（发酵工程专业论文）进出口动物源食品中多肽类和水杨苯胺类兽药残留量检测技术的研究.pdf

摘要 摘要 多肽类抗生素和水杨苯胺类兽药均是目前应用较广的抗菌剂和杀虫药，其在动物组 织中的残留具有一定的毒、副作用，由此导致的食品安全问题日益受到人们的关注。本 研究选取具有代表性的动物组织为研究对象，分别利用液相色谱法、液相色谱质谱质 谱法对氯氰碘柳胺和雷复尼特等两种水杨苯胺类兽药，以及多粘菌素b 、粘杆菌素、杆 菌肽和维吉尼霉素等四种多肽类抗生素进行了相应的检测分析，效果良好，能够满足相 关的检测要求。 研究内容包括： 一、选用动物组织( 肌肉、肝脏、肾脏) 为研究对象，建立了一种可同时测定氯氰 碘柳胺和雷复尼特等两种水杨苯胺类兽药残留量的检测方法。样品经乙腈提取，反相液 相色谱分离，2 8 2 n m 紫外检测，结果表明动物组织中氯氰碘柳胺的回收率为7 1 3 6 - - 9 2 2 3 ，相对标准偏差( r s d ) 为2 0 5 - - 7 0 6 ；雷复尼特的回收率为7 0 8 6 - - - 9 5 6 6 ， 相对标准偏差( r s d ) 为3 0 2 7 0 3 。氯氰碘柳胺和雷复尼特的检测限均为1 0 - , - 2 0 0 g k g 。该方法简便，准确，灵敏度高，可以快速检测和监测动物组织中氯氰碘柳胺 和雷复尼特的残留情况。 二、选用动物组织( 肌肉、肝脏、肾脏) 和牛奶为研究对象，建立了一种可同时测 定多粘菌素b 、粘杆菌素、杆菌肽和维吉尼霉素等四种多肽类抗生素残留量的检测方法。 样品经甲醇一0 1 甲酸体系提取，正己烷脱脂，固相萃取柱净化后，利用反相液相色谱 进行分离，多反应监控模式( 偶m ) 进行定性、定量分析。结果表明该方法回收率为 8 8 5 4 - - - 9 9 8 4 ，相对标准偏差( r s d ) 为1 9 1 - - - 9 8 4 ，具有快速简便、准确度和灵 敏度高、重现性好等特点，适合于不同动物组织中多肽类抗生素的测定。 关键词：高效液相色谱法，液相色谱一质谱质谱法，多肽类抗生素，水杨苯胺类兽药， 样品前处理，液一液分配，固相萃取 a b s t r a c t a b s t r a c t p e p t i d ea n t i b i o t i c sa n da l i c y l a n i l i d e sa r eb r o a d - s p e c t r u ma n t i m i c r o b i a la n dv e r m i f u g e v e t e r i n a r ym e d i c i n ea n dt h e i rr e s i d u ei nf o o d s t u f f so fa n i m a lo r i g i nh a v ec e r t a i nt o x i c a le f f e c t o nh u m a n h e a l t h p e p e l ep a ya t t e n t i o nt ot h ef o o ds a f e t yi s s u ep r o d u c e db ya b o v em e n t i o n e d e l e m e n t sm o r ea n dm o r e t h er e p r e s e n t a t i o n a la n i m a lt i s s u e sw e r es e l e c t e da ss t u d yt a r g e t si n t h i sr e s e a r c h ，a n dh a v eas t u d yo nt h ed e t e r m i n a t i o nm e t h o do fc l o s a n t e la n dr a f o x a n i d e r e s i d u ea n db a c i t r a c i n ，p o l y m y x i nb ，c o l i s t i n ，v i r g i n i a m y c i nr e s i d u ei nf o o d s t u f f so fa n i m a l o r i g i nb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dh i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y ( h p l c - m s m s ) t e c h n o l o g yr e s p e c t i v e l y t h e r e s u l ts h o wt h a tt h em e t h o dc o u l ds a t i s f yt h er e l a t i v ei n t e r n a t i o n a ld e t e c t i o nd e m a n d p e r f e c t l y t h er e s e a r c hc o n s i s t so ft w op a r t s p a r to n e ，a n i m a lt i s s u e s ，s u c ha sm u s c l e ，l i v e ra n dk i d n e yw e r es e l e c t e da ss t u d yt a r g e t s ， a n de s t a b l i s h e dam e t h o dt od e t e c tt h ec l o s a n t e la n dr a f o x a n i d er e s i d u e so ft h e mb yh i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t h es a m p l e sw e r ee x t r a c t e dw i t ha c e t o n i t r i l e ，i s o l a t e db y a5 c 1 8l i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n ( 2 5 0 m m x 4 6 m m ，5 1 x m ) a n dd e t e d t e da tw a v e l e n g t ho f 2 8 2 n m b y u l t r a v i o l e td e t e c t o r t h er e s e a r c hr e s u l t si n d i c a t i e dt h a tt h ea v e r a g e r e c o v e r i e sc l o s a n t e la n dr a f o x a n i d er a n g e df r o m7 1 3 6 - - 9 2 2 3 a n d7 0 8 6 - - 9 5 6 6 a n d t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o ft h e mw e r e2 0 5 7 0 6 a n d3 0 2 7 0 3 r e s p e c t i v e l y a n dt h el o w e s tl i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) a r e10 - - 。2 0 0 p g k gf o rc l o s a n t e la n d r a f o x a n i d e t h i ss t u d ym e t h o di ss i m p l e ，a c c u r a t ea n ds e n s i t i v ea n di ss u i t a b l ef o rf a s t s c r e e n i n ga n dd e t e c t i n gt h er e s i d u e so fc l o s a n t e la n dr a f o x a n i d ei na n i m a lt i s s u e s p a r tt w o ，a n i m a lt i s s u e s ，s u c ha sm u s c l e ，l i v e ra n dk i d n e ya n dm i l kw e r es e l e c t e da s s t u d yt a r g e t s ，a n de s t a b l i s h e dam e t h o dt os i m u l t a n e o u sd e t e c tt h eb a c i t r a c i n ，p o l y m y x i nb ， c o l i s t i n ，v i r g i n i a m y c i nr e s i d u e so ft h e mb yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h ym a s ss p e c t r o m e t r y t h e s a m p l e sw e r ee x t r a c t e d 谢t 1 1m e t h a n o l - w a t e rc o n t a i n i n g0 1 f o r m i ca c i d ，d e g r e a s e db y h e x a n ea n dc l e a n e du pb ys o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) c o l u m n t h ee l u t ew a ss e p a r a t e db y l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n dd e t e r m i n e dw i t ht h em u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n gm o d eb ym a s s i i a b s t r a c t s p e c t o m e t r y t h e r e s e a r c hr e s u l t si n d i c a t i e dt h a tt h e a v e r a g er e c o v e f i e s b a c i t r a c i n ， p o l y m y x i n ，p o l y m y x i nb ，c o l i s t i na ，c o l i s t i nb ，v i r g i n i a m y c i nr a n g e df r o m8 8 5 4 - - 。9 9 8 4 ，t h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) o f t h e mw a s1 9 l 9 8 1 t h em e t h o di ss i m p l e ， r a p i d ，a c c u r a t ea n ds u i t a b l ef o rs i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fp e p t i d e sa n t i b i o t i c si nd i f f e r e n t a n i m a lt i s s u e s k e yw o r d s ：hig hp e r f o r m a n c ei iq uidc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) ，liq uidc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y ( l c m s m s ) ，p e p t i d e sa n t i b i o t i c s ，s a ii c y i a n iii d e s ， s a m p i et r e a t m e n t ，l i q u i d ii q u i de x t r a c t i o n ，s o ii dp h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) i i i 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：进出旦动物遮盒晶虫多丛粪塑丞扬苤麈娄盏药毯留量捡 迩撞丕的硒究 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的 规定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印 件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 存) ，保密期至 年月日为止。 学生签名：鹰堑 第一章绪论 第一章绪论 随着科学技术的发展和人们生活水平的不断提高，生活、生产和环境中外源性化学 物质增多导致的食品污染问题日益突出，引起世界各国人民的极大关注。兽药在畜牧生 产中的不当应用产生的兽药残留对人们的健康具有一定的毒副作用，由此引发的食品安 全问题己成为一个影响广泛和颇具争议的问题，其不仅与公众的健康息息相关，而且也 直接关系到产业界的经济利益。 兽药残留是指给动物使用药物后蓄积或储存在细胞、组织或器官内的药物原形、代 谢产物和药物杂质。兽药在食品中的残留水平通常很低，发生急性中毒的可能性很小， 但这种长期、低水平的接触方式主要产生各种慢性、蓄积毒性，对健康和环境的危害往 往具有隐蔽性，易造成实质性和难以逆转的危害。所以建立残留分析方法对监控是非常 重要的。 兽药残留分析属复杂基质中痕量组分的分析技术，与药品或制剂分析有很大不同， 兽药残留分析的显著特点是待测物质浓度低，样品基质复杂，干扰物质多，既需要精细 的微量操作手段，又需要高灵敏度的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分析成本高， 对分析质量控制和分析策略( 如筛选性分析、确证性分析) 有特殊要求。 1 1 兽药残留的相关知识背景 1 1 1 兽药残留对人体的危害 兽药残留是人体的“隐形杀手”口中的“定时炸弹”，人们食用残留兽药的动物性 食品后，虽不表现为急性毒性作用，但人如果经常摄入低剂量的兽药残留物，在经过了 一定时间后，残留物可在人体内逐渐蓄积而导致各种危害，主要表现在以下几方面。 ( 1 ) 毒性作用 人长期微量摄入含兽药残留的动物性食品后，用药不断在体内续集，当浓度达到一 定量后，就会对人体产生毒性作用。毒性反应是抗生素等药品所引起的最多见、或最易 被注意的一种不良反应。这种作用是潜在性的，与药物的剂量和摄入或使用的时间有关。 第一章绪论 在每日允许摄入量，或容许最高残留限量内可以不显示毒性，而高于这个安全水平，则 因药物在体内蓄积或其毒性的累积可显示毒性反应，造成人体功能障碍或器质性损害， 使人体在不知不觉中使受到伤害。 ( 2 ) 过敏反应和变态反应 经常食用一些含低剂量抗菌药物残留的食品能使易染的个体出现过敏反应。它们具 有抗原性，刺激机体内抗体的形成，造成过敏反应，严重者可引起休克，短时间内出现 血压下降、皮疹、喉头水肿、呼吸困难等严重症状。 ( 3 ) 细菌耐药性 细菌耐药性是指有些细菌菌株对通常能抑制其生长繁殖的某种浓度的抗菌药物产 生耐受性。经常食用低剂量药物残留的食品可使细菌产生耐药性。动物在经常反复接触 某一种抗菌药物后，其体内的敏感菌株将受到选择性的食品影响。动物体内的耐药菌株 可通过动物性食品传播给人体，当人体发生疾病时，就给临床上感染性疾病的治疗带来 一定的困难，耐药菌株感染往往会延误正常的治疗过程。已发现长期食用低剂量的抗生 素能导致金黄葡萄球菌耐药菌株的出现，也能引起大肠杆菌耐药菌株的产生。 ( 4 ) 菌群失调 在正常条件下，人体肠道内的菌群在长期共同进化过程中与人体能相互适应，如某 些菌群能抑制其他菌群的过度生长。反之，某些菌群能合成b 族维生素和维生素k 以 供机体使用。过多应用药物会使这种平衡发生紊乱，造成一些非致病菌的死亡，使菌群 的平衡失调，从而导致长期的腹泻或引起维生素的缺乏等反应，造成对人体的危害。 ( 5 ) 致畸、致癌、致突变作用 在妊娠关键时期对胚胎或胎儿产生毒性作用造成先天畸形的药物或化学药品成为 致畸物。致突变作用又称诱变作用，诱变剂是指损害细胞或机体遗传成分的化学物质。 ( 6 ) 激素作用 人们通过食用含低剂量激素的动物性食品，不断接触和摄入动物体内的内源性激 素。一般情况下，摄入人体内的动物内源性激素，由于其口服活性低，因而不可能有效 的干扰消费者的激素机能，但也不可忽视。 1 1 2 兽药进入动物体的主要途径 ( 1 ) 预防和治疗疾病用药 在预防和治疗疾病的过程中，通过口服、注射、局部用药等方法可使药物残留与动 2 第一章绪论 物体内。 ( 2 ) 饲料添加剂中兽药的使用 为了治疗和预防动物的某些疾病，在饲料中常添加一些药物，还可促进畜禽的生长。 当这些药物小剂量拌在饲料中，长时间的喂养食用动物，通过饲料使药物残留在食用动 物体内。 ( 3 ) 食品保鲜中引入药物 食品保鲜有时加入某些抗生素等药物来抑制微生物的生长、繁殖，这样也会不同程 度造成食品的药物污染。 1 1 3 兽药残留污染的主要原因 ( 1 ) 不遵守休药期有关规定 休药期是指畜禽停止给药到屠宰和准予其产品( 蛋、乳) 上市的时间间隔。休药期 随动物种属、药物种类、制剂形式、用药剂量及给药途径等不同而有差异，一般为几小 时、几天或几周。 ( 2 ) 不正确使用兽药和滥用兽药 使用兽药时，在用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等方面不符合用 药规定，因此造成药物残留在体内，并使存留时间延长，从而需要增加休药天数。 ( 3 ) 饲料加工运输过程中受到兽药污染 当将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料，或使用胜过药物容器而为充分清洗干净， 都会造成饲料加工过程中兽药污染。 ( 4 ) 使用未经批准的药物 使用未经批准的药物作为饲料添加剂来喂养可食性动物，造成食用动物的兽药残 留。 ( 5 ) 按错误的用药方法用药或未作用药纪录 按错误的用药方法用药或未作用药纪录将造成违章，使药物残留于食用动物中。 ( 6 ) 屠宰前使用兽药 屠宰前使用兽药用来掩饰临床症状、逃避屠宰前检查。 1 1 4 残留分析原理 残留分析的目的是了解待测组分的种类( 定性) 和浓度( 定量) 。生物样品中含有大量 第一章绪论 性质未知的组分，以无法预料的方式影响分析过程，因而分离通常是无法避免的分析步 骤。分离和检测是一个残留分析方法的两个基本组成部分。 1 1 4 1 分离 分离是检测的必要条件。无论从涉及的原理还是消耗的时间和资源，分离过程在残 留分析中的复杂性和重要性都是显而易见的，一般需消耗整个分析过程9 0 以上的时间 和资源。样品基质组成的复杂性和低浓度( 低于百万分之一) 的被测组分是使分离过程或 残留分析复杂化的根源。 分离方法的原则可以简单地比作试图将组分a ( 待测组分) 从基质和其它组分b 中分 离出来，而且a 回收率尽可能地高。但根据统计学或热力学原理，即使混合物中只含有 两种物质也不可能达到完全分离。这样在分离过程中就存在降低检出限和减少待测物损 失这对矛盾。检测方法一旦确定，分离效果则决定了方法的灵敏度和准确度。残留分析 中，通常控制方法定量限低于m r l ，定量方法的回收率范围应为7 0 - - 1 2 0 。 一般根据待测物和样品基质的性质差异，利用组合的分离步骤( 多维分离) 可以达到 分离和分析目的要求。多数分析方法中至少采用3 个分离步骤：1 5 - 提取步骤( 将待测物 从样品中释放进入溶液状态) ：1 - - 3 个净化步骤( 除去部分干扰杂质) ；1 个分离步骤，或 称分辨，通常借用仪器进行连续在线分离的过程，如高效液相色谱( h p l c ) 、气相色谱 法( g c ) 等。 色谱是最重要的分离技术。这种由固定相和流动相组成的分离体系可供选择的分离 机制很多，几乎能够利用待测物所有常见的理化性质，如待测物极性非极性、溶解性、 酸碱性、分子量等。而且操作方便、自动化程度高，具有广泛的适用性。 1 1 4 2 检测 直接对痕量残留物质进行定性或定量分析的方法，主要利用待测物分子的整体性质 进行检测。如紫外一可见光、荧光、质谱等。 残留分析中分离和检测过程是一个整体，分离必须根据分析目的和检测方法设计， 一个高灵敏度和高选择性的检测方法有助于简化分离。另外，待测物浓缩和衍生化也是 常用的提高检测灵敏度的方法。 1 2 多肽类抗生素和水杨苯胺类兽药残留的研究现状 4 第一章绪论 多肽类和水杨苯胺类兽药是广谱抗菌和杀虫类兽药，因其效价高，价格低廉，在国 内、外畜牧业中得到广泛应用，成为畜禽疾病防治的重要药物。随着这两类兽药的广泛 应用和研究，发现其具有毒、副作用，这就使其在动物源食品中的残留引起极大重视。 1 2 1 多肽类抗生素简介 多肽类抗生素( p e p t i d e s ) 是由多粘杆菌或产气孢子杆菌的培养液中提取制得。常 用的多肽类抗生素有多粘菌素b ( p o l y m y x i nb ) 、粘杆菌素( c o l i s t i n ) 、杆菌肽 ( b a c i t r a e i n ) 、维吉尼霉素( v i r g i n i a m y c i n ) 等。每种多肽类抗生素都是一种含有多种 组分的化合物。杆菌肽( 又称枯草菌肽) 目前生产是由枯草杆菌或地衣芽孢杆菌发酵而 制得的。杆菌肽由多种氨基酸结合而成，含1 0 种组分的多肽，它有许多异构体，分别 为杆菌肽a 、a l 、b 、c 、d 、e 、f l 、f 2 、f 3 和g ，其中含量最高、最有效的是a 组分， 结构式见图1 1 1 - 6 1 。多粘菌素b 是最早发现的抗菌素之一，是由日本在2 0 世纪5 0 年代 分离培养获得，因其对革兰氏阴性菌的强大抑菌作用而受到重视。我国山东鲁抗医药集 团公司于本世纪初也成功生产该抗生素【7 ，8 】。多粘菌素b 是一个具有1 0 个氨基酸的多肽， 其中7 个氨基酸形成环状化合物，在n 端连接一个脂肪链，结构式见图1 2 。近年发现 它可有效地与革兰氏阴性菌分泌的高毒性物质一内毒素结合，从而对抗由内毒素引起的 一系列高死亡率的败血疾病，但是多粘菌素b 对人体的毒性限制了它的广泛使用【7 1 。粘 杆菌素又名多粘菌素e 、抗敌素、粘菌素、克利斯汀等，是1 9 5 0 年日本小山康夫等从福 岛县土壤中分离到一株多粘芽孢杆菌抗敌素变株培养液中产生的，一种锁环状碱性多肽 类抗生素【9 1 0 j 。它是一种至少含有3 0 多种不同成分的混合物，主要为粘杆菌素a ( 多粘 菌素e 1 ) 和粘杆菌素b ( 多粘菌素e 2 ) 的混合物，结构式见图1 3 。维吉尼霉素( v g m ) 又名维吉尼亚霉素、维吉霉素、肥大霉素、速大肥等，是一种含有内酯环的多肽类抗生 素。维吉尼霉素为多组分的混合物，是由v g m m ( m 】，m e ) 和v g m s ( s l s 5 ) 组成，其中 v g m m 1 和v g m s l 为主要成分，v g m m l 结构式见图1 4 。单独的v g m m l 或v g m s l 的抗菌作用很弱，但二者存在协同效应。商品v g m 是m l 和s l 的混合物，它由7 0 m l 和3 0 s l 混合组成。m l 为大环内酯对金色葡萄球菌有效，s l 为环状多肽对滕黄八迭球 菌有效。m l 和s 1 两者混合，提高抗菌活性 1 引。 多肽类抗生素可分别抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、绿脓杆菌、真菌、病毒、螺 旋体、原虫的感染，对败血症、呼吸道感染、泌尿系统感染、牛乳腺炎等疾病，小剂量 时抑菌，大剂量时杀菌，被广泛用于家禽、猪、牛等的饲料添加剂和兽药，用来促进动 第一章绪论 物的生长和治疗畜禽疾病。不同多肽类抗生素所具有的抗菌作用不同，多粘菌素类可改 变细胞浆膜的功能，而杆菌肽则作用于细胞壁和细胞质。多肽类抗生素的最大优点是细 菌不易产生耐药性，但缺点为毒性较大，除对细菌细胞膜损伤外，对动物细胞膜也起作 用，主要对肾、神经系统有一定毒性。随着多肽类抗生素应用的增加，人们逐渐发现其 在动物体内的残留，可通过肉、蛋、奶等动物源食品传递给人类。 图卜1 杆菌肽a 结构式 f i g 1 - ls t r u c t u r a lf o r m u l ao fb a c i t r a c i na 图1 - 3 粘杆菌素结构式 f i g 1 3s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc o l i s t i n 6 i i 图1 - 2 多粘菌素b 结构式 f i g 1 2s t r u c t u r a lf o r m u l ao fp o l y m y x i nb 图1 - 4 维吉尼霉素m ，结构式 f i g 1 - 4s t r u c t u r a lf o r m u l ao fv i r g i n i a m y c i nm 1 第一章绪论 1 9 9 9 年欧盟出于对饲用抗生素在动物产品中的残留问题的忧虑，决定禁止将维吉尼 霉素和杆菌肽锌等抗生素作为动物生长促进剂用于饲料，但在我国还未禁止使用。目前 我国允许在畜禽饲料中添加维吉尼霉素和杆菌肽，在实际生产中作为肉猪、肉鸡的药物 添加剂，用于预防动物疾病、促进动物生长【1 4 , 1 5 】。 多粘菌素选择毒性不高，易与哺乳动物的细胞膜结合，例如脑、肾和肝等脏器细胞 膜可与粘杆菌素紧密结合。多粘菌素本身具有高极性和低脂溶性的特点，不会被肾脏重 新吸入血液，故持续大剂量给药不会导致动物血清药物蓄积，却可导致药物在脑、肾和 肝等器官中的蓄积，一旦药物与组织的结合达到或接近饱和，对动物就会产生毒性反应。 多粘菌素b 的毒副作用表现多种，以肾毒性、神经毒性为主。肾脏毒性是该类药物与肾 小管上的p 0 4 3 - 结合后引起损伤造成的，摄入少量时，多粘菌素b 会影响及降低。肾小球 的过滤率，碱少排尿量，此时。肾脏已出现。肾小管云雾状水肿；摄入大量时，就会出现肾 中毒，并能抑制人体补体系统。 粘杆菌素是具有肾毒性的药物，摄入大量时，易损伤肾脏而引起尿道上皮细胞变性， 尿中出现蛋白、红细胞和白细胞，严重者可产生氮质血症、肾功能减退等【16 1 。神经毒性 是该类药物降低了肌肉对递质a c h 的敏感性引起的，多粘菌素是有效的组胺释放剂，过 量时会见到肌肉软弱无力、轻瘫、甚至呼吸停顿及全瘫引起的死亡 9 , 1 7 j 。根据我国农业 部2 0 0 2 年1 2 月2 4 日第2 3 5 号公告，多肽类抗生素的最高残留限量见表1 1 。 表1 - 1 多肽类抗生素兽药残留最高限量 t a b 1 1t h em a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) o fp e p t i d e s 7 第一章绪论 续：表卜1 多肽类抗生素兽药残留最高限量 t a b 1 - lt h em a x i m u mr e s i d u el i m i t sf m r l s ) o fp e p t i d e s 1 2 2 水杨苯胺类兽药简介 氯氰碘柳胺( c l o s a n t e l ) 和雷复尼特( r a f o x a n i d e ) 属于水杨苯胺( s a l i c y l a n i l i d e s ) 类兽药，是一类广谱驱虫药。 氯氰碘柳胺1 9 7 7 年由比利时杨森公司研制合成( 结构式见图1 5 ) ，随后在多国推广 应用1 1 8 , 1 9 。19 9 3 年氯氰碘柳胺被农业部批准为二类新兽药。对与血液循环接触密切或吸 血性寄生的一些线虫和节支昆虫，如肝片吸虫、大片吸虫和巨片吸虫的成虫和幼虫，血 矛线虫、仰口线虫、胃肠道线虫、食道口线虫、盖格属线虫、夏伯特线虫等均具有高效 驱杀作用，一次性投药即可控制牛皮蝇的皮下移动期幼虫。并且对羊鼻蝇蛆、绵羊痒螨、 牛皮蝇蛆等家禽内外寄生虫有驱杀活性。另外该药还对嗜人锥蝇、铜绿蝇、钝眼蝇、牛 蜱、牛血虱等具有抑制产卵和治疗作用。可通过口服或胃肠道外等多种形式投药【2 0 】。 2 0 0 1 年马红霞，贾冬舒等1 2 l j 做了复方氯氰碘柳胺钠片剂对大白鼠的亚慢性毒性试 验，将复方氯氰碘柳胺钠片剂按高、中、低和对照4 个剂量组，分别给大白鼠经口投服， 测定增重及血液生理生化指标，并进行病理解剖及病理组织学检查，实验证明复方氯氰 碘柳胺钠片剂在大剂量使用时，对肝、肾造成损害。 8 第一章绪论 雷复尼特( r a f o x a n i d e ) 又名碘醚柳胺、碘柳酰胺氯苯醚、重碘柳胺、二碘氢柳胺， 是一种卤化水杨苯胺类抗吸虫剂( 结构式见图1 6 ) 。1 9 6 9 年a r m o u r 、c o r b a 及a n n e n 证明 该药对不同龄的肝片吸虫及大片型吸虫有卓越疗效，随后在英国、欧洲、澳大利亚、巴 西和南非广泛应用。在国内多称为碘醚柳胺，该药对治疗牛、羊等反刍兽肝片吸虫、片 形吸虫病及血矛线虫具有很高的杀虫效力。它不仅对肝片吸虫成虫有效，而且对其童虫 也有相当的效果，以及羊鼻蝇蚴的各期寄生性幼虫驱杀效果明显，同时对仰口线虫、和 羊狂蝇等也有一定的效果【2 2 2 训。 图卜5 氯氰碘柳胺结构式 f i g 1 - 5s t r u c t u r a lf o r m u l ao fc l o s a n t e l 图卜6 雷复尼特结构式 f i g 1 - 6s t r u c t u r a lf o r m u l ao fr a f o x a n i d e 2 0 0 1 年吴永魁等【2 5 j 对雷复尼特作了大鼠胚胎毒性和致畸性的研究。以不同剂量的 雷复尼特在w i s t a r 大鼠妊振后7 1 5 d 口服。结果表明，各剂量组吸收胎和死胎率增加， 活胎率减少。高剂量组对胎鼠生长发育和孕鼠体重增长有明显的负影响。雷复尼特与蛋 白结合率较高，半衰期较长，在组织内能残留较长时间。这一方面说明该药可能给受孕 动物及其胚胎和胎儿的生长发育带来不良影响。同时，其肉、蛋、乳等动物性食品对人 也可产生间接影响。根据我国农业部2 0 0 2 年1 2 月2 4 日第2 3 5 号公告，水杨苯胺类兽 药的最高残留限量见表1 2 。 1 2 3 多肽类和水杨苯胺类兽药残留分析的现状 目前，对多肽类抗生素和水杨苯胺类兽药进行提取分离与分析检测主要有微生物 法、免疫分析法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和液质联用技术等方法，其研究进展 情况介绍如下。 9 第一章绪论 1 2 3 1 微生物法 微生物法是多肽类抗生素残留检测中应用较广的一种检测方法，它是根据抗生素对 微生物生理机能和代谢的抑制作用来定性或定量地确定样品中的兽药残留的。杯碟法是 微生物法中较常用的一种方法，我国行业标准s n t 11 3 4 2 0 0 2 t 2 6 】就是利用杯碟法检验进 出e l 肉及肉制品中维吉尼霉素的残留的。该方法的测定低限为0 0 5 m g k g ，鸡肉中维吉 尼霉素添加浓度分别为o 0 5 、0 1 0 、0 2 0 m g k g 时，回收率分别为8 0 o 、8 1 0 、8 1 3 ， 准确度较好。 微生物法成本低，操作简便，具有一定的灵敏度，在同时分析大批样品中具有一定 优势。但该方法分析速度慢，专一性差，并且只能测定有生物活性的残留物。 表1 - 2 水杨苯胺类兽药残留最高限量 t a b 1 - 2t h em a x i m u mr e s i d u el i m i t s ( m r l s ) o fs a l i c y l a n i l i d e s l o 第一章绪论 1 2 3 2 免疫分析法 免疫分析法有放射性免疫分析法、酶联免疫分析法( e l i s a 法) 等多种，后者最为 常用。e l i s a 法是一种以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的检测方法。 m a r i k om a t s u m o t o 等【27 j 曾用e l i s a 法测定了鸡血中杆菌肽的残留量，即用辣根过氧化物 酶为酶标记物，以杆菌肽抗体i g g 测试条进行检测。该法简便快速，检测限为l n g m l ， 回收率范围为9 7 1 0 3 。w i l l i a m sc 等【2 8 1 则利用e l i s a 法对动物饲料中杆菌肽锌在贮 藏过程中的稳定性情况进行了监测，即将杆菌肽锌的各组分分离出来，用e l i s a 技术分 析各组分与抗体的反应情况。 e l i s a 法特异性强，灵敏度高，快速简便，可准确定性、定量，适用于现场检测和 大量样品的快速检测，是一种较理想的兽药残留筛查方法。但该法抗体制备比较困难， 在不能肯定样品中的兽药品种时，有一定的盲目性，易出现假阴性、假阳性现象。此外， e l i s a 法目前大多采用进口试剂盒，价格较贵，且仅能对单一兽药进行检测，使其应用 范围受到了一定的限制。 1 2 3 3 毛细管电泳法 毛细管电泳法是一种利用毛细管和高电压双重作用来分离的分析技术，是凝胶电泳 技术的发展和高效液相色谱分析的补充，具有微量、快速、高效的特点。胶束电动毛细 管色谱法( m i c e l l a re l c t r o k i n e t i cc a p i l l a r yc h r o m a t o g r a p h y ，m e c c ) 是众多c e 分离分析 类型中用于抗生素检测的最常用方法，适合同时分离分析离子型和电中性的样品分子。 k a n gj w 等1 2 9 j 利用m e c c 技术对杆菌肽进行了定量分析，并对分析条件进行了优化， 在p h 为2 5 的t r i s 磷酸缓冲体系下，该法线性范围为0 0 5 - - 1 0 0 m g m l ，l o d 为5 p g m l ， l o q 为1 2 p g m l 。i n j a cr 等 3 0 1 利用m e c c 法检测分析了动物饲料中的杆菌肽和制菌霉 素，以p h 为8 2 的硼酸盐或磷酸盐为缓冲体系，其中包含2 0 m ms d s 和1 0 甲醇( v v ) ， 紫外检测器检测，结果在2 1 5 n m 下二者均检出，1 9 2 n m 和2 5 4 n m 下只检出杆菌肽，3 0 5 n m 下只检出制菌霉素。该法具有很好的特异性，准确度和精密度均较好。 1 2 3 4 高效液相色谱法 近年来，高效液相色谱法因其选择性好、灵敏度高、速度快和操作自动化等优点 已成为分析化学领域广泛应用的一种理化方法。在多肽类抗生素的检测过程中，一些新 的前处理技术、新型高效固定相以及柱前和柱后衍生技术和高灵敏度检测器等的采用， 第一章绪论 大大提高了高效液相色谱法的检测效率。 超声波辅助萃取( u l t r a s o u n d a s s i s t e de x t r a c t i o n ，u a e ) 技术是新近发展的一种很好 的样品提取技术，它是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、乳化、扩 散等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，加速目标成分进入溶 剂，促进提取的进行。m o r a l e s m u n o zs 等【3 l j 利用u a e 技术，在线柱前荧光衍生的方法 对粘杆菌素进行了h p l c 分析检测。我国河北工业大学的佟斌、吴兆亮也利用u a e 技 术，u v d 检测的方法对粘杆菌素进行了h p l c 分析检测1 32 。u a e 技术的应用使得该实 验样品萃取更加快速高效，重现性好，而且在线技术又大大减少了样品的处理量。其他 一些新的样品处理、浓缩技术，如快速溶剂提取( a s e ) 、固相萃取( s p e ) 、超临界萃 取( s p f ) 、免疫亲和层析( i a c ) 等也可以快速提取、纯化食品中很多痕量级成分，有效 地缩短了检测周期。 目前，作为新型高效固定相的整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) 技术已走向实用化。整 体柱是一种利用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位聚合的连续床固定相，利用其 进行高效液相色谱分析具有低压、高速、重现性好、选择性强等特点1 33 1 。在实际应用中， p a v l iv 掣3 4 】用反相硅胶整体柱对杆菌肽进行了快速分离，结果表明整体柱技术对各种缓 冲体系的适应性更强，分离效率更高，而且缩短了保留时间，可以更有效地分离杆菌肽成 分。该法还适于样品的质量标准控制和稳定性检测。 反相高效液相色谱法( i 冲h p l c ) 和荧光衍生技术是兽药检测的常用方法，e r r a n td j 等【3 5 】将老鼠和狗血浆中的粘杆菌素提取后进行荧光衍生，再用r p h p l c 进行分析测定， 荧光检测器检测。结果表明该实验的准确度、精密度都很好，符合f d a 的有关要求， 线性范围为o 0 5 , - - - 5 0 0 p g m l 。c a p i t a n v a l l v e yl f 等1 3 6 j 利用r p h p l c 法对动物饲料中 的杆菌肽锌进行分离后，进一步柱后衍生，然后荧光检测，检测低限小于5 m g k g 。1 9 9 8 年s t o e vg 等【3 7 】报导了用h p l c 荧光检测法定量测定血液和组织中氯氰碘柳胺残留量。 样品用乙腈提取，c 1 8 固相萃取柱萃取净化，由于氯氰碘柳胺本身存在荧光性，作者做 了不同p h 的流动相对氯氰碘柳胺荧光性的影响的研究。研究发现在p h 2 5 时，氯氰碘 柳胺荧光性最强，用荧光检测器检测( 激发波长3 3 5 n m ，发射波长5 1 0 n m ) ，线性相关 系数为r = 0 9 9 2 ，最低检测限为1 0 1 g k g 。并用紫外检测器做了对比实验，结果显示荧光 检测器检测比紫外高1 0 倍。 此外，一些高端检测器，如光电二极管矩阵检测器( p h o t o d i o d ea r r a yd e t e c t o r ， p a d ) 、质谱检测器( m a s ss p e c t r o m e t r y ，m s ) 的使用，也使得多肽类抗生素检测如虎 添翼，效率倍增。耿志明掣孙j 利用p a d 检测器对r p h p l c 分离分析的鸡组织维吉尼亚霉 1 2 第一章绪论 素m l 的残留进行检测，结果表明该方法在鸡组织中的回收率为7 4 5 , - - , 9 1 1 ；批内、 批间变异系数均在1 0 以内；最低检测限均为1 0 p g k g 。 1 2 3 5 液质( l c - m s ) 联用技术 近年来，随着分析仪器的现代化、定性与定量技术的不断进步，液质( l c m s ) 联 用技术在兽药残留分析研究中得到了广泛应用。质谱作为高效液相色谱的高端检测器， 可以较好给出待测物质的定性分析结果，所以液质( l c m s ) 联用技术既具备色谱高效 分离的优点，又具有质谱可以准确鉴定化合物结构的特点，可同时达到定性、定量的检 测目的，所需样品量少，灵敏度高，快速准确，特别适用于确证性分析。d e l l aw a i m e is i n 等【3 9 j 用l c m s m s 法分析了牛奶、动物组织样品中杆菌肽、粘杆菌素主要成分的残留 量。牛奶经三氯乙酸去蛋白质并离心净化，动物组织则借助固相萃取技术( s o l i dp h a s e e e x t r a c t i o n ，s p e ) 净化，之后以多粘菌素b 为内标，r p h p l c 柱分离，多反映监测 ( m u l t i p l er e a c t i o nm o r n i t o r i n g ，m r m ) 模式下进行质谱扫描。杆菌肽a 、粘杆菌素a ( 多粘菌素e 1 ) 和粘杆菌素b ( 多粘菌素e 2 ) 定量限为1 0 0 p g k g 和5 0 9 t g k g 。在所有样 品中日间( n = 7 ) 和日内( n = 4 ) 回收率范围为8 9 2 l1 0 ( r s d 1 0 ) 和9 0 4 11 2 ( r s d 13 ) 。p o u c k ec v 等【4 0 】利用l c m s 对杆菌肽锌、维吉尼霉素等禁用的动物饲 料添加剂进行了定量检测，2 5 9 饲料经甲醇一水体系萃取后，再用o a s i s 固相萃取小柱 净化，k r o m a s i lc 1 8 柱检测，该方法可检测低于l m g k g 的样品。g o v a e r t sc 等【4 l 】利用高 效液相色谱一离子阱质谱( i o nt r a pm a s ss p e c t r o m e t r y ，i t m s ) 联用技术对线性和环状多 肽抗生素( 多粘菌素b 、粘杆菌素、杆菌肽、短杆菌肽) 中的微量组分进行了检测分析， 这种液质联用的检测方式在省去一些费时的分离纯化过程的同时，又得到了较详尽的结 构分析结果，能够快速高效地达到检测目的。 1 3 论文研究意义 当前，我国动物源性食品进出口贸易面临着巨大压力，这就要求我们一方面要保证 出口动物源性食品的卫生质量，提高在国际市场上的竞争力，同时另一方面还要加强对 进口动物源性食品的检验，严把国门，维护我国消费者的