（发酵工程专业论文）马链球菌ha高产菌株选育及生产工艺初步研究.pdf

湖北工业大学硕士学位论文 摘要 本研究对马疫链球菌诱变后，筛选出不产溶血素的透明质酸( h y a l u r o n i c a c i d ，简称i l a ) 高产菌株，优化了发酵条件，并初步确定提取工艺，为今后深入研究 奠定了一定基础。 经n t g 诱变，筛选出不产生溶血素的菌株，多次诱变后得到相对较高产量的菌 株。 最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母膏和牛肉膏的混合氮源，酵母膏和牛肉膏 的比值为4 ：1 ，最佳碳氮比为2 ：1 ，葡萄糖最佳浓度为4 5 l ，牛肉膏和酵母膏 总浓度为2 2 5g l ，m g s 0 4 浓度为l 5g l ，n a h c 0 3 浓度为7g l ，最佳温度为 3 6 ，p h 为7 0 ，接种量为1 3 ，装液量为4 0 ，发酵时间为4 2h 在0 1 6h ，摇瓶 转速为1 5 0r m ，1 6 3 0h 转速为2 0 0r m ，3 0 4 2h 为3 0 0r m ，起始葡萄糖的加入量为 3 5 l ，在1 6 3 0h 加入1 5g l 的葡萄糖，3 0 4 2h 加入5g l 的葡萄糖，透明质酸的 产量达到o 8 2 5g ，l 。 提取透明质酸时，无水乙醇的最佳添加量为3 2 5i 且。乙醇静置时间为2 0h ，在 分级分离纯化透明质酸时，最佳的n a c l 浓度为o 3 5t o o l l ，除去蛋白的最佳的氯仿 用量1 5 i 几。 紫外和红外光谱分析鉴定了精制的样品，测定纯度为6 5 ，其分子量为1 0 1 1 0 6 。在5 l 发酵罐中发酵，透明质酸产量达到了0 9 5 2 9 l 。 发酵法生产透明质酸研究所用的出发菌株为兽疫链球菌，本研究采用马疫链 球菌作为出发菌株具有较高的创新意义。透明质酸的产量从0 4 2g l 增加到0 9 5 2 g l ，达到出发菌株的2 倍多，分子量也较高，所做工作为今后的深入研究奠定了 坚实的基础。 关键词：马疫链球菌，透明质酸，发酵，培养基，提取 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h er e s e a r c hs e l e c t e das t r a i nw i t h o u tt h eh y m o l y s i np r o d u c t i o nf r o ms t r e p t o c o c c u s e q u i nm u t a n t sa n ds t u d i e do nt h eo p t i m i z a t i o no ft h et e c h n o l o g yo ff e r m e n t a t i o na n d p r i m a r ye x t r a c t i o n i ti sv e r yu s e f u lf o rt h ef u t u r er e s e a r c h t h es t r a i nw a st r e a t e db y n t g ，t h e nam u t a n tw i t h o u tt h eh y m o l y s i np r o d u c t i o n w a sf o u n do u t t r e a t e db yn t ga g a i n ，ah i g h e rh y a l u r o n i ca c i dp r o d u c t i o nm u t a n tw a s d i s c o v e r e d t h eb e s ts o u r c eo fc a r b o ni sg l u c o s ea n dt h eb e s ts o u r c eo fn i t r o g e ni sy e a s te x t r a c t a n db e e re x t r a c t t h er a t i o no fy e a s t e x t r a c tt ob e e re x t r a c t i s4 ：1 t h eo p t i m u m r a t i o no fc a r b o ns o u r c et on i t r o g e ns o u r c ei s2 ：1 t h eo p t i m u mf e r m e n t a t i o nm e d i u m c o n t a i n s4 5g lg l u c o s e 、2 2 5g ls o u r c eo fn i t r o g e n 、1 5g lm g s 0 4 、7g l n a h c 0 3 t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r ei s3 6 。c ，p hi s7 0 ，t h eb e s tr a t i o n o ft h es e e d c u l t u r el i q u i dt ot h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ml i q u i di s1 3 ，t h eb e s tr a t i o n o ft h e f e r m e n t a t i o n c u l t u r el i q u i dt ot h ef l a s kc u b a g ei s4 0 ，t h et i m ef o rf e r m e n t a t i o ni s4 2 h o u r s d u r i n gt h e 0t o1 8h o u r s t h eo p t i m u ms h a k es p e e di s 1 5 0 r m ；d u r i n gt h e 1 8t o3 0h o u m ，i ti s2 0 0r m ；d u r i n gt h e3 0t o4 2h o u r s ，i ti s 3 0 0 r m d u r i n gt h e0t o 1 8h o u r s ，t h eg l u c o s et o t a ld e n s i t yi s3 5g l ，d u r i n gt h e 0t o1 8h o u r s ，a d d i n gg l u c o s e d e n s i t yi s 1 5g e l ，d u r i n gt h e3 0t o4 2h o u r s ，a d d i n gg l u c o s ed e n s i t yi s5g l t h e h y a l u r o n i ca c i dp r o d u c t i o nr e a c h e st o0 8 2 5g l w h e nh y a l u r o n i ca c i di se x t r a c t e d ，p u r ee t h a n o l sv o l u m ei s3 2 5l l , t h eo p t i m u m t i m ef o rs e d i m e n t a t i o ni s2 0h o u r s 。w h e nd i s s o l v ec p c h a ，t h eb e s tn a c l sd e n s i t yi s 0 3 5m o l l , t h eb e s tc h l o r o f o r m sv o l u m et oe x t r a c tp r o t e i ni s1 5u _ l t h eh y a l u r o n i ca c i ds p e c i m e nw a si d e n t i f i e dw i t hu v s p e c t r u ma n di rs p e c t r u m ，a n d t h ep u r i t yi s6 5 ，t h em o l e c u l ei s1 o l x l o 。i nt h e5lf e r m e n t e r , t h ep r o d u c t i o nr e a c h e s t o0 9 5 2 班 t h eo r i g i n a lb a c t e r i a lf o rt h eh y a l u r o n i ca c i dp r o d u c t i o nb yf e r m e n t a t i o ni su s u a l l y i i s f r e t o c o c c u sz o o e p i d e m i c i ti sc r e a t i v et h a t t h eo r i g i n a lb a c t e r i a li ss t r e p t o c o c c h s e q “i n e t h ep r o d u c t i o ni sm o r et h a nt h et w i c eo ft h eo r i g i n a l f r o m0 4 2g lt 。o 9 5 2 g l t h em o l e c u l ei s hjg h e r t h er e s u l ti sv e r yu s e f u lf o r t h ef u t “。 r e s e a r c h k e y w o r d s ：s t r e t o c o c c u se q u i n e ，h y a l u r o n i ca c i d ，f e r m e n t a l i o n ，c u l t u r e m e d i u m ， e x t r a c t 1 1 1 诹；l 童工案火浮 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作所取 得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经 发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：而娲艾 日期：弘( 年6 月扩日 学位论文版权使用授权书 本学位沦文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权湖= l p , 3 1 , j k 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名 日期：? 乩年6 月 慈洒轧 日 指导教师签名：c 扛汜吃 日期：玑年6 月丫日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 结构和- 眭质 透明质酸是1 9 3 4 年m a y e r 博士首次从牛眼玻璃体中分离提纯制得的【1 1 ，英文 名为h y a l u r o n i ca c i d ，简称为h a h a 是一种酸性粘多糖，是糖胺聚糖中结构中最简单的一种，依据组织来源不 同，分子量介于1 0 5 - - 1 0 7 ，乙酰氨基葡糖和葡糖醛酸二糖单体为h a 结构单元【2 】 通过且一1 4 糖苷键交替连接而形成的一种链状高分子粘多糖，分子式为 ( c 1 4 h 2 l n 0 1 1 ) 。，分子式结构如下【3 ： d 一葡萄糖酸纳 h a 的生物合成途径起始于核心蛋白，经过多种糖基转移酶和有关修饰酶的作 用，形成有特定顺序的重复单位的线形分子【4 j 。从其结构上可以看出，由于直链轴 上的基团之间的氢键作用，h a 分子空间结构为二折体或三折体【5 】的螺旋结构， 透明质酸的二折体或三折体螺旋结构进一步折绕【6 】，形成特有的三级结构，赋予其 弹性。葡萄糖醛酸残基上的羧基使它一具有特殊的粘性，较多的亲水基团和蔬水 区域使其有优异的保湿功能。 透明质酸可以发生降解，研究表明降解反应主要由水解和羟基活性氧引起 的。在c ，和c 4 部位的水解导致链的断裂，保留半醛环【”。在碱性溶液中，断裂 则多发生在c ，环中的o 及乙酰氨基上的n 原子上。透明质酸可以发生交联反应， 可用来制备交联剂【8 j 。 1 2 透明质酸的生理功能 h a 是构成细胞外基质和细胞间质的主要成份，细胞问质填充在细胞隙内，维 湖北工业大学硕士学位论文 持细胞完整及组织的结构完整【。h a 网状结构可以预防大量的液体自软骨中被 挤压出，保证软骨内的水分，从而保护软骨的弹性和缓冲作用【1 0 1 。h a 的大分子网 状结构发挥过滤器或分子筛的作用，对大分子物质的扩散有阻止作用【1 “。h a 为关 节润滑液的主要成份，赋予润滑液良好的粘弹性，实验发现，将h a 除去后，润 滑液的粘度和假塑性明显降低【1 2 】。h a 可以使细胞免受细胞溶解毒素的攻击，还 有一定的免受病毒和植物凝集素的毒害【1 3 】。h a 可影响纤维细胞、淋巴细胞的增殖 【，粘弹性溶液可抑制淋巴细胞向成淋巴细胞转化，h a 的浓度达到一定程度后， 可以抑制吞噬细胞的摄取细胞的功能【1 5 】，中胚层的细胞是由于与h a 与受体的作 用而达到凝聚的【1 6 i ，h a 可阻影响细胞的移动，从而影响神经的组织生成。h a 能 促进细胞的增殖，高浓度的h a 抑制内皮细胞的移动，从而影响血管的生成1 1 ”， 组织内的高浓度、高分子量的h a 可高度水合，具有保水功能h a 与癌细胞表面的 结合蛋白作用，促进癌细胞向组织入侵【”】，h a 与血纤蛋白组成的凝块在伤口愈合 过程中发挥构造功能【1 9 j ，通过促进粒细胞的吞噬活性调节炎症反应，局部降解产 生h a 促进血管生成。 1 3 透明质酸应用 透明质酸具有保湿、营养、润肤等作用，广泛用于各种高级化妆品中，与传 统的保湿剂相比，透明质酸具有更高的保湿效果，且无油腻和阻塞皮肤等缺点。 当h a 加入化妆品中涂于皮肤表面时，会形成一层粘弹性透明水化膜，这层膜具 有很好的保水作用，广泛地应用在洗面奶、洗发香波、浴液中”。 纯h a 制剂在l 晦床应用中有三种剂型：液体喷雾、胶体涂布及薄膜覆盖。可 广泛应用眼科。“、耳科、骨科。“、关节炎、风湿性痛疼1 等的治疗，并己取得 令人满意的结果。临床上检测h a 的血清含量水平，能诊断各种疾病“。现在h a 凝胶已作为必备的填充剂被广泛用于白内障囊外摘除术、人工晶体植入术。“、 视网膜剥离术和角膜移植术等多种眼科手术。此外，h a 还可用于泪道再通和 干眼症等方面。1 。透明质酸对关节炎的注射治疗也有较好效果。1 ，无任何副作用， 是治疗干性鼓膜小穿孔的良好手段 h a 作为一种载体，可将各种药物靶向送至各病理部位。让药物定位于作用 部位同时缓慢释放，这样可大大增强药物的疗效。 1 4 动物组织提取法制备透明质酸 组织提取法制备透明质酸，制备过程包括提取、除杂、沉淀、和分级分离等。 湖北工业大学硕士学位论文 根据不同的组织，h a 提取纯化过程有一定的差别。玻璃体和润滑液的h a 以溶解 形式出现，我国已经成功从羊眼、鸡冠、兔皮等动物材料中分离出h a 并应用于 眼科及外科、化妆等。以鸡冠【3 1 和动物眼玻璃体为原料制备【3 2 】透明质酸技术已 经非常成熟。 1 5 发酵法生产透明质酸的研究现状 a 、c 群链球菌为人体非致病菌，兽疫链球菌。”1 、马疫链球菌。”比较适合于工 业化生产。郑州工业工程高等专科学校的赵敏诱变得到高产菌株“3 ，用氨基葡糖 法测得透明质酸产量为4 5g l ；张淑荣诱变兽疫链球菌，透明质酸产量可稳 定在3 5 9 l 。；高海军等对兽疫链球菌的发酵条件进行优化得到透明质酸的产 量为4 2 9 l o ”；赵惠明诱变出的菌株，透明质酸产量为4 3g l 。”；亚硝基胍诱 变出高产菌株，在最优发酵条件下，透明质酸产量达到6 7g l ”1 ；韩国j o n g h y u n k i m 用n t g 诱变出的菌株在摇瓶发酵时产量为3 0g l ，；在发酵罐中发酵产量达 到7g l ，该菌株不产生h a 酶和溶血素。朱广华等用不同功率的h e 一激光照 射不同时间诱变原生质体，从存活变异株中筛选出一株高产透明质酸菌株，其产 量( 2 2 1g l ) 达原始菌株( 0 4 9g l ) 的4 5 倍。凌敏构建表达质粒p s e s q h a s 并转化大肠杆菌d h s a ，诱导培养后在细胞膜中检测到s q h a s 蛋白及活性。利用 携带该酶的细胞膜以u d p g 1 c a 和u d p g 1 c n a c 为底物在体外合成了分子量为 3 6 1 0 6 的h a d ，国外透明质酸的最高产量达到或超过8g l “。 氮源、碳源对发酵生产透明质酸有较大的影响采用葡萄糖初始浓度为4 ， 分批补加葡萄糖，使其浓度控制在2 ，可使h a 的产量达到3 4g l “，添加 o 7 5g l 尿苷一磷酸，h a 的产量可提高2 0 6 ，达4 1g l ，平均分子量 2 8 7 1 0 “4 “。搅拌转速和透明质酸浓度对气液传氧速率有很大影响”；在较高 的搅拌速率下发酵可以得到较高的透明质酸产量，在溶液中添加谷氨酸和精氨 酸可以提高透明质酸的产量“。3 7 。c 培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和 后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成 h a ，提高h a 的产率“。菌体过多的表达i n 合成酶，酶分子之问会竞争同一前体 物资源，导致h am ，( 相对分子量) 的降低。 上海生物研究所采用c p c 沉淀透明质酸后，使用眼用透明质酸产量达到完全 合格m 1 ：c i f o n e l l i 用活性炭和纤维素粉末混合制成吸附柱“，让经乙醇析出的 h a 粗品反复通过吸附柱除去蛋白杂质；w a r r e n n 采用丙酮浓缩，冰乙酸和乙醇析 出法“；t h o n a r d 等先用5 0 的( n h 。) 。s o 。除蛋白后，将( n h 。) 。s 吼浓度增至6 5 湖北工业大学硕士学位论文 ，通过盐析作用沉淀出h a 粗品，用氯仿一丁醇混合液洗涤，1 5 倍体积乙醇( 含 2 5 乙酸和5 乙酸钠) 沉淀h a o ；黄日波等提出用硅藻土和活性炭来吸附微生 物细胞等杂质和脱除溶液颜色，过分离后用乙醇沉淀，真空干燥。”来制纯化透 明质酸。c a z z o l a 等则主张用孔径为0 1 1 0u m纸先过 ，后用孔径为o 4 5 l l m 的过微过，进一步除去细菌，除菌效果较。p o l ls t e f a n 使用经粗 过后的液体先后分别流经阳离子交换树脂床和阴离子交换树脂床，发任何分 子量的h a 都不留在树脂上，毫无改变地通过二树脂床，而杂质则吸附在树脂床 上，所得液体直接冷冻干燥或减干燥可得纯度在9 8 以上的h a “张玉中等 采用丙烯三元共聚物中空纤维超膜浓缩纯化透明质酸钠，经超浓缩纯化制得 的透明质酸钠产品外观及理化指标均，回收率高。透明质酸即使在同一发酵培 养基中发酵，所得透明质酸的分子量也有较的差别，k a z u a k ik a k e m 用电泳 的分离方法，不同数量级的透明质酸得到分离，使分子量较高的透明质酸得到 最有效利用“ 1 6 透明质酸的分析检测 紫外光谱检：对所得的粗产品配成5 0 0m g l 的水溶液，用紫外动扫描仪， 在波长为1 9 0 3 0 0i l i n 范围内扫描，所得图谱与标准图谱相对照，1 9 6 2 0 0n m 为 h a 特征吸收峰，分析是否有杂质的存在。红外扫描：样品4 0 0 4 0 0 0c m l 扫描，对 照标准图谱，可检测出是否有其它粘多糖存在。 蛋白质含量测定【5 5 】通常采用福林酚法或考马斯亮蓝法【5 6 1 测定蛋白质含量 氨基葡糖测定【5 7 】、h a 结合蛋白【5 8 】、葡糖醛酸法 5 9 】，高效液相色谱法【矧、 粘度、法【6 ”、分子排色谱法【6 2 】、分析超速离心澍吲、毛细管电泳法【删细菌内毒 素检查法1 6 5 l 等都可以检测透明质酸的产量或分子量。 4 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章出发菌株考察 2 1 引言 应用诱变的方法选育所需要的突变菌种，出发菌株必须具备一定的要求，才 能通过诱变得到高产菌株。选择的出发菌株首先从遗传方面考察看是否有我们所 需要的特性，作为出发菌株要有一定的生产能力，或者至少能少量生产这种产物。 如果出发菌株能具有产生所需要产物的能力，表明该菌株有产生所需要产物的代 谢途径，容易诱变得到高产菌株。为了诱变菌株顺利进行，菌株的生长曲线，目 的产物随时间的积累曲线，菌株的活化培养基的选择，菌种保藏方法的选择等都 必须考察，以便使菌种的活化和保藏得到较佳效果。 2 2 材料和方法 2 2 1 菌种 马疫链球菌购于北京微生物研究所 2 2 2 试剂与仪器 马丁肉汤北京奥普生物技术有限公司蛋白胨广东生物制剂厂 牛肉膏亚辉生物技术公司酵母膏奥普生物技术有限公司 葡萄糖华美生物工程公司琼脂上海朝阳公司 透明质酸钠 s i g m a 无水乙醇华美生物工程公司 氯仿华美生物工程公司四硼酸钠长阳化工 咔唑 s i g m a 其它分析纯国产纯试剂 7 2 2 分光光度计离心机，超净工作橱恒温摇床恒温水浴锅 移液枪 2 2 3 固体活化培养基配制 固体活化培养基i ：马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l0 1 2 5 n a h c 0 ：， 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 h p 0 42 固体活化培养基l i ：蛋白胨2 ，牛肉膏5 ， n a c lo 1 2 5 ，n a h c o ， 湖北工业大学硕士学位论文 2 ，琼脂 2 4 0 n a 2 h p 0 42 固体活化培养基i i i ：葡萄糖4 ，蛋白胨2 ， n a c lo 1 2 5 ， n a h c 0 32 ，琼脂2 4 ， n a 2 h p 0 42 2 2 4 液体活化培养基 马丁肉汤5 ，蛋白胨2 o ，n a c l0 1 2 5 ，n a h c 0 。2 ，n a 2 h p 0 42 2 2 5 发酵培养基 n a c l 0 4 5 ，n a h c 0 30 4 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0o 5 0 2 ，酵母膏1 5 ，葡萄糖3 o ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 6 ，m n s 0 4 7 h 2 00 0 3 2 2 6 保存培养基 保存培养基i ：马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c lo 1 2 5 ，n a h c 0 。 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 h p 0 42 保存培养基i i ： 马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l0 1 2 5 ，n a h c 0 。 2 ，琼脂 2 4 ，n a 2 h p 0 4 2 ， 甘油o 6 2 2 7 菌种纯化 把固体活化培养基上的菌种接种于液体活化培养基中，在培养箱中培养，3 7o c 培养1 4 小时，在微镜下计数，得菌液浓度为，稀释到1 0 0 个m l ，取0 5m l 稀释菌 液，接种于固体活化培养基倒制的平板。平板在培养箱种培养2 8 小时后得到清晰 可见的菌落，挑选菌落凸起较厚，菌落的作为出发菌落。菌落用接种环挑取在 固体培养基倒制的平板上划线培养，当培养2 8h 后，用接种环挑取少许，接种于 液体活化培养基中，培养1 4h ，放置4 0 c 的冰箱中保藏。 2 2 8 溶血性鉴定培养基 诱变后的菌液涂布于溶血素缺陷型培养基上，在3 7o c 恒温培养，等到生长 出可见菌落后，观察菌落周围是否有透明圈，没有透明圈的为溶血型缺陷型菌种， 有透明圈的为溶血性菌种。 2 2 9 菌体生长曲线测定 按菌种液体活化培养基配制活化培养基，灭菌后接入菌种，接种量为每1 0m l 3 环接种量。在3 7o c ，转速为2 5 0r m 的摇床培养箱中摇瓶培养。每隔2h 检测生 湖北3 5 业大学硕士学位论文 物量。取5m l 菌体培养液离心，稀释1 0 倍，测定生物量随时间的变化曲线，得到 生长曲线。 2 2 1 0 摇瓶发酵 活化的菌种按1 0 接种量接种于发酵培养基，装液量为4 0 ，2 5 0 r m ，3 7 0 c ， 发酵4 6 h 。 2 2 1 1 粗提透明质酸 取提取液在离心机5 0 0 0r m 离心1 5m i n ，取上清液，加入2 5 倍的无水乙醇， 静置2 0h ，去上层液，用蒸馏水溶解沉淀，不停摇动，到沉淀全溶解。 2 2 1 2 标准曲线的绘制 试剂配制 ( 1 ) 硼酸硫酸溶液称取四硼酸钠4 7 7g ，溶于浓硫酸( a r ) 5 0 0m l 中即得。 ( 2 ) 咔唑试液称取咔唑0 1 2 5g ，溶于乙醇( a r ) 1 0 0m l 中，放置棕 色试剂瓶保存。 标准曲线的绘制 取6 支2 5m l 试管按表1 顺序操作，在7 2 2 分光光度计5 3 0n m 检测，以葡糖 醛酸含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制曲线。 2 1 1 3 透明质酸产量测定 每两小时取发酵液，粗提透明质酸。把透明质酸稀释2 倍后，取0 2m l 的透 明质酸稀释液，按与2 1 1 2 相同操作在5 3 0n m 处测定吸光度，得到葡糖醛酸的 含量，从而计算透明质酸的产量 h a 浓度( l ) = 1 0 0 x ( y + 0 0 0 0 2 ) 2 x1 0 一4 6 3 2 0 2 0 0 1 2x1 0 1 2 3 结果和讨论 2 3 1 葡糖醛酸标准曲线 从图1 中可以看出该标准f 【| _ i 线的相似度非常高，可以作为检测透明质酸含量 的标准曲线。 湖北工业大学硕士学位论文 2 3 2 固体活化培养基的选择 表1 葡糖醛酸钠标准曲线制备步骤 标准葡萄 糖醒目菇自漓液 d口 蒸黯水，皿10 硼酸勰试液m d 5 加热 铷 咔唑试液m d 加热 0 2 0 8 0 40608l0 060 402 0 55555 拂水浴1 0 分种 冷却至室温 02 沸水浴1 5 分种 j 墟度( o d y j o ) 0 口001 8 60 3 7 805 8 807 9 709 4 0 葡瞎醛酸含量m g 01 63 24 86 48 0 把菌种接种于固体活化培养基上，在3 7o c 恒温培养，当固体活化培养基培养，3 8 小时后，逐一观察菌落生长情况。固体活化培养基i 菌落生长均匀，菌落形态饱 满，边缘光，厚度较，色泽均一。固体活化培养基i i 的菌落形态均匀，但是 菌落形态不饱满，菌落厚度相对较小。固体活化培养基i i i 菌落稀疏，菌落形态 不均匀，干瘪，色泽不均一。在固体活化培养基i 经过再继续培养到4 8h 后，没 有新的菌落长出，然而固体活化培养基i i 经过连续再培养后，有新的可见菌落长 出来。固体活化培养基i i l 上新出的可见菌落较多。可见固体活化培养基i 能较 的满足菌活化生长的需要。固体活化培养基和固体活化培养基i i i 不能较 满足菌活化生长的需求。在活化菌时，要求菌生长均一，生长迅速。而且在经过 较长时间保存的菌进行活化时，出于较长时间的新陈代谢几乎处于停状态，菌 体内的代谢途径可能 湖北工业大学硕士学位论文 1 0 8 吕0 6 0 4 0 2 0 o 2 04 06 0 8 0 葡糖醛酸含量u g 图l 葡糖醛酸标准曲线 受到一定程度损伤，所以必须为菌提供较为充分的营养物质。如果营养物质 不能满足生物生长的需要，菌的活化非常困难，不能快速增殖，满足试和生产 需求。 固体活化培养基i 能使菌快速增殖，菌的形态较，能满足试和生产的基本需求， 所以选用固体活化培养基i 为固体活化培养基。 2 3 3 菌种保存培养基选择 以菌种保存培养基i 和菌种保存培养基1 1 分别取1m l 放入1 5m l 的离心管 中，在3 7 0 c 培养1 4h 后，放入冰箱中保存。保存1 5 天后，在水浴锅中放置3 7o c 水浴3 0m i n 。把菌稀释涂布于固体活化培养基i 倒制的平板上，观察菌落数目。 用菌种保存培养基i 保存的培养基菌落生长数目较多，菌落形态饱满。菌种保存培 养基i i 的菌落生长数目较少。原因可能是加入的甘油对菌有一定的毒害作用。把 保存的菌种在3 个月后，继续作相同试，发结果相同，同样是菌种保存培养 基础i 的菌落数目较多，形态饱满。所以选用菌种保存培养基i 为菌的保存培养基。 2 3 4 菌种生长曲线的测定 把在菌种保存培养基中保存的菌种，在水浴锅中水浴3 0m i n ，然后涂布于固 体活化培养基i 倒制的平板上，等到菌体量生长后接种于液体活化培养基中， 每间隔两小时取一定培养液检测生物量。 由图2 可以看出，4 1 8h 左右为对数生长期，最佳接种时间确定定为1 4h 。 处于对数生长期接种菌中生长旺盛，新陈代谢活跃，对菌体的诱变处理和培 9 湖北工业大学硕士学位论文 养非常有利。 0 7 0 6 0 5 。0 4 o 0 3 0 2 0 1 o ? 一囊爹_ 薯；秒菇攀零誊豢州 _ 爹誊戮i i ：i j 誓! | | | 垂誊 一 i 篓! ； | i 萎囊莹薹塞i 鎏j ；| i 囊 一 “：* 一 ；。 一一 善 = 蕾 ? 疆照篓麓? i ： h 嚣鋈黛善囊? ；| | 1 ：誊；i 薹誉；鎏。i 。； “ ” 辫! 誊囊 籀 。； 1 。 一 “一 2468l o1 21 41 6 1 82 0 2 2 培养时间h 图2 菌种生长曲线 2 3 5 透明质酸产量随时间变化曲线的初步测定 菌种经过活化后1 0 接种量，3 7o c ，4 0 装液量，2 5 0r m ，每间隔2h ，取 发酵液体，粗提透明质酸，检测透明质酸的产量。 芒 圃硎 丰l 董 誊。 _ _ _ _ = “ - ”一? 蔷纛 誉粪| i j ；曩鎏i i 誊 蜜i 鬻： 一 i ? * 攀；誊篓至i “薯；： | 黧 j 、j 鏊；萎器萋：嚣，i i 篓 “ 一， + $ i ； ；一。：i 。毫鬻i ；：i j 譬纛 | i ： 。一 一 至芳譬鬈，篓i 孽_ ：；： 赫 。 i7 j ! 。一+ 。一；_ 一 蝌 i 扎 “ 一 ；：j ：io ，j j ，、强峨 1 4 1 6 1 82 02 22 42 6 2 83 03 23 43 63 84 0 4 2 4 4 4 6 发酵时间h 图3 透明质酸产量随时间变化曲线 通过透明质酸产量随时问的变化曲线，可以发当发酵时间为4 2h 时，透明 质酸的产量达到最，初步确定检测透明质酸的最高产量定为4 2h 。在以后试 中以发酵4 2h 时透明质酸的检测产量为判定透明质酸产量高低的最佳时间。 2 3 6 溶血性鉴定 1 0 蛎“门饬卫o嘶0 湖北工业大字硕士字位论文 诱变后的菌液涂布于溶血素缺陷型培养基上，在3 7o c 恒温培养，等到生长 出可见菌落后，观察菌落周围有透明溶血圈的存在，该菌株有溶血性，产生溶血 素 2 4 结论 本章所做工作下 1 绘制了透明质酸检测标准曲线。 2 比较了三种固体活化培养基： 固体活化培养基i ：马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l0 1 2 5 ， n a h c 0 a 2 ，琼脂 2 4 ，n a 2 h p 0 42 固体活化培养基i i：蛋白胨2 ，牛肉膏5 ， n a c l0 1 2 5 ， n a h c 0 。 2 ，琼脂2 4 ， n a z h p 0 42 固体活化培养基i i i ：葡萄糖4 ，蛋白胨2 ，n a g l 0 1 2 5 ，n a h c 0 。 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 i - i p 0 4 2 根据活化菌种的效果，确定固体活化培养基i 为最佳固体活化培养基。 3 比较了两种保存培养基： 保存培养基l ：马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l 0 1 2 5 ，n a h c 0 。 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 h p 0 42 保存培养基i i ：马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a g l 0 1 2 5 ，n a h c 0 a 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 h p 0 42 ， 甘油0 6 根据保存效果，确定保存培养基i 为保存培养基。 4 绘制了菌种生长曲线，在4 一1 8h 左右为对数生长期。 5 绘制了透明质酸产量随时间变化曲线，通过透明质酸产量随时间的变化曲 线，发当发酵时间为4 2h 时，透明质酸的产量达到最，初步确定检测透明 质酸的产量定为4 2h 。 6 对菌种的溶血性进行了鉴定，鉴定结果表明该菌株产生溶血素。 为了使菌种诱变和发酵条件的研究顺利进行，必须首先确定菌种的有效活化培 养基的组成和最佳的保存方法。通过三种固体活化培养基的活化菌种的比较， 发用马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ， n a c o 1 2 5 ，n a h c 0 32 ，琼脂 2 4 ，n a 2 h p 0 42 ，配制的固体活化培养基能使菌种较 的活化，菌落形 态饱满，菌落生长速度较为均一。对保存菌种，通过比较试发马丁肉汤5 ， 蛋白胨2 ， n a c lo 1 2 5 ，n a h c 0 ，2 ，n a 2 h p 0 42 1 配n 成的 湖北工业大学硕士学位论文 保存液可以较的保存菌种。对菌种的生长曲线进行了绘制，在4 1 8h 为对数 生长期，初步确定4 2h 为透明质酸积累的最高时间，该菌株有溶血性。透明质 酸的产量达到0 4 2 班该菌种具有产生透明质酸的能力，可以作为较的出发 菌株。 湖北工业大学硕士学位论文 第3 章溶血素缺陷型透明质酸高产菌株诱变和筛选 3 1 引言 溶血素能溶解血红细胞，对人体而言它非常有害，可以使人体致病，比如颈 偻病等。为了使菌体适应工业化生产的需要，必须使菌株不产生溶血素或者采用 分离纯化的方法除去透明质酸中的溶血素，这样以来分离纯化使透明质酸的成本 增加，所以能得到溶血素缺陷型的菌株可以使菌株较 的适应工业化生产的 需要，而且可以降低成本。 微生物的代谢途径相互联系，相互交织。某一个代 身 途径的终断，可以使底 物积累，从而可能使另外产物产量的提高。如果能筛选出溶血素缺陷型有可能可 以使发酵法生产透明质酸更容易工业化。 链球菌的a 群和c 群可以产生透明质酸，而且没有较强的致病性，可以作为 生产透明质酸的出发菌株。国外开展透明质酸发酵法生产的研究起步较早，通过 诱变和基因改造技术，已经得到透明质酸产量较高的菌株。我国开展透明质酸发 酵法生产的研究相对较晚。用诱变法得到透明质酸高产菌株，一般用的出发菌株 为兽疫链球菌，而且用马疫链球菌作为出发菌株诱变鲜有报道。通过诱变马疫链 球菌筛选出透明质酸高产菌株，而且不产生溶血素的菌株具有较高的创新意义。 n t g 有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果 ，n t g 还能 使多基因发生突变，在复制叉附近突变能诱发邻近位置基因的连锁突变，尤其适合 于诱发营养缺陷型突变菌株。n t g 是一种有效的诱变剂，使用n t g 作为诱变剂得到 正突变株的概率比其它的化学诱变剂有正突变率较高的特点。 诱变出无溶血素的菌株，然后以诱变得到无溶血素菌株为出发菌株，再经过 n t g 诱变得到透明质酸高产菌株。 3 2 材料和方法 3 2 1 菌种 马疫链球菌购于北京微生物研究所 3 2 2 试剂 羊血购于武汉疫站马丁肉汤北京奥普生物技术有限公司 湖北工业大学硕士学位论文 蛋白胨广东生物制剂厂 牛肉膏亚辉生物技术公司 酵母膏 北京奥普生物技术有限公司 葡萄糖 华美生物工程公司 琼脂上海朝阳公司 透明质酸钠 s i g m a 无水乙醇 华美生物工程公司氯仿 华美生物公司 四硼酸钠长阳化工 咔唑s i g m a n t g 深圳晶荣公司 3 2 3 活化培养基 马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l0 1 2 5 ，n a h c o ：, 2 ， 琼脂 2 4 ，n a 2 h p 0 42 3 2 4 液体活化培养基 马丁肉汤 5 ，蛋白胨2 ，n a c l o 1 2 5 ， n a h c o 。2 ， n a 2 h p 0 42 3 2 5 菌种保存培养基 马丁肉汤5 ，蛋白胨2 ，n a c l0 1 2 5 n a h c o 。 2 ，琼脂2 4 ，n a 2 h p 0 42 3 2 6 基本培养基 同活化培养基 3 ，2 7 溶血素缺陷型筛选培养基 马丁肉汤5 ， 蛋白胨2 ， n a c lo 1 2 5 ， n a h c 0 32 ，琼脂2 4 ， n a 2 h p 0 42 ，羊血1 0 。把除羊血外的组分加入三角瓶中灭菌，然 后冷却，在超挣橱中加入量取的一定量羊血。 3 2 8 菌种活化 把菌种在水浴锅中水浴3 0m i n ，然后在超净操作橱中涂布与用固体活化培养 基配制的平板，3 7o c 在培养箱中恒温培养3 8h ，菌苔出 。 湖北2 7 _ 业大学硕士学位论文 3 2 9 菌种在液体活化培养基种培养 按l o m l 3 环的接种量，把在固体活化培养基一k 活化的菌种接种于液体活化培 养基中，3 7o c ，4 0 装液量，2 5 0r m ，在摇床上培养1 4h 。 3 2 1 0 菌液菌体浓度测定 取在液体活化培养基中培养的菌液，稀释不同梯度涂布与固体活化培养基倒 制的平板，在培养箱中3 7o c 培养。选取菌落分布适中的平板，进行推算得到菌 体浓度。 3 2 1 1 诱变菌液制备 取在液体活化培养基中培养的菌液，在超净橱中取适量菌液加入离心管中， 5 0 0 0r m 离心1 0m i n 。弃去上层液，加入无菌水，然后摇动，让菌充分分散于无 菌水中。把菌液加入盛有灭菌玻璃株的三角瓶中。放在摇床上，3 0 0r m 摇1 5m i n ， 让菌体表面的夹膜去掉。然后取少量的菌液于离心管中，稀释到1 0 7 个m l 菌液 浓度。 3 2 1 2n t g 母液配制 n t g 加入少量的丙酮，加入p h 为5 8 磷酸钠缓冲液。 3 2 1 3n t g 诱变 取一定量的制备好的菌液，加入到离心管中，然后取n t g 母液加入到离心管 中，放在摇床上开始计时，到诱变时间后，取诱变的菌液，稀释不同梯度涂平板。 3 2 1 4 致死率的测定 在诱变开始前，用制备好的诱变菌液，稀释不同梯度涂布基本培养基配制的 平板。等到诱变处理的菌株生长到可见的菌落后，对平板上的菌落计数，根据稀 释梯度得到存活菌体的总浓度。用存活的菌数总菌数，得到存活率。1 与存活率 的差值为致死率 3 2 15 溶血素缺陷型菌株的筛选 诱变后的菌液涂布于溶血素缺陷型筛选培养基上，在3 7o c 恒温培养，等到 生长出可见菌落后观察菌落周围是否有透明圈，没有透明圈的为溶血素缺陷型 湖北工业大学硕士学位论文 菌株。 3 2 1 6 摇瓶发酵 活化的菌种按1 0 接种量接种于发酵培养基，2 5 0r m ，3 7o c ，发酵4 2h 。 3 2 1 7 粗提透明质酸 取发酵液稀释2 倍，在离心机5 0 0 0r m 离心2 0 m i n ，取上清液，加入2 5 倍的 无水乙醇，静置2 0h ，去乙纯得沉淀，用蒸馏水溶解上清液至沉淀全溶解。 3 2 1 8 透明质酸标准曲线制备 同2 1 1 2 3 2 1 9 透明质酸产量检测 同2 1 1 3 3 3 结果和讨论 3 3 1 致死率的测定 当诱变时间为7 0m i n 时，致死率达到8 1 ，选用7 0m i n 作为诱变时间。8 1 的致死率相对较高，较高的致死率便于筛选。而且根据诱变经8 0 左右的致 表1 诱变时间与致死率 诱变时间m i n致死车 死率正突变率一般一些。称量n t g ，使诱变菌液中的n t g 浓度达到l o gu g m l 垢加巧盯订他舭8： 加如如阳帅 湖北工业大学硕士学位论文 诱变不同时间，测定致死率如表l 。 3 3 2 无溶血素菌株筛选 用1 0 0u g m l 的n t g 诱变菌液，诱变8 0m i n 后稀释涂无溶血素的筛选平板， 4 0 0 0 多株菌落中得到2 5 株无溶血性的突变株，为简便起见，重新编号依次为0 0 1 0 0 2 、0 0 3 、0 0 4 、0 0 5 、0 0 6 、0 0 7 、0 0 8 、0 0 9 、0 1 0 、0 1 1 、叭2 、0 1 3 、0 1 4 、0 1 5 、 0 1 6 、0 1 7 、0 1 8 、0 1 9 、0 2 0 、0 2 1 、0 2 2 、0 2 3 、0 2 4 、0 2 5 ，结果如表2 。 3 3 3 溶血素缺陷型菌种稳定性测试 把2 5 株无溶血性的菌种转接于基本培养基上，等到菌落量出后，再次 转接，此为转接一代，如此转接1 0 代，测定2 5 菌株稳定性，无溶血性记为a ，有 溶血性的记为b ，。测定结果示，菌株0 1 5 的稳定性较，传代1 0 代没有溶血素 的产生，菌株0 1 5 的稳定性测定结果如表3 。 湖北工业大学硕士学位论文 表2 溶血性筛选检测结果 菌落编号是否有透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈 无透明圈