（发酵工程专业论文）高温α淀粉酶产生菌的遗传改良及发酵工艺优化.pdf

摘要 摘要 高温0 淀粉酶是目前最重要的工业酶制剂之一，广泛应用于发酵、制糖、纺织、造 纸等工业。地衣芽孢杆菌是至今为止用于高温a 淀粉酶工业化生产的为惟一生产菌株。 本研究对地衣芽孢杆菌生产菌株进行了遗传改良并对其发酵工艺进行研究与优化，以期 提高其高温0 【淀粉酶的发酵生产水平。 本文从改善高温仅淀粉酶的来源菌地衣芽孢杆菌的蛋白分泌角度，采用基因工程手 段对地衣芽孢杆菌进行遗传改良。通过p c r 技术，从地衣芽孢杆菌a t c c l 4 5 8 0 基因组 扩增出含有地衣芽孢杆菌d e g q 完整读框的6 0 0b p 左右的片段。用b a m h i 酶切p c r 产 物，克隆入p h y - p 4 3 的b g l l i 位点，获得了重组质粒p h y - p 4 3 一d e g q 。将上述构建的重组 质粒通过电转化的方法转化地衣芽孢杆菌a t c c l 4 5 8 0 和b 0 2 0 4 ，分别获得了转化子 a t c c l 4 5 8 0 ( p h y - p 4 3 一d e g q ) 和b 0 2 0 4 ( p h y - p 4 3 - d e g q ) 。摇瓶发酵试验结果表明，转化子 a t c c l 4 5 8 0 ( p h y p 4 3 d e g q ) 产伐淀粉酶水平为3 5 4u m l ，较出发菌株提高了近3 0 倍， 转化子b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 产a 淀粉酶的水平提高了1 5 18 。对转化子 b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 做进一步的发酵工艺研究与优化。 考察了菌株b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 基本的生理特征，能够利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、 甘油、卫矛醇、半乳糖、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸为碳源，在3 4 5 0 、p h5 5 7 8 下生长， 最适生长温度4 2 ，最适生长p h 6 5 。 初步确定了重组菌b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 适宜的培养基和发酵条件，最优的摇瓶发 酵条件是：棉籽粉2 5 ，碳源4 ，磷酸盐4 0m m o l l 。培养基p h 6 0 ，接种量为1 0 。 重组菌b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 优化后产酶能力比优化前产酶活能力提高7 1 5 ，在优化 条件下对重组菌b 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 d e g q ) 作进一步的研究和出发菌株b 0 2 0 4 进行摇瓶发 酵，在整个发酵过程中，重组茵的酶活提高了2 8 。 关键词：高温一淀粉酶，表达，地衣芽孢杆菌，发酵条件优化 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et h e r m o s t a b l e 一a m y l a s ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tc o m m e r c i a le n z y m e sw i t ha n u m b e ro fa p p l i c a t i o n s ，i n c l u d i n gi t su s ei ns t a r c hp r o c e s s i n g ，s u g a r ，t e x t i l ea n dp a p e r i n d u s t r i e s u pt ot h ep r e s e n t ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i si st h eo n l yi n d u s t r i a ls t r a i nf o rp r o d u c t i o n o ft h e r m o s t a b l e 伐- a m y l a s e t h i ss t u d yh a si n v e s t i g a t e dt h eg e n e t i ci m p r o v e m e n ta n d f e r m e n t a t i o np r o c e s so p t i m i z i n go ft h ei n d u s t r i a ls t r a i nb a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ，h o p i n gf o r i n c r e a s i n gt h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h et h e r m o s t a b l ea - a m y l a s e b a s e do nt h eo p t i m i z a t i o nt h ep r o t e i ne x p r e s s i o ns y s t e mo ft h et h e r m o s t a b l e 仅a m y l a s e p r o d u c i n gs t r a i n 丑l i c h e n i f o r m i s , t h ea i mo ft h ep r e s e n tw o r ki st op e r f o r mt h eg e n e t i c i m p r o v e m e n to f 丑l i c h e n i f o r m i sb yg e n e t i ce n g i n e e r i n g i nt h i sw o r k ，a6 0 0b pf u l lg e n e f r a g m e n to fd e g qt h a ta m p l i f i e df r o mt h eg e n o m i cd n ao fb 1 i c h e n i f o r m i sb yp c rm e t h o d ， w a sd i g e s t e dw i t l lb a m h ia n di n s e r t e di n t ot h eb g l i is i t eo fp h y - p 4 3 p r o d u c e da r e c o m b i n a n tp l a s m i dp h y - p 4 3 - d e g q t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p h y - p 4 3 一d e g q w a s t r a n s f o r m e di n t o 最l i c h e n i f o r m i sa t c c14 5 8 0a n db 0 2 0 4b ye l e c t r o p o r a t i o nm e t h o d ，r e s u l t e d i nr e c o m b i n a n ts t r a i n sa t c c l 4 5 8 0 ( p h y - p 4 3 一d e g q ) a n d ( p h y - p 4 3 一d e g q ) ，r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t so fs h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o ni n d i c a t e dt h a tt h e 仅一a m y l a s ep r o d u c t i o nl e v e lb ys t r a i n a t c c l 4 5 8 0 ( p h y p 4 3 d e g q ) w a s3 5 4u m l ，w h i c hi sa l m o s t3 0f o l d so ft h eo r i g i n a ls t r a i n ( 1 2u m 1 ) ，a n dt h a to fs t r a i nb 0 2 0 4 ( p h y - p 4 3 - d e g q ) i n c r e a s e d1 5 - 1 8 af u r t h e rs t u d yh a s d o n et oi n v e s t i g a t ea n do p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so ft h er e c o m b i n a n ts t r a i nb 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 一d e g q ) t h es t u d i e so nt h ep h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r so fs t r a i nb 0 2 0 4 ( p h y p 4 3 一d e g q ) s h o w e dt h a t i tw a sa b l et ou t i l i z eg l u c o s e ，l a c t o s e ，s u c r o s e ，g l y c e r o l ，g a l a c t i t o l ，g a l a c t o s e ，s o d i u m g l u c o n a t ea n dg l u c o n a t e ，a n dc a ng r o wa tat e m p e r a t u r er a n g eo f3 4 - 5 0 0 ca n da tap hr a n g e o f5 5 - 7 8 晰t hi t so p t i m a lg r o w t hc o n d i t i o n so ft e m p e r a t u r eo f4 2o ca n dp ho f6 5 ， r e s p e c t i v e l y t h i ss t u d yh a si n i t i a l l yc o n f i r m e dt h ep r o p e rm e d i u ma n df e r m e n t a t i o np r o c e s s ，a n dt h e o p t i m i z e ds h a k i n gf l a s kf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r e ：b e a np o w e r2 5 ，l a c t o s e4 ，p 0 4 。 4 0m m o l l ，p h6 0 ，i n o c u l a t i o n10 a f t e rt h eo p t i m i z a t i o no ft h ef e r m e n t a t i o n ，t h e t h e r m o s t a b l e 0 【- a m y l a s ep r o d u c e db yt h er e c o m b i n a n ts t r a i nb 0 2 0 4 ( p h y - p 4 3 - d e g q ) w a s i n c r e a s e d71 5 o nt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，t h er e c o m b i n a n ts t r a i nb 0 2 0 4 ( p h y - p 4 3 一d e g q ) p r o d u c e d2 8 t h e r m o s t a b l ea - a m y l a s em o r et h a nt h a to fs t r a i nb 0 2 0 4 k e y o r d s ：t h e r m o s t a b l e 仅一a m y l a s e ，e x p r e s s i o n ，b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s , f e r m e n t a t i o n p r o c e s so p t i m i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 塑：! 兰：塑 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名：鱼逖 导师签名： 日 期： | 1 洲。 谗l 。司 第一章前言 第一章前言 淀粉是由葡萄糖基组成的、用途十分广泛的高分子物质。淀粉制成的食品如粉丝、 粉条等可以直接食用。淀粉作为原料可应用于方便面、火腿肠、冰淇淋等食品和可降解 塑料制品中。作为发酵原料用于淀粉糖、氨基酸、酒精、抗生素、味精等产品的生产。 淀粉也可以加工成变性淀粉，应用于造纸、纺织、食品、铸造、医药、建筑、石油钻井、 选矿等领域【l j 。淀粉是工业上制取葡萄糖和糊精的主要原料。历史上，淀粉主要通过酸 水解制取葡萄糖，2 0 世纪5 0 年代末，日本成功地应用酶法水解淀粉制取葡萄糖。与酸 法制糖相比，酶法制糖有很多优势，因此，现在国内外葡萄糖生产已全数采用酶法【2 】。 1 1 淀粉酶的定义及主要产生菌 0 【一淀粉酶是以淀粉为底物的淀粉内切水解酶，又称仅1 ，4 葡聚糖4 葡聚糖水解酶 ( o c - 1 ，4 - g l u c a n 一4 一g l u c a n o h y d r o l a s e ) ，编号：e c3 2 1 1 ，通常分子量为4 5 6 0k d 左右。它 与淀粉作用时，是从分子内部切开o 1 ，4 糖苷键使淀粉分子量迅速降低，降解为水溶性 的糊精并产生少量麦芽糖和葡萄糖。 仅- 淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前，工业生产中都是以 微生物发酵法大规模生产a 淀粉酶。有实用价值的0 c 淀粉酶的产生菌为：枯草芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、地衣芽孢杆菌( 曰1 i c h e n i f o r m i s ) 、嗜热脂肪芽孢杆菌( g e o b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 、凝结芽孢杆菌( b c o a g u l a n s ) 、解淀粉芽孢杆菌( b a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 、 嗜碱芽孢杆菌( b a l k a l o p h i l i c ) 、米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 、黑曲霉似n i g e r ) 和拟内孢霉 ( e n d o m yc o p s i s f i b n l i g e r ) 等i 弘5 1 。其中，高温& - 淀粉酶的工业生产菌株为地衣芽孢杆菌 1 i c h e n i f o r m i s ) ；中温仅一淀粉酶的工业生产菌株为解淀粉芽孢杆菌( 召a m y l o l i q u e f a c i e n s ) 或 枯草芽孢杆菌( 丑s u b t i l e ) 。 1 21 3 c 淀粉酶的应周 o c 一淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业 化应用在1 8 9 4 年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。现在，a 淀粉酶己广泛应用于食品、 清洁剂、啤酒酿造、酒精工业、纺织退浆和造纸工业。 1 2 1 在焙烤工业中的应用 各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年i f , 淀粉酶广泛地应 用于焙烤工业中。焙烤工业中使用的酶制剂有很多，如蛋白酶、脂肪酶、普鲁兰酶、木 聚糖酶、纤维素酶、糖化酶等，但没有一种酶能取代仅淀粉酶在焙烤食品中的应用。仅 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度；改善面 包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽；提高入炉 的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。目前， 焙烤工业使用的仪淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。1 9 5 5 年，美国批准真菌0 c 淀 江南大学硕士学位论文 粉酶作为面包添加剂。1 9 6 3 年，英国证实了它们的安全性【6 j 。现在，仅淀粉酶已经在全 世界范围内使用。面粉中添加的真菌仅淀粉酶具有较高的活力，在面粉中添加仅淀粉酶 不仅能提高发酵速率，而且能降低面团的粘度，从而增加面包的体积，提高产品的质地， 并且由于双淀粉酶的存在，面团会产生额外的糖，可以提高面包的风味，改善外表的色 泽。面包等焙烤食品储存一定时间后逐渐变干变硬，易碎，风味变差，这些都是由于面包 的陈化造成的，每年由于面包老化造成巨大的损失。传统的用于抑制老化，提高焙烤食品 质地和风味的添加剂主要有化学试剂，食糖，奶粉，糖酯，卵磷脂和抗氧化剂等，近几年， 酶制剂越来越多的作为面团改良剂和抗老化剂用在焙烤工业中，包括仪淀粉酶、分支酶、 去分支酶、b - 淀粉酶和普鲁兰酶等，其中将0 c 淀粉酶和普鲁兰酶联合使用可以有效的延 迟焙烤食品陈化，提高产品的货价期。但是，在使用仅淀粉酶时，对其加入量要求比较严 格，稍微过量就会导致面包等焙烤食品粘度的增加。因此，近人们逐渐使用中温仅淀粉酶， 由于其最适作用温度在5 0 。c - 7 0 。c 左右，所以其在淀粉糊化时具有活性，而在焙烤过程中 则会逐渐失活，最终在焙烤完成时活性丧失。而且，在加工过程中0 c 淀粉酶会水解淀粉生 成聚合度在4 9 的糊精，这些糊精也具有抗老化性。但是，现在中温仪淀粉酶仅能从极少 的一些微生物中提取。 1 2 2 在淀粉工业中的应用 仪淀粉酶用于淀粉工业，可用来生产变性淀粉，淀粉糖等。由于伐淀粉酶在适宜条件 下对淀粉具有较强的水解能力，控制反应的条件，可以控制淀粉的水解率，从而将淀粉水 解成多孔状的多孔淀粉。多孔淀粉可以作为微胶囊芯材和吸附剂，作为香精香料、风味 物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸附载体，成本低，可自然降解，现已广泛应 用于食品、医药、化工、农业、保健品等领域。淀粉在高温条件下发生糊化，因此生产 多孔淀粉多采用中温0 c 淀粉酶，另外，将仅淀粉酶和其它淀粉酶如糖化酶、普鲁兰酶等协 同使用会提高反应效率和淀粉成孔效果，因此现在多孔淀粉的研制多采用0 【淀粉酶和其 它酶协同反应【7 j 。淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产，主要用于淀粉的糖化和液化， 因此都采用高温酶。工业生产中，淀粉的液化是将0 【淀粉酶先混入淀粉乳中，加热，淀粉 糊化后进行液化。由于仅淀粉酶对于糊化淀粉具有很强的催化水解作用，因此可以迅速 将淀粉水解成小分子，使其粘度降低，流动性增高，以利于淀粉的糖化【8 胡。 1 2 3 在纺织退浆中的应用 由于棉织物在编织过程中需使用较大的张力，容易使丝线断裂，因此需加入一些浆 料对其保护。由于淀粉资源广泛，廉价易得，易退浆，因此纺织工业中多采用淀粉浆。织 物退浆主要使用伐淀粉酶，它会使淀粉大分子发生分解，生成可溶性的水解产物，减弱了 对纤维的粘附力，因此可以通过水洗将其除去，最后从纤维上脱除。早期是用麦芽产生的 一种内生酶来退浆，近期则使用真菌或细菌淀粉酶。细菌仅淀粉酶尤其适用，因为它们能 够耐高温，在碱性的环境里有一定的稳定性，具有一个中性的最适p h 值( p h 5 7 5 ) 。 淀粉酶的催化效率高，有利于提高生产效率。如用碱分解淀粉退浆需要1 0 1 2h ，而用仅一 淀粉酶只要2 0 3 0m i n 即可完成退浆过程。淀粉酶退浆的另一原因是比其它退浆剂( 如酸 2 第一章前言 或氧化剂) 更利于环保。在退浆浴中添加钙盐，可提高淀粉酶的稳定性，从而可用较高的 温度或较低的酶剂量来达到退浆的目的1 1 u 川j 。 1 2 4 在造纸中的应用 当代造纸工业中，造纸用化学品在提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和 降低生产成本等方面发挥着极为重要的作用。由于淀粉与造纸用植物纤维素结构相近， 相互间有良好的亲和作用，资源广泛，廉价易得，尤其是经变性处理的淀粉，能赋予纸张 优异的性能，因此各类变性淀粉在造纸中广泛用于湿部添加、层间喷雾、表面施胶和涂 布粘合。0 【淀粉酶可以生产涂布粘合用变性淀粉。b r u i n e n b e r g 等t 1 2 l 用0 淀粉酶生产了涂 布粘合用低粘度，高分子量的变性淀粉。此外，其还可以应用于纸的表面施胶，由于造纸 施胶过程中要保持淀粉乳的粘度，压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度，而 且天然淀粉的粘度较高需经处理降低其粘度后才能用于表面施胶，因此需要用仅淀粉酶 间歇式或连续降解淀粉来调整淀粉乳的粘度。其反应的条件要根据所用淀粉和a 淀粉酶 的性质来确定。 1 2 5 在清洁剂中的应用 目前，各种酶制剂广泛地应用于现代高密度清洁剂。酶用在清洁剂中最主要的优点 是它的反应条件比无酶清洁剂温和，早期的洗碟机用洗涤剂反应需要的条件比较苛刻， 使用时容易对餐具造成损伤，而且它不能用于清洗精巧瓷器和木质餐具，因此清洁剂工 业开始寻找条件温和，更加有效的清洁剂，而将酶制剂用于清洁剂以后，可以在较低的清 洗温度下就到达很好的清洗效果。1 9 7 5 年，仅淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在，几乎9 0 以上的液体清洁剂中都含有a 淀粉酶，而且其在洗碟机用洗涤剂中的应用需求还在不断 的增加。虽然如此，其在清洁剂中的应用也有一定的局限性。这主要是因为0 【一淀粉酶对。 钙离子比较敏感，如果钙离子浓度过低，其稳定性很差，容易失活。而且大部分温和型q 淀粉酶对清洁剂中的氧化剂也比较敏感。最近，世界最大的两家清洁剂酶供应商诺维信 和杰能科成功的用蛋白质工程提高了淀粉酶的漂白稳定性。他们用其它氨基酸替代淀粉 酶中的易氧化氨基酸，从而提高了淀粉酶抵抗氧化剂的能力，提高了清洁剂的储存稳定 性和性能。目前，这些新产品已经在市场上销售【1 3 ”】。 1 2 6 在啤酒酿造中的应用 啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加伐淀粉酶使其较快液化以取代 一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较大的场 合，使用仅淀粉酶和1 3 淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含 量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊 化时间。啤洒酿造中糊化时添加0 【淀粉酶，在2 0 世纪7 0 年代主要用b f 7 6 5 8 仅淀粉酶：8 0 年代用食品级枯草杆菌0 c 淀粉酶：8 0 年代末，我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温仅淀 粉酶，可使副原料从原来的3 0 增加到4 0 以上，实现了无麦芽糊化，节粮、节能显著， 使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高【l 制。 江南大学硕士学位论文 1 2 7 在酒精工业中的应用 在以玉米为原料生产酒精中添加仅淀粉酶低温蒸煮的新工艺，每生产1 t 酒精可节煤 2 2 4 4 2k g ，又可减少冷却用水，提高出酒率8 8 ，酒精成品质量也有显著提高。酒精生产 应用耐高温0 c 淀粉酶，采用中温9 5 c 1 0 5 c 蒸煮，既可有效地杀死原料中带来的杂菌， 降低入池酸度和染菌机率，又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏，形成焦糖或其它物 质而损失，从而提高原料利用率【1 7 】。 1 30 【一淀粉酶的生产 仅一淀粉酶的生产方法有液体发酵法和固体培养法两种。液体发酵法生产的0 c 一淀粉 酶，经分离提纯后，可制得纯净的食品级酶制剂产品，这种产品主要应用在食品、淀粉 糖、制药等直接入口的产品生产中。固体培养法生产的0 【一淀粉酶经干燥后得到粉剂产品， 由于含有多种复杂的酶系和杂质，所以适合于条件要求不高的粗质原料发酵产品中。 淀粉酶的生产过程受到很多因素的影响。这些因素主要是培养基的组成，培养基的 p h ，磷酸盐的浓度，种龄，温度，通风，碳源，氮源等。 1 3 1 碳源 仅一淀粉酶是一种诱导酶，一般是在淀粉或它的水解产物如麦芽糖存在的情况下诱导 其产生【1 8 。2 0 】。如报道的根霉的不同菌株在仪一淀粉酶的生产方面其诱导物是麦芽糖。有文 献报道在使用淀粉和麦芽糖的情况下根霉产仅一淀粉酶的能力提高2 0 倍【l 引。除了麦芽糖， 在其他菌株中如乳糖，海藻糖，等也可作为0 【一淀粉酶产生的诱导物【2 0 1 。像其它诱导酶一 样0 c 一淀粉酶的生产也受葡萄糖和其他糖代谢的抑制。然而在淀粉酶的生产过程中葡萄糖 的作用是有争议的【1 8 】。而木糖或果糖对仅一淀粉酶的生产过程中是有抑制作用的。碳源如 葡萄糖和麦芽糖用于仪一淀粉酶的生产中，而淀粉质碳源在仪一淀粉酶的生产中仍保持良好 的发展前景。一些不常用的底物女r j g l 糖、含油种子，淀粉加工生产过程的废水也已用于 仅一淀粉酶的生产。 1 3 2 氮源 有机氮源是0 【一淀粉酶生产的首选氮源。酵母抽提物已用在s t r e p t o m y c e ss p 2 1 1 ， b a c i l l u ss p i m d4 3 5 2 2 1 和h a l o m o n a sm p ，f d 砌门口【2 3 】一淀粉酶的生产上。酵母抽提物组合 细菌蛋白胨用于b a c i l l u ss p i m d4 3 4 t 2 4 1 q 一淀粉酶的生产上，酵母抽提物组合硫酸铵用于 b a c i l l u ss u b t i l i s l 2 习仪一淀粉酶的生产上，酵母抽提物组合硫酸铵和酪仪一蛋白用于c g i g a n t e a n0 c 一淀粉酶的生产上，酵母抽提物组合豆饼粉用翻o r y z a e 2 6 1a 一淀粉酶的生产 上。据报道锄o r y z a e 2 7 10 【一淀粉酶的生产上使用酵母抽提物比单独使用氨盐产量将提高 为1 1 0 一1 5 6 。有机氮源牛肉抽提物蛋白胨能有效提高细菌产一淀粉酶的量，而豆饼粉， 酪蛋白水解物能有效提鼽o r y z a e 产0 c 一淀粉酶的量。氨基酸与维生素结合也能影响仪一淀 粉酶生产，由于不同文献报道的差异很大，没有结论说明在不同的微生物中氨基酸与维 生素结合在q 一淀粉酶生产过程中的作用，氨基酸复合物的作用在q 一淀粉酶的生产中既不 做为氮源也不做为碳源而是一淀粉酶合成和分泌的刺激物。 4 第一章前言 1 3 3 磷酸盐 磷酸盐在微生物主要和次级代谢产物的合成过程起重要的作用，同样它也影响菌体 的生长和0 c 一淀粉酶的生产。据报道当磷酸盐的浓度为0 2m o l l a o r y z a e 产淀粉酶的能力 得到有效的提高。相似的现象也出现在丑a m y l o l i q u e f a c i e n s 中，在低磷酸盐条件下菌体 密度很低无淀粉酶产生，而高磷酸浓度又抑制酶的产生【2 8 】。 1 3 4p h 在一些物理参数中，生长培养基的p h 对微生物生长和酶的分泌起着重要的作用。在 微生物生长过程中p h 的变化影响产品的稳定性。商业上所用的通过深层发酵所获得细菌 0 【一淀粉酶的产生菌芽孢杆菌其最适的生长和产酶p h 为6 7 。p h 也是酶合成开始和结束的 标志。 1 3 5 温度 温度对淀粉酶生产的影响与菌体的生长有关。在真菌中对生长温度在2 5 3 7 产仪一 淀粉酶嗜温真菌研究表明，仅一淀粉酶的最适产酶温度是3 0 3 7 。在细菌中淀粉酶产生 菌的生长温度更宽些。 1 4 高温0 【淀粉酶 高温淀粉酶系指热稳定性为9 0 以上的仅淀粉酶，是淀粉加工中有重要用途的一 种酶，其工业产生菌为地衣芽孢杆菌。高温0 【淀粉酶具有作用温度高、作用力强、反应 速度快的特性，其最适作用温度为9 0 9 5 ，最适使用范围为9 5 1 0 5 ，在蒸汽喷射工 艺中，使用温度可高达1 0 5 11 0 ，淀粉的液化在淀粉糖生产过程中是最重要的一步， 液化质量的好坏，对其后一系列操作的顺利与否起着决定性的作用。用高温a 淀粉酶液 化淀粉具有以下优点：在9 0 以上高温液化淀粉反应快，液化彻底，可避免淀粉分子 胶束重排形成难溶性的团粒，因此过滤容易，可节省能源。c a 2 + 依赖性小，液化时不 需添加c a 2 + ，故糖化液的精制大为省力，成本可以下降。酶的稳定性好【2 9 1 等。 1 5 高温仪淀粉酶的产生菌的生物学特征 高温仅淀粉酶工业产生菌为地衣芽孢杆菌。地衣芽孢杆菌是一种革兰氏阳性的腐生 性微生物，广泛分布于土壤和其它自然环境，具有耐热、酶系丰富，产酶量高，安全等 诸多优良特性，被认为是较理想的工业生产菌株。与枯草相比，地衣芽孢杆菌生长温度 高，不仅能节省生产能源，而且也使某些酶对结合在胞壁上的蛋白酶的敏感性降低；其 次，其生长速率慢，容易使刚跨膜的未折叠的蛋白充分折叠。再则，地衣芽孢杆菌分泌 蛋白至培养基中的能力大约是枯草芽孢杆菌的2 倍，重组蛋白表达水平可以达到2 5 m g m l ，为所见报道的所有芽孢杆菌表达水平最高者【3 0 1 。与枯草芽孢杆菌相似，地衣芽 孢杆菌d s m l 3 3 1 j 包含有五种蛋白质分泌途径：s e c 型分泌途径、t a t 分泌途径、a b c 转 运途径、c o m 分泌途径和穿膜途径。地衣芽孢杆菌d s m l 3 的信号肽可分为五类：由i 型信号肽酶( s i p s t w v ) 切割的s e c 分泌型信号肽，双精氨酸结构信号肽( t a t 信号 5 江南大学硕士学位论文 肽) ，由i 型信号肽酶( l i p ) 切割的脂蛋白信号肽，由c o m 切割的纤毛( c o m ) 信号肽， 以及由e s c a b 或c y d d c 切割的生物信息素( a b c ) 信号肽。 文献报道了枯草芽孢杆菌通过提高其蛋白分泌能力对其宿主细胞进行改造，如促进 蛋白质分泌的d e g q 因子的高表达、蛋白分泌伴侣分子p r s a 的高表达、蛋白分泌s e c 途径中s e c a 因子的高表达等【3 0 1 。可推测其分泌机制一些调控因子对于其蛋白的分泌有 较大的影响，其中影响蛋白分泌的一些正调控因子的变化将会在不同程度上提高或降低 其自身某蛋白分泌的表达。针对地衣芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的相似性都具有较为强大 的蛋白分泌体系，这一特点也可能适用于地衣芽孢杆菌来对宿主细胞进行遗传改良提高 其蛋白的分泌能力从而来提高目的蛋白的表达量。 1 6 高温a 淀粉酶的国内外研究概况 1 6 1 高温a 淀粉酶的国外研究概况 高温仪一淀粉酶与普通仅一淀粉酶相比较，具有更高的作用温度和更好的液化性能，使 用范围更加广泛。近来高温0 c 一淀粉酶几乎有完全取代淀粉芽孢杆菌o 一淀粉酶之势。而地 衣芽孢杆菌是公认的产耐高温0 【一淀粉酶的优良菌种【3 引。 自1 9 7 3 年m a d s e n 3 3 报道了采用常温地衣芽孢杆菌产生一种新的耐热0 【淀粉酶，在 高温l1 0 。c 液化淀粉，开始突破了耐热仅淀粉酶的工作，双酶糖化法生产葡萄糖才能真正 在工业上得到应用。现在已经在丹麦的n o v o 公司、美国的m i l e s 公司和日本的长赖产业 等大量投入生产，使用它在1 0 5 的高温下液化淀粉，时间短，淀粉不易形成难溶性颗 粒，且杂质容易过滤去除，液化可以一步完成，水解效率高，费用低，受到了国际市场 的欢迎。1 9 8 1 年t a m u r i 3 4 】用嗜热脂肪芽孢杆菌得到的耐高温0 c 淀粉酶无c a 2 + 依赖性，在 无c a 2 + ，9 0 ，p h 6 0 处理1 0 分钟，酶活残留7 0 。1 9 8 4 年，g r u e n i n g e r 3 5 】从污泥中分离 到一株产耐热仅淀粉酶的嗜热脂肪芽孢杆菌慨s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 的亚种，在3 或4 种复 合成份的培养基中( 像蛋白胨、大豆粉和麦芽提取物等) 产生较高的酶活力。该酶最适温 度是8 0 ，在9 5 2 d , 时酶活性失活5 0 。然而在有底物淀粉存在时，活性能保持3 d , 时以上。淀粉分解产物主要是麦芽三糖、麦芽糖和少量葡萄糖。1 9 8 5 年丸尾 3 6 】报道以地 衣芽泡杆菌n y k 2 4 为出发菌株，对各种诱变方法作了比较，发现n t g 的诱变效果最好， 通过六次连续诱变与自然选择，挑选环丝氨酸抗性突变株，随着抗药性增加，酶活力增 加了二千倍。但因出发菌株酶活力极微，故无实用价值。这一期间国外以嗜热脂肪芽孢 杆菌作为研究对象的较多，k i n d l e 等【3 7 j 的f 氐c a 2 + 要求的耐高温0 c 淀粉酶，n a n m o r l i 3 8 1 等 的耐高温淀粉酶均是来自嗜热脂肪芽孢杆菌。1 9 9 5 年，m a m o 掣”j 从埃塞俄比亚w o n d o g e n e t 温泉附近土壤中分离得到了b a c i l l u ss p w n l l ，其分泌的耐高温仪淀粉酶在有底物 情况下能够耐1 0 5 c 高温，其最适p h 5 5 。1 9 9 7 年，u g u r u 4 0 】等从磨粉厂废料土壤中分离 得到- j t h e r m a c t i n o m y c e st h a l p o p h i l u s ，可用玉米浆作为碳源，1 0 0 ，p h 5 0 下耐高温o t 淀粉酶的半衰期为3 0m i n 。1 9 9 9 年m a m o 4 l 发现b a c i l l u ss p w n l l 在6 5 是最佳菌种生长 点，5 5 c 为产酶最多，n 0 3 。，n h 4 + 和尿素不能作为氮源，未经诱变处理在有底物情况下 酶活达至f j 2 4u m l ，2 0 0 0 年，m a l h o t m 等【4 2 】报道了一株b a c i l l u st h e r m o o l e o v o r a n sn p 5 4 在 6 第一章前言 7 0 、p h 7 0 下能摇瓶培养产酶，所得酶的半衰期在1 0 0 ，p h 5 0 下为3 小时并且有c a 2 + 依赖性。 m i e l e n z l 4 3 】等将耐高温0 【淀粉酶克隆到大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中，所采用的源基 因也是来自嗜热脂肪芽孢杆菌。h e n a h a i l 】把地衣芽孢杆菌耐热的0 c 淀粉酶基因克隆到 枯草杆菌中，重组株产生的酶在9 3 是稳定的，并且广泛的应用于食品和酿酒工业上。 芬兰国立酒精公司研究实验室的v e i 曲a n a n p e r a 【4 5 】等报道用基因工程芽孢杆菌工业化生 产仅淀粉酶，他们使重组菌株a l k 0 8 4 的多拷贝质粒p u b l l o _ k 带上生产菌株丑 a m y l o l i q u e f a c i e n sa l k 0 8 9 的仅淀粉酶基因，在实验规模上，重组菌的产酶能力是原来的 2 倍。 1 6 2 耐高温0 【淀粉酶的国内研究 我国从8 0 年代开始研究耐热0 t , 淀粉酶的生产，上海工业微生物研究所以地衣孢杆菌 为出发菌株，用n t g 、紫外线和y 射线反复处理，并结合热处理与自然分离，得到一株突 变菌株，产酶能力由1 2u m l 提高到1 0 0u m l 。但是与一般的细菌0 【淀粉酶相比，活性还 很低。1 9 8 7 年任天明【4 6 】等完成了嗜热脂肪芽孢杆菌的高温0 【淀粉酶基因在大肠杆菌中的 克隆和表达。1 9 8 9 年胡学智h 7 】从地衣芽孢杆菌中选育得到无孢子突变株a 4 0 4 1 ，酶活力 达到2 0 0u m l ，最适反应温度达到9 0 9 5 ，9 0 下处理1h 不失活。其后，凌晨【4 8 】等用 a 4 0 4 1 e 出发，用原生质体融合技术进行了菌种改良的研究，结果显示菌种改良后酶活 稳定提高了1 5 倍。1 9 9 0 年金风燮【4 9 j 从曲中分离得到生产高温淀粉酶的菌种，经鉴定 是b a c l l i u s 属中的新种，所产高温仪淀粉酶酶活力达到1 0 0 0u m l ，在8 0 8 5 下能保持3h 不失活，1 0 0 、1 0m i n 后有1 5 的残留酶活力。1 9 9 1 年孔显副5 0 j 等利用地衣芽孢杆菌 突变株产高温仅淀粉酶，所得酶液在不力n c a 2 + 和无任何保护剂条件下于9 0 。c 处理6 0m i n ， 9 5 * ( 2 处理2 0m i n 后，酶活力均能保留9 0 以上。1 9 9 7 年李瑶等【5 l 】在金凤燮的基础j 三进行 诱变，使酶活力提高至0 2 9 4 0u m l 。1 9 9 8 年王磊等【5 2 】在枯草杆菌中扩增表达高温0 c 淀粉 酶基因，在无任何选择压力的情况下，使酶活力达到2 2 0u m l 。2 0 0 2 年卢涛【5 3 】等在土壤 中筛选到一株凝结芽孢杆菌，经诱变处理，酶活力达到1 0 0u m l 。2 0 0 4 年潘风光【5 4 】等报 道了地衣芽孢杆菌耐高温0 【淀粉酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达。2 0 0 5 年袁铁铮1 5 5 j 等报道了密码子优化改造后的耐热酸性a 淀粉酶基因r b d 5 0 6 3 在毕赤酵母获得表达，表 达的重组淀粉酶r b d 5 0 6 3 具有0 【淀粉酶的活性，表达量达到6 0m g l 。对r b d 5 0 6 3 进行 了纯化并对多组分的表达产物进行了研究。r b d 5 0 6 3 作用最适p h 值为5 0 ，在p h 3 5 1 0 0 范围内酶活性保留5 0 以上，最适温度在1 0 5 1l o 之间，在9 0 下酶活性半衰期约3 0 m i n 。2 0 0 6 年牛丹丹【5 6 j 报道t b 1 i c h e n i f o 删括c i c i mb 0 2 0 4 高温0 c 淀粉酶编码基因的克隆 及其在大肠杆菌中的表达。2 0 0 6 年将若天【57 】从西藏当雄温泉附近的土壤中筛选到的一株 分泌高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌b 1 i c h e n i n f o r m i sl t 。该菌的原始的淀粉酶活为6 0u 。 经优化培养基后在5 0 、装液量1 0 、1 8 0r m i n 的摇床培养7 2h 后，测得酶活1 0 5u 。2 0 0 7 年王春铭【5 8 】等从堆肥中筛选到一株能在5 5 。c 生长并分泌高温仅淀粉酶的菌株，经初步鉴 定为地衣芽孢杆菌，命名为b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sz d 8 。在液体筛选培养基的碳源为乳糖、 7 江南大学硕士学位论文 氮源为( n i - h ) 2 s 0 4 ，通气量为1 0 、p h 值及c n l p , 分别为8 和3 l 、6 5 的条件下，培养2 4 h 的菌株产酶量最高酶学性质研究表明，该酶最适p h 值为8 ，最适反应温度为9 5 。c ；9 5 下保温6 0m i n 后酶活仅损失4 8 ；较低浓度c a 2 + 存在下，该酶即可有很好的稳定性污 泥有机质降解实验表明，培养了2 2h 的菌株对污泥有机质降解能力最强；2 0 0 8 年张强【5 9 1 以一株耐高温仅淀粉酶产生菌d g 4 为出发菌株，通过紫外线( u v ) 诱变，得到菌株 d g 4 4 ，酶活提高了2 0 4 ；通过硫酸二乙酯( d e s ) 诱变，得到菌株d g 4 4 6 ，酶活在 u v 诱变基础上提高了6 1 9 ，比初始出发菌株d g 4 提高了9 5 0 。2 0 0 8 年；张强【6 0 】以 一株高温淀粉酶产生菌为出发菌，经过单因素法和正交实验法确定优化培养条件为：玉 米粉0 5 0g ，黄豆粉1 0 0g ，n a c l 0 5g ，蒸馏水l o om l ，p i l l 0 0 ，接种量0 4 ( v v ) ，装 液量1 4 ，5 0 。 1 7 本课题的立题意义及主要研究内容 地衣芽孢杆菌仪淀粉酶( b l a ) 是目前工业上最重要的高温仪淀粉酶，由于其具有 众多优点及应用范围广泛，且有重要商业价值，致使人们积极研究高效b l a 生产菌种， 或者用基因工程的方法寻找编码该酶的新基因，然后通过对菌株进行遗传改良来提高酶 活力，并进一步进行发酵工艺优化，从而降低生产成本。为此，本研究的主要研究内容 为： ( 1 ) 通过研究地衣芽孢杆菌d e g q 蛋白的功能，探讨其对提高地衣芽孢杆菌主要分泌 酶蛋白，特别是b l a 的表达的影响；应用高表达d e g q 提高b l a 工业生产菌株的b l a 的生产水平； ( 2 ) 研究b l a 重组菌的发酵培养基、发酵工艺条件等，考察温度，p h ，磷酸盐， 碳源，氮源种龄，接种量，通风量等对菌株产0 c 淀粉酶的影响，以及菌株利用廉价原料 的情况，以获得重组菌的b l a 最适生产工艺条件及最优参数。 8 第二章地衣芽孢杆菌d e g q 功能鉴定 第二章地衣芽孢杆菌d e g q 功能鉴定 芽孢杆菌作为优良的发酵工程菌株的一个主要优点，是它具有将蛋白质分泌到细胞 外的能力。然而分泌又是其表达系统的瓶颈之一。据文献报