（发酵工程专业论文）脂肪酶产生菌的细胞融合选育及其产酶条件优化.pdf

摘要 摘要 脂肪酶( l i p a s e ) 是一种特殊的酯键水解酶，它可作用于甘油三酯的酯键， 使甘油三脂降解为甘油二酯、单甘油酯、甘油和脂肪酸。脂肪酶是最早被人们 研究的酶类之一，也是一种重要的工业用酶，被广泛应用于轻工领域。微生物 脂肪酶被发现以来，由于其种类多，高度的底物专一性，宽范围的作用p h 和温 度，容易工业化生产应用等优点，选育脂肪酶高产菌株成了国内外相关研究的 热点。 本文利用化学p e g 融合法使白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ) 原生质体 和假丝酵母( c a n d i d av a l i d at 2 ) 原生质体融合，结合抗药性标记筛选方法，成 功筛选出一株产脂肪酶能力较高并且生长能力较强的融合菌株，并对融合株的 固态发酵产脂肪酶条件进行初步研究。主要研究工作和结果如下： ( 1 ) 脂肪酶双亲本菌株抗药性标记的选择。实验利用药物浓度梯度平板法 和医学给药原则，选用1 2 种药物分别对白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ) 和 假丝酵母( c a n d i d av a l i d at 2 ) 进行抗药性测定，成功筛选出白地霉和假丝酵母 的抗药性标记。白地霉抗性而假丝酵母非抗性的药物标记为曲咪新乳膏浓度为 2 1 0 3 - t g r r d ，假丝酵母抗性而自地霉非抗性的药物标记则为硫酸铜浓度为2 x 1 0 3 i - t g r r d 。 ( 2 ) 双亲本菌株原生质体制备和再生条件的研究。利用单因素实验探讨影 响白地霉和假丝酵母原生质体形成率和再生率的各种因素，结果表明制备原生 质体的优化条件为：双亲本菌龄为对数生长中期、1 5 的纤维素酶酶解1 小时、 酶解温度3 0 、脱壁促进剂为0 0 5 的半胱氨酸、渗透压稳定剂为o 7mn a c l 。 ( 3 ) 双亲本原生质体融合及融合子的鉴定。利用化学p e g 方法使双亲本原 生质体融合，通过影印法筛选得到5 0 株融合子。连续传代1 0 次，获得8 株性 状稳定的融合子，再通过油脂同化平板法筛选得到一株融合菌株，命名为c g l 6 。 通过比较双亲本及融合子c g l 6 的菌落表型、显微结构，以及对融合子c g l 6 全 细胞可溶性蛋白电泳分析，结果表明融合子c g l 6 是由双亲本原生质体融合得到 的新菌株。 ( 4 ) 融合子c g l 6 固态发酵生产脂肪酶条件初步优化研究。通过单因素比 较实验，对融合子c g l 6 进行了固态发酵培养基成分和发酵培养条件的初步优 摘要 化。结果表明固态发酵的优化培养基为：1 2g 固体物质( 麦麸：大豆粉- 3 ：2 ) ， 8m l 营养盐溶液( g l ：k h 2 p 0 47 0 7 ，n a 2 h p 0 42 2 0 6 ，m g s 0 4 7 h 2 02 0 ，n a 2 c 0 3 2 0 ，n a n 0 3 7 0 7 ) ；发酵条件为：接种量为2 ，3 0 ，初始p h 7 0 ，培养7 2 h ， 产酶酶活达到8 2 2 2u g 干物质，比亲本假丝酵母和白地霉的产酶活力分别提高 了3 2 和1 7 1 。 关键词：白地霉g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ，假丝酵母c a n d i d av a l i d at 2 ，原生 质体融合，融合子鉴定，脂肪酶，固态发酵条件 a d v a n t a g e ss u c ha sd i v e r s i t y , h i g h l ys p e c i f i c i t yo fs u b s t r a t e ，w i d er a n g ea c t i o np ha n d t e m p e r a t u r e ，c o n v e n i e n tt or e a l i z ei n d u s t r i a l i z a t i o n , e a s yt oo b t a i na n ds oo n i nt h i st h e s i s ，t h ep r o t o p l a s tf u s i o no fg e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3p r o t o p l a s t a n dc a n d i d av a l i d at 2p r o t o p l a s tw a ss t u d i e db yc h e m i c a lp e gf u s i o nm e t h o d i nt h e m e a n w h i l e ，t h er e s i s t a n c eo fd r u g sw a sa l s ou s e dt os c r e e naf u s i o ns t r a i n 诵t l l h i g h - y i e l do fl i p a s ea n ds t r o n gg r o w t ha b i l i t y m o r e o v e r , t h es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so ff u s a n tf o rp r o d u c i n gl i p a s ew e r es t u d i e dp r e l i m i n a r y t h es p e c i f i c m e t h o d sa n dr e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h er e s i s t a n tm a r k e rw a ss e l e c t e df r o mt h ep a r e n t ss t a i n sp r o d u c e dl i p a s e t w e l v ek i n d so fd r u g sw e r ec h o s e na s t h es i g no fr e s i s t a n c et oa n t i b i o t i c so f g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3a n dc a n d i d av a l i d at 2 ，r e s p e c t i v e l yb yt h em e t h o do f c o n c e n t r a t i o ng r a d i e n ta n dp r i n c i p l e so fm e d i c a la d m i n i s t r a t i o n t h er e s i s t a n tm a r k e r s o ft h et w os t a i n sw e r eo b t a i n e d o n eo ft h em e d i c a lt a g si sq u m i x is l a v ea ta c o n c e n t r a t i o no f2 10 3l x g m lw h e ng e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3i sr e s i s t a n c ea n d c a n d i d av a l i d at 2n o n - r e s i s t a n c e t h eo t h e ro n ei sc u s 0 4a tt h ec o n c e n t r a t i o no f2 10 3i ，t g m lw h e nc a n d i d av a l i d at 2i sr e s i s t a n c ea n dg e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3i s n o n r e s i s t a n c e ( 2 ) t h ep a r e n t so ft h es t r a i n sp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o nc o n d i t i o n s w e r es t u d i e d t h ev a r i o u sf a c t o r st h a ta f f e c tt h ef o r m a t i o nr a t ea n dr e g e n e r a t i o nr a t e o fg e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3p r o t o p l a s ta n dc a n d i d av a l i d at 2p r o t o p l a s tw e r e i n v e s t i g a t e db ym e a n so fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n t t h er e s u l t ss h o w e dt h eo p t i m u m p r e p a r a t i o n c o n d i t i o n sf o rp r o t o p l a s t so fc a n d i d av a l i d at 2a n dg e o t r i c h u m i i i a b s t r a c t c a n d i d u mn s 3w e r ea sf o l l o w i n g ：u s i n gm i d d l ee x p o n e n t i a lp h a s ec e l l s ，t h ea c t i o no f 1 5 c e l l u l a s ee n z y m ea t3 0 cf o r1 l l t a k i n g0 0 5 c y s t e i n ea st h er e a g e n to f p r o m o t i n gc e l lw a l ld e g r a d a t i o na n du s i n g0 7 mn a c la so s m o t i cs t a b i l i z e r ( 3 ) t h ep r o t o p l a s tf u s i o no ft h ep a r e n t sa n di d e n t i f i c a t i o no ff u s a n t t h e p r o t o p l a s tf u s i o no fp a r e n t ss t r a i n sp r o t o p l a s t sw a ss t u d i e db yc h e m i c a lp e g f u s i o n m e t h o d f i 衄i n d i v i d u a lf u s a n t sh a v eb e e ng o tb yr e p l i c ap l a t t i n gm e t h o d , a n de i g h t i n d i v i d u a lp l a n t sw e r ei s o l a t e df r o mt h ef i r s tg e n e r a t i o n , as t e a d yf u s a n tw a ss e l e c t e d f r o mt h et e n t hg e n e r a t i o nc u l t u r e ，t h e nt h ef u s a n tn a m e dc g 16 b yc o m p a r i n gt h e c o l o n i a lm o r p h o l o g ya n dm i c r o s t r u c t u r eo ft h ep a r e n t sa n df u s a n tc g l6 ，a n dt h e f u l l c e l ls o l u b i l i t yp r o t e i ne l e c t r o p h o r e s i s ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tc g16f u s a n tw a sa n e ws t r a i nd e r i v e df r o mt h ep r o t o p l a s tf u s i o no f p a r e n t s ( 4 ) t h ei n v e s i t i g e t i o na n do p t i m i z a t i o no fs o l i d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so f f u s a n tc g16h a v eb e e nc a l t yo u tb ys i n g l ef a c t o rc o m p a r i s o ne x p e r i m e n t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lm e d i u mc o m p o s i t i o nf o rp r o d u c i n gl i p a s eb yf u s a n tc g16 w a s 12gs o l i dm a t t e r ( w h e a tb r a n ：s o y b e a nm e a l = 3 ：2 ) ，8m ln u t r i e n ts o l u t i o n ( e l ： k h 2 p 0 47 0 7 ，n a 2 h p 0 42 2 0 6 ，m g s 0 4 。7 h 2 02 0 ，n a 2 c 0 32 0 ，n a n 0 3 7 0 7 ) t h e l i p a s ea c t i v i t yp r o d u c e db y c g16r e a c h e d8 2 2 2 u gd r y m a t t e ru n d e rt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw i t h3 0 c ，i n i t i a lp h7 0a n dc u l t u r e7 2h t h el i p a s ea c t i v i t y o fc g l 6w a sh i g h e r3 2 a n d1 7 1 t h a nt h a to ft h ep a r e n ts t r a i n sp r o d u c e d , r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ；c a n d i d av a l i d at 2 ；p r o t o p l a s tf u s i o n ； f u s a n ti d e m i f y ；l i p a s e ；s o l i d - f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 目录 目录 f 第1 章绪论l 1 1脂肪酶概述1 1 1 1 前言1 1 1 2 脂肪酶简介1 1 1 3 脂肪酶的结构和性质2 1 1 4 脂肪酶产生菌。3 1 1 5 脂肪酶产生菌双亲本介绍5 1 2脂肪酶的生产与用途5 1 2 1 脂肪酶的生产5 1 2 2 脂肪酶的用途8 1 3原生质体融合育种技术1 2 1 3 1 原生质体融合步骤1 2 1 3 2 原生质体融合的优点1 5 1 3 3 原生质体技术在脂肪酶产生菌选育方面的应用1 6 1 4 课题来源及研究意义1 6 1 4 1 课题来源1 6 1 4 2 研究意义1 6 1 5本论文主要研究内容1 7 第2 章假丝酵母和白地霉双亲本抗药性标记的筛选1 8 2 1 材料与方法18 2 1 1 材料，1 8 2 1 2 实验方法1 9 2 2 结果与讨论2 2 2 2 1 抗药性标记筛选结果2 2 2 2 2 抗性稳定性2 3 2 2 3 菌落形态对比、镜检和还原培养结果2 4 v 目录 2 2 4 酶活对比实验结果2 6 2 2 5 讨j 沧2 6 2 3 本章小结。2 7 第3 章假丝酵母和白地霉原生质体制备及再生条件研究2 8 3 1 材料与方法2 8 3 1 1 材料2 8 3 1 2 实验方法3 0 3 2 结果与讨论3 2 3 2 1 双亲本生长曲线的测定3 2 3 2 2 茵龄对双亲本原生质体制备和再生的影响3 3 3 2 3 破壁酶种类及浓度对双亲本原生质体制备和再生的影响3 4 3 2 4 酶解时间对双亲本原生质体制备和再生的影响3 5 3 2 5 不同的脱壁促进剂对双亲本原生质体制备和再生的影响3 6 3 2 6 不同的渗透压稳定剂对双亲本原生质体制备和再生的影响3 7 3 2 7 双亲本原生质体的显微观察3 8 3 2 8 讨论4 0 3 3 本章小结4 l 第4 章一原生质体融合及融合子的检出、鉴定4 2 4 1 材料与方法一4 2 4 1 1 材料4 2 4 1 2实验方法4 5 4 2 结果与讨论4 8 4 2 1 融合子稳定性4 8 4 2 2 融合子与双亲本菌落形态观察：4 8 4 2 3 融合子与双亲本显微结构观察4 9 4 2 4s d s 全细胞可溶性蛋白质电泳分析结果4 9 4 2 5 讨论5l 4 3 本章小结5 1 第5 章融合子c g l 6 产酶条件优化初步研究一5 2 v i 5 1 材料与方法5 2 5 1 1 材料5 2 5 1 2 实验方法5 3 5 2 结果与讨论5 5 5 2 1 融合子c g l 6 固态发酵产酶曲线5 5 5 2 2 发酵温度对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 6 5 2 3 起始p h 对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 6 5 2 4 接种量对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 7 5 2 5 培养基含水量对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 7 5 2 6 碳氮比对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 8 5 2 7 外加氮源对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 8 5 2 8 金属离子对融合子c g l 6 固态发酵产酶的影响5 9 5 2 9 融合子c g l 6 与双亲本固态发酵产酶比较5 9 5 2 1 0 讨论6 0 5 3本章小结6 0 第6 章结论与展望6 2 6 1 结论6 2 6 2 展望6 3 参考文献 。6 4 j 致 射7 1 攻读学位期间的研究成果7 2 v i i 第1 章绪论 1 1 脂肪酶概述 1 1 1 前言 第1 章绪论 随着全球经济发展，人类对能源的需求日益增长，使得全世界能源形势十 分严峻。自上个世纪七十年代以来，全球范围内发生能源危机以及由能源引发 的战争越来越频繁，人们感觉到常规的能源开发和利用已不足以满足整个社会 的需求；同时传统的能源利用，对环境造成的危害越来越严重，酸雨、赤潮以 及全球气候变暖等环境问题已经直接威胁到人类生存。因此，寻找清洁、可持 续利用的替代能源迫在眉睫。 生物柴油( b i o d i e s e l ) 作为可再生的清洁能源受到世界各国科学家的关注。生 物柴油( b i o d i e s e l ) ，是由德国工程师r u d o l f d i e s e l ( 1 8 5 8 1 9 1 3 ) 于1 8 9 5 年提出 【1 0 】。1 9 8 8 年，德国聂尔公司发明一种洁净的生物燃料，是由甲醇( 或乙醇) 等醇类物质与天然植物油( 或动物油脂) 中的主要成份甘油三酸酯发生酯 交换反应，生成脂肪酸甲酯【3 j ( 或脂肪酸乙酯) 化合物。 目前，生物柴油的生产方法主要有化学法、生物酶法和工程微藻法三种， 其中生物酶法是生物柴油新能源产业发展的方向，受到广大科学家的关注。 同时，酶法也有其不足，主要是：( 1 ) 、脂肪酶在有机溶剂中存在聚集作用， 催化效率低【4 】；( 2 ) 、短链醇对脂肪酶有毒害作用；( 3 ) 、酶的制备成本较高。 选育获得生产能力强，脂肪酶活力高，应用性能好的生产微生物是解决酶 法生物柴油生产的关键，脂肪酶的工程应用研究也具有重要的意义。 1 1 2 脂肪酶简介 脂肪酶( l i p a s e ，e c 3 1 1 3 ) 又称三酰基水解酶，可以在油水界面上催 化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油，以及中间产物甘油一酯和甘油二酯 【5 - 7 】；也可以在有机溶剂或离子液【8 1 中催化脂肪酸和醇合成脂肪酸单酯( 即 第1 章绪论 生物柴油) ，也可催化甘油三酯和醇类通过酯转化作用生成生物柴油。它是 最早被人们研究的酶类之一，从1 8 3 4 年兔胰脂肪酶活性的报道到如今微生 物脂肪酶广泛应用已有上百年的历史。它是一种重要的工业用酶，被广泛 应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。自微生物脂肪酶发现以来， 由于种类多、高度的底物专一性、对称选择性以及p h 、温度的适应性，在 理论和实际应用中有关脂肪酶结构、生理生化性质、酶学性质等方面得广 泛研究【9 1 2 1 。 1 1 3 脂肪酶的结构和性质 1 1 3 1 脂肪酶的结构 m a l c a t a i 乃】等研究表明，不同种类的脂肪酶，特别是不同来源的微生物 脂肪酶，其一级结构各不相同，但大部分具有相同的： h i s x y - g i y - z - s e r w - g i y 或者y - g l y h i s - s e r - w - g l y ( 其中x 、y 、w 、z 是 可变的氨基酸残基) 特征区段。活性中心则是由丝氨基酸残基参与组成的 三联体。尽管微生物脂肪酶的一级结构差异较大，但它们的二级结构都是 由a 1 3 折叠构成，属于q 1 3 水解酶家族【1 4 】。多数脂肪酶都有1 个螺旋片段， 一般称为“盖子 ，当酶处于闭合状态时，活性位点被“盖子 覆盖；当存 在脂质微囊时，“盖子”打开与其结合，催化脂肪水解。也有研究报道，少 数脂肪酶不具备“盖子 结构。“盖子 结构对脂肪酶的活性、底物的特异 性和稳定性都有很大的影响。 1 1 3 2 脂肪酶的性质 微生物脂肪酶的分子量大都在1 7 0 0 0 7 0 0 0 0d a 之间【1 4 】，多数是糖蛋白， 其中糖基占整个分子量的2 1 5 ，主要是甘露糖，蛋白质分子主要由亲水 部分和疏水部分组成，因此脂肪酶能够在不同的反应体系中发挥不同的活 性。 多数脂肪酶的最适作用温度在3 0 6 0 0 之间，如少根根霉( r h i z o p u sa r r h i z u s b u c t ) 脂肪酶最适作用温度为4 3 。c 1 b 】，粗状假丝酵母产脂肪酶水解猪油的最 适温度则在4 5 c t 坫】。少数微生物脂肪酶在较极端的温度下仍然具有活力，胡泊 7 i 等从嗜冷枯草芽孢杆菌中分离的低温脂肪酶的最适作用温度为2 5 0 ，在0 c 以下仍可保持2 5 酶活，在6 0 。c 保温3 0 m i n 酶活力全部丧失；n a w a n i 和k a u r 1 8 1 第l 章绪论 从一些杆菌中分离到脂肪酶在7 0 能够保持活力1 5 0 m i n ，个别假单孢菌脂肪酶 在1 0 0 时仍保持活性。 目前已知的脂肪酶主要是中性和碱性脂肪酶，微生物脂肪酶有些较大的p h 稳定范围一般在p h 4 p h l l 。例如：a n d e r s s o n l l 9 】等从p f l u o r e s c e n ss i kw 1 分离 的脂肪酶在p h 4 8 时活性最好，k a n w a r 和g o s w a m i t 2 0 】分离的假单孢菌脂肪酶酶 活在p h l o 时最高，在p h l l 时仍保留8 0 的相对酶活。也有一些脂肪酶的p h 范围更宽，如b r a d o o 【1 1 j 等从b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u ss b 1 ，b a t r o p h a e u ss b 2 和b 1 i c h e n i f o r m i ss b 3 中分离到脂肪酶的p h 范围在p h 3 p i l l 2 之间。 研究表明，金属离子对脂肪酶酶活影响较大，c a 2 + 可以提高脂肪酶活力，而 z n 2 + 和m 矿+ 对脂肪酶活性有轻微抑制作用，一些重金属离子，如：c 0 2 + ，n i 2 + ， h 孑+ 和s d + 等严重抑制酶活性【2 2 1 。然而，不同微生物来源的脂肪酶，金属离子 对其影响也不同，k a l l w a r 和g o s w a m i 2 0 】研究的假单孢菌脂肪酶，c a 2 + 则不能提 高其活力，胡洲1 7 】等研究的嗜冷枯草芽孢杆菌脂肪酶，结果表明没有一种金属 离子可以提高其活力，酶在结构和功能上不需要金属离子作为辅因子。 1 1 4 脂肪酶产生菌 大部分微生物都有产脂肪酶能力。常见的脂肪酶生产菌株有假丝酵母、曲 霉、毛霉、青霉、地霉、假单孢菌和枯草芽孢杆菌等。据统计，产脂肪酶微生 物共有6 5 个属，其中真菌3 3 个属( 包含酵母菌l o 个属) ，细菌2 8 个属，放线 菌4 个属。目前，工业化所用的脂肪酶都是由真菌和细菌产生的，且生产菌株 都通过诱变或基因工程改造选育。施巧琴【2 3 】发表研究报道的碱性脂肪酶生产微 生物是通过物理和化学方法诱变青霉菌株得到的突变菌u n 5 0 3 ，再对突变菌株 多次诱变，最终成功筛选出稳定的突变菌株p f 8 6 8 ，其生产酶活达1 2 0 0u m l 。 n i u 矧等通过d n as h u f f m g 定向进化的基因育种方法，成功筛选出一株少根根霉 ( r h i z o p u sa r r h i z u s ) 突变株，其脂肪酶酶活比亲本提高了1 2 倍。常见的能够生 产脂肪酶的微生物见表1 1 。 第l 章绪论 表1 1 产脂肪酶的微生物 t a b 1 1i s o l a t i o no fl i p a s ef r o mm i c r o o r g a n i s m s 种类 菌种 酶活参考文献 细菌 b a c i l l u ss p428u m gp r o t e i n s h a r m a 心e ta 1 ，2 0 0 2 b a c i l l u ss u b t i l i s 2 0u l e g g e r tt , e ta 1 ，2 0 0 3 b a c i l l u st h e r m o l e o v o r a n s5 5 0 0u m gp r o t e i nc a s t r o - o c h o ald ，e ta 1 ，2 0 0 5 b a c i l l u st h e r m o c a t e n u l a t u s4 6 7 0u m gp r o t e i n k a r k h a n eaa ，e ta 1 ，2 0 0 9 b a c i l l u sc o g 酬g i i s1 1 6u m l k u m a rs ，e ta 1 ，2 0 0 5 。p s e u d o m o n a s s p 1 2 4 0u m gp r o t e i n r a h m a np , , e ta 1 ，2 0 0 5 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a 2 5 0i ug a u rr , e ta 1 2 0 0 8 p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s 9 8 5 4u m gp r o t e i n k o j i m ay , e ta 1 ，2 0 0 3 e s e u d o m o n a s f r a g i 18 0u m g s a n t a r o s s ag , e ta 1 ，2 0 0 5 e n t e r o c o c c u s f a e c a l i s 2 1 4 5u m gp r o t e i n n i s h i ot , e ta 1 ，1 9 8 7 l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m 10 0u m la n d oa ，e ta 1 ，2 0 0 4 s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 4 2 0 0u m gp r o t e i n h o r c h a n ih ，e ta 1 ，2 0 0 9 s t a p h y l o c o c c u sw a r n e r i 2 5 2u m g k a m p e nm ，e ta 1 ，2 0 0 1 s t a p h y l o c o c c u sx y l o s u s 15 0 0u m g m o s b a hh ，e ta 1 ，2 0 0 6 a c i n e t o b a c t e r o h n s o n i i 3 0 6u m l戚薇等，2 0 0 9 f u s a r i u ms o l a n i 1 8 9u m gm a i am m d ，e ta 1 ，2 0 0 0 真菌p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m 10 0 0u m g c h a h i n i a nh ，e ta 1 ，2 0 0 0 p e n i c i l l i u ms i m p l i c i s s i m u m3 0u g g u t a r r aml e ，e ta 1 ，2 0 0 7 a s p e r g i l l u sn i g e r 13 7 3 1u r a g m h e t r a sn c ，e ta 1 ，2 0 0 9 a s p e r g i l l u so r y z a e 3 0u m lo h n i s h ik , e ta 1 ，19 9 4 t r i c h o s p o r o nl a i b a c c h i i 111 4 6u g z h a n gy y a n d l i ujh ，2 0 1 0 r h i z o p u ss p 4 1 6 u m g ( s y n t h e t i e ) m a c e d og a ，e ta i ，2 0 0 4 r h i z o m u c o rm i e h e i2 4 3 2u gd r yc e l l h a r tzl ，e ta 1 ，2 0 0 9 g e o t r i c h u mc a n d i d u m 0 12 9u gh l a v s o v tl ( ，e ta 1 ，2 0 0 9 p i c h i ab u r t o n i i1 3 9 5 1 0 6 帆贝锦龙等，2 0 0 3 c a n d i d ac y l i d r a c a e 1 0 8 3u g徐慧显等，1 9 9 6 4 第1 章绪论 1 1 5 脂肪酶产生菌双亲本介绍 1 1 5 1 粗状假丝酵母( c a n d i d av a l i d at 2 ) 粗状假丝酵母( c a n d i d av a l i d a 他) 属于子囊菌纲，半子囊菌亚纲，酵母目， 隐球酵母科，隐球酵母亚科，假丝酵母属，生长过程中可形成假菌丝、有隔的 菌丝茁芽和厚垣孢子。假菌丝发达，与克鲁斯假丝酵母菌表型有相似之处。 粗状假丝酵母( c a n d i d av a l i d at 2 ) 具有较好的生产脂肪酶的能力，肖海群 1 2 5 】等对筛选到的一株粗状假丝酵母( c a n d i d av a l i d a r tt 2 ) 进行发酵条件优化后， 其脂肪酶活力达到1 4 6 7u m l ，欧阳军梅【2 6 】等则对这株菌固定化后测定其脂肪 酶活力也高达1 4 1 5u g 干细胞。此外，粗状假丝酵母( c a n d i d av a l i d at 2 ) 还具 有一定的发酵和个别生化物质代谢能力。 1 1 5 2 白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ) 白地霉( g e o t r i c h u mc a n d i d u mn s 3 ) 属于半知菌亚门，丛梗孢目，丛梗孢 科，卵形孢霉族，地霉属。菌丝为有横隔的真菌丝，有的为二叉分枝。菌丝宽3 7g m 。茵丝成熟后断裂成单个或成链、长筒形、末端钝圆的节孢子。节孢子大 小( 4 9 7 6g m ) x ( 5 4 1 6 6p m ) 。茵落呈平面扩散，生长快，扁平，孚l , f l 色，短绒 状，有同心圈放射线，呈中心突起。 大多数自地霉具有产脂肪酶能力，只是野生菌株产脂肪酶能力较弱，但其 生长迅速，对培养基要求低，具有广泛的生态适应性，因此，白地霉是一种非 常具有开发潜力的脂肪酶产生菌。另外，白地霉还有其他的工业价值，其细胞 内含有丰富的蛋白质和脂肪口，人工大量繁殖可制造“人造肉”，也可用于饲料 添加。国外有报道，白地霉用来生产乳酪【2 引、香精、香料、单细胞蛋白、工业 酶制剂以及在污水处理中应用。 1 2 脂肪酶的生产与用途 1 2 1 脂肪酶的生产 脂肪酶作为一种广泛应用的工业用酶，根据其来源，可分为动物脂肪酶、 植物脂肪酶和微生物脂肪酶。动、植物脂肪酶的生产方法主要是提取法，即从 动、植物体内，如：动物的胰脏等器官、脂肪组织和油料作用的种子中提取。 5 第1 章绪论 微生物脂肪酶具有比动、植物脂肪酶更广的来源和应用范围，其生产方法得 了广泛的研究【2 9 】。目前，微生物脂肪酶生产主要分为液态发酵【3 0 】和传统的固 发酵i 3 l 】方法。 1 2 1 1 液态发酵法生产 液态发酵也叫液态深层发酵( s u b m e r g e df e r m e n t a t i o n ，s m f ) ，主要适用 细菌和酵母，也适用于少量的霉菌。酵母菌同细菌( 所需水分活度大于0 9 ) 样需要较高的水活度，但比细菌所需水分略少。国内外也有关于霉菌液态发 的报道，如m h e t r a s l 3 2 等对黑曲霉n c i m1 2 0 7 进行液态发酵生产胞外脂肪酶 纯化后的胞外脂肪酶活力高达1 3 7 3i u m g 。 生产上采用的液态深层发酵( s m f ) ，该方法具有易于控制，不易染杂菌 生产效率高等优点，但也存在分离纯化成本高且产生大量的污水等缺点【3 3 1 。 态深层发酵( s ) 通常采用的发酵方式有：分批( b a t c h ) 发酵、补料( f e d b a t e 发酵和连续( c o n t i n u a n c e ) 发酵。 ( 1 ) 分批发酵( b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 分批发酵【3 4 】( b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 是指基质在反应前一次性加入反应器，在 适宜条件下将微生物接入，反应终了把反应液一次性排出的培养方式。实验室 所采用的摇瓶发酵是最典型的分批发酵方式，也可使用鼓泡式、气升式、搅拌 式发酵罐【3 5 】进行分批发酵。k a r 【3 6 】等采用2 0l 的反应器对y a r r o w i al i p o l i t y c a 产 胞外脂肪酶的影响因素进行研究，结果表明溶氧是对其生长有明显影响，降低 了酶的表达水平，其他条件如p h 值只是对菌体产量和酶产率略有影响。y a n g 卅 等对r h i z o p u sa r r h i z u s 进行反复分批发酵，研究培养基组成、发酵体积和时间对 微生物产酶的影响，结果表明，采用反复分批发酵可使脂肪酶活力提高到1 7 6 u m l h 。 ( 2 ) 补料分批发酵( f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 补料分批发酵【3 4 】( f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 是一种半连续的操作方式，即反 应过程中向反应器里补加底物，但不从或不连续从反应器里排出物料的培养方 式。它是介于分批发酵和连续发酵之间的过渡方式，具有分批发酵和连续发酵2 种培养方式的优点，可降低细胞新陈代谢对生产的影响，可避免底物和代谢物 的抑制，因此，补料分批发酵在脂肪酶的生产中应用广泛【3 引。许多研究表明， 采用补料分批发酵( f e d b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 比分批发酵( b a t c hf e r m e n t a t i o n ) 所 得产物量及酶活都高。如：k i m 和h o u l 3 9 】采用补料分批发酵培养c a n d i d a 6 第1 章绪论 c y l i n d r a c e a 所得菌体浓度和酶活分别为9 0g l 和2 3 7u m l ，比分批发酵时最大 菌体浓度2 0 叽和最高酶活3u m 1 分别提高3 5 倍和6 9 倍。 ( 3 ) 连续发酵( c o n t i n u a l l c ef e r m e n t a t i o n ) 连续发酵【3 4 】( c o n t i n u a n c ef e r m e n t a t i o n ) 是指基质边流入反应器，反应液边 流出反应器的连续操作方式。与分批发酵培养相比，连续发酵具有很多优点， 如生产效率高、辅助时间短、反应体积小、易自动化、产品品质稳定等。但由 于连续操作的原因易导致染菌，因而工业应用慎重。m o n t e s