液中加入2 5 m l n a o t t 溶液；反应时间2 0 m i n 。在 此条件下，虾青素保留率为8 6 5 4 。经过皂化后，包合率明显提高，由未皂化 前的2 6 6 7 提高到8 0 2 7 。 对虾青素一卢一环糊精包合物的制备工艺条件进行正交优化试验，结果表明： 在本实验范围内影响虾青素包合率的各因索中转速为显著影响因素，各因素的重 要性排列依次为：转速 时间 温度 环糊精用量。获得虾青素包合率最高的反应条 件为：每4 0 m g 皂化浓缩后的虾青素样品加入卢一环糊精7 9 ；温度4 0 ；转速 6 0 0 r m ir l ：搅拌包合时间5 h 。在此条件下制备虾青素一口一环糊精包合物，其包 合率高达8 5 7 7 。 对虾青素样品进行了光和热稳定性的研究，结果表明：随着温度和光强的升 高，虾青素一石油醚溶液和虾青素一卢一环糊精包合物样品稳定性都呈下降趋势， 但采用环糊精包合技术后。虾青素对光和热稳定性与未包合前相比有了很大的提 高。 采用x 射线衍射分析法和红外光谱法对虾青素一卢一环糊精包合物、卢一环 糊精、虾青素样品及两者物理混合物的结构进行了检测。x 射线衍射分析检测结 果表明；包合物结构与混合物相比发生了显著变化，在衍射峰的位置和强度上均 有显著不同，而且产生了新的峰；另外，红外光谱检测结果表明：虾青素一口一 环糊精包合物的红外吸收峰相对于主客体吸收峰有多个发生位移和消失，且峰形 华南理工大学硕士学位论文 和峰强度亦有改变。x 射线衍射和红外光谱测定结果均表明虾青素与卢一环糊精产 生了包合作用，形成了包结物。 委托中国广州分析测试中心对虾青素一芦一环糊精包合物中残存丙酮、乙酸乙 酯、砷、铅的含量进行了检测，结果显示，所得包合物中残存的丙酮、乙酸乙酯、 砷和铅的含量均达到了f a o w h o 质量指标的要求，可安全用作食品添加剂。 关键词：虾青素；提取；皂化；口一环糊精；包合 i i a b s t r a c t a b s t r a c t w it ht h ee n h a n c e m e n to fp e o p l e ss t a n d a r do f1 i v i n g ，a s t a x a n t h i nh a s b e c o m et h es t u d yh o t p o ti nt h ef i e l do ff o o da n dm e d i e i n ei n d u s t r yb e c a u s e o fi t sf u n c t i o n so fa n t i o x i d a t i o n 、b e p a i n t i o n 、a n t i t u m o u ra n d i m m u n e b u i1 d u p t h isp a p e ro p t i m i z e dt h ec o n d i t i o n so fe x t r a c t i n ga s t a x a n t h i nf r o m p h a f f i ar h o d o z v m aa n d s a p o n i f i c a t i o n o f e x t r a c t a s t a x a n t h i nw a s e n c a p s u l a t e db y 卢一c y c l o d e x t r i n i n c l u s i o n t e c h n i q u e t o i m p r o v e i t s s t a b i l i t y a n du t i l iz a t i o n r a t e ，o p t i m a l i n c l u s i o ne o n d i t i o n sw e r e r e s e a r c h e db yo r t h o g o n a lt e s t t h ee x t r a c ti n gm e t h o do fa s t a x a n t h i nf r o mp h a f f i ar h o d o z y m aw a s s t u d i e dp r i m a r i1 y a c i dh e a tm e t h o d ，s u p e r s o n icm e t h o d ，g r i n d in gm e t h o da n d d i m e t h y ls u l p h o x i d e ( d m s o ) m e t h o d w e r ec o m p a r e da b o u t t h e i re f f e c to f d i s r u p t i n gc e l lw a l l ，a n dm ix e ds 0 1 v e n t ( d i f f e r e n tr a t i oo fa c e t o n ea n d h e x a n e ：e t h a n o la n dh e x a n e ) w e r ea ls oc o m p a r e da b o u tt h e i re x t r a c t i n g e f f e c t t h er e s u l ts h o w e d ：t h eo p t i m a lm e t h o do fd i s r u p t i n gc e l lw a l li s a c i d - h e a t ，a n dt h eo p t i m a lm i x e ds o l v e n t isa c e t o n e ：h e x a n e ( v ：v ) = 1 ：1 t h ei n c l u s i o nr a t eo fa s t a x a n t h i nw a si m p r o v e ds i g n i f i c a n t lyw h e nf a t i na s t a x a n t h i ne x t r a c tw a se 1i m i n a t e dm o s t l yb ys a p o n if i c a t i o n 。b u tt h e b r o k e n d e g r e e o fa s t a x a n t h i nb yh e a ta n da l k a l iw o u l dr i s ea st h e a g g r a v a t i o no fs a p o n i f ic a t i n gc o n d i t i o n s t h er e s e a r c ho nt h ec o n d i t i o n s o f s a p o n i f i c a t i o n s h o w e d ：t h e o p t i m u m e o n c e n t r a t i o no fn a o h is 0 0 2 l m o l l ，t h eo p t i m u mv o l u m eo fn a o his2 5 m l ( t oa s t a x a n t h ine x t r a c t0 f 1 9d r yr h o d o t o r u l a ) ，t h eo p ti m u mr e a c ti0 1 3 ti m eis2 0 m in ，a n dt h eo p ti m u m t e m p e r a t u r eis2 0 r e m a n e n tr a t eo fa s t a x a n t h i nc a nb er e a c h e d8 6 5 4 a n di n c l u s i o nr a t ec a nb ei m p r o v e df r o m2 6 6 7 t o8 0 7 7 u n d e rt h e s e c o n d i t i o n s t h et e c h n ic a lc o n d i t i o n so f p r e p a r i n g i n c l u s i o n c o m p le x e s o f a s t a x a n t h i nw it h 芦一c y c l o d e x t r i nw e r er e s e a r c h e db yo r t h o g o n a lt e s t t h e r e s u l tw a sa sf 0 1 1 0 w s ：i na 1 1f a c t o r sw h i c hi n f l u e n c et h ei n c l u s i o n r a t e ，r o t a t es p e e di st h em o s ti m p o r t a n t t h es e r i e so fe a c hf a c t o r 1i n e b e h i n di nc o n s i d e r a t i o no fi t si m p o r t a n c e ：r o t a t es p e e d ，r e a c t i o nt i m e ， t e m p e r a t u r e q u a n t i t yo f 卢一c y c l o d e x t r i n t h ec o n d i t i o n sf o rt h eh i g h e s t i i l 华南理工人学硕士学位论文 i n c l u s i o nr a t ei s ：r o t a t es p e e d6 0 0 r m i n ：t i m e5 h ；t e m p e r a t u r e4 0 。c ： 一c y c l o d e x t r i n7 9 ( t os a p o n if i e de x t r a c ti n c l u d i n g4 0 m ga s t a x a n t h i n ) i n c l u s i o nr a t ec a nb er e a c h e d8 5 7 7 u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s t h er e s e a r c ho nt h es t a b i l i t yo fa s t a x a n t h i nt oh e a ta n d 1 i g h t s h o w e d ：t h es t a b i l i t yo fa s t a x a n t h i n g p e t r o l e u me t h e rs o l u t io na n d a s t a x a n t h i n 一卢一c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o nc o m p l e xb o t hf a l lw h e nt e m p e r a t u r e i sr i s e no r l i g h t isi n t e l l s i f i e d b u tt h e s t a b i l i t yo f a s t a x a n t h i n 一 口一c y c l o d e x t r i ni n e l u s i o nc o m p l e xisi m p r o v e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t h a s t a x a n t h i n - p e t r o l e u me t h e r a s t a x a n t h i n 一芦_ c y c l o d e x t r i n i h e l u s i o n c o m p le x ，a s t a x a n t h i n ， 一c y c l o d e x t r i na n dt h em ix t u r eo fa s t a x a n t h i na n d8 一c y c l o d e x t r i nw e r e e x a m i n e db yx r a yd i f f r a c t i o i lt e c h n i q u e sa n di rs p e c t r a t h er e s u l to fx - r a y d i f f r a c t i o ns h o w e d ：c o m p a r e dw i t ht h em i x t u r e ，t h e x r a yd i f f r a c t i o np e a k o f a s t a x a n t h i n 一卢一c y c l o d e x t r i n i n c l u s i o n c o m p l e x h a sa l t e r e d s i g n i f i c a n t ly ，t h ep o s i t i o na n di n t e n s i t yo fp e a kh a sa l t e r e de v i d e n t ly ，a n d n e wp e a kh a sa l s oa p p e a r e d i na d d it i o r t h ef e s u l t0 fi rs p e c t r as h o w e d ： c o m p a r e dw i t hh o s ta n dg u e s t ，t h ei ra b s o r b i n gp e a ko fa s t a x a n t h i n 一 卢一c y c l o d e x t r in i n e l u s i o n c o m p l e x h a ss e v e r a ld is p l a c e m e n ta n d d is a p p e a r a n c e ，t h es h a p ea n ds t r e n g t ho fp e a kh a sa l s oa l t e r e d t h er e s u l t o fx - r a yd i f f r a c t i o nt e c h n i q u e sa n di rs p e c t r aa l lc o n f i r mt h ee x is t e n c e o fi n c l u s i o nc o m p l e xo fa s t a x a n t h i nw i t h 口一c y c l o d e x t r i n r e m a n e n tq u a n t i t i e so fa c e t o n e ，e t h y la c e t a t e ，a r s e n i ca n dp 1 u m b u mi n a s t a x a n t h i n 卢一c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o r c o m p l e xw e r ee x a m in e di nc h in a n a t i o n a la n a l y t ic a lc e n t e ro f6 u a n g z h o u ，t h er e s u l ts h o w e d ：r e m a n e n t q u a n t i t i e so fa c e t o n e ，e t h y la c e t a t e ，a r s e n i ca n dp l u m b u ma l lr e a c ht h e q u a l i t ys t a n d a r do ff a o w h o ，a n dt h ea s t a x a n t h i n 一口一c y c l o d e x t r i n i n c l u s i o nc o m p l e xc a nb eu s e da sf o o da d d it i v es a f e l y k e yw o r d ：a s t a x a n t h i n ：e x t r a c t ；s a p o n i f i c a t i o n ；一c y c l o d e x t r i n ：i n c l u s i o n i v 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 到见施 日期：2 0 0 5 年5 月2 8 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ”) 作者签名：3 ! l 风砍日期：2 0 0 5 年5 月2 8 日 导师签名：日期：2 0 0 5 年5 月2 8 日 第一章绪论 1 1 虾青素 第一章绪论 1 1 1 虾青素概述 类胡萝卜素属于萜烯类不饱和化合物，是具有多个共轭双键的多烯烃，在自 然界中广泛存在，现已发现约6 0 0 种类胡萝h 素，虾青素( 3 , 3 二羟基4 ，4 一二 酮基一p ，一胡萝h 素) 便是其中的一种。虾青素( a s t a x a n t h i n ) 广泛分布在自 然界，是甲壳类动物、鲑鱼、各种鸟类如火烈鸟和深红色朱鹭以及很多其他生物 中的主要色素。虾青素具有极强的抗氧化性能，其抗氧化性能较生育酚强百倍 以上，有“超强维生素e ”之称。动物试验表明虾青素有抗肿瘤和增强免疫功能 的作用，因而在食品添加剂、化妆品、保健品和医药工业方面有广阔的应用前景 m 。同时虾青素又是一种良好的着色剂，是鲑鱼等贵重鱼类的主要色素，而动物 缺乏合成类胡萝h 素的能力，因此虾青素在水产养殖方面具有重要价值，9 5 年已 有1 亿多美元的市场n ，。 人工合成虾青素成本高，故售价高达$ 2 0 0 0 k g ”1 ，且大多数为顺式结构。美国 f d a 仅批准人工合成的反式结构的虾青素用作水产养殖的添加剂w 。过去虾青素 的主要来源是甲壳类动物，但甲壳类动物虾青素含量低，提取费用高，不适合作 为虾青素的大规模来源。因此寻找一种廉价的天然虾青素来源是当前研究方向。 目前只发现短杆菌b r e v i b a c t e r i u m ，分枝杆菌m y c o b a c t e r i u ml a c t i c o l a ，土壤杆菌 a g r o b a c t e r i u ma u r a t i u m ，水生红球藻h a e m a t o c o c c u sp l u v a l i s 和红酵母p h a f f i a r h o d o z y m a 等少数几种微生物能够合成虾青素1 。但具有研究价值的主要是 h a e m a t o c o c c u sp l u v a l i s 和p h a f f i ar h o d o z y m a 。其中h a e m a t o c o c c u sp l u v a l i s 的虾青 素含量高，高达0 2 2 ，但其培养周期长，需光照和破壁释放虾青素，因此进行 大规模生产比较困难。红发夫酵母具有作为色素生物来源的一些必要的特征：合 成虾青素作为一种主要的类胡萝h 素，不需要光照；能利用多种糖作为碳源进行 快速异养代谢；培养时间短：能够在发酵罐中实现高密度培养等。但是野生型红 发夫酵母虾青素含量还不够高，只有2 0 0 3 0 0 m g k g 干菌体，与工业生产要求还有 一定的差距，因此，生物来源虾青素目前仍缺乏与化学合成竞争的能力。虽然如此， 红发夫酵母以其生长速度快，发酵周期短，以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作 为饵料、饲料添加剂等优点而成为目前的研究重点。 华南理工大学硕士学位论文 1 ，1 2 虾青素的物理化学特性 虾青素( 3 ，3 一二羟基一4 ，4 - 二酮基一，卢胡萝b 素) 分子式为c 4 0 h 5 2 0 4 ， 相对分子质量5 9 6 8 6 ，是一种萜烯类不饱和化合物，是甲壳类动物如蟹、虾和三 文鱼的主要色素。虾青素易于氧化，氧化后变为虾红素( a s t a c e n e ) 。在k a r r e r 对 虾红素认识的基础上，k u h n 和s o r e n s e n 首先对虾青素进行了化学鉴定，d a v i d 和 w e e d o n 后来通过从角黄素( c a n t h a x a n t h i n ) 合成虾红素证实了虾青素的化学结构。 瑞士f h o f f m a n n l a r o c h e 的研究者已经完成了纯虾青素的合成。 晶体状虾青素是一种精细深紫褐色粉末，熔点大约为2 2 4 ，在水溶液和大 多数有机溶剂中不易溶解，但在室温下能溶于二氯甲烷( 3 0 9 1 ) ，三氯甲烷( 1 0 9 1 ) ，二甲基亚砜( o 5 9 1 ) ，丙酮( 0 2 9 1 ) 和其它的非极性溶剂。它的吸 收光谱代表一个共轭多烯结构，在三氯甲烷中的入m a x = 4 8 9 n m ，在乙醇中九 m a x = 4 7 8 n m ，在丙酮中 m a x = 4 8 0 n m 。 虾青素的化学结构是由四个异戊二烯单位以共轭双键形式联结，两端又有两 个异戊二烯单位组成六节环结构。虾青素中因为含有一个长的共轭双键系统，比 其他异戊二烯化合物更不稳定。光、热、酸和氧特别易于破坏虾青素的结构。当 从生物样品中提取虾青素时，酶的作用也可能破坏虾青素的结构。高效液相色谱 可用于检测虾青素的顺式异构体，检测时虾青素的顺式异构体一般最后从柱中流 出。全反式天然虾青素易于异构化而形成顺反异构体的混合物，特别是9 一顺和1 3 顺异构体。因此必须采取措施防止这种转化。虾青素的顺式结构通常被认为是非 天然的合成品。然而，虾青素顺式异构体可能有必需的代谢功能，并且在某些生 物中能自然形成。p r h o d o z y m a 中已经检测到顺式结构的虾青素。在进行自然来源 虾青素及其酯的分析时，应当避免碱性条件，因为在碱性和有氧条件下皂化时， 虾青素不可逆地转化为虾红素。几种类胡萝b 素的结构式如图1 - 1 所示。 虾青素在3 和3 位置有两个不对称碳原子，能以四种构象存在，包括均一对 映体( 3 s ，3 s ；3 r ，3 r ) 和内消旋形式( 3 r ，3 s ；3 r ，3 s ) 。化学合成的虾青素 是几种构象异构体的混合物。顺反异构体和构象异构体可以通过h p l c 和t l c 分 离。a n d r e w s 和s t a r l 9 7 5 年发现p r h o d o z y m a 中含有3 r ，3 r 虾青素( 9 2 ) 作 为主要的构象异构体。红球藻中生物合成的虾青素为3 s ，3 s 异构体。野生鲑鱼 中检测到所有的虾青素内消旋和对映构象异构体”，。 2 第一章绪论 8 胡萝卜素 o 角黄索 虾红素 虾青素 图1 - 1 几种类胡萝卜索的化学结构式 f i g 1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fc a r o t e n o i d s h 华南理= 大学硕士学位论文 1 1 3 虾青素的生物学功能 1 1 3 1 抗氧化性能 虾青素是海洋动物中主要的类胡萝b 素之一，具有极强的淬灭单线态氧和清 除自由基能力。l e e 等人研究了叶黄素、玉米黄素、番茄红素、玉米黄素和虾青 素( 双键数分别是1 0 ，1 1 ，1 l ，1 1 ，和1 3 ) 等五种类胡萝b 素在豆油光氧化作用 中淬灭活性氧能力。它们淬灭单线态氧速率常数分别为5 7 2 x 1 0 9 ，6 7 9 x 1 0 9 ， 6 9 3 x 1 0 9 , 7 3 9 x 1 0 9 和9 7 9 x 1 0 9 。表明它们淬灭活性氧能力随着共轭双键数的增加 而增加，以虾青素的淬灭能力为最强m 。m i k i 研究了叶黄素、玉米黄素、金枪鱼 黄素、角黄素、胡萝p 、西生育酚和虾青素等类胡萝h 素淬灭单线态氧和清除 自由基能力。各类胡萝b 素和a 生育酚清除自由基的半数效应剂量如表1 1 所 示。研究结果表明，类胡萝b 素具有清除自由基和淬灭活性氧的活性，这种活性 与维生素e 相似，其中以虾青素活性最强，比维生素e 强百倍以上，作者将其称 为“超级维生素e ”。同时还发现虾青素具有抑制脂过氧化的作用”】。w o o d a l l 等 人发现虾青素具有降低脂质过氧化作用，能保护磷脂酰胆碱脂质免受氧化m ，。 n a k a g a w a 等人也发现虾青素具有显著降低脂质过氧化物累积的作用w 。 表1 1 类胡萝h 素和扩生育酚作为自由基清除剂的e d i 。值 t a b l e l le 1 ) j oo fc , a r o t e n o i da n da - t y p b e r o l 清除剂e d 。( n m ) 虾青素 玉米黄素 角黄素 叶黄素 金枪鱼黄素 一胡萝h 素 a 一生育酚 2 0 0 4 0 0 4 5 0 7 0 0 7 8 0 9 6 0 2 9 4 0 1 1 3 2 抗肿瘤和增强免疫作用 t a n a k a 等人通过小鼠试验观察到虾青素对膀胱癌有化学预防作用。在小鼠饮 水中加入2 5 0 p p m n 丁基n 一( 4 羟丁基) 一亚硝胺( o h b b n ) 持续2 0 周，间隔l 周后饮水中加入5 0 p p m 虾青素，再持续2 0 周，发现虾青素组膀胱癌发生率显著 降低m 。t a n a k a 等人在用硝基喹啉1 一氧化物诱发大鼠口腔癌的类似实验中，观察 到虾青素能显著降低口腔肿瘤的发生率m 。 n i s h i n o 研究了各种类胡萝h 素的抗癌作用，发现虾青素具有极强的抗癌作用 4 第一章绪论 m 】。g r a d e l e t 等人以鼠研究了虾青素等类胡萝卜素对肝癌的影响，结果发现虾青 素和卢胡萝h 素在抑制肝癌方面有显著效果，而番茄红素则无效1 。s a v o u r e 等 通过裸鼠表皮试验，说明虾青素抑制肿瘤发生的效应在于对肿瘤增殖的抑制“。 j y o n o u c h i 等人通过试验，发现虾青素能显著促进胸腺依赖抗原( t d a g ) 刺激时 的抗体产生，分泌i g m 和i g g 的细胞数增加“。 1 1 4 虾青素的生物来源 1 1 4 1 甲壳类动物及其副产品 甲壳类动物的甲壳中含有虾青素。有人研究了以甲壳类动物及其副产品作为 色素来源。在挪威，虾废弃物传统上被用作鲑鱼和鳟鱼的虾青素来源。然而在甲 壳类动物及其废弃物中类胡萝卜素含量非常低( 0 2 0 0 m g k g ) ”1 ，同时含有较多 的灰分、几丁质和水分，这些限制了它们的作用。 1 1 4 2 藻 几种藻以虾青素作为它们的基本类胡萝h 素。水生红球藻( h a e m a t o c o c c u s p l u v i a l i s ) 细胞中含有o 5 2 ( 干重) 的虾青素，大多数虾青素以酯类形式( 8 7 ) 存在，这可能影响虾青素在一些动物体内的沉积和代谢。血红裸藻( e u g l e n a s a n g u i n e a ) 细胞中虾青素双酯的含量达细胞干重的0 7 。此外绿藻e r e m o s q h a e r a v i r i d i s 、c h l o r e l l as p p 和b o t r y o c o c c u sb r a u n i i 在不利的生产条件下产生虾青素。 k v a l h e i m 和k n u t s e n 观察到以藻喂养鲑鱼时，虾青素在鲑鱼体内的沉积量较少。 他们认为这主要是由于藻中虾青素以酯类形式存在，但这种结论并没有被其他人 证实。另一个限制因素是从藻体中提取色素。高色素含量的藻体通常被一层厚的 细胞壁包围，这也阻碍了色素的吸收和利用。另外，微藻类通常生长较慢，需要 较长的自养培养周期。 1 1 4 3 真菌 某些真菌中含有虾青素。如酵母菌p h a f f i ar h o d o z y m a 中含有0 0 2 0 0 5 的虾 青素，真菌r h o d o t o r u l ar u b r a 、p e n i o p h o r a ，s pc r y p t o c o c c u s 和s p o r o b o l o m y c e 中 虾青素的含量较低。 p r h o d o z y m a 最早由p h a f f 等人在美国阿拉斯加的高山上和日本国采集到，开 始命名为r h o d o z y m a m o n t a n a e 作为一个新种和属，但没有按照国际植物命名标准 进行拉丁鉴定，后经m i l l e r 鉴定并命名为新属p h a f f i a 。m i l l e r 认为p r h o d o z y m a 有下面几个独特性质：发酵能力强，类胡萝h 素含量高和独特的细胞壁组成等。 19 7 6 年a n d r e w s 等发现其产生虾青素，。 p r h o d o z y m a 具有以下特点：类胡萝h 素合成；细胞表面相关的胶化纤维素化 合物的生成；辅酶q 1 0 体系以及发酵糖的能力。p r h o d o z y m a 能够利用的碳源有 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、棉子糖、可溶性淀粉、乙醇( 潜在 5 华南理工大学硕士学位论文 和消极) 、a 一甲基葡萄糖苷( 潜在和消极) 、d 甘露醇、水杨苷( 弱) 、2 - 酮葡萄糖 酸、d l 乳酸( 潜在) 、琥珀酸和甘油( 弱) ，不能利用乳糖、半乳糖、d 一核糖、 葡萄糖胺和阿拉伯糖。不能利用硝酸盐作为氮源，但能水解尿素作为氮源。生长 在0 2 7 的温度下* ，。 p r h o d o z y m a 从起源上说是担子菌纲，但有性过程没有得到证实。它与担子菌 纲的关系由多层细胞壁和成肠细胞芽的存在而得到阐述。它与担子菌的亲源关系 被细胞的碳水化合物组成支持。p r h o d o z y m a 在种系起源上与其他生成类胡萝h 素 的无性酵母相近，包括r h o d o t o r u l a ，c r y p t o c o c c u s 和其他的异担子菌纲酵母。 p r h o d o z y m a 通过它的胶化纤维素的生成和发酵糖的能力与r h o d o t o r u l a 区别开 来，通过糖发酵与c r y p t o c o c c u s 区别开来。 类胡萝h 素组成是p r h o d o z y m a 区别于其他酵母属的一个主要特征。虾青素 是p r h o d o z y m a 的主要色素。野生菌株类胡萝h 素含量达到5 0 0 m g k g 干菌体，其 中4 0 9 0 是虾青素。虾青素含量随菌种和培养方法的不同而有很大的差异。 1 1 4 4 其他微生物 一些短杆菌b r e v i b a c t e r i u m ，分枝杆菌m y c o b a c t e r i u ml a c t i c o l a ，土壤杆菌 a g r o b a c t e r i u ma u r a t i u m 也被报道含有虾青素。在这些微生物中类胡萝h 素含量比 较低，生长也比较缓慢，没有对这些微生物进行发酵研究。 1 1 5 虾青素的提取 利用红酵母发酵生产天然虾青素是近来我国学者研究较多且较具应用前景的 课题。但类胡萝h 素是酵母细胞内产物，破壁效果及提取方法直接影响红酵母发 酵生产、类胡萝h 素的产量、质量和生产成本。因此，研究红酵母破壁及提取方 法具有重要的现实意义。 目前虾青素的提取主要是先用各种方法破壁，然后再用有机溶剂提取。酵母 细胞的细胞壁不容易破碎，这给酵母中虾青素含量测定带来了困难。酵母细胞的 破壁方法一般有物理法( 机械碾磨、超声波) 、化学渗透法、酶法( 包括自溶法) 和酸 热法几种“。有机溶剂的选择对于提取虾青素是非常重要的。虾青素不溶于水， 在极性弱的有机溶剂中溶解度较大，如在氯仿中的溶解度为1 0 9 l ；在极性强的 有机溶剂中溶解较小，如丙酮中虾青素的溶解度为0 2 9 l ，二甲亚砜中为0 5 9 l 。 据文献报道，应用较多的有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲亚砜、丙酮、石油醚等”“。 由于虾青素对光、热、氧都比较敏感，易分解、破坏，因此在提取过程中应尽量 避免由这些因素而导致的分解和破坏，在提取过程应及时加入一些保护物质，尽 量避免其他杂质与虾青素一起被提取出来，可以减少以后净化、分离工序的繁杂 程度。 6 第一章绪论 1 2 环糊精 环糊精是一种淀粉水解的中间产物，由于它的特殊结构和性能，使之得到臼 益广泛的应用，在医药、食品、化妆品、农业、化工以及分析、分离技术上都有 巨大应用潜力。当今国际上，日本在环糊精的研究上发展极快，我国也在积极研 究，有待大力发展。 1 2 1 环糊精的分子结构 环糊精是由环糊精糖基转移酶作用于淀粉或直链糊精而产生的至少有六个 d 一吡喃葡萄糖单元环状排列而成的一组低聚糖。环状糊精首次由a v i l l e r s 发现于 1 8 9 1 年”，1 9 0 3 年至1 9 1 1 年期脚，薛定谔( s c h a r d i n g e r ) 完成了确定环糊精结构的 研究，从而为环糊精化学的开创奠定了基础。常见的有a c d 、卢c d 和r c d ， 分别含有6 、7 、8 个葡萄糖单元。经x 射线衍射和核磁共振证实：c d 是以口一1 ，4 糖苷键相连而成的简状分子，3 种c d 内径分别为o 4 7 o 5 3 n m 、0 6 0 0 6 5 n m 和o 7 5 0 8 3 n m ，高度均为( 0 7 9 0 1 ) r i m 。每个c d 分子外侧面窄端口连接伯羟 基( 6 一o h ) ，宽端口连接2 类仲羟基( 2 - o h ，3 - o h ) ，所以宽端口o h 是窄端口的2 倍。 c d 分子的内空腔表面仅存在糖苷氧原子及覆盖糖苷氧原子的氢原子，所以c d 腔 内呈疏水环境，外侧面边框由于羟基的聚集而呈亲水性，这种“内亲油、外亲水” 的特殊结构，使c d 作为“主体”可以包结不同“客体”化合物。客体分子全部 或部分地嵌入环糊精空穴内，多数以范德华力、氢键形成特殊结构的包结物”。 环糊精结构如图1 2 2 1 1 所示。 e o f s 髫 ，麟”羚，。“ 。“秒 ：p n ，矗o 2 h 蘑广 ( a ) ( b ) 图1 2 口c d 的化学结构 f i g 1 2 c h e m i c a ls t r u c t u r eo f 芦一c d 7 华南理t 大学硕士学位论文 1 2 2 环糊精的物理和化学性质 环糊精有点甜味，在低浓度比蔗糖还甜，环糊精呈现甜味的最低浓度为 o 0 3 9 ，蔗糖是0 2 7 ，2 5 的芦环糊精溶液的甜度与1 7 1 的蔗糖甜度相当。 在室温条件下，口环糊精的水溶性( 1 8 5 ) 显著低于口环糊精和，一环糊精，使 一环糊精在生产上更易获得。形成的复合物有不同的溶解度。每种复合物的溶解度 取决于环糊精洞穴所包络的客体，一般介于未包络的环糊精和客体的溶解度之间。 由于香料分子在水中的溶解度一般比环糊精低，客体分子的疏水部分与环糊精的 洞穴相互作用，而环糊精分子外部具有亲水性，客体分子就被包围它的环糊精分 子带入溶液。复合作用往往能增加香料的溶解度，当复合物与水混合后，除了增 溶作用外，还有速溶和扩散作用。环糊精分子在水中保持不变，并保持形成复合 物的能力。环糊精在油中不溶，可以用水来取代油作为大多数香料的溶剂和稀释 剂。表1 2 列出了环糊精的一些重要物理参数”“。 卢- 环糊精的热稳定性较好，在大约1 0 0 ，当水从晶体中蒸发时，产生吸热； 大约在2 7 0 2 8 0 ，当晶体熔化和热分解出现时，产生吸热。而在其它温度范围， 这种晶体材料不吸热。用于胶囊化的淀粉、蛋白质和其它大分子材料在加热时， 其二级和三级结构会发生变化。在大多数情况下，这种变化是不可逆的，因此加 热会使聚合物分子失去胶囊物质的能力，而环糊精的结构在加热和冷却后不变化， 保持了形成复合物的能力。 在加热过程中，挥发性客体有一些损失，损失的量取决于诸如客体的性质和 含水量等。对于干燥的复合物，客体的蒸发温度常常超过未复合的客体温度1 0 * c 以上，如果含有水的话，一些客体会以游离的( 未复合) 的状态存在，加热时容易 损失。 环糊精和它的复合物不吸湿，在同样潮湿条件下，与卢c d 形成复合物的 香料比用乳糖等包衣的香料性能更好。例如香料分别与口c d 和麦芽糊精胶囊化， 贮放两周后，用麦芽糊精胶囊的香精变坚硬，而用p c d 胶囊的香精仍然保持干 燥，成易流动的粉末状n 。 环糊精的化学性质相当稳定。环糊精没有还原性末端基团，除非环糊精水解， 无涉及还原糖的反应。对碱稳定，在7 5 的o 3 5 m o l l n a o h 溶液中，检测不到 降解产物。强酸如硫酸和盐酸能水解环糊精，其水解程度取决于酸的浓度和反应 温度。弱的有机酸如乙酸不能水解环糊精。在食品的正常p h 值范围内，环糊精不 能被水解。许多。淀粉酶能水解p 环糊精，但其水解率取决于酶的来源，一些酶 比另一些酶更能开环，如真菌淀粉酶一般比细菌淀粉更能水解环糊精。而与客体 形成复合物的环糊精比未复合的环糊精更能抗酶的水解。卢一环糊精能抗唾液淀粉 酶的水解，因此在口腔中不能检测到它的水解。环糊精很容易受胃酸水解，其水 8 第一章绪论 解速度为一般直链糊精的3 倍。故可在人体内代谢消化。 表1 2 口一、口一和r 一环糊精的一些重要特性 t a b l e l 2i m p o r t a n tq u a i t i e so fd 一、一a n dy c y c l o d e x t r i n 1 2 3 安全性 环糊精具有无毒、无味、在体内易水解为葡萄糖分子的特点。虽然环糊精分 子对唾液淀粉酶稳定，但环糊精作为一种低聚糖摄入人体内后易受胃酸水解为单 糖即葡萄糖，其水解速度一般为直链淀粉的3 倍，故可在人体内代谢消化。另外， 食用后因肠道内的细菌作用能加速环糊精代谢的进行，所以环糊精能得以充分的 保证其食用安全性，对人体无任何毒害作用。文献报导了用白鼠进行了口一环糊精 的实验结果如表l 一3 ”“。从表中可见芦坏糊精不含毒性，目前欧、美、日等国家 的政府已批准允许芦环糊精在食品工业的应用。 表1 3 口一环糊精的毒性实验 t a b l e l 3 t o x i c i t ye x p e r i m e n to f 芦一c y c l o d e x t r i n 慢性病毒经过6 个月的实验，按0 1 9 ，1 6 9 k g 的比 例连续口服后没有任何变化 9 华南理工大学硕士学位论文 1 2 4 环糊精包结物的形成条件 能与c d 形成包结物的客体非常广泛，如有机分子、无机离子、生物小分子u “、 配合物、聚合物甚至惰性气体。分子大小适于其洞穴尺寸的客体分子，只要极性 小于水，就有可能代替小分子而进入空腔形成包结物。但包结过程及包结物的稳 定性要受各种因素影响m - ，其内在因素取决于c d 和客体的基本性质。 1 2 4 1 主客体分子尺寸空间的匹配性 影响c d 与客体形成包结物的因素有很多，其中客体分子大小起决定作用”。 客体分子尺寸太大，不易进入c d 空腔；尺寸太小，包结物不稳定。只有客体分子 大小与c d 空腔内径相匹配，才能形成比较稳定的包结物。 1 2 4 2 主、客体之间要有疏水基团的相互作用 环糊精空腔是疏水性的，所以客体分子的非极性越大越易被包结。当具有疏 水基的客体分子进入c d 空腔，疏水端与c d 内腔才有最大接触，而亲水