（发酵工程专业论文）粘细菌stigmatella+wxnxjb产生新型抗肿瘤抗生素的研究.pdf

摘要 摘要 i i l l i | | | | 1 1 1 i | f i i | i l i f l | | 删l l | 1 1 洲佣 y 18 2 9 6 6 9 粘细菌是一类具有群体习性和复杂发育史的、革兰氏阴性单细胞的滑行细菌的总 称。粘细菌能产生很多具有生物活性的化合物，这些化合物具有结构新、种类多、作用 机制多样等特点，为新药的筛选提供了很好的微生物资源，因此关于粘细菌生物活性物 质的研究工作日趋受到重视。本文对本实验室保存的w 舢b 菌株进行生理生化特征 鉴定并分类；检测其产生的挥发性物质，并对其生长条件进行了优化；以小鼠黑色素瘤 b 1 6 细胞为模型，对其产生的高活性代谢产物进行分离、纯化和鉴定；并以其为主要目 标，对w 叮) ( j b 菌株摇瓶发酵条件进行了优化；分析w ) q 叮x t b 产生的活性物质对肿瘤 细胞和正常细胞的毒性以及探索体外对肿瘤细胞的凋亡机理。 对w x n x ，b 菌落形态和生理生化特征进行观察，把所得到的结果与伯杰氏细菌 鉴定手册( 第八版) 比较，鉴定此菌为标桩菌属( 枷 口绝砌够) ；采用s p m e g c m s 方 法对菌体产生的挥发性物质进行鉴定，w 叮x j b 菌主要产生酮类和杂环类化合物；以 菌体生物量为目标，采用单因素和正交实验优化了菌株的生长条件，最佳生长条件和培 养基为：麦芽糖8g l ，酵母粉6g l ，胰蛋白胨6g l ，d 一葡萄糖酸钠5g l ，c a c l 2 1 5g l ， m g s 0 4 0 5g l ，初始p h 为7 0 ，培养温度为2 8 。 采用m t t 法评价活性代谢产物的细胞毒性和对外界环境的稳定性。结果表明 & f j 聊口纪砌w 、x t b 所产生的活性物质对b 1 6 细胞、人肝癌细胞h e p g 2 和人乳腺癌细 胞d m a m b 2 3l 有很高的活性，在不高于7 0 的条件下活性物质稳定，对自然光和紫 外光不敏感，在p h 3 1 0 时较稳定。对代谢产物进行定性分析发现树脂提取液中主要含 有甙类、甾体类、生物碱类和内酯类物质。 以b 1 6 肿瘤细胞系为模型，采用液液萃取、葡聚糖凝胶s e p h a d e xl h 2 0 柱、低压 c 1 8 柱和h p l c 分离、纯化和制备等手段分离纯化出一高活性物质，通过对其n m r 、 l c 门订s 、m a l d i t o fm s m s 、双和u v 等图谱的解析，确定其分子量为4 3 5d a ，化学 式为c 2 9 h 2 5 n 0 3 以及结构式为： 根据习惯命名法、系统命名法，并参考国际惯例，给出了化合物c 2 9 h 2 5 n 0 3 的俗名 ( q u i n o x 址o n e ，喹乐霉素) 和系统名称( 1 6 r - 5 - ( 6 - b e n z y l q 血1 0 l i n _ 3 一y l i i l e t l l y l ) 一6 - p h e n y l 3 ，7 d i o x a - b i c y c l o 4 1 0 】h 印t a l l 3 o n e ，5 ( 6 苯甲基喹啉3 基甲基6 苯基3 7 二氧 双环 4 1 o 】庚烷3 酮) 。通过教育部科技查新文献检索中心华东理工大学站对喹乐霉素 的名称、结构、性质以及研究现状进行了查新工作( 查新号为2 0 1 0 3 6 0 0 0 l 0 6 0 0 0 1 ) ， 未发现具有相同结构的物质被报道。 摘要 对握册口纪妇w 叮x j b 产喹乐霉素的发酵条件进行优化。优化后的最佳条件为培 养时间6 天，接种量8 ，温度2 8 ，装液量8 0i 洲5 0 0m l ，p h 为6 5 ；考察了无机 离子、铵盐与磷酸盐、前体物质、氨基酸对喹乐霉素发酵的影响，结果表明c a 2 + 、m 9 2 + 、 z n 2 + 、c 0 2 + 和n a + 有促进作用，l i 2 + 有抑制作用，铵盐不高于2g l 具有促进作用；磷酸 盐不起作用；0 4g 几乙酸钠和o 8g l 丙酸钠分别可以提高至9 0 5 1 5 “g l 和8 7 8 4 2 斗g 几； 适量的乙醇、乳酸、异丙醇、异戊醇、色氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和谷氨酸有促 进作用；缬氨酸对喹乐霉素的合成有抑制作用。 采用p 1 a c k e t t b 咖a n 设计法筛选出培养基中脱脂奶粉、m g s 0 4 7 h 2 0 和葡萄糖对喹 乐霉素的产量影响较大；采用b o x b e h n k e n 实验设计优化出三个影响因子水平：葡萄糖 5 1 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 8g l 和脱脂奶粉7 9 2g l ，在这个条件下喹乐霉素的产量可达 到1 2 0 5 0 8p g l ，比优化前提高了5 9 6 9 。同时通过对大孔树脂的静态吸附实验，筛选 出对喹乐霉素吸附效果较好的d 1 0 1 树脂。 体外毒性实验表明，喹乐霉素对b 1 6 、h e p g 2 、c t 2 6 和d m a m b 2 3 1 肿瘤细胞系 都有很强细胞毒性，对这四种肿瘤细胞的i c 5 0 分别为2 4 1 、5 4 、2 8 3 、1 7 8 “g m l 。与 对照1 奴0 1 和e p o t l l i l o n eb 相比，其毒性与1 l 觚o l 相近；喹乐霉素对正常小鼠的脾脏细 胞的毒性较低( i c 5 0 7 0 0p 鲈n l ) 。因此，喹乐霉素是选择性地作用于细胞。 b 1 6 细胞被不同浓度的喹乐霉素处理2 4h 后于倒置显微镜下，可见b 1 6 细胞数量 减少，形态变圆：扫描电镜观察到b 1 6 细胞表明大量微绒毛消失，并可见细胞表面出泡 以及凋亡小体的形成；荧光电镜下b 1 6 细胞核皱缩，细胞核荧光呈颗粒状或片絮状，可 见致密强荧光。研妊l a d d e r 电泳结果显示b 1 6 细胞的聊蛆呈梯度，含有1 8 0 2 0 0b p 整数倍的寡核苷酸片段。采用流式细胞仪检测碘化丙啶单染色的b 1 6 细胞周期发现，喹 乐霉素主要将肿瘤细胞阻滞在s 期和g 2 m 期，阻止细胞分裂和进入细胞增殖周期，导 致b 1 6 肿瘤细胞凋亡。b 1 6 细胞经过碘化丙啶和罗丹明双染后，流式细胞仪检测发现， 喹乐霉素在不影响细胞膜完整性的情况下，导致b 1 6 细胞的线粒体膜电位甲m 下降， 促使细胞凋亡；通过检测b 1 6 细胞凋亡相关基因蛋白的表达，结果表明喹乐霉素上调 p 5 3 蛋白、b a ) 【蛋白和c 2 l s p a s e 3 蛋白、下调b c l 2 蛋白，从而诱导b 1 6 细胞凋亡。 关键词：咖口纪砌w 删- b ，挥发性成分，分离纯化，喹乐霉素，优化，凋亡 a b s 仃a c t a b s t r a c t t h em y x o b a c t e r i aa r ec o l o n yd e v e l o p ，c o m p l e xl i f e c y c l e ，g r a m _ n e g a t i v e ，出i d i l l g m o v e m e ma i l du 1 1 i c e u u l a rb a c t e r i a 、衍t hr o d s h a p e dv e g e t a t i v ec e l l s t h e yp r o d u c eb i o a c t i v e s e c o n d 暑町m e t a b o l i t e s 吐l a ti i lb i b “t h e 星，o w t l lo fo t h e ro r g a l l i s m sa r l ds o m en m 】o r s d u et 0 m e i re x 廿a o r d i r 瑚了a b i l i t ) rt op r o d u c en o v e lc l a l s s e so fs e c o n d a r ym e t a b o l i t e s ，m y x o b a c t e r i a a l _ ea ni m p o r t 趾tr e s o u 】陀et oc h o o s en e wd n l g s m a n yr e s e 扣- c h e ra t t a c h e d 油p o i r t a n c et ot 1 1 e 殉】d yo ft h es e c o n 也町m e t a b o l i t e s 仔o mm em y x o b a c t e r i a h 1t h i s 阳l d y ，血e 咖i i l w x n x ，bp r e s e r v e d 洫t h ela _ bw 勰i d e n t i f i e da c c o r d i n gt 0i t sp h y s i 0 1 0 9 i c a la i l db i o c h 触i c a l c l 胁c t e r i s t i c sa i l db e 玛e y sm a l l u a lo fs y s t 锄a t i cb a c t e r i 0 1 0 9 ) ，( 8 m e d ) n sa b i l 埘t op r o d u c e v 0 1 a t i l i t yc o m p o w l d s 龇1 d 盯o w t l lc o n d i t i o nw e r es t u d i e d b a s e do nb i o a c t i v ee v a l 删i o n 研m t h em o d e lo fb16t u m o rc e u1 i n e s ，吐1 es t r o n gb i o a c t i v es u b s t a i l c ep r l ) d u c e db yw 、j b w e r ei s o la ：t e d ，p u r i e da n di d e n t i f i e d t h ec u l t u r ec o n d i t i o no f 1 es 1 口陷i 1 1 、7 i r a so p t i i n i z e dt o i n c r e a s et h eb i o a c t i v es u b s t a l l c ep r o d l l c t i o na i l dt h em e c b a n j s mo f 锄t i t u m o rw 弱a 王s o 蛔v e s t i g a t e d c o m p a r e d 研也也ed e s c r i p t i o no fb e r g e y sm a n u a lo fs y s t e m a t i cb a c t e r i o l o g y ，删 j - b 郴i d e n t i 丘e da ss t i 舯a t e l l ag e n u sa c c o r d i n gt 0t h es 缸伍nc l o n ea n dt h ep h y s i o l o 百c 出 a 1 1 db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s t h ev o l a t i l ec o m p o n e n t sp r o m l c e db yw x n x ，bw e r e d e t e c t e da n di d e m i 丘e db yu s i l l gs p m 巳g c 门订sa 1 1 d 吐圮啦a i l lm a i l d yp r o d u c e dk e t o n ea n d h e t e r o c y c l i cv o l a t i l ec o m p o u n d s t h ec m t u r ec o n d i t i o nw 弱o p t i i i l i z e dt 0i 1 1 c r e a s et h ec e u w e i g h tb ys i l l g l ef i a c t o re x p e r h n e n ta 1 1 do h o g o r l 2 l le x p e r i m e n t t h eo p t i 玎缸z e dr e s l l l t sw e r e s h 0 、v e da sf o l l o w s ：i n m t o s e8g l ，y e a s tp o 、e r6g l ，p e p t o n eo f6g l ，d - s o d i 眦g h l c o m 【t e5 g l ，c a c l 21 5g l ，m g s 0 40 5g l ，证t i a lp h7 o ，血u b a t h l gt e n l p e r a l 珊e2 8 。 倒1 em e t a _ b o l i t e s 五m 蜘砒l l 肠w x n x j bh a ds 旬n gc y t o t o 】( i c i 锣t 0n 1 0 u s e m e l a n o m ac e l ll i l l e ( b16 ) ，h 啪a nl i v e rc a r c 协o m ac e l l sl i n e ( h e p g 2 ) a n db l 】m a nb r e a s tc a 口c c r c e l l sl i i ：l em i a m b 2 31 ) n l ea i l t i t u m o rb i o a c t i v 岫0 nb16c e l ll i n ed i dn o to b v i o l l s l y c h a n g ew h e nt h et e i n p e r a t u r ew a s1 0 、张r7 0 ，p hw a si 1 1 也er a l l g e 自o m3t o1 0a n d 也e m e t a b o l i t e sw e r e 仃e a t e d 、析t l ld a y l i g h ta n du l 仃a 啊o l e tl i g h td u 一玎g1 2h t h em e t a _ b o l i t e s a d s o r b e db yx ad 16r e s i i lp r o b a b l yc o n t a j n e dalk ai o i d s ，l a c t o n e s ，9 1 y c o s i d e sa i l ds t e r o i d s c o n l p o n e n t sb yq u a l i t a t i v ea i l 2 l l y s i se x p e r i i 】1 e n t i s o l a t e da n dp u r i 丘e db y1 i q u i d l i q u i de x 臼a c t i o 玛s e p h a d e xl h 一2 0a n dc 1 8c o h n n c h r o m a t o 铲a p h y ，a 芏1 dp r e p a r e dh p l c ，ac o m p o u n d 、弱o b t a i n e df i r 谢1 y t h e nt 1 1 es 饥i c t l l r e a i l a l y s i so f t 1 1 ec o n l p o u n d 、弱趾a l y z e db yu vl c m s ，m a l d i t o f m s m s ，取a n dn m r s d e c 廿a s t h er n o l e c u l a r 、e i g h tw a s4 35d aa n dt h em o l e c u l a rf 0 衄u l aw 弱c a l c l l l a t e da s c 2 9 h 2 5 n 0 3 t 1 1 e ni t ss 订u c t u r ew a sm a d eo u t a 6 s 纽c t h ep o p u l a rn 锄ea n ds y s t e m i cn a m eo fc o m p o u n dc 2 9 h 2 5 n 0 3 、e r eq u i r l o x a l o r 地， 1 r 6 r 一5 ( 6 - b e n z y l - q u i n o l i l l - 3 一y l m e t l l y l ) 一6 一p h e n y l - 3 ，7 - d i o x a - b i c y c l o 4 1 o h e p t a n - 3 一o n e ， r e s p e c t i v e l y n 、v a san 0 v e lc o m p o u i l dw l l i c hw a sc o 硼m e d 晰mh 1 v e s t i g 池gn o v e l r 印o r t b ys t a t i o no fs c i e n c ea n dt e c l l l l 0 1 0 9 yo fe d u c a t i o no fm 证s t e r ，e a s tc l l i l l au n i v e r s 姆o f s c i e n c ea n dt e c h i l o l o g ) r ( n o 2 010 3 6 0 0 0 l 0 6 0 0 0 1 ) t h ec o n d i t i o n sw e r eo p t i 血z e dt oi n c r e a s e 也eq u i l l o x a l o n ey e l dd u 咖g 册劬口胞砌 w x n x t bf e n n e n t a t i o n t h er e s l l l t ss h o 、e da sf o l l o w i l l g ：i n c u b a t i l l gt i i n eo f6 d a y s ， i i l o c u l u lc o n c e n t r a t i o no f8 ，t e m p e r a t u r eo f2 8 ，v 0 1 u i n ec o n t e n to f6 0m l 5 0 0m l ， i 1 1 i t i a lp ho f6 5 t h ee f f e c t so fi 1 1 0 r g a 血cs 越t s ，a m 加0 1 1 i 啪a 工1 dp h o s p h a t es a l t ，p r e c u r s o r sa 1 1 d 孤m n 0a c i d st 0q u i i l o x a l o n ey i e l dw e r em e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt 1 1 a tc a 2 + ，m g z + ，z n z + ， c o 计2 l r l dn a 十c o u l di n c r e a s e 铂1 eq u i n o x a l o n ey i e l d ，b u tl i z + w a so p p o s i t e a m m o 血啪 c o n c e n t r a t i o nn oe x c e s s2g lc o u l di 1 1 c r e a s eq 曲加x a l o n ey i e l d ，b u tt h cp h o s p h a t ec o m d i 1 1 h i b i t e dt h e 姐e l d s o d i 啪a c e t a t e ( o 4g l ) 锄ds o d i u mp r o p i o n a t e ( o 8 9 l ) i 1 1 c r e a s e dt h e 姐e l dt 09 0 5 15p g la i l d8 7 8 4 2p g lr e s p e c t i v e l y ac e n a j i lc o n c e 姗眦i o no fe t h a n o l ，l a c t i c a c i d ，i s o p r o p a l l o l ，i s o a m y la l c o h o l ，t r y t o p h a l l ，t ) ，r o s i n e ，“弛e ，m e t h i o n i n ea n d9 1 u t a m a t e c o l l l ds t h n u l a t em ep r o d u c t i o n ，b u tv a l mc o m di 出b i t 眦 p l a c k e t t b 眦l a l ld e s i g nw 弱u s e dt 0s c r e e nt l l e s i 嘶f i c a n t f a c t o r s i 1 1 n u e n c i l l g q u i n o x a l o r l ep r o d u c t i o ni 1 1m e d i 啪，i t l ls t a t i s t i ca n a l y s i s ，廿1 es i g 面f i c a mf 缸o r s 、e r es l 【i m n l i l k ，m g s 0 4 7 h 2 0a 1 1 dg l u c o s e r e s p o n s es u r f a c em e t l l o d o l o g y ( r s m ) 、v a su s e dt 0o p t 砌z e m e 曲r e ec r i t i c 2 l lf i a c t o r sm 脚1 t i o r 圮da b o v e ，a 1 1 dt h er e s u l ts h o 、e dm a tt ：h e o 口t i m a i c o n c e 腑a t i o n so f 也e t o r sw e r ed e t 锄血e da s ：s k i i i lm n k5 1 2g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 8g l a n dg l u c o s e7 9 2g l u n d e rg u c hc o n d i t i o l l s ，t l l em a x n 啪q u i n o x a l o n ey i e l d 、a s1 2 0 5 0 8 “g la c t u a l l y ，w 1 1 i c h 、v a s5 9 6 9 h i g h e rm a l lm a tb e f o r eo p t i m 场| 】g t h em a c r o p o r o u s a d s o 印t i o nr e s i l l s 、r ei i e s t i g a t e da 1 1 dd 1o1r e s i i lw a ss e l e c t e dt oa d s o r bt 1 1 eq u i i l o x a l o n e 丘o m 也ec u l t u r eb r o m a c c o r d i l l gt ot l l es t a t i ca b s o 印t i o ne x p 痂e n t q u i n o x a l o n es h o 、e ds 的n ga n t i - t u l ：i l o rb i o a c t i v 毋t 0b 16 ，h e p g 2 ，d m a m b 2 31a n d m u r i i l ec o l o nc a r c i 工1 0 m ac t 2 6c e ul i i l e sf 以v f 加t 1 1 ev d u eo fi c 5 0w e r e2 4 l ，5 4 ，2 8 3 ，1 7 8 p g 1 n lo na b o v ef o l l rt u m o rc e u1 i n e sr e s p e c t i v e l y c o n l p a r e dw i t ht h et v 旧p o s i t i v ec o n 拄o l s 1 叙o la n de p o t l l i l o 鹏b ，t h ec y t o t o x i c 时o fq u i n o x a l o n ew 鹤t h es i 工血1 a r 嬲1 觚0 1 t h c c y t o t o x i c 时t 0m en o 瑚mm o u s es p l e e nc e l l s 、a sl o wa i l di c 5 0 、弱a b o v e7 0 0 烬m l s o ， q u i i l o x a l o n es e l e c t i v e l yi m b i t e d 也eg r o w t l lo f t l l l l l o rc e l l l1 妇s 1 ks no fb16c e l l s 谢t 1 1 妣a t e db yq u i n o x a l o n e 、v 懿d i s t i n c t l yd e c r e a s e dn l a n 廿1 c c o n t r o la n dt 1 1 e s h a p eb e c 锄er o u r l db yp h a s e c o n 位哦e d 而c r o s c o p e s c a i 】i l i n ge l e c 臼o n n l i c r o s c o p ep h o t o ss h o w l e d 虹蚍吐l em o s to f 啊l l u so fb 16c e l l sd i s a p p e a r e da t l l i g h e r c o n c e n t r a t i o n _ sa n dt 1 1 es u 时i a c eo fm e m b r a n ew 弱s i n o o t ha 1 1 ds “n k a g e ，e v e nt 0f o r m a p o p t o t i c b o d i e s t h e 印o p t o t i c c h a r a c t e r i s t i c i i l c l u m n g m k l e a r c r i r l l p l e ， c 1 1 】o m a t i i l c o n d e n s a t i o l l ，n u c l e a r仔a 鲫e m a t i o na i l dc o i n p a c t b l u cn u o r e s c e n tw e r eo b s e r v e d b y n u o r e s c e n t 面c r o s c o p e n u c l e a rd n a o fb16c e l l ss h o w e dl a d d e rp a 位e ma n d18 0 - 2 0 0b p 丘a g m e n tb ya g a r o s eg e le l e c 仃o p h o r e s i s b yf l o wc y t o m e 仃ya n a l y s i sa n ds t a i m n g 、杌mp i ， b16c e l lp r o l i f e r a t i o n 、v a ss t o p p e db e c a u s eb16c e nc y c l e 、v a sa 仃e s t e da tsp h a s ea n dg 2 m p h a s e t h eq u i n o x a l o n ed r o p p e di x l i t o c h o n “a l仃a n s m e n l b r a n ep o t e n t i a l( 、壬，m ) i n 讹a 恤e n t - i i l d u c e da p o p t o s i s 耐也o u tc h a n g i n gp l a s m am e m b r a l l ep e m l e a b i l i 哆i nb16c e l l sb y a b s 仃a c t f l o wc y t o m e t r ya 1 1 a l y s i sa i l ds 切埘n g 晰t l lp ia 1 1 dr h12 3 f u n h e rr e s e a r c hr e s u l t ss h o w e d 缸t t h e 印o p t o t i cm e c l l a 血s mo fb 16c e l l si n d u c e db yq u i n o x a l o n ew 韶a s s o c i a t e dw m lad e c r e 2 l s e i nb c l 一2 p r o t e 虹a i l du p 伊a d i i l gt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fp 5 3 ，b a xa n dc a s p a s e 一3b y i m l u r l o c y t o c h e m i c a ls t a i l l i l l g k e y w o r d s ：r n y x o b a c t e r i 如受握即口把砌w 燃j b ， v o l a t i l e c o r n p o n e 鸡 i s o l a t i o na l l d p u r i f i c a t i o 玛q u i i l o x a l o l l e ，o p 血i l i z a t i o n ，a m i 一咖r ，印o p t o s i s v 目录 目录 摘要i a b s 乜a c t i i i 目录。i 第一章绪论1 1 1 粘细菌的发现及分类1 1 2 粘细菌的生物学特征2 1 2 1 粘细菌的生态3 1 2 2 粘细菌的生活周期4 1 2 3 粘细菌的分离4 1 2 4 粘细菌的菌落和共生4 1 2 5 基因组5 1 2 6 粘细菌噬菌体和粘菌素5 1 2 7 子实体5 1 2 8 溶解性行为和滑动行为6 1 2 9 大分子物质的降解能力7 1 3 粘细菌的生物活性物质。7 1 3 1 粘细菌产活性物质的特征8 1 3 2 粘细菌产生活性物质的作用机制1 0 1 4 粘细菌研究的国内外现状1 1 1 5 本课题研究的主要内容1 1 第二章粘细菌w 叮x j b 生物学特性及生长条件研究1 3 2 1 实验材料与仪器1 4 2 1 1 实验材料。1 4 2 1 2 实验仪器与设备1 4 2 1 3 实验试剂。1 4 2 1 4 培养基15 2 2 实验方法1 5 2 2 1 菌种的活化l5 2 2 2 单一菌种种子液的制备1 5 2 2 3w ) q 、x 7 一b 细菌形态的观察1 5 2 2 4w 怄，b 细菌生理生化特征的测定1 5 2 2 5w x n x ，一b 细菌的分子生物学鉴定1 6 2 2 6w 怄t b 细菌产生挥发性物质的测定1 7 2 2 7 生物量的测定1 8 2 2 8 碳源、氮源和无机盐的筛选1 8 目录 2 2 9 初始p h 和培养温度对w 恹，b 菌株生长的影响1 8 2 3 结果与讨论18 2 3 1 菌株的形态特征18 2 3 2 生理生化特征1 9 2 3 3 厂) ，b 的1 6 sr d n a 测定1 9 2 3 4 挥发性物质的测定2 1 2 3 4 粘细菌& 劬口地妇w x n x j b 生长曲线2 4 2 3 5 生长条件的筛选2 5 2 4 本章小结2 8 第三章& 姗砒如w 岖j b 产生的抗肿瘤物质的分离纯化及结构鉴定3 0 3 1 实验材料与仪器31 3 1 1 实验材料3 1 3 1 2 实验仪器与设备。3 1 3 1 - 3 实验试剂。3 1 3 1 4 培养基3 2 3 1 5 肿瘤细胞株3 2 3 1 6 溶剂的配制3 2 3 2 实验方法3 2 3 2 1 细胞培养3 2 3 2 2 细胞生长抑制的测定3 2 3 2 3 溶剂d m s o 对肿瘤细胞增殖的影响。：3 3 3 2 4 翩肼口抛砌w 町x j b 发酵3 3 3 2 5 代谢产物的粗提3 4 3 2 6 活性物质稳定性的测定3 4 3 2 7 次级代谢产物的初步定性分析3 4 3 2 8 活性物质的分离纯化和鉴定3 4 3 3 结果与讨论3 6 3 3 1d m s o 对肿瘤细胞增殖的损伤模型3 6 3 3 2 发酵产物的预处理3 6 3 3 3 活性物质的稳定性3 7 3 3 4 树脂提取物的初步定性分析3 8 3 3 5 活性物质的萃取3 9 3 3 6 葡聚糖凝胶s e p h a d e xl h 2 0 柱分离3 9 3 - 3 7 低压c 1 8 柱分离4 0 3 3 8 唧l c 分离和制备4 1 3 3 9u p l c m a i ，d i t o fm s m s 分析4 1 3 3 1 0r 分析4 3 目录 3 3 1 1n m r 分析 3 3 1 2c f l 0 0 2 结构及其化学性质 3 4 本章小结。 第四章& f 聊口抛妇w 町x j b 产喹乐霉素发酵条件的优化及大孔树脂的筛 4 1 材料与仪器 4 1 1 材料 4 1 2 实验仪器与设备 4 1 3 实验试剂 4 1 4 培养基 4 2 实验方法 4 2 1 粘细菌的发酵及喹乐霉素的提取 4 2 2 喹乐霉素含量的测定 4 2 3 蛋白浓度的测定 4 2 4 还原糖的测定 4 2 5p l a u c k e t t b u n n a n 和响应面实验设计 4 2 6 大孔树脂的筛选 4 3 结果与分析。 4 3 1 & 缸卵a 饱砌w 町b 摇瓶发酵过程 4 3 2 摇瓶发酵条件的优化 4 3 3 发酵培养基优化 4 3 。4 大孔吸附树脂的选择 4 4 本章小结 第五章喹乐霉素诱导肿瘤细胞凋亡及相关机制的研究 5 1 实验材料与仪器 5 1 1 实验材料 5 1 2 实验设备与仪器 5 2 实验方法 5 2 1 喹乐霉素对肿瘤细胞和小鼠脾脏细胞生长状况的影响6 9 5 2 2 扫描电镜观察喹乐霉素对b 1 6 细胞的形态影响6 9 5 2 3 荧光显微镜观察喹乐霉素对b 1 6 细胞核的影响6 9 5 2 4 凝胶电泳检测喹乐霉素对b 1 6 细胞d n a 的影响。7 0 5 2 5 流式细胞仪检测喹乐霉素对b 1 6 细胞周期的影响7 0 5 2 6 流式细胞仪检测喹乐霉素对b 1 6 细胞