（发酵工程专业论文）蚕豆酱质量的初步研究.pdf

摘要 摘要 豆酱是我国传统的微生物发酵豆制品，以其独特的工艺，细腻的品质，丰富的营养， 鲜香可口的风味而深受广大群众的喜爱，有良好的市场前景。但由于豆酱生产工序较多， 且豆酱发酵是复杂的微生物代谢过程，所以易出现一些质量问题，豆酱白点问题就是其 中之一，这是豆酱生产厂家长期以来未能彻底解决的一个难题，所谓白点是指成品豆酱 表面生成的白色小颗粒，它严重影响豆酱的外观质量，影响豆酱的销量。生产中另一个 令人头疼的问题是豆酱的传统发酵周期太长( 约4 个月) ，采用高温发酵可缩短生产周期 至1 个月，但传统发酵豆酱比高温发酵豆酱具有更优越的风味特色。基于此，本论文研 究白点物质的组成，发酵工艺参数对其有何影响，并用驯化米曲霉菌株酿制豆酱，以期 能降低豆酱中酪氨酸的含量，减少白点的生成；分析传统发酵豆酱成熟期的微生物菌群 及两种工艺豆酱的风味物质组成，为进一步改善高温发酵豆酱的风味提供依据。主要结 果如下： 白点物质主要由大量的酪氨酸以及少量的苯丙氨酸组成，为减少豆酱中酪氨酸的含 量应控制好制曲时间、发酵时间、盐水浓度及曲水比。另外在发酵前期每千克成曲中加 入1 4m l 的冰乙酸有助于控制豆酱中的酪氨酸含量，且风味不受明显的影响。 米曲霉用添加酩氨酸的麦汁培养基进行驯化，驯化菌种与生产菌种相比，产酸性、 中性蛋白酶能力都有所下降，将驯化菌种用于豆酱发酵，采用的工艺参数与正常生产的 相同，发酵过程中取样检测氨基酸组成，发现酪氨酸含量明显减少，说明用此菌种进行 一豆酱生产能降低白点的出现率。 采用免培养法( 基因克隆文库的构建技术) 对传统发酵成熟酱醅中的细菌1 6 sr d n a 和 真菌1 8 sr d n a 进行了分析。结果表明，成熟酱醅中存在的细菌分别为& 印h y l o c o c c u s 属、l a c t o b a c i l l u s 属和t e t r a g e n o c o c c u s 属，其与具有最高同源性的菌株的相似性分别为 9 9 、9 8 、9 9 。成熟酱醅中发现的真菌共5 个属，分别为z y g o s a c c h a r o m y c e s 属、 r h i z o c h a e t e 属、a s p e r g i l l u s 属、r h o d o t o r u l a 属和p h a s e o l e a ee n v i r o n m e n t a ls a m p l e ，与具 有最高同源性的菌株的相似性均为9 9 。 应用顶空固相微萃取气质联用( h s s p m e g c m s ) 对传统发酵和高温发酵两种工艺 的成熟酱醅中的挥发性风味物质进行了分析检测。结果表明，与高温发酵相比，传统发 酵产生的挥发性风味物质种类较多( 包括醇、醛、酯、酮、烃、杂环、腈、酸、醚、酚 等) ，并且酯、醛、烃、杂环类化合物的相对含量较高。 关键词：豆酱，酪氨酸，苯丙氨酸，细菌，真菌，挥发性风味物质 a b s t r a c t a b s t r a c t s o y b e a np a s t ew a so n eo ft h et r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y b e a np r o d u c t si no u rc o u n t r y i tw a s p o p u l a rw i t hm a n yp e o p l eb yi t sn i c et a s t ei nq u a l i t y , r i c hn o u r i s h m e n t ，d e l i c i o u sf l a v o ra n dt h e p r o s p e c to fm a r k e tw a se x t e n s i v e b u tt h e r ew e r em a n yp r o c e d u r e si nt h ep r o d u c t i o na n dt h e f e r m e n t a t i o no fs o y b e a np a s t ew a sac o m p l e xc o u r s eo fm e t a b l i s mo f m i c r o o r g a n i s m s s oi tm a y c a u s es o m eq u a l i t yp r o b l e m sa n dt h ew h i t ep a r t i c l e sw a so n eo ft h e mw h i c hs e v e r e l ye f f e c t s p r e s e n t a t i o nq u a l i t yo fs o y b e a np a s t e a n o t h e rp r o b l e mw a st h a tt h ep r o d u c t i o nc y c l eo f t r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nw a sv e r yl o n g ( a b o u t4m o n t h s ) c o m p a r e dw i t hh i g ht e m p e r a t u r e f e r m e n t a t i o n ( a b o u t1m o n t h ) ，t h ef l a v o ro fs o y b e a np a s t ew i t ht r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nw a sb e t t e r b a s e do nt h e s ef a c t s ，w eh a v es t u d i e dc o m p o n e n to ft h ew h i t ep a r t i c l e sa n dt h ee f f e c to ft h e t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so nt h ec o n t e n to ft y r o s i n e ，a n dt h e nw em a d es o y b e a np a s t ew i t ht h e d o m e s t i c a t ea s p e r g i l l u so r y z a ei no r d e rt or e d u c et h ec o n t e n to f t y r o s i n e a n a l y z e dt h em i c r o b i a l f l o r ai nt h em a t u r es o ys a u c em a s ho ft r a d i t o n a lf e r m e n t a t i o na n dv o l a t i l ef l a v o rc o m p o u n d so f t h et w op r o d u c t i o np r o c e s s e sf o rt h ef u r t h e ri m p r o v e m e n to ff l a v o rw i t hh i g ht e m p e r a t u r e f e r m e n t a t i o n i nt h i ss t u d y , w ec o n c l u d e dt h a t ： t h ew h i t ep a r t i c l e si ns o y b e a np a s t ei n c l u d e dam a s so ft y r o s i n ea n da s p o to fp h e n y l a l a n i n e i no r d e rt od e c r e a s e dc o n t e n to ft y r o s i n ei n s o y b e a np a s t e ，m a n i p u l a t i o no ft e c h n o l o g i c a l p a r a m e t e rs h o u l db ep a i da t t e n t i o nw h i c hi n c l u d ep r o p e r l yc o n t r o l l i n gs t a r t e rp r o a g a t i o nt i m ea n d f e r m e n t a t i o nt i m e ，t h ea m o u n to fs a l ta d d i t i o na n dw a t e ra d d t i o n m o r e o v e rw ea d d e d14m l g l a c i a la c e t i ca c i d - op e rk gk o j it oh e l pt or e d u c et h ec o n t e n to ft y r o s i n ew i t hn oi n f l u e n c et ot h e f l a v o r - a d d e dt y r o s i n et ow o r tm e d i u mt od e m e s t i c a t ea s p e r g i l l u so r y z a e t h ea b i l i t i e so fp r o d u c i n g a c i d i co rn e u t r a lp r o t e a s eo fa c c l i m a t e da s p e r g i l l u so r y z a ew e r es e p a r a t e l yd e c r e a s i n gc o m p a r e d t ot h ep r o d u c t i v ea s p e r g i l l u so r y z a e 胎a p p l i e da c c l i m a t e da s p e r g i l l u so r y z a et o f e r m e n t a t i o n a n du s e dt h es a m ep r o c e s s i n gp a r a m e t e r sa ss o y b e a np a s t em a n u f a c t u r i n g a tt h ei n t e r m e d i a t e s t a g eo ff e r m e n t a t i o n ，a m i n oa c i dp r o d u c e db yp r o d u c t i v ea s p e r g i l l u so r y z a ea n da c c l i m a t e d a s p e r g i l l u so r y z a ew e r ed e t e c t e d ，w ef o u n dt h a tt h ec o n t e n to ft y r o s i n ei ns o y b e a np a s t ep r o d u c e d b yt h el a t t e rw a sr e m a r k a b l ed e c r e a s i n g s o u s i n gt h e a c c l i m a t e d a s p e r g i l l u so r y z a et o f e r m e n t a t i o nw i l lh e l pt op r e v e n tt h ef o r m a t i o no fw h i t e p a r t i c l e s c u l t u r e i n d e p e n d e n ta p p r o a c h ( c l o n el i b r a r yt e c h n i q u eb a s e do ns m a l ls u b u n i tr i 酬ag e n e ) w a su s e dt o a n a l y z et h eb a c t e r i a l16 sr d n aa n df u n g a l18 sr d n ao ft h es a m p l e t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eb a c t e r i ae x i s t e di n m a t u r es o ys a u c em a s h b e l o n g t ot h e s e g e n u s ： s t a p h y l o c o c c u s 、l a c t o b a c i l l u sa n dt e 护a g e n o c o c c u sr e s p e c t i v e l y s i m i l a r i t i e sw i t ht h en e a r e s t s p e c i e sw e r ef r o m9 8 t o9 9 t h ef u n g ie x i s t e dw e r ez y g o s a c c h a r o m y c e s , r h i z o c h a e t e a s p e r g i l l u s ，r h o d o t o r u l aa n dp h a s e o l e a ee n v i r o n m e n t a ls a m p l e ，s i m i l a r i t i e sw e r e9 9 h e a d s p a c e s o l i d p h a s em i c r o e x t r a c t i o nc o m b i n e dw i t hg a s c h r o m a t o g r a p h y m a s s s p e c t r o m e t r y ( h s s p m e g c - m s ) w a su s e dt oa n a l y z et h ev o l a t i l e si nm a t u r es o ys a u c em a s ho f t r a d i t o n a lf e r m e n t a t i o na n dh i g ht e m p e r a t u r ef e r m e n t a t i o nr e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h et y p e so fm a i nv o l a t i l e si nt r a d i t o n a lf e r m e n t a t i o ns a u c em a s hw e r em o r et h a nt h o s ei n h i g h i l t e m p e r a t u r e f e r m e n t a t i o ns a u c em a s h i n c l u d i n ga l c o h o l s ，a l d e h y d e s ，e s t e r s ，k e t o n e s ， h y d r o c a r b o n s ，h e t e r o c y c l e s ，n i t r i l e s ，a c i d s ，a e t h e r s ，p h e n o l s r e l a t i v ec o n t e n t so f e s t e r s ，a l d e h y d e s ， h y d r o c a r b o n sa n dh e t e r o c y c l e s i nt r a d i t i o n a lf e r m e n t a t i o nw e r em o r et h a nt h o s ei nh i g h t e m p e r a t u r ef e r m e n t a t i o n k e yw o r d s ：s o y b e a np a s t e ；t y r o s i n e ；p h e n y l a l a n i n e ；b a c t e r i a ；f u n g i ；v o l a t i l ef l a v o rc o m p o u n d s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：宣塞盘日期：2 丑丛：圣! 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，- j - 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：亟龛叁导师签名： 日 期：超卜皿 第一章绪论 第一章绪论 1 1 发酵调味品的发展潜力 1 1 1 发酵调味品的优越特性 传统豆类发酵食品营养价值很高，在我国已有上千年的历史，早己普及到朝鲜、日 本及东南亚等国家和地区，对亚洲乃至全球人类的饮食生活和健康都起到了非常重要的 作用。豆类发酵食品，与其他多数发酵食品一样，其优势主要体现在以下几方面【1 8 l ： 一是原料中的蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子物质被微生物酶水解成肽、氨基酸、 脂肪酸、低聚糖和单糖等小分子物质，提高了营养价值和消化性能；二是微生物代谢产 生的乳酸、乙醇、乙酸、氨等酸碱性保藏效应化合物，改变了体系的p h 值，加上食盐的 添加和小分子物质降低水份活度的协同作用，产品无需罐藏、冷冻或干燥即可延长货架 期，这对发展中国家具有极为重要的意义；三是发酵赋予的香味、色泽、口感、风味、 外观、密度、质构等感官特征的改善和多样化，使产品更易为消费者喜爱，尤其不被西 方消费者接受的豆腥昧可通过发酵完全除去，市场适应性大大提高；四是发酵期间，优 势益酵菌可阻滞大量病源性微生物的生长，提高了产品的安全性；五是豆类原料中难消 化的涨气性寡糖( 棉籽糖、水苏糖) 和抗营养因子( 胰蛋白酶抑制剂、血凝素和植酸、丹宁、 多酚等) 可被发酵除去或降低，而维生素、抗癌物质、活性肽、抗氧化剂、降胆固醇活 性化合物等功能成分却被大量合成或释放，强化了产品的功能特性；六是豆类发酵食品 多以固态或半固态方式生产，比纯液态发酵方式具有较低资金的投入、较低的能耗和水 耗、少废弃物产生、不要求无菌条件等优势，同时一些产品可不经烹调或者仅需很少的 热处理便能直接食用，从而降低了烹饪所用的时间和能耗。 因此，许多国家都掀起了对豆类发酵食品研究的热潮，豆类传统发酵食品的高营养 及其独特的风味引起了各国学者的高度重视f 9 】。 1 1 2 发酵赋予豆类食品更强的生理功能 发酵对活性物质的形成是很重要的，它可以使各个成分通过生物化学反应转化生成 有活性的低分子量物质l j 。由于发酵过程使异黄酮成分发生改变导致了韩国豆酱 c h u n g k o o k j a n g ( c k j ) t z 燕煮后的大豆具有更高的抗氧化能力。m c c u e 幂t l s h e t t y 峙旨出在 发酵过程中，随着糖苻酶和衙萄糖甘酸酶活性的增加配糖类化合物至少有一部分发生分 裂反应或者改变，使类黄酮转化成有效的抗氧化物糖苷配基异黄酮。在豆类发酵产品中 糖苷配基异构体是多仔在的二j i 要形式，然而豆类中9 5 的异黄酮以7 o 单配糖体、染料 木苷、黄豆苷元形式存在。与异黄酮的配糖类相比，异黄酮的糖苷配基形式具有更强的 抗氧化能力( 抗a b t s + ) 、d p p h 自i h 摹清除能力和推迟低密度脂蛋白氧化时间的能力【1 2 】。 日本科学家研究发现在l 互酱中染料木黄酮的含量比在大豆、酱油及非发酵大豆产品 ( 豆腐、豆奶等) 中的含量要高，分析其原因可能是在过滤和脱脂过程中异黄酮类会损失 掉一部分。在发酵生产豆酱的过程中通过微生物作用染料木苷的p 一糖基结合物裂解生成 江南大学硕士学位论文 染料木黄酮。基于日本人每年对大豆及相关产品的消耗数据，每天对染料木黄酮和染料 木苷的摄入量分别为1 5 - - - 4 1 、6 3 - - 8 3m g 人，这些都比美国人或者西方欧洲人要高很 多，因此日本人乳腺癌、肠癌、前列腺癌的发病率普遍低于西方国家【l 3 。 大豆发酵食品中的生理活性物质可大致分为两类【1 4 】：一类是原料的固有成分，即原 始成分，不经微生物及其酶的作用就天然存在于发酵成品中的“一次生理活性物质”， 如异黄酮、多酚、蛋白质、维生素( b 2 、b 1 2 、e ) 、皂角苷、食物纤维素等；另一类则是 在发酵过程中借助微生物及其酶的综合作用，对原料大分子物质进行分解和重组，并经 过复杂的生化反应才形成的二次加工成分，称为“二次生理活性物质”，如发酵微生物 代谢合成的纤溶酶、蛋白质降解产生的活性肽、氨基与羧基化合物经美拉德反应生成的 类黑精等。正是这些新形成的“二次生理活性物质 ，赋予豆类发酵食品比不发酵食品 更突出的营养健康机能。 1 2 发酵豆制品中白点问题的研究进展 1 2 1 不同发酵豆制品中白点物的组成 发酵豆制品中的白点物质是指腐乳、豆豉、腊八豆和豆酱成熟后，其表面常生成一 些乳白色硬圆粒状小点，有时呈片状，有时附着于产品表面松散毛霉菌丝上，或悬浮于 汁液中，沉积于容器底部【l5 。腐乳白点问题由来已久，最初有人根据白点的硫酸溶液能 使几滴高锰酸钾溶液褪色，推测它是由毛霉孢子囊壁的草酸钙结晶而成。后来耿予欢【l 6 j 对豆酱中的白点物质进行了较为全面系统的分析，发现白点物主要由少量的氨基酸和大 量的面筋蛋白组成。而李国基【1 。7 】分析蒜蓉豆豉酱白点结晶时发明白点物中氨基酸含量 占n 7 5 7 5 ，共检测出1 7 种氨基酸，其中酪氨酸含量最高。 1 2 2 白点形成的原因 在豆制品发酵过程中，毛霉和米曲霉产生的蛋白酶水解大豆蛋白生成各种氨基酸和 少量的短肽而形成独特的风味。蛋白酶的水解作用包括中性蛋白酶优先切断邻近疏水氨 基酸残基的肽键生成含疏水氨基酸末端的肽链，其中包括含酪氨酸末端的肽链，在酪氨 酸羧肽酶f 酸性蛋白酶) 的作用下生成酪氨酸。制曲时间过长致使毛霉菌分泌的酪氨酸羧 肽酶积集过多，在后发酵中由于盐和其他添加剂的加入抑制了其他酶系的协同作用而酪 氨酸羧肽酶在1 0 左右的食盐存在下仍有较高的活性，将大豆中的蛋白质酶解出过多的 酪氨酸，而酪氨酸的溶解度较小，2 5 水中的溶解度为4 5 0m g l 。极易结晶析出从而 产生了发酵豆制品的白剧恪2 。林影【2 2 l f | 勺研究表明当腐乳中游离酪氨酸含量达到2m g g 时即形成白点。李理1 2 3 j 在研究毛霉蛋1 7j 酶对大豆分离蛋白的降解作用时发现酶解后的可 溶性大豆多肽中酪氨酸的摩尔比比人豆分离蛋白中酪氨酸的摩尔比明显增加了，这就提 示我们毛霉蛋白酶由于其酶切位点的特一t t 有将酪氨酸带入可溶性肽的趋势，当含有多量 酪氨酸的小肽进入汤汁后如果再遇剑足够数量的外肽酶便可产生大量的酷氨酸而形成 白点。 耿予欢【1 6 】分析认为，生产豆酱的原料配比面粉的量均较多，通常为黄豆：面粉= 6 ：4 ， 第一章绪论 由于制曲过程中米曲霉分泌的蛋白酶和淀粉酶是有限的，不能完全将曲料中面粉中的蛋 白质和淀粉进行水解及糖化，这些面粉由于在制曲及发酵过程翻动小而结成团块，在盐 水浸泡下才慢慢分散，大部分淀粉被分解，而面粉中一些蛋白仍未被彻底分解而与酱体 中的部分游离氨基酸混合粘附于黄豆的表面，在盐水浸泡下形成较硬难溶解的白点物。 1 2 3 白点问题的解决方案 c h i o u 2 4 1 研究了几种微生物生长抑制剂对“白点”形成的影响，以米曲和米一豆曲 作为酶源制作腐乳，并分别加入对羟基苯甲酸酯、磺胺、四环素、氯霉素、冰醋酸作为 微生物生长抑制剂，经过一年的发酵，以米曲作为酶源的产品中未出现“白点”，以米 一豆曲作为酶源并在盐溶液中加入1 0m l l 冰醋酸的产品也未出现“白点”，成分分析 显示，以米曲作为酶源的腐乳盐溶液中其p h 、酪氨酸含量及总的氨态氮含量均低于以米 一豆曲为酶源的腐乳盐溶液。可见，酸性条件可抑制腐乳“白点”的形成。 酪氨酸是经过豆腐坯上积累的毛霉蛋白酶分解腐乳蛋白而来的，可以通过控制毛霉 菌株生产毛霉蛋白酶的途径来抑制白点的生成，所以可以采用在培养基中添加酪氨酸的 方法来进行毛霉菌株的酪氨酸驯化，以阻遏毛霉中酪氨酸羧肽酶的合成，再将驯育后的 菌株投入生产发酵，可以降低腐乳中的白点率。袁振远、林影等【2 2 , 2 5 l 在这方面做了一定 程度的研究，发现驯化菌种对防止腐乳产生白点有一定效果。 从何刖2 6 j 实验可以看出，减小腌制时的用盐量，腐乳毛霉分解大豆蛋白质的速度加 快，成熟腐乳的白点率增加；而且减小泡乳盐水浓度或延长泡乳时问也会使腐乳白点率 增加。其原因可能是与分解代谢产生酪氨酸的酶系在相对较低的盐浓度条件下易发挥其 分解作用，导致酪氨酸增加，从而使腐乳产生更多的白点。 表面活性剂的加入降低了酱料的表面张力并增强其界面的增溶作用，使得一些易结 晶析出的氨基酸不易集结，使其分散或溶解于酱料中。李国基【1 7 j 实验发现在豆酱研磨煮 制过程中加入0 2 的表面活性齐i j s p ( 石油磺酸钠) 、s f e ( 淀粉脂肪酸酯) 和s e ( 蔗糖脂肪 酸酯) 后再进行后发酵，产品表面白点已明显减少或不再出现，其效果s f e p s s e 。 耿予欢i l6 j 提出解决豆酱中自点问题的办法，即加强发酵过程的生产管理，增加前期 翻酱的次数，翻酱要均匀、彻底，使结团粉料得到分散，豆酱中的白点物就会减少很多。 1 3 豆酱中微生物及其对风味物质影响的研究进展 食品科技界普遍引用h a l1 r l 于1 9 8 6 年提出的食品风味的定义。他认为风味是摄入 口腔的食物使人的感觉器官包括味觉、嗅觉以及痛觉、触觉和温觉等所产生的感觉印象， 即食物客观性质使人产生的感觉印象的总和。可见，对于食品风味的研究或评价，涉及 生理、心理、生物、化学和物理等学科，受诸多因素的影响，因而是一个相当| 木】难和复 杂的研究领域口。 豆酱香气成分很多，成香机制复杂，大体可归纳为四类：由原料成分所产生；由米 曲霉代谢产物生成；由耐盐酵母、细菌的代谢产物生成：由非酶化学反应7 成。挥发性 的香气成分主要为醇类，酯类、酸类、吡嗪等。传统发酵豆酱的味觉是成而鲜，具极微 弱的甜味，具有醇和弱酸味，不苦。作为调味品，其鲜昧尤为突出。鲜味来自蛋白质分 3 江南大学硕士学位论文 解产物，原料中蛋白质经混合菌种中曲霉及根霉的蛋白酶、肽酶、谷氨酰胺酶作用后， 水解生成多种游离氨基酸和肽【2 8 1 ，其中谷氨酸、天冬氨酸含量较高，赋予产品鲜味。极 微弱的甜味来自淀粉酶水解淀粉所生成的葡萄糖和麦芽糖以及部分呈甜味的氨基酸：此 外，发酵过程中米曲霉分泌的脂肪酶能将油脂水解成脂肪酸和甘油，甘油微甜。酸味主 要由乳酸、醋酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸形成。发酵过程中，乳酸菌所引起的乳酸发 酵因菌种不同使糖类变成乳酸和醋酸【2 9 1 。 总之，豆酱的呈味成分是十分复杂的，豆酱作为传统的调味品，已有三百多年历史， 然而对其发酵机理和后熟机理的研究尚不多，有许多复杂的机理尚不清楚，有待进一步 深入研究。 1 4 立题背景与意义 我国传统发酵豆制品历史悠久，加之我国幅员广阔，形成了种类繁多且各具地方特 色的酱类调味品，这些传统发酵豆制品的制作是几千年来劳动人民智慧的结晶，也蕴含 着不少可贵的科学原理。其中传统酿造蚕豆酱是有益于身体健康、增进食欲的调味品， 已被世界各地的人们所接受。但我国豆酱的发展仍存在一些问题，随着货架期的延长， 豆类发酵制品中普遍会出现一些白点物质，它严重影响了产品的外观质量，最终在销售 方面出现了很大的问题；传统发酵豆酱具有良好的风味，但发酵周期长达四个月，为了 缩短发酵周期大多数厂家采用高温发酵，虽然此法大大缩短发酵周期至一个月，但其风 味特色不如传统发酵豆酱那么耐人寻味。 基于此，本论文将更全面地分析蚕豆酱中白点物的成分，研究豆酱发酵工艺参数对 其产生的影响；本文还从微生物的角度入手考虑白点问题，认为成曲中积累的酪氨酸羧 肽酶对酪氨酸的生成起主要作用，于是采用在培养基中添加酪氨酸的方法来进行曲霉菌 株的酪氨酸驯育，以阻遏霉菌对酪氨酸羧肽酶的合成，再将驯育后的菌株投入生产发酵， 以期减少白点的生成。 本论文以蚕豆酱作为对象，研究了传统发酵蚕豆酱成熟期酱醅中的微生物群落，分 析比较了传统发酵和高温发酵两种工艺成熟酱醅中的挥发性风味物质组成。为进一步探 索微生物群落与风味物质之间的关系、改善高温发酵豆酱风味提供依据。 1 5 本i f - 题主要研究内容 1 、全面系统的对蚕豆酱中白点物质的组成进行了分析研究。 2 、研究发酵工艺条件对白点物的影响。 3 、进行菌种驯化，考查驯化过程中酸( 中) 性蛋白酶活力变化趋势及驯化菌种对发酵 豆酱氨基酸组成的影响。 4 、采用分子生态学技术对传统发酵成熟期酱醅中的微生物群落进行分析研究，研究 比较传统发酵和高温发酵两种工艺豆酱中的挥发性风味物质组成。 4 第二章材耩与方法 第二章材料与方法 2 重主要材辨与试剂 蚕豆酱，某酿造食品有限责任公司；生产菌种：沪酿3 0 4 2 米曲霉；l 酪氨酸( 分析 纯) ，上海生亿试剂厂；盐酸( 分奉厅纯) 、氢氯化钠( 分析纯) 、氯化钠( 分析纯) 、葡萄糖分 橱纯) 、牛蠢浸膏、琼艏粉，上海匡药集团化学试裁有限公震；骧蛋囱膝、酵母膏，o x o i d 产品；食盐：市售；饮用水；蚕豆：市售；瓦埕：规格为装水2 5k g 个，市售；g o l d v i e w ， t r i sb a s e ，e d 队购自上海生工生物工襁有限公司；甘油、冰乙酸、无水乙醇，中国医 药( 集团；轻质碳酸钙，江苏省微生物研究所有限公司；e x t a qd n a 聚合酶、d n t p ， 大连t a k a r a 公司；基因组d n a 提取试剂盒( 离心柱型) 、p c r 产物纯化试剂盒( 离心柱型) ， 捷瑞生物工程( 上海) 有限公司；限制性内切酶h i n fi 和c s p 6i ，f e r m e n t a s 公司。 2 。2 主要培养基 营养肉汤培养基( 细菌培养基) ( l ) ：胰蛋白胨1 0 。0 ，n a c l5 0 ，牛肉浸膏3 0 ，琼脂 粉2 0 2 5 ，1 2 1 2 0m i n 。 y p d 培养基( 真菌培养基) ( l ) ：胰蛋盘胨2 0 。0 ，酵母膏1 0 。0 ，葡萄糖2 0 。0 ，琼脂粉 2 0 - 2 5 ，1 2 i 2 0m i n 。 l b 培养基( g l ) ：胰蛋白胨1 0 0 ，酵母膏5 0 ，氯化钠1 0 0 ，1 2 1 2 0m i n 。 麦汁培养基：5 0 p 麦汁中鸯f l 入2 琼脂粉，1 2 1 2 0m i n 。 三角瓶培养基：麸皮黯g ，覆粉2 0g ，求8 0m l 。拌匀，2 5 0m l 三角魏装瀑料2 0g ， 1 2 1 2 0 m i n 。 2 3 主要仪器 u n i c ou v 一2 0 0 0 分光光度计 a l 2 0 4 型电子天平 g s p 9 0 5 0m b e 隔水式恒温培养箱 g z x 一9 2 6 4m b e 数显鼓风于燥籍 p h s 一3 c 型精密p h 计 样牖处理柱s e p p a kc i8c a r t r i d g e 蹑子吸收分光光度计s p e c t r aa a 2 2 0 k 、n a 、m g 、z n 、c a 空心阴极灯 马弗妇1 s x 4 1 0 a g i l e n tl l0 0 氯罐酸用高效液相色谱仪 2 3 0 0 一蠢动定氮仪 h v e 5 0 高速灭菌锅 黼速冷冻离心机 尤尾挺上海) 仪器有羧公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 上海博迅 上海博迅 上海雷磁仪器厂 美国w a t e r s 公司 美国v a r i a n ( e 里安) 公司 威掊拉斯霸艺京有限公司 上海洪纪设备仪器公司 美国a g i l e n t 公司 瑞典f o s s 。t e c a t o r 公司 舀本h i r a y a m a 株式会裢 s i g m a ( 美国) 江南大学硕士学位论文 台式离心机上海安亭仪器厂 p c r 仪中国l o n g g e n e 科学仪器有限公司 超净工作台上海定山湖净化设备厂 h y g i i 型回旋式恒温调速摇床上海新星自动化控制设备成套厂 s h i m a d z ug c 2 0 1 0 气相色谱仪日本岛津s h i m a d z u 公司 t r a n c e 气质联用仪 美国f i n n i g a n 公司 固相微萃取手柄( s u p e l c o ，b e l l e f o n t e ，p a )上海安谱科学仪器有限公司 7 5 i - t m 固相微萃取头( c a r p d m s l上海安谱科学仪器有限公司 1 5 m ls p m e 样品瓶 美国s u p e l c o 公司 h h 4 型数显恒温水浴锅金坛市富华电器有限公司 2 4 主要分析及实验方法 2 4 1 主要分析方法 2 4 1 1 金属离子的测定 准确称取一定量样品，用1m l ( 1 ：i ) h n 0 3 溶解，移入5 0m l 容量瓶中并定容。同时做 好样品空白，进行原子吸收法测定。具体测定条件如表2 1 所示。 表2 1 原子吸收分光的工作条件 t a b l e2 - 1o p e r a t i n gc o n d i t i o n so ff a a s 配制系列标准溶液：为准确定量，测定钠和钾时需加入镧溶液作为释放剂，测定钙 和镁时加入锶作为释放剂。具体配置方法如下： 用移液管分别吸取含有n a 和k 离子的混合标准溶液( 浓度均为5 0p 8 m l ) 0 0 0 ，0 2 5 ， o 5 0 ，1 o o ，2 0 0m l 于2 5m l 容量瓶中，用1 的h n 0 3 和1 0 0g l 的氯化锶作为溶剂 定容，并作为测量时的空白液。此标准系列溶液中含4 种离子的溶度分别为0 o o ，0 5 0 ， 1 0 0 ，2 0 0 ，4 0 0 - “m l 。钙镁标准溶液的配置方法同上，只需换用l 的h n 0 3 和1 5 0 l 氧化镧作为溶剂定容，并作为测量时的空白液。 2 4 1 2 氯离子测定 准确称取适量绝干白点物t - 2 5m l 容最瓶中，加入3m l ( 1 + 1 ) h n 0 3 、2m la g n 0 3 溶液，以超纯水稀释至刻度，混匀，然后汁时，准确反应2 5m i n 后取出，上下轻微颠倒 数次。将其中部分溶液移入lc m l l 色皿中，以不 j i i a g n 0 3 溶液的同样操作为空白，用分 光光度计在波长4 4 0n m 处测量其吸光度i3 0 1 。 2 4 1 3 灰分的测定 称取一定量在1 0 5 烘箱r f l 干燥至恒晕的白点物质，用马弗炉s x 一4 1 0 在5 5 0 进 行灰化，计算灰分的百分比。 6 第二章材料与方法 2 4 1 4 氨基酸组成分析【3 1 1 称取0 5g 样品于2 5m l 容量瓶中，用5 1 0 0m l - - - 氯乙酸定容，摇匀静置lh 后用双 层滤纸过滤，取滤液1m l 于1 5m l 离心管1 0 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 后取上清5 皿进行检测。 分析条件：4 0 x 1 2 5r n n lc 1 8 柱，流速1 0m l m i n ，柱温4 0 ，检测波长3 3 8n i 1 ，2 6 2 r i m ( p r o ) ，流动相a 为2 0m m o l 醋酸钠，流动相b 为2 0m m o l 醋酸钠：甲醇：乙腈为l ：2 ：2 ( v v ) 。 2 4 1 5 总氮含量的测定 称取一定量的绝干白点物，加入7g 催化剂( c u s 0 4 ：k 2 s 0 4 为0 3 ：1 0 ) 和1 5m l 浓硫酸 在4 2 0 消化炉中消化lh 左右，待液体变成透亮的浅绿色时停止消化，冷却后用 f o s s t e c a t o r ( s w e d e n ) 生产的型号为2 3 0 0 的自动定氮仪进行总氮含量的测定。 2 4 1 6 酪氨酸溶解度的测定 于5 0m l 的容量瓶中加入5m l2 0 - - - 1 8 0p g m t , 的酩氨酸标准溶液，再依次加入5m l 0 0 5m o l l 的4 氨基安替比林，2 5m ln h 4 0 h - n h 4 c i 缓冲溶液( p h9 4 0 ) ，2 5m lo 1 m o l l 的高碘酸钠溶液，用蒸馏水定容至5 0m l 。显色2 5m i n 后，以空白作参比，4 8 0n l n 波长下测吸光度值【3 引。按上述方法绘制工作曲线：酪氨酸标准溶液浓度2 0 - - 一1 8 0l a g m l 。 得到回归方程为y = 0 0 0 2 x + o 0 0 2 ，相关系数r 2 为0 9 9 5 6 。标准曲线见图2 1 所示。 o 4 0 3 80 2 0 1 o 05 0l o o1 5 02 0 0 t y r 浓度( m g l ) 图2 - 1 酪氨酸标准曲线 f i g 2 - 1s m n d a r dc u r v eo ft y r o s i n e 2 4 1 7 总酸的测定 准确称取研磨均匀的样品1 0g ，放入烧杯内，加蒸馏水1 5 0m l ，加热至沸，倒入2 0 0 m l 容量瓶中，并用蒸馏水洗净各容器，洗液也并入容量瓶中，冷至2 0 后加入蒸馏水 至刻度，摇匀，用滤纸过滤，弃去初滤液5m l ，然后滤入2 5 0m l 带锥形瓶中，供测定用。 吸取稀释液5m l ，放入1 0 0m l 烧杯中，加蒸馏水3 0m l ，开动磁力搅拌器。用0 0 5 0 0 n 氢氧化钠标准溶液滴定至p h8 2 0 。记下耗用毫升数。同时做试剂空门试验。 总酸(以乳酸计，)：一(v-vo)xnxo09100 、 二 2 0 0 式中卜样品耗用氢氧化钠标准溶液毫升数； 珩一空白耗用氢氧化钠标准溶液毫升数； 卜氢氧化钠标准溶液当量浓度； 7 江南大学硕士学位论文 肜样品重量，g ； o 0 9 乳酸毫克当量。 2 4 1 8 氨基态氮检测 吸取上述稀释液5m l ，放入1 0 0m l 烧杯中，加蒸馏水3 0m l ，加入甲醛溶液1 0m l ， 开动磁力搅拌器，然后，用氢氧化钠标准溶液滴定至p h9 2 0 为终点。记下加入甲醛后耗 用氢氧化钠标准溶液毫升数。同时做试剂空白试验。 氨基酸态氮( 以氮计，) ：( v - v o ) x n _ x o 0 1 4 1 0 0 w 土 2 0 0 式中卜样品加入甲醛后，耗用氢氧化钠标准溶液毫升数； 空白加入甲醛后，耗用氢氧化钠标准溶液毫升数； 卜氢氧化钠标准溶液当量浓度； 肜样品重量，g ； o 0 1 4 氮的毫克当量。 2 4 1 9 盐分检测 吸取上述稀释液5m l ，放入2 5 0m l 锥形瓶中，加入蒸馏水5 0m l ，铬酸钾指示液0 5 m l ，用硝酸银标准溶液滴定，至刚显砖红色沉淀时即为终点。记下耗用硝酸银标准溶 液的毫升数。 食盐()：一(v-vo)x n x 0 0 5 8 5 1 0 0 、 二，_ 2 0 0 式中卜样品耗用硝酸银标准溶液毫升数； 试剂空白耗用硝酸银标准溶液毫升数； 卜硝酸银标准溶液当量浓度； 形一样品重量，g ； 0 0 5 8 5 氯化钠的毫克当量。 2 4 1 1 0 蛋白酶活的测定 a 试剂的配制 福林试齐o ( f o l i n 试剂) ：于2 0 0 0m l 磨口回流装置内，加入钨酸钠( n a 2 w 0 4 芝h 2 0 ) l o o g ，钼酸钠( n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 ) 2 5g ，蒸馏水7 0 0m l ，8 5 磷酸5 0m l ，浓盐酸10 0m l ，文 火回流1 0h 。 取去冷凝器，加入硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) 5 0g ，蒸馏水5 0m l ，混匀，加入几滴 液体溴，再煮沸1 5m i n ，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有 绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1 0 0 0m l ，用细菌漏斗( n 0 4 - - - 5 ) 过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。 o 4m o l 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠( n a 2 c 0 3 ) 4 2 4g ，定容至1 0 0 0m l 。 o 4m o l = 氯乙酸( t c a ) 溶液：称取三