（法医学专业论文）头发mtdna4977bp缺失与年龄的关系研究.pdf

重庆医科大学 研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 学位论文作者签名：盗堕硇日期：塞堕：兰坚 学位论文版权使用授权书 本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产书的规定，即：研究生在攻读学 位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后，发表论 文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学 位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，可以采用影印、缩f p 或其他手段保 存论文。 论文作 指导教 日 重庆医科大学硕士研究生学位论文 英文缩写 m t d n a d n a b p p c r g d b p k e b d n t p r i f f s e d l 、a a g a g e o d s e p i c 1 0 符号说明 英文全名 m i t o c h o n d r i a ld n a d e o x y 曲o n u c l e i ca c i d b a s ep a i r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t h eg e n o m ed a t a b a s e p r o t e i nk e t h i d i u mb r o m i d e d e o x y 曲o n u c i e o s i d et r i p h o s p h a t e t r i s h y d r o x ym e t h l a m i n o m e t h a n e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t a t e a g a r o s e a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s o p t i c a ld e n s i t y s t a n d a r de r r o r p o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o nc o n t e n t 1 0 b u a f t e r 中文全名 线粒体d n a 脱氧核糖核酸 碱基对 聚合酶链反应 基因组数据库 蛋白酶k 溴化乙啶 脱氧核糖核苷三磷酸 三羟甲基氨基甲烷 乙二胺四乙酸 琼脂糖 琼脂糖凝胶电泳 光密度 标准误 多态信息总量 p c r 缓冲液 重庆医科大学硕士研究生学位论文 头发m t d n a 4 9 7 7 b p 缺失与年龄的关系研究 摘要 目的：研究头发m t d n a 4 9 7 7 b p 片段缺失与人群年龄的关系，建立 相关方程，以期在微量物证中寻找更多的信息，为分子水平构建犯罪 分子特征提供更多的可能。 方法：按中国人口自然分布规律，随机剪取5 4 名汉族健康志愿者 的头发若干，各取4 根用无水乙醇清洗、蒸馏水漂洗后，自然风干，从 近毛囊部位截取1 5 c m ，剪成o 3 c m 左右的片段，放入o 5 m le p 管中， 加c h e l e x 一1 0 0 和蛋白酶k 消化抽提m t d n a ，用所设计的引物分别对 m t d n a 保守区和4 9 7 7 b p 缺失突变区进行聚合酶链反应( p c r ) ，若 4 9 7 7 b p 处不发生缺失，常规p c r 不能扩增正常约5 0 0 0 b p 的碱基，所 以没有产物，反之，可以扩增出线粒体片段缺失后相应遗留序列的p c r 产物。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，e b 染色后，在b i o r a d 紫 外凝胶成像仪扫描成像，确定其激光密度。以保守内参照区扩增产物 激光密度作为总量，缺失区扩增产物激光密度值作为缺失量，用缺失 量总量计算缺失率。 结果：2 5 岁以下几乎无缺失，缺失区很少扩增出产物，大于2 5 岁者缺失区逐渐可扩增出产物，且随年龄增长，相同条件下扩增产物 增多，4 9 7 7 b p 缺失率增大，各年龄段组问比较均p 6 5 岁组，遵循知情同意的原则，随机选择5 4 名汉族 健康志愿者，贴头皮剪取头发若干( 经前期实验证实，本研究所用提取方法在人 发毛干中可获得稳定且满足实验需求的m t d n a 量) 。各取4 根用无水乙醇清洗， 蒸馏水漂洗后自然风干待用。 1 1 2 试剂 ( 1 ) 引物： 3 条m t d n a 引物序列根据i k e b es i 等报道的方法设计，并经p r i m e r5 和 o l i g o6 严格检测和评价，证实无其他配对，能够保证产物的准确性。所有引物均 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下： p l ( n t8 1 7 1 8 1 9 0 ) ：5t g ct c tg a aa t ct g tg g ag c3 ： p 2 ( n t1 3 5 2 5 1 3 5 0 6 ) ：5c g a t g a t g tg g tc t tt g ga g3 ： p 3 ( n t8 4 0 2 8 3 7 8 ) ：5a t ta t g g t g g g cc a ta c g g t ag t a3 p l 为共用引物，引物p l 、p 3 位于4 9 7 7 b p 缺失的同侧，可扩增所有的m t d n a ， p 2 设计于4 9 7 7 b p 缺失的另一侧，在一般条件下，p 1 、p 2 仅能扩增己发生4 9 7 7 b p 缺 失的m t d n a 。 ( 2 ) 其他试剂 c h e l e x 一1 0 0 德国s i g m a 公司 1 0 p c rb u f f e r 上海生工生物工程有限公司 m g c l 2 上海生工生物工程有限公司 d n t p 上海生工生物工程有限公司 t a qd n ap o l y m e r a s e上海生工生物工程有限公司 8 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 k bd n am a r k e r t r i s 硼酸 e d t a n a 2 蛋白酶k 琼脂糖 溴酚蓝 e b 1 1 3 仪器 b c d 一4 3 8 w 普通冰箱 e l i x 型超纯水器 微量加样器 高速冷冻离心机 电子天平 u v 2 4 0 1 型紫外分光光度计 h e m a 4 8 0 型p c r 扩增仪 琼脂糖凝胶电泳仪 b i o r a d 紫外凝胶成像系统 超低温冰箱 超净工作台 实验耗材 9 天为时代生物公司 香港f a r c o 化学公司 重庆北碚化学试剂厂 成都化学试剂厂 上海生工生物工程有限公司 t a k a r a 公司 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 海尔集团 美国m i l l i p o r e 公司 法国g i l s o n 公司 上海安亭科学仪器厂 上海精天电子仪器有限公司 日本岛津 珠海黑马公司 美国b i or a d 公司 美国b i o - r a d 公司 日本s a n y o 电机株式会社 苏净集团安泰公司 上海生工生物工程有限公司 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 方法 1 2 1d n a 模板的制备 将各自清洗风干的头发4 根从近毛囊端截取1 5 c m ，剪成0 3 c m 左右的片段，放 入o 5 m l e p 管中，加c h e l e x 1 0 0 和蛋白酶k 提取d n a 1 8 】，方法见附录一。用紫外分 光光度计确定模板d n a 质量，显示均无蛋白质及r n a 污染。 1 2 2 p c r 扩增 1 2 2 1p c r 反应体系 p c r 反应体系总体积为2 0 p 1 ，将一个样本的模板d n a 各取5 1 a 1 分别加入两支 e p 管中，两管分别加引物p 1 、p 2 和p 1 、p 3 使引物终浓度为o 2 - - - 0 6 2 5 i ，t m o l l ， 其他相同均加1 0 b u f f e r2 0 9 l ，d n t po 7 h 1 ( 2 0 0 ) ，m g ”1 2 9 l ( 1 5m m o l l ) ，t a q p o l y m e r a s e0 6 9 l ( 3 u ) ，加超纯水至终体积2 0 a l ，液体石蜡油覆盖，阴性x , i - n 3 u j h 引物加相同体积的超纯水，其余相同，同置于p c r 扩增仪中。 1 2 2 2p c r 循环参数 9 5 预变性2 m i n ，9 4 变性4 m i n ，退火温度分别为5 3 5 7 。c1 m i n ，7 2 延 伸i m i n ，共2 5 3 5 个循环，最后7 2 延伸2 0 m i n 。 ( 1 ) 引物浓度 引物终浓度在o 2 、o _ 3 、0 4 、0 5 、0 6 2 5 9 m o i l 范围内选择，p c r 产物经琼脂 糖凝胶电泳判断最佳引物浓度。最佳引物终浓度为o3 9 m o l l 。 ( 2 ) 退火温度 退火温度选择范围为5 3 、5 4 、5 5 、5 6 、5 7 。c ，判断结果同引物浓度确定。最 佳退火温度为5 6 。 ( 3 ) 循环次数 p c r 循环次数在2 5 、3 0 、3 5 中选择，判断结果同引物浓度的确定。缺失区 p c r 循环次数3 5 个最佳。 其他条件的确定也同此方法。 1 0 重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 2 3 电泳分离 用0 5 t b e 做电泳缓冲液，取扩增产物5 9 l j j l 2 i _ t l 的载样缓冲液混匀上样，以l k b d n am a r k e r 做为判断标准，经1 5 琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色分离目的 条带。方法见附录二。 1 2 4p c r 产物定量 将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外凝胶成像系统成像，用b i o r a d 软件确定各条带的光密度。 1 2 5m t d n a 4 9 7 7b p 缺失定量检测 以内参照区扩增产物的激光密度值作为总量，缺失区扩增产物激光密度值作 为缺失量，用缺失量总量计算其缺失率。 1 3 统计学处理 实验数据用e x c e l 和s p s s 统计软件进行处理，用均数标准差( i s ) 表示， 各组间缺失率的差异比较用方差分析，相关性用相关回归分析。 2 结果 2 1p 佩条件的优化 经过反复摸索，各引物对进行p c r 的最佳实验条件为：引物终浓度为 0 3 9 m o l l ，退火温度为5 6 。c ，进行3 5 个循环，在与保守区扩增片段相同的p c r 条件下，缺失区可扩增出3 6 0 b p 的产物。 2 2 扩增结果 p c r 产物经凝胶密度扫描检测， 4 9 7 7 b p 缺失突变的m t d n a ( d ) 量 引物p l 、p 2 扩增产物为3 6 0 b p ，代表包含有 p l 、p 3 扩增产物为2 3 0 b p ，代表总m t d n a 1 1 重壅堕型查兰堡主里壅生兰垡堡苎一 ( t ) 量。结果显示，所有标本在2 3 0 b p 处均有明亮清晰的条带，表明d n a 模板 质量良好( 见附图1 ) ，随着年龄的增长，相同扩增条件下3 6 0 b p 处逐渐有清晰条 带( 见附图2 ) ，经对各组电泳结果的凝胶密度扫描，对比各组的m t d n a 4 9 7 7 b p 缺 失率。 2 3m l d n a 4 9 7 7 b p 缺失与年龄的关系 2 3 1 各组m t d n a 4 9 7 7 b p 缺失率的比较见表1 表1 各年龄段m t d n a 缺失率的比较 t a blt h ep e r c e n t a g eo f d e l e t e dm t d n ae v e r yg r o u p g r o u pa g e nd td i 一一一一一 1 1 5 2 4 7o o3 2 1 3 4 0 8o o 2 5 3 4 l o4 2 7 o 3 7 3 2 9 3 3 6 8o 1 3 0 0 2 3 5 4 48 8 4 4 _ + 0 7 43 3 4 8 5 3 4 o 2 6 o 0 3 4 5 5 4 1 01 5 4 4 2 9 0 4 1 5 7 - - + 5 6 2o 3 6 0 1 0 5 5 5 6 49 2 05 0 + _ 2 2 04 2 3 5 6 0 o 4 9 o 0 8 6 6 51 02 47 8 1 9 0 3 6 9 7 3 0 9o 6 8 o 0 8 用s p s s l l 0f o rw i n d o w s 统计软件，采取方差分析，p = o 0 0 0 1 ，再经l s d 两 两比较，相邻组问均p 0 0 5 ，相间隔组间均p 6 0 ，2 3 0 b pd n af r a g m e n t sa r ec l e a ri na l lg r o u p sd i s p l a yt h ed n a e x t r a c t i n gs t a b l y l a n e8 ：n e g a e t i v ec o n t r 0 1 重庆医科大学顿士研究生学位论文 精糟2 缺失区妒增鼯幕 l ：m a r k e r ；2 ：1 组；3 ：2 组；4 ：3 组；5 ：4 组；6 ：5 组；7 ：6 组； 8 ：阴性对照 2 7 蠡t 3 6 0 b p 处遥渐蠢清晰的每带，；l 耱p 1 、i 2 扩增包舍4 9 7 7 b p 缺失的m t d n a , 表包龠4 9 7 7 b p 缺失的m t d n a 砖羹，表昵垂霸辩扩增奈件下，糖警鼙增长，4 9 7 7 h p 缺失增多。 f i g 2 t h ep c rp r o d u c t so f d e l e t e dm t d n a w i t hp l 、i 2p r i m e rp a i r m o r ea n dm o r ep r o d u c t sa p p e a ra t3 6 0 b ps p o t , t h ef r a g m e n ti sc l e a r e ra n dc l e a r e r , i n d i c a t i n gt h ed e l e t e dm t d n a 重庆医科大学硕士研究生学位论文 c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ep e r c e n t a g eo fd e l e t e dm t d n aa n da g e 附图34 9 7 7 b p 缺失与年龄关系的散点图 年龄与m t d n a 4 9 7 7 b p 缺失之间有直线相关趋势，可以进一步做直线相关与回归分析用 s p s s l l 0 统计软件分析得相关系数r = 0 9 s i r e = 0 9 6 , p = 0 0 0 0 ) ，并建立如下回归方程： a g e - - 0 7 4 ( 士- 0 0 2 ) x d m t d n a + 2 1 0 3 ( 圭o s o ) 其中d m t d n a 即为缺失4 9 7 7 b p 的m t d n a 占总m t d n a 的百分率。 f i 9 3 t h es c a t t e r f i g u r eo f c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e p e r c e n t a g e o f d e l e t e d m t d n a a n d a g e l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i so f t h ed a t ap r o d u c e dar e g r e s s i o ne q u a t i o nw i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to f r = 0 9 8 ( r z = 0 9 6 , p = 0 0 0 0 1 t h ep r o p o r t i o no f d e l e t e dm t d n a c a nb ei n s e r t e d i n t ot h ef o l l o w i n gf o r m u l ai no r d e rt or o u g h l yc a l c u l a t e t h ea g e a g e - - 0 7 4 ( - i - 0 0 2 ) x d m t d n a + 2 1 0 3 ( + 0 8 0 ) d m t d n ai st h ep e r c e n t a g eo f 4 9 7 7 b pd e l e t e dm t d n a 重庆医科大学硬士研究生学位论文 附录 附录一 c h e l e x - 1 0 0 法提取头发d n a 一、试剂配方 1 c h e l e x 一1 0 0 悬浊液 c h e l e x - 1 0 0 5 9 双蒸去离子水定容至l o o m l 2 蛋白酶k 蛋白酶2 5 m g 双蒸去离子水定容至l m l 二、操作程序 1 将各自清洗风干的头发4 根从近毛囊端截取1 5 c m ，剪成0 3 c m 左右的片段， 放入05 m l e p 管中。 2 加入1 0 0 9 1 5 c h e l e x 一1 0 0 溶液，蛋白酶k 5 9 l ，震荡混匀，置5 6 。c 水浴消化4 5 分钟，剧烈振荡。 3 1 0 0 。c 沸水浴8 分钟，剧烈振荡，使蛋白变性。 4 4 0 0 0 r p m 离心3 分钟，上清液用于p c r 反应或置于一2 0 。c 冰箱保存。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 附录二 琼脂糖凝胶电泳体系 一试剂配制 1 5 t b e 电泳缓冲液配制 t r i s2 6 9 9 硼酸1 3 9 5 9 e d t a - n a 21 8 6 9 加双蒸去离子水至5 0 0 m l ，充分溶解，作为母液保存，用时稀释。 2 载样缓冲液： n a o h10 m m o l l 甲酰胺9 5 溴酚兰0 0 5 二甲苯腈兰f f0 0 5 3 溴化乙锭( 1 0 m g m l 溶液) ( 母液) 称取l g 溴化乙锭 n x 1 0 0 m l 水中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然 后转移至棕色瓶中，保存于室温。用时取适量稀释成o 5 p _ g m l 。 溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶液时务必戴 上手套，称量染料时要戴面罩。 二、操作方法 电泳操作步骤 ( 1 ) 取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成 约8 c m 高的挡墙。要确保严密，以免制胶时有胶液漏出。 ( 2 ) 将梳子插入到胶床上小凹槽内。梳子平面要和胶床底面垂直，梳齿前端和胶床 底面有l r a i n 的间隙。 ( 3 ) 将胶床放在调整好的水平台面上。 ( 4 ) 取适量按需要稀释的电泳缓冲液( o5 t b e ) 加入到洗净的三角瓶中，再加入一定 重庆医科大学硕士研究生学位论文 量的琼脂糖粉末( 0 2 3 9 ) ，轻轻摇动三角瓶，使琼脂糖粉微粒呈均匀悬浊状态，瓶内 溶液应只占容器容积的1 3 1 2 为宜，用保鲜膜或铝箔纸封盖，且应留有小缝隙 或穿刺2 3 个小孔，以便加热时水蒸气逸出。 ( 5 ) 用微波炉加热使琼脂糖熔化。在使用微波炉时，应控制好时间，先加热2 0 s ，取出 振摇几秒后，再放入加热2 0 s 。有时加热到一定时间会突然产生气泡，使琼脂糖沸 逸出来，所以应随时观察熔化情况。 ( 6 ) 熔化的琼脂糖自然冷却到6 0 。c 时，加入0 5 u g m l 的e b 进行凝胶染色( 戴手套操 作) 。轻轻摇动三角瓶，将溴化乙锭与琼脂糖混合均匀后，倒入已准备好的胶床内， 凝胶浓度为1 5 。 ( 7 ) 室温下静置o 5 小时左右，凝胶固化后，撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶 床置于电泳槽中。 ( 8 ) 向电泳槽中加入电泳缓冲液( o 5 ) ，缓冲液的量以超过凝胶表面1 2 m m 为宜， 加入的电泳缓冲液应与配制凝胶所用的缓冲液相同，否则因离子强度或p h 不一致 而影响核酸的泳动。 ( 9 ) 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子，使原梳齿处因缺如凝胶而形成的样品孔自然充 满缓冲液，如发现样品孔内有残留气泡，应设法去除( 如用注射器吸除) ，以免加样 时样品随气泡散溢。 0 0 ) 在待电泳分析的核酸样品中加入约为样品体积1 4 的上样缓冲液，用加样器轻轻 混合均匀，并以低转数离心5 秒钟，使其全部汇集于试管底部。 n d 用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样器吸头要轻贴样品孔 壁，但不能碰坏i l 壁，否则电泳条带不整齐，因混有上样缓冲液，样品比重变大， 加样后带有溴酚蓝颜色的样品应缓缓沉于样品孔底。每加完一种样品应更换一个 吸头，以避免交叉污染。d n a 的参比物( m a r k e r ) 应该加在两侧的加样孔内。 在样品全部加完后，开始电泳前，应检查一次凝胶放置是否正确，即确认凝胶 的样品孔一端为负极。确认后可接通电源，选择适当的电压，开始电泳。几分钟 后，见到溴酚蓝指示剂向正极移动，表示电泳正常。根据样品分子质量大小、凝 胶浓度来决定电压和电泳时间。 ( 1 3 ) 根据指示剂迁移的位置判断是否终止电泳。如可以终止，则切断电源，取出凝 胶。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 ( 1 4 ) 将取出的凝胶置于b i o r a d 紫外凝胶成像分析系统，该系统装置的数码摄像镜头 可采集荧光信号后转换成数字信号，再经计算机处理，即可在屏幕上呈现电泳结 果图像。运用系统自带分析软件，设置需要参数，分析图像中目的条带的激光密 度值。 注意：在制备凝胶时，应对样品d n a 的片段大小有所了解或粗略的估计，以决定 应制备凝胶的浓度。再根据样品的情况考虑需制备凝胶的多少，最后计算出要向 三角瓶中加入琼脂糖粉的量。 重庆医科大学硕士研究生学位论文 文献综述 线粒体d n a 推断年龄的研究进展 郭燕丽综述，万立华审校 f 摘要】线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i a ld n a ，m t d n a ) 是惟一的核 外遗传物质，是人体的动力工厂，近年来研究发现m t d n a 的损伤会在 生命过程中累积，与年龄有相关性。深入研究并将m t d n a 的损伤程度 应用于法医学中的年龄推断将有重要意义。本文将对m t d n a 推断年龄 的研究进展作一综述。 【关键词l 线粒体d n a ，年龄推断 p r o g r e s s i o no na g e - a s s o c i a t e di n j u r ei nm i t o c h o n d r i a ld n a g u oy a n - l i ，w a nl i h u a ( d e p a r t m e n to ff o r e n s i cm e d i c i n e ， c h o n g q i n gu n i v e r s i t yo fm e d i c i a ls c i e n c e s ，c h o n g q i n g4 0 0 016 ，c h i n a ) 【a b s t 瑚州m i t o c h o n d r i a ld n a i st h eo n l yg e n e t i cm a t e r i a l so u to f n e c l u e s ，t h ei n j u r yo fi ti sw e l lk n o w nt oa c c u m u l a t ei nv a r i o u st i s s u e sw i t h a g e i t ss i g n i f i c a n tt of u r t h e ri n v e s t i g a t ea n dt h e na p p l yi tt oe s t i m a t i o no f t h ea g ea tf o r e n s i cp r a c t i c e f k e yw o r d s lm i t o c h o n d r i a ld n a ，a g e ，f o r e n s i cm e d i c i n e 年龄推断是法医学个体识别中的主要内容之一，目前主要运用人 类学的方法，例如：耻骨联合形态，牙齿磨耗程度等来推断硬组织年 龄川。实践证明，人类学方法已经比较成熟。但在目前犯罪手段日益精 2 9 重庆医科大学硕士研究生学位论文 细化，遗留现场物证微量化的情况下，推断软组织检材，如现场毛发、 唾液、血痕等还是难题。自线粒体d n a 氧化损伤在生命过程中累积的 现象被发现后，由于线粒体具有的自身特点及其在生命活动中的重要 作用，使得m t d n a 在细胞遗传学、分子遗传学，法医学等领域受到了 广泛重视。有学者提出通过线粒体d n a 损伤程度来解决微量物证年龄 推断这一难题，并做了很多相应的探索性研究【2 堋，取得了一定成绩， 为其在法医学上的应用提供了依据。 1m t l l n a 的遗传特点 线粒体d n a 是由1 6 5 6 9 b p 组成的呈闭环双链结构的核外惟一的遗传物质。其 主要特点如下：( 1 ) 母系遗传。( 2 ) 拷贝数多，每一个细胞中含有成百上千个拷 贝。( 3 ) 异质性，即指同一个线粒体、同一细胞或同一个体内存在两个或两个以 上的m t d n a 亚群。它包括点异质性和长度异质性。( 4 ) 进化速度快，突变率高。 由于m t d n a 裸露于氧化磷酸化环境中，无组蛋白保护，复制错误率高，缺乏必要 的修复机制，突变率较核d n a 高5 1 0 倍。( 5 ) 复制分离现象：细胞分裂时m t d n a 随机进入子代细胞中，可使突变型和野生型发生分离，子代细胞可拥有不同比例 的突变型m t d n a 分子口l 。分裂旺盛的细胞如血细胞往往向野生型m t d n a 发展， 而分裂不旺盛的细胞如肌肉组织则出现突变m t d n a 的逐渐累积，因而这一过程中 也可能存在一定的选择机制( 8 】。( 6 ) 阈