（发酵工程专业论文）辅酶q10高产菌株的选育及发酵工艺研究.pdf

摘要 摘要 辅酶q l o 是一种脂溶性醌类化合物，它作为呼吸链中重要的递氢体主要分布于真核 生物的线粒体内膜及原核生物的质膜上。辅酶q l o 具有多种生理活性，它在医药、食品 和化妆品等行业具有很大的应用潜力。虽然采用微生物发酵法大量获得辅酶q l o 较为可 行，但现阶段辅酶q l o 较低的生产能力却限制了它的大量使用。基于上述原因，本文对 辅酶q i o 产生菌的选育及发酵工艺进行了研究。 第一阶段，首先以根癌土壤杆菌( r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ) 为出发菌株，以辅酶q i o 的结构类似物维生素k 3 及糖苷类抗生素作为筛选因子，确定了快速高效筛选辅酶q l o 高产突变株的方法。确定维生素k 3 的最小抑制浓度为0 0 4 l ，丁胺卡那霉素和硫酸庆 大霉素分别为0 0 2 5g l 和o 0 0 4 8g l 。其次，确定了诱变条件。其中紫外照射时间1 5s ， 脉冲注入n + 离子能量为1 0k e v ，剂量采用2 0 x 1 0 mi o n c m 2 。最终，经紫外线和离子束 双重诱变，结合抗性平板初筛、摇瓶初筛和复筛获得了3 株高产菌株k 5 3 ( 1 0 1 1m g l ) 、 q 一1 8 ( 1 0 4 7m g l ) 和y 8 0 - 5 8 - 2 ( 1 0 5 8m g l ) ，与出发菌株( 6 3 7m g l ) 相比产量分别提高了 5 8 7 、6 4 4 和6 6 1 。尽管产量不是最高，2 株产生性状变异的突变株q 1 4 ( 9 4 7 7m g l ) 和y 8 0 8 8 1 ( 9 7 0 1 m g l ) 却表现出了值得关注的特性。5 代的传代稳定性实验表明，高产 菌株的辅酶q l o 产量较稳定。 第二阶段，在1 5l 通气搅拌发酵罐规模对菌种培养条件进行了研究。首先考察了3 株高产或者性状变异特性突变株的分批发酵和流加葡萄糖的补料分批发酵过程。最终选 择了性能最佳的突变株q 1 4 。然后，通过在线控制p h 值及分批补加葡萄糖和新鲜培养 基，辅酶q l o 的产量提高到6 9 1 1 2m g l 。为了避免产生葡萄糖抑制效应，采取连续流加 葡萄糖的方式替代分批流加，使得产量增加到8 0 3 5 9m g l 。最后，通过检测发酵过程 中的磷含量，采用连续流加k h 2 p 0 3 维持发酵液中的磷在一定水平，进一步提高了产量。 最终，通过对培养条件的优化，突变株q 一1 4 在1 5l 搅拌发酵罐内生产辅酶q l o 的 产量达到了2 16 6 2 0m g l ，生产强度2 5 8 7 8m g ( l h ) ，产物对菌体得率y p x 为2 5 0 3 6 m g g 。 关键词：辅酶q l o ，根癌土壤杆菌，诱变育种，条件优化，连续流加分批发酵 a b s t r a c t a b s t r a c t c o e n z y m eq l oi s al i p i d s o l u b l eb e n z o q u i n o n e ，w h i c hp l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo n t r a n s f e r r i n ge l e c t r o n sf r o mm e m b r a n e - b o u n dd e h y d r o g e n a s e st oc o m p l e xi i i i ne l e c t r o n t r a n s p o r tc h a i n b e c a u s eo fi t sm u l t i p l ep h y s i c a la c t i v i t i e s ，c o q i oh a sg r e a tp o t e n t i a lt ob e u s e di np h a r m a c e u t i c a l ，f o o d ，a n dc o s m e t i ci n d u s t r i e s d e s p i t eal a r g ed e m a n d ，t h e p r o d u c t i v i t yn o w a d a y si ss t i l ln o td e s i r a b l e f o r t u n a t e l y , i ti sb e l i e v e dt h a tu s i n gb i o t e c h n i c s t op r o d u c ec o q t oi sap r o m i s i n gw a y t a k i n gi n t oa c c o u n tt h er e a s o n sm e n t i o n e da b o v e ， m e t h o d sf o rb r e e d i n gh i 曲- y i e l dc o q i 0s t r a i n sa n df o ro p t i m i z i n gt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s s a r ei n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r a tt h ef i r s ts t a g e ，aq u i c ka n dh i g hp e r f o r m a n c em e t h o df o rs c r e e n i n gh i g h y i e l dc o q l 0 m u t a n t su s i n ga no r i g i n a ls t r a i n ，r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r , w a sd e t e r m i n e d o n es t r u c t u r a l a n a l o g u e so fc o e n z y m eq 1 0 ，v i t a m i nk 3 ，a n dt w og l y c o s i d ea n t i b i o t i c s ，a m i k a s i n ，a n d g e n t a m y c e ns u l f a t e ，w e r ec h o s e na sg r o w i n gi n h i b i t o r s i nt h i ss c r e e n i n gm e t h o d ，a n dt h e i r o p t i m i z e dc o n c e n t r a t i o n sw e r e0 0 4g l ，0 0 2 5g l ，a n d0 0 0 4 8 l ，r e s p e c t i v e l y o p t i m a l r e s u l t sf o rt w om u t a t i o nm e t h o d si nt h i ss t u d y , w h i c hi n c l u d e da15 一s e c o n dr a d i a t i o nt i m ef o r u va n dai m p l e m e n t a t i o nd o s a g eo f2 0 x1 0 1 4i o n c m 2f o r1 0k e vn 十w e r es e l e c t e d f i n a l l y , t h r e em u t a n t st r e a t e dw i t hd u a lm u t a t i o na n dw i t hs c r e e n i n gi nf l a s k s ，k 一5 3 ，q 一18 ，a n d y 8 0 - 5 8 2 ，w e r eo b t a i n e d y i e l do fc o q i oo ft h e mw e r e10 1 1m g l ，10 4 7m e g l ，a n d10 5 8 m e g l ，r e s p e c t i v e l y t h e s em u t a n t sh a da tl e a s t5 8 7 m o r ei np r o d u c t i o nt h a nt h a to ft h e o r i g i n a ls t r a i n t w om u t a n t s ，q 一1 4 ( 9 4 7 7m g l ) a n dy 8 0 - 8 8 一l ( 9 7 0 1 m g l ) ，w i t hs h i f t so n t h e i rc h a r a c t e r i s t i c sa l s oa t t r a c t e dt h ea u t h o r sa t t e n t i o n ，a l t h o u g hb o t ho ft h em u t a n t sd i d n t p r o d u c em o r ec o q l 0t h a no t h e r s f u r t h e r m o r e ，t h ey i e l dl e v e l so ft h e s es t r a i n sf o rc o q l oa r e c o m p a r a t i v e l ys t a b l eb yr e p e a t e df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n t st h r o u g h5g e n e r a t i o n s a tt h es e c o n ds t a g e ，o p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n sf o rm u t a n t si na na e r a t e da n d s t i r r e df e r m e n t o rw i t hav o l u m ec a p a c i t yo f15lw a si n v e s t i g a t e d a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so f b a t c ha n do fg l u c o s ef e e d i n gf e d - b a t c hw h i c hw e r et a k e nu s i n gt h r e em u t a n t sw i t hs p e c i a l c h a r a c t e r i s t i c s ，s u c ha sh i 曲一y i e l do rs h a p ev a r i a t i o n ，am u t a n tw i t ht h eb e s tp e r f o r m a n c e , q - 14 ，w a sc h o s e nf o rt h es u b s e q u e n tr e s e a r c h w i t ha l lo n l i n ec o n t r o lo fp ha n da ne x t r a f e e d i n go fg l u c o s ea n df r e s hm e d i u m ，a no u t p u to f 6 9 1 12m g lw a sa c h i e v e d t oa v o i d i n h i b i t i o ne f f e c tc a u s e db yh i 曲g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n , ac o n t i n u o u sf e e d i n gm o d ew a s a p p l i e di n s t e a do f t h ef o r m e rg r a d i n gm o d e a se x p e c t e d ，t h ey i e l dg o ta no b v i o u si n c r e a s eu p t o8 0 3 5 9m e g l a l t h o u g ht h em e t h o dm e n t i o n e da b o v es h o w e dag r a t i f y i n gr e s u l t ，t or e a c ha h i g h e rg o a lh a v ei m p e l l e dt h ea u t h o rt ow o r kf u r t h e r b e c a u s ep h o s p h o r u s ( p ) i nt h e f e r m e n t a t i o nb r o t hp l a y e da l li m p o r t a n tr o l eo nc e l lg r o w t ha n dc o q l os y n t h e s i z a t i o n ，t h e c o n t e n to fpi nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sw a sm e a s u r e di nt i m e i no r d e rt ok e e ppi na n a p p r o p r i a t el e v e l ，c o n t i n u o u sf e e d i n go fp o t a s s i u md i h y d r o g e np h o s p h a t e ( k h 2 p 0 3 ) i n t ot h e b r o t hw a sc a r r i e do n b yp u t t i n ga l lt h ec o n t r o l l i n gw a y st o g e t h e r , t h ey i e l do fc o q i o i n c r e a s e di nm a n yf o l d sa tl a s t a tt h ee n do ft h i sr e s e a r c h ，a 1 1o u t p u to f2 16 6 2 0m # b c o q l ow a sa c h i e v e db ya p p l y i n g a l lt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n so nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s sf o rq 一14i nt h el5la e r a t e da n d i i i a b s t r a c t s t i r r e df e r m e n t o r m e a n w h i l e ，t h ep r o d u c t i v i t y , c o q l oy i e l do nc e l lw e i g h t ( y p ) ( ) w e r e2 5 8 7 8 m e , ( l 。h ) a n d2 5 0 3 6m g g k e y w o r d s ：c o e n z y m eq i o ；r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ；m u t m i o nb r e e d i n g ；o p t i m i z a t i o no f c u l t u r ec o n d i t i o n ；f e d b a t c hw i t hc o n t i n u o u sf e e d i n g i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是4 叉z d f _ 导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：堡! 复整 日 期： 竺z ：! 兰：兰兰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 建絮彩导师签名： 日 期： 兰1 2 二! 兰：兰兰 第一章绪论 第一章绪论 辅酶q t o ( c o e n z y m eq i o ，c o q t o ) 别名泛醌( u b i q u i n o n e ) 、癸烯醌，是一类存在 于动物肝脏、植物细胞及革兰氏阴性细菌中的脂溶性醌类化合物，是呼吸链中重要的递 氢体【i l 。辅酶q 家族根据其侧链中异戊二烯单元个数来命名，不同的生物含有不同单位 数的异戊二烯侧链，人和烟草中含有辅酶q l o ，啮齿动物中为辅酶q 9 ，而大肠杆菌和酿 酒酵母中则为辅酶q 8 和辅酶q 6 2 。辅酶q l o 是一种生理活性物质，具有医疗和保健功 能，在医药、保健及食品方面具有广泛的应用【3 】。 1 1 辅酶q l o 的结构和性质 1 1 1 辅酶q l o 的结构 辅酶q l o 具有较长的类异戊二烯侧链【4 1 ，化学名称为2 ，3 二甲氧基5 甲基6 癸异 戊烯基苯醌( 2 ，3 一d i m e t h o x y - 5 m e t h y l 6 一d e c a p r e n y l l ，4 - b e n z o q u i n o n ) i s ，其分子式为 c 5 9 h 9 0 0 4 ，分子量为8 6 3 3 7 ，结构式为： o ，o h 3 c h 鱼c 、 。o h 0 1 1 2 辅酶q l o 的理化性质 辅酶q l o 是一类醌类化合物，无臭无味，常温下是黄色或淡黄色结晶，熔点为4 9 c 。 易溶于氯仿、苯、四氯化碳，溶于丙酮、石油醚及乙醚；微溶于乙醇；不溶于水和甲醇。 遇光易分解成微红色物质，对温度和湿度较稳定【6 】。 1 2 辅酶q l o 的制备方法 近几年，随着辅酶q l o 广泛的应用于医药、化妆品及食品等领域，全球对辅酶q l o 的需求量逐渐增加。与此同时，研究者对动植物组织提取法、化学合成和半合成法【7 】及 微生物法生产辅酶q l o 等方面做了很多的研究【8 】。 在上述辅酶q l o 的制备方法中，动植物组织提取法的原材料来源有限，成本较高， 难以实现工业化生产网；化学合成法主要以烟叶中的茄尼醇为原料合成，工艺也较成熟， 但产物多为顺反异构体的混合物，生物活性低。相比之下发酵法生产的辅酶q l o 为天然 产物，生物活性好，并且没有原材料的限制，可通过规模放大提高生产力。微生物发酵 法是近几年全球开发的热点，被认为是最有前途的生产方式。 1 3 辅酶q l o 的功能及应用 辅酶q l o 存在于动物肝脏、植物细胞及革兰氏阴性细菌中，是呼吸链中的递氢体， 作为n a d h 脱氢酶、琥珀酸脱氢酶和b c 复合物之间的脂溶性电子载体，在负责电子传递 的同时对维持细胞膜内外的质子梯度也有重要作用。研究表明，辅酶q 1 0 在临床上有多 硕士学位论文 方面的应用。氧化形式的辅酶q 1 0 有抗动脉硬化的功能，它的缺乏还与心脏衰竭和其他 心血管疾病的高发病率有关。另有研究表明辅酶q l o 在神经系统中也起了很重要的作用， 例如，在预防和治疗帕金森综合症、线粒体肌病、肌营养不良症【l o 】及神经退行性疾病8 1 、 a i d s 免疫缺陷、高胆固醇、阿尔茨海默氏症】也有很好的效果。综上所述，辅酶q l o 具 有很高的应用价值。 1 4 辅酶q l o 的研究现状 目前，日本用发酵法生产辅酶q l o 的生产水平及其产量均居国际领先地位，全球大 部分的产品均来自于日本，1 9 9 2 年时辅酶q l o 的产量已达到了7 7 0m g l t l 2 】。近几年韩 国也投入了较大的研发力度，h a t 】等在根癌农杆菌分批培养过程中通过控制蔗糖的浓 度，细胞内辅酶q i o 的含量提高到9 7 1m g g 干细胞，辅酶q l o 的产量也高达6 3 8m g l 。 h a t l 3 】等通过在发酵过程中添加c a 2 + ，使辅酶q i o 的含量达1 1 8 4m g g 干细胞，辅酶q , o 的产量达7 6 3 7m g l 。目前国内发酵法生产辅酶q i o 的产量在2 0m g l 2 0 0m g l ，吴祖 芳【1 4 】等通过对放射根瘤菌w s h 2 6 0 1 在7l 发酵罐上进行发酵研究，辅酶q l o 的最大产 量达5 2 4m e g l 。李梅等以c p u 0 4 0 2 发酵辅酶q l o 产量达8 7m g l 。李继扬【1 6 】等通过 耐受前体及结构类似物筛选到的高产菌株产量可达1 2 0m l 。陈亮【1 。刀等通过对粉红掷孢 酵母进行条件优化，最终辅酶q l o 的产量达到1 8 8 6m g l 。据估计【2 1 ，具有工业化应用 价值的菌株其产量应高于5 0 0m g l ，若实现工业化生产目的，需进一步提高辅酶q 1 0 的 产量。 1 4 i 菌种选育及采用合适方法筛选突变株 可以发酵生产辅酶q l o 的野生菌种有：根癌土壤杆菌( r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ， a g r o b a c t e r i u mm m e f a c i e n s ) ，脱氮副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) ，罗伦隐球酵母 ( c r y p t o c o c c u sl a u r e n t i i ) ，丝孢酵母( t r i c o s p o r o ns p ) ，红色掷孢酵母( s p o r o b o l o m y c e s s a l m o n i c o l o r ) 和浑球红细菌( r h o d o b a c t e rs p h a e r o i d e s ) 等【1 8 ，1 9 1 。野生菌株辅酶q l o 的 产量一般不高，因此可以通过诱变育种来提高产量。物理诱变的方法主要有u v 、离子 束、氩离子激光、( 6 0 ) c o t 射线等，其中离子束注入发生正突变的机率比较高，而且传 代稳定，是比较理想的诱变方法。化学诱变所用试剂有亚硝基胍( n t g ) 、硫酸二乙酯等。 单纯的物理诱变和化学诱变一般提高幅度较小，可采用物理加化学复合诱变的方法。采 用复合诱变后，为快速筛选高产突变株，应选择合适的筛子，包括筛选代谢类似物抗性 突变株，抗反馈调节突变株以及营养缺陷型突变株等。 1 4 1 1 代谢类似物抗性突变株 阿霉素和维生素k 3 ( 又称甲基萘醌) 是辅酶q l o 的结构类似物，通过筛选抗阿霉素 和维生素k 3 的突变株，可以解除辅酶q l o 对合成途径的反馈调节。由于维生素k 3 是脂溶 性物质，难溶于水，因此要解决其在培养基中的溶解度问题。戚薇【2 0 】等通过将维生素 k 3 溶于n ，n 二甲基甲酰胺( d m f ) 中，再加入到含有3 吐温8 0 的培养基中，解决了 维生素k 3 在培养基中不溶解的问题，并确定7 抗性平板中维生素k 3 的浓度为o 1 5 m g m l 。 2 第一章绪论 在辅酶q 1 0 的合成过程中，s 腺苷甲硫氨酸( s a m ) 是芳香环甲( 氧) 基化的甲基供体。 而s a m 直接由l 甲硫氨酸转化而来，l 乙硫氨酸是l 一甲硫氨酸的结构类似物，因此以l - 乙硫氨酸抗性为筛选模型，选育抗l 广乙硫氨酸突变株，使胞内甲硫氨酸过量合成，有利 于辅酶q l o 的积累【2 l 】。 1 4 1 2 抗反馈调节突变株 在根瘤土壤杆菌中，还可选用芳香族氨基酸结构类似物以及呼吸强度抑制剂来提高 辅酶q l o 的产量。如选育l 酪氨酸结构类似物突变株有利于解除l 酪氨酸与l - 色氨酸或 l 苯丙氨酸对前段d h a p 合成酶的协同反馈抑制作用【2 2 1 ，l 酪氨酸结构类似物有3 氨基 酪氨酸( 3 a t ) ，酪氨酸氧肟酸盐，d 酪氨酸等。 n a n 3 、n a 2 s 均为呼吸链泛醌抑制剂，能阻断呼吸链电子传递从而抑制呼吸导致细胞 凋亡。由于辅酶q i 0 是呼吸链中的重要递氢体，因此若诱变菌株能在含有一定浓度的呼 吸链抑制剂的培养基上生长，则表明该突变株体内辅酶q l o 的积累量提高【2 3 】。 1 4 1 3 其它类型突变株的筛选 突变株的筛选还可以通过色素的产生作为指示剂，出发菌株在含有x - g a l l ( 5 溴4 氯 3 吲哚b d 半乳糖苷) 和葡萄糖的培养基中培养，菌落呈淡蓝色，诱变后突变株的菌落 呈深蓝色，表明突变株利用x g a l 的能力提高了，从而减轻葡萄糖的分解代谢阻遏，增加 葡萄糖的代谢通量，促进辅酶q 1 0 的合成。 辅酶q l o 可以提高机体的免疫力，如果在培养基中加入某种对菌体细胞产生毒性的 物质，有可能得到抗性突变株，从而提高辅酶q i o 的产量。放线菌素d ( a c t i n o m y c i nd ， a c t d ) 是一种致畸剂，通过在培养基中加入a c t d ，可获得抗性突变株，使辅酶q 1 0 的产量 提高【2 4 】。 类胡萝卜素与辅酶q l o 均以聚异戊二烯为前体进行合成代谢，因此减少类胡萝卜素 的生成量可能会促进辅酶q i o 的生物合成。类胡萝卜素含量的减少与辅酶q 1 0 产量增加之 间的关系还不完全清楚，可能是由于突变使聚异戊二烯过量，从而转向合成辅酶q 1 0 另一原因可能是由于，合成类胡萝卜素少的突变株通过增加辅酶q 1 0 的合成代替类胡萝 i - 素的抗氧化作用【2 5 1 。另外，甾簇化合物、异戊二烯醌、异戊二烯类蛋白质和萜醇等的 合成也是以聚异戊二烯作为前体。 1 4 2 基因工程茵的构建与分子改造 辅酶q l o 由芳香环和侧链组成，芳香环的前体是对羟基苯甲酸、聚异戊二烯侧链的 前体是聚异戊二烯焦磷酸( p p p ) ，甲基供体为s 腺营甲硫氨酸( s a m ) ，而s a m 直接由【广 甲硫氨酸转化而来。另外还包括芳香环的修饰【2 6 】。 1 4 2 1 辅酶q 1 0 产生菌中基因的强化表达 通过将带有目的基因的质粒转化至突变株中，随着细胞中合成酶基因拷贝数的增 加，可积累较大量的产物。找出辅酶q l o 合成过程中的关键酶基因，通过其强化表达就 有可能提高产物的产量。z h a n g t 2 7 1 等研究了含d p s 柏f c - “6 谢基因的重组勘t u m e f a c i e n s ， 3 硕上学位论文 结果表明辅酶q l o 的产量比其它的重组菌要高。 1 4 2 2 构建产辅酶q l o 的大肠杆菌基因工程菌 构建产辅酶q l o 的大肠杆菌基因工程菌，可从两方面入手：一方面改造大肠杆菌链 长控制基因，使其能够合成辅酶q l o ，另一方面强化表达合成途径的关键酶基因，通过 增强整个合成通路提高大肠杆菌辅酶q 生物合成能力【2 引。 u b i a 、i s p b 是两个关键因子。前者是辅酶q 合成的限速酶，它对长链聚异戊二烯 焦磷酸底物的专一性不高；后者则决定辅酶q 的种类。将卸b 灭活，并表达外源性聚 十异戊二烯焦磷酸合成酶的基因( d d s a ) ，即有可能在大肠杆菌中产生辅酶q i o 。据报 道，重组大肠杆菌辅酶q l o 的产量比天然产辅酶q 1 0 的菌株要低【刀j 。 范怡【3 0 】等将弱氧化葡糖杆菌( g l u c o n o b a c t e rs u b o x y d a n s ) 聚十异戊二烯焦磷酸合成 酶编码基因d d s a 转入大肠杆菌宿主中，通过产物分析确定了d d s a 基因能在各种大肠杆菌 中表达出有活性的聚十异戊二烯焦磷酸合成酶而使大肠杆菌生产辅酶q l o 。并且在 e s c h e r i c h i ac o l i h b l 0 1 这一菌株中，d d s a 的表达使辅酶q i o 的产量略超过了在野生型中占 主导地位的辅酶q 8 的产量。 1 4 2 3 构建基因工程菌使其具有某种代谢途径 异戊二烯焦磷酸( i p p ) 的合成途径【3 i 】分为甲羟戊酸途径( m e v a l o n a t ep a t h w a y ) 和m e p 途径。甲羟戊酸途径存在于真核微生物和动物中，利用甲羟戊酸作为中间代谢物合成 i p p ，是自然界中合成i p p 的普遍方式，乙酰c o a 为该途径的起始物；m e p 途径存在 于大多数原核细菌以及高等植物的质粒中，起始物为丙酮酸和3 磷酸甘油醛【3 引。 z a h i r i t 8 】等在大肠杆菌中构建了三个质粒，分别含有甲羟戊酸途径中的不同基因及 d d s a 基因，使不具备甲羟戊酸途径的大肠杆菌可以通过此途径合成i p p ，结果表明比所 有基因构建在同一个质粒上产量要高。 1 4 3 发酵过程控制及培养条件优化 菌种经过诱变和基因改造，生产辅酶q l o 的能力有所提高，为了进一步提高产量， 对发酵条件进行优化也是一条很有效的途径。 1 4 3 1 培养条件优化 不同的发酵条件对菌体生产辅酶q i o 的量有很大的影响，可以研究碳源、氮源、溶 氧、p h 值、温度等培养条件对发酵的影响。例如，葡萄糖是可快速利用的碳源，过高的 葡萄糖浓度会产生葡萄糖效应，影响产物的合成量，因此葡萄糖维持在较低浓度有利于 产物的形成，蔗糖则为慢速利用的碳源，采用葡萄糖加蔗糖的复合碳源有利于产物合成。 h a t 州等发现当从分批培养转为补料分批培养时，随着蔗糖的消耗辅酶q l o 的产量逐 渐减少，而副产物胞外多糖( e x o p o l y s a c c h a r i d e ，e p s ) 则有很多的积累，为了提高辅酶 q i o 的产量，研究了蔗糖浓度对e p s 、细胞生长、辅酶q l o 产量的影响。辅酶q l o 产量下降 的原因是由于副产物胞外多糖增加了发酵液的黏度，最终导致了氧的传递速率下降，影 响了产物的合成。因此控制蔗糖浓度对产物合成有很重要的作用。 4 第一章绪论 1 4 3 2 添加剂对发酵的影响 在发酵液中添加一定量的前体物质、生长因子( 氨基酸、核酸碱基、维生素、天然 氮化物等) 可以促进辅酶q 1 0 的产量。 潘春梅【3 3 】等研究了花生油、乙酸钠及v b l 等促进剂对放射型根瘤菌发酵产辅酶q l o 的影响，结果表明适量添加均可提高辅酶q l o 的产量，优化后辅酶q i o 的产量可达5 0 7 m g l 。 左智洁【3 4 】等研究了p 紫罗酮和麦角固醇对酵母生长及产辅酶q l o 的影响，结果表明d 紫罗酮和麦角固醇能有效地促进菌体产辅酶q l o ，同时添加两者，菌体中辅酶q l o 的含量 为0 2 2 8m g g 。这为发酵法生产辅酶q l o 提供了一条新的研究思路。 对羟基苯甲酸和茄昵醇是合成辅酶q l o 醌环核心的直接前体，陈亮【l5 】等在粉红掷孢 酵母( s p o r o b o l o my c e s r o s e u s ) 的发酵过程中添加了适量的对羟基苯甲酸和茄昵醇，结果 表明均可大幅度提高辅酶q l o 的产量，且分别提高了1 1 和2 1 。除此之外甲羟戊酸、异 戊烯醇和香叶醇也是辅酶q l o 合成的前体物质【”】。 三羧酸循环中的丙酸是辅酶q 1 0 中侧链异戊二烯基聚合物的前体，培养基中加入 0 5 丙酸，可提高辅酶q t o 的产量。在p s c h u y 腑l l i e n s i s 菌株的培养基中添加作为侧链合 成过程中前体的异戊基乙醇和牛儿醇，可提高菌体中的辅酶q l o 含量约达2 0 6 0 【3 6 1 。 1 4 4 辅酶q l o 的分离与纯化 辅酶q 1 0 主要存在于线粒体内膜上，其提取方法对产品的纯度和收率有很大的影响。 辅酶q l o 的分离纯化方法有不经皂化的有机溶剂提取、皂化后提取、吸附柱层析以及重 结晶。薄层色谱法也可用于分离辅酶q 1 0 0 辅酶q t o 的含量测定可采用紫外分光光度计和高效液相色谱法，纯化可采用硅胶柱 法和高速逆流色谱法( h i g h - s p e e dc o u n t e r - c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，h s c c c ) 。c a o 【3 7 】等 第一次采用高速逆流色谱法纯化辅酶q l o ，结果表明采用h s c c c 法纯化辅酶q l o 比硅胶柱 法效果要好，色谱纯度由9 6 o 提高到9 9 2 ，绝对纯度由9 3 3 提高到9 7 8 ，回收率 由7 4 3 提高到8 8 ，得率由2 3 4 提高至1 j 2 6 4 。 1 5 立题意义 近几年随着辅酶q l o 在医药、食品添加剂等领域的广泛应用，这种产品的市场前景 越来越广阔。我国辅酶q l o 的开发应用非常活跃，特别是医药行业，辅酶q l o 的针剂、 胶囊、片剂都有生产，加上食品领域作为各类营养保健食品添加剂的广泛应用，国内辅 酶q l o 的市场需求呈逐年增长之势。 由于动植物细胞提取法生产辅酶q t o 的原料来源受到限制，而半化学合成法虽然在 技术上已相当成熟，但在使用上却由于包含顺反异构体，生物活性差，难以发挥其药理 作用，因此微生物发酵提取法得到了长足的发展。目前，通过对菌种进行诱变和抗性筛 选是提高辅酶q i o 产量最有效的方法之一。然而，使用相同的方法再进一步提高产量相 对来说就比较困难，因为能在抗性平板上生长的突变株不一定能提高产量。为了获得高 性能的随机突变株，需要采取一种高通量的筛选方法用以提高辅酶q l o 的产量。随着研 5 堡主堂竺丝茎 究的深入，会得到通过基因工程组建的高产菌株，以及通过进一步研究辅酶q i o 的代谢 途径选育的高产菌株，从而满足工业化生产的要求。另外，还应保证高产菌株在发酵过 程中的稳定性，并采用合适的分离纯化方法，降低成本，从整体上提高辅酶q l o 的产量 与质量。 一言蔽之，在我国加快开发生产辅酶q l o 这种市场前景极好的产品已成为当务之急。 1 6 本论文的主要研究内容 本论文的主要研究内容包括： ( 1 ) 辅酶q l o 高产菌株快速筛选方法的建立。 ( 2 ) 结合抗性筛选，采用紫外诱变和离子束诱变筛选辅酶q l o 高产菌株。 ( 3 ) 通过1 5l 发酵罐在线控制发酵条件，进一步提高突变菌株发酵生产辅酶q l o 的能力。 6 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 实验材料 2 1 1 茵种 根癌土壤杆菌( r h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ) ，本实验室保藏菌种 2 1 2 主要试剂与材料 葡萄糖 蛋白胨 酵母膏 硫酸铵 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 氯化钠 氯化钙 碳酸钙 七水合硫酸亚铁 七水合硫酸镁 硫酸锰” 氯化钴 9 9 9 味精 无水乙醇 甲醇 盐酸 冰醋酸 3 0 过氧化氢 n ，n 二甲基甲酰胺 维生素k 3 丁胺卡那霉素注射液 硫酸庆大霉素注射液 2 1 3 主要仪器与设备 j y 2 5 0 2 型电子天平 电热恒温培养箱 恒温干燥箱 高压蒸汽灭菌锅 h y g i i 型回转式摇床 口服 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 食品级 优级纯 色谱纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 医药级 医药级 山东西王生化科技有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 山东齐鲁味精集团 国药集团化学试剂有限公司 江苏汉邦科技有限公司 上海振兴化工厂 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 中国医药上海化学试剂有限公司 徐州莱思药业有限公司 徐州莱恩药业有限公司 上海精密科学仪器有限公司 上海森信实验仪器有限公司 江苏连云港墟沟电器厂 上海申安医疗器械有限公司 上海欣芯自动化设备有限公司 硕士学位论文 s h z 3 型水循环真空泵 高效液相色谱仪a g i l e n th pl1 0 0 系列 1 c 1 8 2 5 4 f 型c 1 8 色谱柱 7 2 1 型分光光度计 c r 2 2 g 高速冷冻离心机 s b a 4 0 c 生物传感分析仪 梅特勒s 4 0 k 酸度计 1 5 l 发酵罐 2 2 实验方法 2 2 1 培养基及培养方法 河南省巩义市仪器厂 美国惠普公司 江苏汉邦科技有限公司 上海第三分析仪器厂 t h e r m oi e c i e cm u e t i r f 山东省科学院生物研究所 m e t t l e rt o l e d o 浙江新昌德力石化设备有限公司 斜面或平板培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，酵母膏1 0 ，n a c l5 ，琼脂2 0 ，p h7 2 ； 1 2 1 灭菌2 0m i n ，摆斜面或倒平板；冷却后接种根癌土壤杆菌，3 0 培养2 4h 。 种子培养基( l ) 葡萄糖3 ，酵母膏5 ，( n h 4 h s 0 43 ，k h 2 p 0 40 6 ，k 2 h p 0 4o 4 ，n a c i 2 ，p h7 2 ，1 2 1 灭菌2 0m i n ；从斜面培养基上刮一环菌种接种到种子培养基中，于3 0 下2 0 0r m i n 振荡培养2 4h ，种子瓶装液量为2 5 0m l 三角瓶装5 0m l 。 发酵培养基( g l ) 葡萄糖1 8 ，( n h 4 ) 2 5 0 44 ，玉米浆1 0 ，n a c i2 ，k h 2 p 0 42 ， m g s 0 4 7 h 2 03 ，p h7 2 ，1 2 1 灭菌2 0m i n ；将培养好的种子按8 的接种量接入发酵 瓶中，3 0 2 0 0r m i n 振荡培养。发酵瓶装液量为2 5 0m l 三角瓶装5 0m l 。 基本培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 43 ，n a c i2 ，k h 2 p 0 41 ，m g s 0 4 。7 h 2 00 5 ， 琼脂2 0 ，p h7 2 ，1 1 5 灭菌2 0m i n 。 2 2 2 诱变方法 2 2 2 1 紫外诱变方法 将培养好的对数生长期的菌悬液离心收集，用无菌生理盐水洗涤两次，然后稀释适 当倍数，使细胞浓度为1 0 8 个m l 。 开启紫外灯预热2 0m i n ，取制备好的菌悬液1 0m l 加入到9c n l 的无菌培养皿中，放 入无菌磁力搅拌棒，置于磁力搅拌器上。然后在红光下，打开皿盖，边搅拌边用紫外线 分别照射1 0 ，1 5 ，2 0 ，2 5 ，3 0s 。然后适当稀释后取0 1m l 分别涂布普通培养基平板和 含药平板。3 0 避光培养，待菌长出后计算普通平板上长出的菌落数，以未经照射的菌 液涂布的平板为对照计算致死率。挑取对应照射剂量含药平板上长出的菌落，进行摇瓶 发酵检测辅酶q , o 的产量。 致死率( ) = 塑堕骧畿鬟矬燮堕圳o 2 2 2 2 离子束诱变方法 将对数生长期的菌悬液离心收集，用无菌生理盐水洗涤两次，然后稀释适当倍数， 使细胞浓度为1 0 9 1 0 1 0 个m l 。将0 1m l 对数期菌悬液稀释后置于直径9c i n 的无菌平 8 墨三兰塑整兰查鎏 板，涂布均匀，于无菌状态吹干，脉冲注入n + 离子，注入能量为10k e v ，注入剂量分别 为2 5 、5 、1 0 、1 5 、2 0 、2 5 、3 0 x 1 0 1 4i o n c r n 2 ，然后用无菌生理盐水洗下菌膜，取0 1m l 涂布平板。3 0 培养4 8h 后，挑取对应注入剂量平板上长出的单菌落，进行摇瓶培养检 测辅酶q i o 的含量。 2 2 3 筛选平板的制备方法 2 2 3 1 抗性平板培养基的制备 将灭好菌的平板培养基凝固前加入一定量的筛选剂，摇匀后倒平板，配成含一定筛 选剂浓度的抗性平板。 2 2 3 2 筛选剂梯度平板培养基的制备 先将灭好菌的培养皿斜放，倒入适量不含筛选剂的平板分离培养基，待凝，使培养 基成一斜面；然后放平，倒入适量含筛选剂的培养基，待凝，凝固后即为筛选剂的浓度 梯度培养基。 2 2 3 3 代谢类似物抗性菌株的筛选 经诱变处理后的存活细胞，适当稀释后涂布于抗性平板分离培养基中，待平板菌落 培养成熟后移种于斜面，单菌落斜面培养成熟后，经摇瓶发酵，测定辅酶q l o 的含量。 高产菌立即制成甘油管保存，同时进行复筛。 2 2 4 辅酶q l o 高产菌株的筛选 采用抗性平板筛选辅酶q i o 菌株，具有操作方便、快速高效的优点，可以大大减少 筛选的工作量。辅酶q l o 高产菌株